制造疫苗的方法
专利名称：制造疫苗的方法
技术领域：
本发明系关于一种制造疫苗的方法，及由此制造之疫苗。
背景技术：
艰难梭菌(Clostridium difficile)系一种会形成孢子的革兰氏阴性菌，其引起 60%之与抗生素相关的腹泻病例，及几乎100%罹患伪膜性结肠炎的病患。引起该疾病爆发的机制尚未充分了解。其可能同时与宿主及菌株因素相关，因为并非所有感染艰难梭菌的病患均发展为疾病。感染病患之临床症状范围可从无症状至危及生命的毒性巨结肠。艰难梭菌如同多种引起包括人类之动物疾病的其它病原体，会产生毒素。毒素系由活细胞或生物体产生的毒性物质，其在非常低的浓度下即具活性。毒素可系小分子类、肽类、或蛋白质，当接触或与生物性大分子，如酶或细胞受体交互作用而被人体组织吸收时， 可以引起疾病。艰难梭菌产生两种毒素，毒素A(TcdA)与毒素B (TcdB)，其引起与抗生素相关的腹泻或伪膜性结肠炎。它们系非常大的(3081^^与沈91^幻细菌蛋白质，连同索氏梭菌 (C. sordellii)之TcsH与TcsL及诺氏梭菌(C. novyi)之Ten α共同属于所谓的大梭菌细胞毒素(LCT)家族之一部分。所有该等毒素均显示高度序列同源性、类似之域结构且含有糖基转移酶部分。TcdA与TcdB系特征为三重功能组织的单链蛋白质。其等之C末端结构域系与目标细胞的质膜结合所需要的，疏水性中间部分为推断的转位域，且该等蛋白质之N 末端催化结构域承载该糖基转移酶位置。尚未充分了解吸收进入该目标细胞的胞液之过程。然而，通常认为该等毒素在与细胞表面受体结合后被吞噬。在内涵体酸化后，只有该毒素之N末端结构域转位进入该胞液中。推断该转位过程系藉由形成微孔所介导，因为TcdA 可在低PH在人工膜上形成微孔。该毒素之活化需要在氨基酸Leu543与Gly544之间进行蛋白质水解而断裂，其释放含有该N末端催化结构域之63kDa小片段至该胞液中。TcdB之较大的207kDa C末端部分仍留在膜部分中。N末端63kDa片段展现完整细胞毒性活性。一旦释放，该N末端糖基转移酶结构域即可在该胞液中自由移动，以灭活其目标蛋白质Aho/ Rac家族之GTP酶。该等蛋白质参与多种细胞功能，例如，肌动蛋白细胞骨架之组织架构、转录控制、细胞极性及增殖。由于Mio GTP酶在免疫系统的多种功能中有重要作用，包括病原体防御反应、细胞因子表达及免疫细胞的信号传导，所以它们构成细菌毒素的最佳目标。最近已显示艰难梭菌毒素之活化系藉由自身催化裂解发生(Reineke等人， Nature 2007,446:415-419)。此外，已阐明六磷酸肌醇 Gns6P、IP6，CASnumber[83-86-3]) 的作用系毒素B之自身催化裂解之有效活化剂及辅助因子(Reineke等人，如上述文献)。此高度带电荷的分子似乎履行多种功能及可能参与该毒素之构象的稳定化。现已知毒素透过自身催化裂解而活化之作用亦发生在其它生物体的类似毒素，包括艰难梭菌之LCT毒素A(TcdA)及B (TcdB)、索氏梭菌之致命(TcsL)及出血毒素(TcsH)、及诺氏梭菌之α-毒素(Tcna )、以下各者之RTX毒素霍乱弧菌(Vibrio cholerae) (VcRTX)、 创伤弧菌(V. vulnificus) (VvRtx)、灿烂弧菌(V. splendidus) (VsRtx)、嗜线虫致病杆菌 (Xenorhabdus nematophila) (XnRtx)、伯氏致病杆菌(X. bovienii) (XbRtx)、假结核耶尔森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis) (YpRtx)、莫氏耳口尔森氏菌(Y. mollaretti)(YmMfp2)及百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis) (FhaLl-4) (Sheahan KL 等人， EMBO J 2007,26(10) :2552-2561)、鳗利斯顿氏菌(Listonellaanguillarum)、发光光杆菌(Photorhabdus luminescens)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)及小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica) (Lupardus PJ 等人，SCIENCE 2008,322(5899) 265-268)。下文中所有该等毒素可归类为“AB毒素”。国际专利申请案W02008014733揭示一种治疗梭菌感染之方法，其中对病患投与该自身催化活性之抑制剂或活化剂(IP6)。多种公开案揭示艰难梭菌疫苗。其中藉由化学药剂福尔马林灭活TcdA及 TcdB 之疫苗揭示于 Sougioultzis S. L.等人，Gastroenterology (2005), 128 :764-770, Kotloff，Infect. Immun. 2001、W09920304、及 Ghose 等人，Infect. Immun. (2007)，75 (6)， 2826-2832中。包括重组表达的呈现TcdA或TcdB之C末端配体结构域之多肽之疫苗揭示于 W09859053、W0006176U W00061762, W09702836、Pavliakova 等人之 hfect Immun (2000)， 68 (4)，2161-2166,Ward 等人之 Infect Immun (1999)，67 (10)，5124-5132、及 Lyerly 等人之 CurrentMicrobiol 21 :29-32)中。W02007146139 揭示一种编码 iTcdA 及 iTcdB 之受体结合性结构域之密码子最适化的DNA分子及其用作DNA疫苗。W02004041857揭示TcdB之无毒突变体及其用于接种之用途。Genth, H.等人，Infect. Immun. (2000),68 :1094-1101揭示一种用于产生酶解缺陷之艰难梭菌毒素B作为免疫抗原之方法。疫苗之典型制法为制造一种包括此等病原体之抗原组分之制剂，及将其与医药上可接受的载体混合。为获得有效的免疫反应及基于经济原因，需要采用仅需少数几个处理或分馏步骤即可自细菌培养物获得之制剂。在产生毒素的生物体情况下，其问题在于包含于此等制剂中之毒素除非已灭活，否则应避免投药。因此，先前技术方法已建议藉由该等毒素的化学灭活法、该等毒素之无毒性结构域之重组表达法(C末端受体结合性或“B”结构域)、或制备该等毒素之无毒性突变体，以制造对抗产生AB毒素之细菌病原体，如艰难梭菌之疫苗。然而，所有该等措施导致该病原生物体之抗原表位损失，可能影响该疫苗之有效性，及/或耗费成本。发明概述本发明系关于一种制造对抗产生AB毒素之细菌病原体之疫苗的方法，其包括(a)在可产生该AB毒素的条件下培养该病原体，并收获该培养物；(b)于活体外使该AB毒素经酶裂解；及(c)将步骤(b)之组合物与医药上可接受的载体组合。在较佳态样中，该酶裂解系自身催化的。在较佳态样中，使用磷酸肌醇，较佳六磷酸肌醇，作为该酶裂解之辅助因子。在其它较佳态样中，本发明系关于一种如所述之方法，其中该等细胞系在收获后， 自该培养基分离，且裂解该培养基中之AB毒素。本发明方法可用于制备对抗以下病原体之疫苗梭菌属(Clostridium)，较佳为艰难梭菌(C. difficile)、索氏梭菌(C. sordellii)、肉毒梭菌(C. botulinum)、产气荚膜梭菌(C.perfrmgens)、破伤风梭菌(C. tetani)、或诺氏梭菌(C. novyi)，或弧菌属 (Vibrio)，较佳为霍乱弧菌(V. cholerae)、副溶血弧菌(V. parahaemolyticus)、创伤弧菌 (V. vulnificus)、或灿烂弧菌(V. splendidus)、或鳗弧菌(V. anguillarum)，或致病杆菌属
4(Xenorhabdus)，较佳为嗜线虫致病杆菌(X. nematophila)、伯氏致病杆菌(X. bovienii)， 或耶尔森氏菌属Yersinia)，较佳为假结核耶尔森氏菌(Y. pseudotuberculosis)、鼠疫耶尔森氏菌(Y.pestis)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Y. enterocolitica)、或莫氏耶尔森氏菌(Y.mollaretti)，或博德特氏菌属(Bordetella)，较佳为百日咳博德特氏菌(B. pertussis)、副百日咳博德特氏菌(B. parapertussis)、或支气管炎博德特氏菌(B.bronchis印tica)，或放线杆菌属(Actinobacillus)，较佳为胸膜肺炎放线杆菌 (A. pleuropneumoniae)、或猪方文线杆菌(A. suis)及大肠杆菌(E. coli)。可添加佐剂至该疫苗组合物。在其它态样中，本发明系关于一种用所述方法制造之疫苗。本发明之另一态样系关于根据所揭示方法制造之疫苗之用途，其系用于包括人类之动物之接种，以对抗产生AB毒素之细菌病原体的感染。本发明之另一态样系关于对包括人类之动物接种对抗产生AB毒素之细菌病原体之感染的疫苗之方法，其包括对包括人类之动物投与有效量之根据本发明方法制造的疫
田ο发明详述本发明系关于一种制造对抗产生AB型毒素(AB毒素)之细菌病原体之疫苗的改良方法。本发明提供一种藉由活体外利用此等毒素固有的蛋白质水解活性之自身催化酶过程灭活AB毒素之巧妙的方法。为此，调整含有该等毒素之组合物成适合发生此酶裂解之条件。特定言之，加入必要的辅助因子，如磷酸肌醇，可诱发该AB毒素之蛋白质水解灭活。藉由该蛋白质水解作用裂解，该毒性A结构域与转运子结构域B分离，且失去其进入需发挥其毒性作用之细胞的胞液中之能力。实际上，所得组合物施加至活的生物体时不再有毒性，或远远低于该单链AB毒素的毒性。另一方面，此类灭活法保留对该疫苗效力具有重要性之该等蛋白质天然构象及抗原表位。在本发明说明书中，术语“AB毒素”系用作如LCT之包括催化结构域(A结构域) 及受体结合/转位域(B结构域或转运子结构域)之单链细菌毒素，且其中在活体内藉由自身催化裂解作用，释放该催化结构域至胞液中，而活化该催化结构域。AB毒素系例如，艰难梭菌之LCT，其包括毒素A (TcdA)及毒素B(TcdB)、索氏梭菌之致命(TcsL)及出血毒素 (TcsH)、及诺氏梭菌之α-毒素(Tcna )。此外，AB毒素包括以下各者之RTX毒素霍乱弧菌(VcRTX)、创伤弧菌(VvRtx)、灿烂弧菌(VsRtx)、嗜线虫致病杆菌OinRtx)、伯氏致病杆菌 OCbRtx)、假结核耶尔森氏菌(YpRtx)、莫氏耶尔森氏菌(YmMfp2)、小肠结肠炎耶尔森氏菌 (YST)、鳗利斯顿氏菌(VaRtx)及百日咳博德特氏菌(冊吐1-4)。因此，本发明方法可用于制造对抗产生AB毒素之细菌病原体(如彼等如上所列细菌)之感染的疫苗。疫苗系用于提高包括人类之动物对特定疾病的免疫力之医药制剂。疫苗可预防疾病(例如，预防或改善未来被任何天然或“野生”病原体感染的影响)、或治疗， 亦即应用于宿主已被病原体感染，有或没有疾病临床症状之情况。疫苗可含有杀死的微生物、经改性的活(减毒)微生物、微生物之抗原亚基制剂(例如，片段或重组表达的多肽)、 或较适用于本发明中之类毒素，亦即用在其系主要的引起疾病的情况下之灭活的毒性化合物。该疫苗可含有佐剂，亦即可刺激免疫系统且加强对疫苗反应而其本身不具任何特异性抗原作用之作用剂。普遍使用的佐剂实例为明矾(水合硫酸铝钾)、磷酸铝、氢氧化铝、角鲨烯、或油基佐剂。较佳的佐剂是商品化的Carbopol 934P(Carbomer 934P ；Noveon, Inc., Pedricktown, NJ, USA)，其可以以约2ml/l的量存在。Carbopol系一种与聚烯丙基蔗糖交联的丙烯酸聚合物。该方法之第一步系在产生该AB毒素的条件下培养病原体。细菌细胞培养在相关技术中系众所周知。已知对于不同物种而言之标准方法且可自公开之收集处获得该微生物之适宜样品。根据其特定需求培养所列微生物。梭菌系在厌氧环境下培养，而耶尔森氏菌、 致病杆菌、博德特氏菌及弧菌可在有氧下培养。耶尔森氏菌耐低温，通常在培养该等生物体。每种生物体需要其用于生长之特定培养基组合物，其容易自相关技术中得知。该AB毒素通常在该培养之稳定后期释放至该培养基。收获后，经常宜自该培养基分离该等细胞，因为该等AB毒素以充足的浓度存在于该培养基中。这可藉由离心完成。当离心分离该等细胞后，其被丢弃且进一步处理上清液。随后利用其自身催化特性优势之酶裂解灭活培养基中之毒素。为达成裂解，必须适当调整该等条件，以允许酶发挥活性。最重要的是，必须加入一种促进该酶活性的辅助因子。可使用磷酸肌醇(特定言之，六磷酸肌醇)作为辅助因子，在Ιμπιο /l至lOmmol/1之浓度范围内，更佳为10至100 μ mol/Ι，但是其它类似物或衍生物，诸如1，3，4-或3，4，6-三磷酸盐、1，2，3，4-、1，3，4，5-、3，4，5，6、或 1,4,5,6-四磷酸盐、或 1，2，3，4，5-、1，2，3，5，6-、1，3，4，5，6-、2，3，4，5，6_ 五磷酸盐亦有良好效用，但可能需要更高的浓度。pH应在6. 5至8. 5之范围内，且该培养基之pH通常已在该范围内。否则，可藉由(例如)透析或超滤法加入或交换缓冲液，例如PH为8. 5之Tris HCl0适宜的温度范围为20至40°C。通常将在1至对小时内完成裂解，且应采用彼等如实例中揭示之试验测试，以避免残留毒性。该等毒素种类可在灭活前，自收获物和/或培养基纯化。若病原体产生超过一种的毒素种类，此等毒素种类可在灭活前彼此分离。例如，艰难梭菌产生两种毒素，即毒素 A(TcdA)和毒素B (TcdB)，如上文所述。此等两种蛋白质可在灭活前，如本文实施例4中所例示地分开，然后个别地或组合地在疫苗制剂中使用。艰难梭菌的类毒素A和/或类毒素 B，即根据本发明灭活的毒素A和/或毒素B，系用于接种的较佳抗原。该等类毒素可在自身催化裂解后进一步纯化，富集较大的C-末端裂解片段(例如由全毒素A的氨基酸M3-2710 或者全毒素B的氨基酸M44666或M54666组成)。该纯化的本发明类毒素可在疫苗制剂中进一步组合灭活的其它病原体的AB毒素。随后将所得制剂制成其最终调配物，并用作认为恰当的疫苗。例如，其可直接使用，以水性环境作为医药上可接受的载体。亦可改变该环境，例如稀释、透析、超滤或进一步纯化步骤，如亲和层析。该抗原制剂可冷冻干燥供贮存，使用前用水重建。若适当，可加入佐剂。可考虑的佐剂系(例如)油包水性、水包油性、多相或非矿物油性乳液、基于铝之佐剂、聚合物佐剂如Carbopol 、角鲨烯、脂质体、微粒、免疫刺激复合物及Toll样受体级联活化佐剂。将藉由经皮下、皮内、肌肉内、静脉内或腹膜内注射投与该疫苗。注射的频率及剂量取决于目标物种。易感受之物种系人类、犬、猫、兔、猪、牛、鱼、啮齿类动物及马。该疫苗接种法系预防性治疗，且可藉由母体接种来保护后代。接种疫苗的时间始于母体抗体消失后，及可能需要在4星期后及以后时间点追加接种疫苗。如此，在另一态样中，本发明系关于一种对抗梭菌诱发的腹泻之疫苗，其包含艰难梭菌的类毒素A和/或类毒素B，其中所述类毒素A和/或类毒素B系藉由自身催化裂解自毒素A和/或毒素B生成的，任选与医药上可接受的载体一起。在一些实施方案中，类毒素A 由公开数据库(EMBL，NCBI)中以登录号YP_001087137、ZP_05349827、或YP_003213641 保藏的序列的氨基酸Μ3-2710组成。在其它实施方案中，类毒素B由公开数据库(EMBL，NCBI) 中以登录号 YP_001087i;35、ZP_05349824、ZP_053^744、YP_003217086、或 ΥΡ_003213639 保藏的序列的氨基酸Μ44666或Μ5-2666组成。该疫苗可进一步包含佐剂。
实施例实施例1 制造艰难梭菌疫苗可自公开收集处获得艰难梭菌样品，例如美国标准菌种中心(ATCC)，Manassas， VA，USA，编号ATCC 9689、ATCC 43255。其生长于BHI培养基(脑心浸液，德国海德堡Becton Dickinson ；见美国医药协会(AmericanPharmaceutical Association), 1950,国家处方集 (The national formulary)，第 9 版，ΑΡΑ, Washington, D. C.)之发酵槽中，在 37°C厌氧条件下发酵3至4天。在稳定后期释放两种大型细胞毒素TcdA及TcdB。在该时间点，收获该培养物，在SOOOxg下离心10分钟，使该细菌沉降。取该上清液直接使用，或可藉由凝胶渗透层析(例如，在S300kphaCryl上)、亲和层析、阴离子交换层析及/或超滤来富集毒素。随后依终浓度1至50mmol/l添加还原剂二硫苏醣醇至该上清液或富集毒素的制剂，接着依终浓度10至lOOmmol/1添加螯合物形成剂乙二胺四乙酸。随后依终浓度1 μ mol/1与 10mmol/l之间，添加六磷酸肌醇(IP6)，例如10 μ mol/1或100 μ mol/1，且在37°C适宜的缓冲液中(如Tris-HCl)在pH 6. 5至8. 5培养该组合物2至M小时。可藉由十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及蛋白质染色法检测该裂解之完成性。随后将所得制剂制成其最终调配物，并用作认为恰当的疫苗。例如，其可直接使用，以水性环境用作医药上可接受的载体。亦可改变该环境，例如稀释、透析、超滤或进一步纯化步骤，如亲和层析。若适当，可加入佐剂。可考虑的佐剂系(例如)油包水性、水包油性、多相或非矿物油性乳液、基于铝之佐剂、聚合物佐剂如Carbopol 、角鲨烯、脂质体、微粒、免疫刺激复合物及Toll样受体级联活化佐剂。将藉由经皮下、皮内、肌肉内、静脉内或腹膜内注射投与该疫苗。注射的频率及剂量取决于目标物种。易感受物种系人类、犬、猫、 兔、猪、牛及马。该疫苗接种法系一种预防性治疗且可藉由母体接种保护后代。接种疫苗的时间始于母体抗体消失后，且可能需要在4星期后及以后时间点追加接种疫苗。实施例2 活性试验在含有例如5% FCS (胎牛血清)的例如Ham氏FlO培养基中接种CHO细胞(中国仓鼠卵巢，例如DSMACC110，德国Braunsctiweig市之德国微生物与细胞培养物收集公司 (Deutsche Sammlungvon Mikroorganismen und ZellkulturenGmbH))至 96 或 24 槽穴微板 (每槽穴100 μ 1)，在37°C潮湿环境下培养过夜直至其达到汇集。用不含二价离子，如镁或钙的Ringer氏溶液冲洗，随后添加100 μ 1 (96槽穴板)或400 μ 1 (24槽穴板)不含Mg及 Ca的Ringer氏溶液至该槽穴中。随后用移液管分别吸取100或400 μ 1实施例1之疫苗制剂，及各稀释液系列(ΙΟ—1至10_8)至槽穴，每个样本重复两次。用与疫苗制剂相同的方法处理BHI培养基作为阴性对照。用未处理的艰难梭菌上清液作为阳性对照。在37°C潮湿环境下培养该板3至M小时，随后用显微镜检查该等细胞。用疫苗制剂处理的细胞应显示无形态变化，与该等阴性对照一致。用未处理的培
7养上清液处理的细胞将显示细胞病变结果，其主要特征为变成圆形及发展为“星形细胞样” 的形态。如果该等疫苗处理的细胞显示类似于该阳性对照的细胞病变结果，则是酶裂解未完全，必须重复处理。实施例3 动物之疫苗接种可采用叙利亚金仓鼠作为艰难梭菌感染的标准化动物模型。在试验中使用60至 IOOg重的动物。该等动物藉由腹膜内或皮下注射获得不同浓度(1至100 μ g)的疫苗制剂。 该疫苗不含佐剂，或含有完全弗氏佐剂(与疫苗制剂1 1)或Ribi (单磷酰脂质A与二棒分枝酸海藻糖(trehalose dicorynomycolate)乳液)作为佐剂。用与疫苗相同方法处理的BHI培养基作为阴性对照。在最后一次接种疫苗2星期后，该等动物经腹膜内或口胃获得10至100mg/kg克林霉素(clindamycin)。M小时后，利用胃管或球形末端插管，分别对每只动物接种至少IO4个有活力之艰难梭菌病菌或100c. f. u (菌落形成单位)。透过腹泻或死亡率的临床监测决定该疫苗之保护效能。实施例4 动物之艰难梭菌疫苗接种在这些研究中，艰难梭菌的AB毒素通过利用它们的内在自身催化裂解功能来灭活并在动物中用作疫苗。为了生成毒素，将Iml艰难梭菌(参照株VPI10463，ATCC 43255)工作培养物转移入经预处理的且无菌的透析袋中，其中装有200ml 0.9%妝(1。将透析袋置入1.318!11培养基中并于37°C在厌氧室中温育5天。5天后将透析袋的内容物离心(5000rpm，4°C，15min) 并对上清液实施分级过硫酸铵沉淀。实施第一个沉淀步骤(毒素A)，即添加45% (NH)4SO4 并于4°C搅动3小时。此时之后，将溶液离心(5000rpm，4°C，30min)并进行第二个沉淀步骤 (毒素B)，即添加(NH) 4S04至终含量70 %。将第二级分于4°C搅动3小时并在此后再次离心 (5000rpm，4°C，30min)。将沉淀步骤得到的团粒悬浮在5ml 50mMTris/HCl pH 7. 5中。通过蔗糖密度梯度离心来进一步纯化自(NH)4SO4沉淀得到的两个级分(毒素A和B)。因此，制备蔗糖密度梯度，即在超速离心管中以渐增的次序加4. 5ml下述蔗糖溶液10%，18. 75%, 27. 50%，36. 25%和45%蔗糖，在50mM Tris/HCl pH 7.5中。将毒素级分加到顶部并将管于4°C以100. OOOg离心3. 5小时。以2ml等分试样收集所得梯度。用CH0-K1细胞通过细胞毒性测定法测量样品的毒素含量。因此，在含有10% FCS,0. 5% L-谷氨酰胺和0. 5%青霉素/链霉素的DMEM/F10培养基中培养CH0-K1细胞(ATCCCCL-61)。在96孔微量滴定板中制备细胞单层(约4000每孔)并于37°C和5% CO2温育M小时。温育时间后，制备含有毒素的样品的10倍稀释液。自细胞除去培养基后，添加毒素稀释液。对小时后用倒置显微镜以显微术检查细胞毒效应。使用下面的方案来评估细胞毒性阳性(+) :> 90%圆形细胞阴性(-)< 90%圆形细胞合并含有毒素的蔗糖密度梯度离心级分(毒素A和毒素B各自进行)，并用50mM Tris/HCl pH 7. 5进行1 2稀释。将样品(毒素A或毒素B)加载到离子交换柱上，并进行范围从含 50mM NaCl 的 50mM Tris/HCl pH 7. 5 至含 700mMNaCl 的 50mM Tris/HCl pH 7. 5 的 NaCl梯度(ΔNaCl 5mM/ml)以洗脱毒素。收集2ml的级分。用CH0-K1细胞通过细胞毒性测定法来测量样品的毒素含量。合并含有毒素的级分并通过超速离心步骤G°C，5000rpm，15min)来浓缩。为了获得毒素溶液，添加20%甘油并将样品保存于-20°C。还通过SDS-PAGE来监测纯化步骤。通过Coomassie染色来显现蛋白质。通过比较 SDS凝胶中毒素量与BSA标准品来测定最终毒素样品的浓度。比较通过光学调节(optical adjustment)及通过计算机分析来进行。制备疫苗制备物，即通过添加DTT和IP6来诱导毒素的自身催化裂解。毒素A裂解在H2O中以终体积50 μ 1通过添加3mM IP6和50mM DTT来实施。毒素B裂解在H2O中以终体积100 μ 1通过添加ImM IP6和150mM DTT来实施。自身裂解在旋转台上于37°C实施过夜。通过细胞毒性测定法和SDS PAGE分析来分析所得裂解产物。细胞毒性测定法用 CHO-Kl细胞和Caco细胞来实施，因为Caco细胞显示较高的针对毒素A的敏感性。Caco细胞在含有10% FCS和0. 5%青霉素/链霉素的MEM培养基中在96微量滴定孔上于37°C和 5% CO2培养48小时。细胞毒性测定法显示M小时后毒素A至少IO3倍和毒素B至少IO4 倍的细胞毒性降低。裂解效率用Coomassie染色的SDS PAGE分析来显现。用Sigma佐剂系统(用单磷酰基脂质A和合成二棒分枝酸海藻糖来水包油乳化) 制备含各灭活毒素(类毒素)的疫苗剂。通过比较SDS凝胶中的毒素量与BSA标准品来测定类毒素浓度。通过光学调节(optical adjustment)及通过计算机分析来进行比较。佐剂如制造商所述用PBS重建，并与各类毒素样品1 1混合。艰难梭菌感染的经典模型生物体是叙利亚仓鼠。叙利亚仓鼠对感染反应非常灵敏，而且形成与人的类似的临床体征和病理改变。如此，仓鼠感染模型是一种非常严格的模型，以受感染动物100%死亡结束。在试验中，加入时体重60_80g的叙利亚仓鼠购自Charles River, D-97633， Sulzfeld, Germany.动物在到达测试机构时随机化至各组并给予至少5天的充足适应期。 给动物接种疫苗3次，间隔2周。最后一次免疫接种后14天，用艰难梭菌实施感染。在艰难梭菌的口服攻击前M小时，给每只动物口服施用ang克林霉素。通过破坏肠道的正常菌群，抗生素克林霉素的施用使动物易患艰难梭菌感染。在攻击后的7天时段里，进行仔细的每日临床检查并记录临床发现。在研究期间的数个时间点采集血液样品并对血清分析抑制毒素A和毒素B对培养细胞的细胞毒性的抗体。因此，CH0-K1细胞以5000个细胞/孔在96孔板中在含有10% FCS,0. 5% L-谷氨酰胺和0. 5%青霉素/链霉素的DMEM/F10培养基中接种并于37°C和5% CO2温育过夜。在培养基中制备仓鼠血清的稀释液并与毒素A和B稀释液一起于37°C温育1小时。毒素稀释至 3小时和M小时后引起> 90%的细胞变圆的浓度。3小时和M小时后如前所述以显微术确定细胞变圆。中和滴度定义为完全抑制M小时后细胞变圆的最大血清稀释度的倒数值。该研究的目的是确定不同剂量的灭活毒素A和B组合的重复皮下免疫接种是否是生物相容的及针对艰难梭菌感染的保护是否能得到诱导。因此，使用了 12只雄性叙利亚仓鼠，它们在到达测试机构时被随机化至4个组。每个组由3只动物组成。各组在不同日子以渐增剂量接种疫苗以能够在疫苗接种后与潜在毒性效应反应。
权利要求
1.一种制造对抗产生AB毒素的细菌病原体之疫苗的方法，其包括(a)在产生该AB毒素的条件下培养该病原体，并收获该培养物；(b)于活体外使该AB毒素经酶裂解；及(c)将步骤(b)之组合物与医药上可接受的载体组合。
2.如权利要求1之方法，其中使用磷酸肌醇(较佳六磷酸肌醇)作为该酶裂解的辅助因子。
3.如权利要求1或2之方法，其中该等细胞系在收获后，自该培养基分离，且裂解该培养基中之AB毒素。
4.如权利要求1至3中任一项之方法，其中在裂解前自该收获物(较佳自该培养基) 纯化该AB毒素。
5.如权利要求1至4中任一项之方法，其中该病原体为梭菌(Clostridium)属，较佳为艰难梭菌(C. difficile)、索氏梭菌(C. sordellii)、肉毒梭菌(C. botulinum)、产气荚膜梭菌(C.perfrmgens)、破伤风梭菌(C. tetani)、或诺氏梭菌(C. novyi)，或为弧菌(Vibrio)属，较佳为霍乱弧菌(V. cholerae)、副溶血弧菌(V. parahaemolyticus)、 创伤弧菌(V. vulnificus)、灿烂弧菌(V. splendidus)、或鳗弧菌(V. anguillarum)， 或为致病杆菌(Xenorhabdus)属，较佳为嗜线虫致病杆菌(X. nematophila)、伯氏致病杆菌(X. bovienii)，或为耶尔森氏菌(Yersinia)属，较佳为假结核耶尔森氏菌(Y. pseudotuberculosis)、鼠疫耶尔森氏菌(Y. pestis)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Y. enterocolitica)、或莫氏耶尔森氏菌(Y. mollaretti)，或为博德特氏菌属(Bordetella)，较佳为百日咳博德特氏菌(B. pertussis)、副百日咳博德特氏菌 (B. parapertussis)、或支气管炎博德特氏菌(B. bronchiseptica)，或为放线杆菌属 (Actmobacillus)，较佳为胸膜肺炎放线杆菌(A. pleuropneumoniae)、或猪放线杆菌 (A. suis)及大肠杆菌(E. coli)。
6.如权利要求5之方法，其中该病原体为艰难梭菌，且在裂解前自毒素B纯化毒素A。
7.如权利要求1至6中任一项之方法，其中将佐剂添加至该组合物中。
8.利用如权利要求1至7中任一项之方法所制造之疫苗。
9.如权利要求8之疫苗，其包含艰难梭菌的类毒素A和/或类毒素B。
10.对抗梭菌诱发之腹泻的疫苗，其包含艰难梭菌的类毒素A和/或类毒素B，其中所述类毒素A和/或类毒素B系藉由自身催化裂解自毒素A和/或毒素B生成的，任选与医药上可接受的载体一起。
11.如前述权利要求任一项制造之疫苗用于接种包括人类之动物，以抵抗产生AB毒素之病原体的感染的用途。
12.对包括人类之动物接种对抗产生AB毒素之病原体之感染的疫苗的方法，包括对包括人类之动物投与有效量之根据权利要求1至7中任一项制造的疫苗。
全文摘要
本发明系关于一种制造对抗产生AB毒素之细菌病原体，如梭菌(Clostridium)之疫苗的方法，其包括(a)在产生该AB毒素的条件下培养该病原体，并收获该培养物，(b)于活体外使该AB毒素经酶裂解，较佳使用六磷酸肌醇作为辅助因子，及(c)将步骤(b)之组合物与医药上可接受的载体组合。
文档编号A61K39/08GK102238960SQ200980148516
公开日2011年11月9日 申请日期2009年12月1日 优先权日2008年12月3日
发明者杰西卡·赖内克 申请人:贝林格尔.英格海姆维特梅迪卡有限公司
技术领域：
本发明系关于一种制造疫苗的方法，及由此制造之疫苗。
背景技术：
艰难梭菌(Clostridium difficile)系一种会形成孢子的革兰氏阴性菌，其引起 60%之与抗生素相关的腹泻病例，及几乎100%罹患伪膜性结肠炎的病患。引起该疾病爆发的机制尚未充分了解。其可能同时与宿主及菌株因素相关，因为并非所有感染艰难梭菌的病患均发展为疾病。感染病患之临床症状范围可从无症状至危及生命的毒性巨结肠。艰难梭菌如同多种引起包括人类之动物疾病的其它病原体，会产生毒素。毒素系由活细胞或生物体产生的毒性物质，其在非常低的浓度下即具活性。毒素可系小分子类、肽类、或蛋白质，当接触或与生物性大分子，如酶或细胞受体交互作用而被人体组织吸收时， 可以引起疾病。艰难梭菌产生两种毒素，毒素A(TcdA)与毒素B (TcdB)，其引起与抗生素相关的腹泻或伪膜性结肠炎。它们系非常大的(3081^^与沈91^幻细菌蛋白质，连同索氏梭菌 (C. sordellii)之TcsH与TcsL及诺氏梭菌(C. novyi)之Ten α共同属于所谓的大梭菌细胞毒素(LCT)家族之一部分。所有该等毒素均显示高度序列同源性、类似之域结构且含有糖基转移酶部分。TcdA与TcdB系特征为三重功能组织的单链蛋白质。其等之C末端结构域系与目标细胞的质膜结合所需要的，疏水性中间部分为推断的转位域，且该等蛋白质之N 末端催化结构域承载该糖基转移酶位置。尚未充分了解吸收进入该目标细胞的胞液之过程。然而，通常认为该等毒素在与细胞表面受体结合后被吞噬。在内涵体酸化后，只有该毒素之N末端结构域转位进入该胞液中。推断该转位过程系藉由形成微孔所介导，因为TcdA 可在低PH在人工膜上形成微孔。该毒素之活化需要在氨基酸Leu543与Gly544之间进行蛋白质水解而断裂，其释放含有该N末端催化结构域之63kDa小片段至该胞液中。TcdB之较大的207kDa C末端部分仍留在膜部分中。N末端63kDa片段展现完整细胞毒性活性。一旦释放，该N末端糖基转移酶结构域即可在该胞液中自由移动，以灭活其目标蛋白质Aho/ Rac家族之GTP酶。该等蛋白质参与多种细胞功能，例如，肌动蛋白细胞骨架之组织架构、转录控制、细胞极性及增殖。由于Mio GTP酶在免疫系统的多种功能中有重要作用，包括病原体防御反应、细胞因子表达及免疫细胞的信号传导，所以它们构成细菌毒素的最佳目标。最近已显示艰难梭菌毒素之活化系藉由自身催化裂解发生(Reineke等人， Nature 2007,446:415-419)。此外，已阐明六磷酸肌醇 Gns6P、IP6，CASnumber[83-86-3]) 的作用系毒素B之自身催化裂解之有效活化剂及辅助因子(Reineke等人，如上述文献)。此高度带电荷的分子似乎履行多种功能及可能参与该毒素之构象的稳定化。现已知毒素透过自身催化裂解而活化之作用亦发生在其它生物体的类似毒素，包括艰难梭菌之LCT毒素A(TcdA)及B (TcdB)、索氏梭菌之致命(TcsL)及出血毒素(TcsH)、及诺氏梭菌之α-毒素(Tcna )、以下各者之RTX毒素霍乱弧菌(Vibrio cholerae) (VcRTX)、 创伤弧菌(V. vulnificus) (VvRtx)、灿烂弧菌(V. splendidus) (VsRtx)、嗜线虫致病杆菌 (Xenorhabdus nematophila) (XnRtx)、伯氏致病杆菌(X. bovienii) (XbRtx)、假结核耶尔森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis) (YpRtx)、莫氏耳口尔森氏菌(Y. mollaretti)(YmMfp2)及百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis) (FhaLl-4) (Sheahan KL 等人， EMBO J 2007,26(10) :2552-2561)、鳗利斯顿氏菌(Listonellaanguillarum)、发光光杆菌(Photorhabdus luminescens)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)及小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica) (Lupardus PJ 等人，SCIENCE 2008,322(5899) 265-268)。下文中所有该等毒素可归类为“AB毒素”。国际专利申请案W02008014733揭示一种治疗梭菌感染之方法，其中对病患投与该自身催化活性之抑制剂或活化剂(IP6)。多种公开案揭示艰难梭菌疫苗。其中藉由化学药剂福尔马林灭活TcdA及 TcdB 之疫苗揭示于 Sougioultzis S. L.等人，Gastroenterology (2005), 128 :764-770, Kotloff，Infect. Immun. 2001、W09920304、及 Ghose 等人，Infect. Immun. (2007)，75 (6)， 2826-2832中。包括重组表达的呈现TcdA或TcdB之C末端配体结构域之多肽之疫苗揭示于 W09859053、W0006176U W00061762, W09702836、Pavliakova 等人之 hfect Immun (2000)， 68 (4)，2161-2166,Ward 等人之 Infect Immun (1999)，67 (10)，5124-5132、及 Lyerly 等人之 CurrentMicrobiol 21 :29-32)中。W02007146139 揭示一种编码 iTcdA 及 iTcdB 之受体结合性结构域之密码子最适化的DNA分子及其用作DNA疫苗。W02004041857揭示TcdB之无毒突变体及其用于接种之用途。Genth, H.等人，Infect. Immun. (2000),68 :1094-1101揭示一种用于产生酶解缺陷之艰难梭菌毒素B作为免疫抗原之方法。疫苗之典型制法为制造一种包括此等病原体之抗原组分之制剂，及将其与医药上可接受的载体混合。为获得有效的免疫反应及基于经济原因，需要采用仅需少数几个处理或分馏步骤即可自细菌培养物获得之制剂。在产生毒素的生物体情况下，其问题在于包含于此等制剂中之毒素除非已灭活，否则应避免投药。因此，先前技术方法已建议藉由该等毒素的化学灭活法、该等毒素之无毒性结构域之重组表达法(C末端受体结合性或“B”结构域)、或制备该等毒素之无毒性突变体，以制造对抗产生AB毒素之细菌病原体，如艰难梭菌之疫苗。然而，所有该等措施导致该病原生物体之抗原表位损失，可能影响该疫苗之有效性，及/或耗费成本。发明概述本发明系关于一种制造对抗产生AB毒素之细菌病原体之疫苗的方法，其包括(a)在可产生该AB毒素的条件下培养该病原体，并收获该培养物；(b)于活体外使该AB毒素经酶裂解；及(c)将步骤(b)之组合物与医药上可接受的载体组合。在较佳态样中，该酶裂解系自身催化的。在较佳态样中，使用磷酸肌醇，较佳六磷酸肌醇，作为该酶裂解之辅助因子。在其它较佳态样中，本发明系关于一种如所述之方法，其中该等细胞系在收获后， 自该培养基分离，且裂解该培养基中之AB毒素。本发明方法可用于制备对抗以下病原体之疫苗梭菌属(Clostridium)，较佳为艰难梭菌(C. difficile)、索氏梭菌(C. sordellii)、肉毒梭菌(C. botulinum)、产气荚膜梭菌(C.perfrmgens)、破伤风梭菌(C. tetani)、或诺氏梭菌(C. novyi)，或弧菌属 (Vibrio)，较佳为霍乱弧菌(V. cholerae)、副溶血弧菌(V. parahaemolyticus)、创伤弧菌 (V. vulnificus)、或灿烂弧菌(V. splendidus)、或鳗弧菌(V. anguillarum)，或致病杆菌属
4(Xenorhabdus)，较佳为嗜线虫致病杆菌(X. nematophila)、伯氏致病杆菌(X. bovienii)， 或耶尔森氏菌属Yersinia)，较佳为假结核耶尔森氏菌(Y. pseudotuberculosis)、鼠疫耶尔森氏菌(Y.pestis)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Y. enterocolitica)、或莫氏耶尔森氏菌(Y.mollaretti)，或博德特氏菌属(Bordetella)，较佳为百日咳博德特氏菌(B. pertussis)、副百日咳博德特氏菌(B. parapertussis)、或支气管炎博德特氏菌(B.bronchis印tica)，或放线杆菌属(Actinobacillus)，较佳为胸膜肺炎放线杆菌 (A. pleuropneumoniae)、或猪方文线杆菌(A. suis)及大肠杆菌(E. coli)。可添加佐剂至该疫苗组合物。在其它态样中，本发明系关于一种用所述方法制造之疫苗。本发明之另一态样系关于根据所揭示方法制造之疫苗之用途，其系用于包括人类之动物之接种，以对抗产生AB毒素之细菌病原体的感染。本发明之另一态样系关于对包括人类之动物接种对抗产生AB毒素之细菌病原体之感染的疫苗之方法，其包括对包括人类之动物投与有效量之根据本发明方法制造的疫
田ο发明详述本发明系关于一种制造对抗产生AB型毒素(AB毒素)之细菌病原体之疫苗的改良方法。本发明提供一种藉由活体外利用此等毒素固有的蛋白质水解活性之自身催化酶过程灭活AB毒素之巧妙的方法。为此，调整含有该等毒素之组合物成适合发生此酶裂解之条件。特定言之，加入必要的辅助因子，如磷酸肌醇，可诱发该AB毒素之蛋白质水解灭活。藉由该蛋白质水解作用裂解，该毒性A结构域与转运子结构域B分离，且失去其进入需发挥其毒性作用之细胞的胞液中之能力。实际上，所得组合物施加至活的生物体时不再有毒性，或远远低于该单链AB毒素的毒性。另一方面，此类灭活法保留对该疫苗效力具有重要性之该等蛋白质天然构象及抗原表位。在本发明说明书中，术语“AB毒素”系用作如LCT之包括催化结构域(A结构域) 及受体结合/转位域(B结构域或转运子结构域)之单链细菌毒素，且其中在活体内藉由自身催化裂解作用，释放该催化结构域至胞液中，而活化该催化结构域。AB毒素系例如，艰难梭菌之LCT，其包括毒素A (TcdA)及毒素B(TcdB)、索氏梭菌之致命(TcsL)及出血毒素 (TcsH)、及诺氏梭菌之α-毒素(Tcna )。此外，AB毒素包括以下各者之RTX毒素霍乱弧菌(VcRTX)、创伤弧菌(VvRtx)、灿烂弧菌(VsRtx)、嗜线虫致病杆菌OinRtx)、伯氏致病杆菌 OCbRtx)、假结核耶尔森氏菌(YpRtx)、莫氏耶尔森氏菌(YmMfp2)、小肠结肠炎耶尔森氏菌 (YST)、鳗利斯顿氏菌(VaRtx)及百日咳博德特氏菌(冊吐1-4)。因此，本发明方法可用于制造对抗产生AB毒素之细菌病原体(如彼等如上所列细菌)之感染的疫苗。疫苗系用于提高包括人类之动物对特定疾病的免疫力之医药制剂。疫苗可预防疾病(例如，预防或改善未来被任何天然或“野生”病原体感染的影响)、或治疗， 亦即应用于宿主已被病原体感染，有或没有疾病临床症状之情况。疫苗可含有杀死的微生物、经改性的活(减毒)微生物、微生物之抗原亚基制剂(例如，片段或重组表达的多肽)、 或较适用于本发明中之类毒素，亦即用在其系主要的引起疾病的情况下之灭活的毒性化合物。该疫苗可含有佐剂，亦即可刺激免疫系统且加强对疫苗反应而其本身不具任何特异性抗原作用之作用剂。普遍使用的佐剂实例为明矾(水合硫酸铝钾)、磷酸铝、氢氧化铝、角鲨烯、或油基佐剂。较佳的佐剂是商品化的Carbopol 934P(Carbomer 934P ；Noveon, Inc., Pedricktown, NJ, USA)，其可以以约2ml/l的量存在。Carbopol系一种与聚烯丙基蔗糖交联的丙烯酸聚合物。该方法之第一步系在产生该AB毒素的条件下培养病原体。细菌细胞培养在相关技术中系众所周知。已知对于不同物种而言之标准方法且可自公开之收集处获得该微生物之适宜样品。根据其特定需求培养所列微生物。梭菌系在厌氧环境下培养，而耶尔森氏菌、 致病杆菌、博德特氏菌及弧菌可在有氧下培养。耶尔森氏菌耐低温，通常在培养该等生物体。每种生物体需要其用于生长之特定培养基组合物，其容易自相关技术中得知。该AB毒素通常在该培养之稳定后期释放至该培养基。收获后，经常宜自该培养基分离该等细胞，因为该等AB毒素以充足的浓度存在于该培养基中。这可藉由离心完成。当离心分离该等细胞后，其被丢弃且进一步处理上清液。随后利用其自身催化特性优势之酶裂解灭活培养基中之毒素。为达成裂解，必须适当调整该等条件，以允许酶发挥活性。最重要的是，必须加入一种促进该酶活性的辅助因子。可使用磷酸肌醇(特定言之，六磷酸肌醇)作为辅助因子，在Ιμπιο /l至lOmmol/1之浓度范围内，更佳为10至100 μ mol/Ι，但是其它类似物或衍生物，诸如1，3，4-或3，4，6-三磷酸盐、1，2，3，4-、1，3，4，5-、3，4，5，6、或 1,4,5,6-四磷酸盐、或 1，2，3，4，5-、1，2，3，5，6-、1，3，4，5，6-、2，3，4，5，6_ 五磷酸盐亦有良好效用，但可能需要更高的浓度。pH应在6. 5至8. 5之范围内，且该培养基之pH通常已在该范围内。否则，可藉由(例如)透析或超滤法加入或交换缓冲液，例如PH为8. 5之Tris HCl0适宜的温度范围为20至40°C。通常将在1至对小时内完成裂解，且应采用彼等如实例中揭示之试验测试，以避免残留毒性。该等毒素种类可在灭活前，自收获物和/或培养基纯化。若病原体产生超过一种的毒素种类，此等毒素种类可在灭活前彼此分离。例如，艰难梭菌产生两种毒素，即毒素 A(TcdA)和毒素B (TcdB)，如上文所述。此等两种蛋白质可在灭活前，如本文实施例4中所例示地分开，然后个别地或组合地在疫苗制剂中使用。艰难梭菌的类毒素A和/或类毒素 B，即根据本发明灭活的毒素A和/或毒素B，系用于接种的较佳抗原。该等类毒素可在自身催化裂解后进一步纯化，富集较大的C-末端裂解片段(例如由全毒素A的氨基酸M3-2710 或者全毒素B的氨基酸M44666或M54666组成)。该纯化的本发明类毒素可在疫苗制剂中进一步组合灭活的其它病原体的AB毒素。随后将所得制剂制成其最终调配物，并用作认为恰当的疫苗。例如，其可直接使用，以水性环境作为医药上可接受的载体。亦可改变该环境，例如稀释、透析、超滤或进一步纯化步骤，如亲和层析。该抗原制剂可冷冻干燥供贮存，使用前用水重建。若适当，可加入佐剂。可考虑的佐剂系(例如)油包水性、水包油性、多相或非矿物油性乳液、基于铝之佐剂、聚合物佐剂如Carbopol 、角鲨烯、脂质体、微粒、免疫刺激复合物及Toll样受体级联活化佐剂。将藉由经皮下、皮内、肌肉内、静脉内或腹膜内注射投与该疫苗。注射的频率及剂量取决于目标物种。易感受之物种系人类、犬、猫、兔、猪、牛、鱼、啮齿类动物及马。该疫苗接种法系预防性治疗，且可藉由母体接种来保护后代。接种疫苗的时间始于母体抗体消失后，及可能需要在4星期后及以后时间点追加接种疫苗。如此，在另一态样中，本发明系关于一种对抗梭菌诱发的腹泻之疫苗，其包含艰难梭菌的类毒素A和/或类毒素B，其中所述类毒素A和/或类毒素B系藉由自身催化裂解自毒素A和/或毒素B生成的，任选与医药上可接受的载体一起。在一些实施方案中，类毒素A 由公开数据库(EMBL，NCBI)中以登录号YP_001087137、ZP_05349827、或YP_003213641 保藏的序列的氨基酸Μ3-2710组成。在其它实施方案中，类毒素B由公开数据库(EMBL，NCBI) 中以登录号 YP_001087i;35、ZP_05349824、ZP_053^744、YP_003217086、或 ΥΡ_003213639 保藏的序列的氨基酸Μ44666或Μ5-2666组成。该疫苗可进一步包含佐剂。
实施例实施例1 制造艰难梭菌疫苗可自公开收集处获得艰难梭菌样品，例如美国标准菌种中心(ATCC)，Manassas， VA，USA，编号ATCC 9689、ATCC 43255。其生长于BHI培养基(脑心浸液，德国海德堡Becton Dickinson ；见美国医药协会(AmericanPharmaceutical Association), 1950,国家处方集 (The national formulary)，第 9 版，ΑΡΑ, Washington, D. C.)之发酵槽中，在 37°C厌氧条件下发酵3至4天。在稳定后期释放两种大型细胞毒素TcdA及TcdB。在该时间点，收获该培养物，在SOOOxg下离心10分钟，使该细菌沉降。取该上清液直接使用，或可藉由凝胶渗透层析(例如，在S300kphaCryl上)、亲和层析、阴离子交换层析及/或超滤来富集毒素。随后依终浓度1至50mmol/l添加还原剂二硫苏醣醇至该上清液或富集毒素的制剂，接着依终浓度10至lOOmmol/1添加螯合物形成剂乙二胺四乙酸。随后依终浓度1 μ mol/1与 10mmol/l之间，添加六磷酸肌醇(IP6)，例如10 μ mol/1或100 μ mol/1，且在37°C适宜的缓冲液中(如Tris-HCl)在pH 6. 5至8. 5培养该组合物2至M小时。可藉由十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及蛋白质染色法检测该裂解之完成性。随后将所得制剂制成其最终调配物，并用作认为恰当的疫苗。例如，其可直接使用，以水性环境用作医药上可接受的载体。亦可改变该环境，例如稀释、透析、超滤或进一步纯化步骤，如亲和层析。若适当，可加入佐剂。可考虑的佐剂系(例如)油包水性、水包油性、多相或非矿物油性乳液、基于铝之佐剂、聚合物佐剂如Carbopol 、角鲨烯、脂质体、微粒、免疫刺激复合物及Toll样受体级联活化佐剂。将藉由经皮下、皮内、肌肉内、静脉内或腹膜内注射投与该疫苗。注射的频率及剂量取决于目标物种。易感受物种系人类、犬、猫、 兔、猪、牛及马。该疫苗接种法系一种预防性治疗且可藉由母体接种保护后代。接种疫苗的时间始于母体抗体消失后，且可能需要在4星期后及以后时间点追加接种疫苗。实施例2 活性试验在含有例如5% FCS (胎牛血清)的例如Ham氏FlO培养基中接种CHO细胞(中国仓鼠卵巢，例如DSMACC110，德国Braunsctiweig市之德国微生物与细胞培养物收集公司 (Deutsche Sammlungvon Mikroorganismen und ZellkulturenGmbH))至 96 或 24 槽穴微板 (每槽穴100 μ 1)，在37°C潮湿环境下培养过夜直至其达到汇集。用不含二价离子，如镁或钙的Ringer氏溶液冲洗，随后添加100 μ 1 (96槽穴板)或400 μ 1 (24槽穴板)不含Mg及 Ca的Ringer氏溶液至该槽穴中。随后用移液管分别吸取100或400 μ 1实施例1之疫苗制剂，及各稀释液系列(ΙΟ—1至10_8)至槽穴，每个样本重复两次。用与疫苗制剂相同的方法处理BHI培养基作为阴性对照。用未处理的艰难梭菌上清液作为阳性对照。在37°C潮湿环境下培养该板3至M小时，随后用显微镜检查该等细胞。用疫苗制剂处理的细胞应显示无形态变化，与该等阴性对照一致。用未处理的培
7养上清液处理的细胞将显示细胞病变结果，其主要特征为变成圆形及发展为“星形细胞样” 的形态。如果该等疫苗处理的细胞显示类似于该阳性对照的细胞病变结果，则是酶裂解未完全，必须重复处理。实施例3 动物之疫苗接种可采用叙利亚金仓鼠作为艰难梭菌感染的标准化动物模型。在试验中使用60至 IOOg重的动物。该等动物藉由腹膜内或皮下注射获得不同浓度(1至100 μ g)的疫苗制剂。 该疫苗不含佐剂，或含有完全弗氏佐剂(与疫苗制剂1 1)或Ribi (单磷酰脂质A与二棒分枝酸海藻糖(trehalose dicorynomycolate)乳液)作为佐剂。用与疫苗相同方法处理的BHI培养基作为阴性对照。在最后一次接种疫苗2星期后，该等动物经腹膜内或口胃获得10至100mg/kg克林霉素(clindamycin)。M小时后，利用胃管或球形末端插管，分别对每只动物接种至少IO4个有活力之艰难梭菌病菌或100c. f. u (菌落形成单位)。透过腹泻或死亡率的临床监测决定该疫苗之保护效能。实施例4 动物之艰难梭菌疫苗接种在这些研究中，艰难梭菌的AB毒素通过利用它们的内在自身催化裂解功能来灭活并在动物中用作疫苗。为了生成毒素，将Iml艰难梭菌(参照株VPI10463，ATCC 43255)工作培养物转移入经预处理的且无菌的透析袋中，其中装有200ml 0.9%妝(1。将透析袋置入1.318!11培养基中并于37°C在厌氧室中温育5天。5天后将透析袋的内容物离心(5000rpm，4°C，15min) 并对上清液实施分级过硫酸铵沉淀。实施第一个沉淀步骤(毒素A)，即添加45% (NH)4SO4 并于4°C搅动3小时。此时之后，将溶液离心(5000rpm，4°C，30min)并进行第二个沉淀步骤 (毒素B)，即添加(NH) 4S04至终含量70 %。将第二级分于4°C搅动3小时并在此后再次离心 (5000rpm，4°C，30min)。将沉淀步骤得到的团粒悬浮在5ml 50mMTris/HCl pH 7. 5中。通过蔗糖密度梯度离心来进一步纯化自(NH)4SO4沉淀得到的两个级分(毒素A和B)。因此，制备蔗糖密度梯度，即在超速离心管中以渐增的次序加4. 5ml下述蔗糖溶液10%，18. 75%, 27. 50%，36. 25%和45%蔗糖，在50mM Tris/HCl pH 7.5中。将毒素级分加到顶部并将管于4°C以100. OOOg离心3. 5小时。以2ml等分试样收集所得梯度。用CH0-K1细胞通过细胞毒性测定法测量样品的毒素含量。因此，在含有10% FCS,0. 5% L-谷氨酰胺和0. 5%青霉素/链霉素的DMEM/F10培养基中培养CH0-K1细胞(ATCCCCL-61)。在96孔微量滴定板中制备细胞单层(约4000每孔)并于37°C和5% CO2温育M小时。温育时间后，制备含有毒素的样品的10倍稀释液。自细胞除去培养基后，添加毒素稀释液。对小时后用倒置显微镜以显微术检查细胞毒效应。使用下面的方案来评估细胞毒性阳性(+) :> 90%圆形细胞阴性(-)< 90%圆形细胞合并含有毒素的蔗糖密度梯度离心级分(毒素A和毒素B各自进行)，并用50mM Tris/HCl pH 7. 5进行1 2稀释。将样品(毒素A或毒素B)加载到离子交换柱上，并进行范围从含 50mM NaCl 的 50mM Tris/HCl pH 7. 5 至含 700mMNaCl 的 50mM Tris/HCl pH 7. 5 的 NaCl梯度(ΔNaCl 5mM/ml)以洗脱毒素。收集2ml的级分。用CH0-K1细胞通过细胞毒性测定法来测量样品的毒素含量。合并含有毒素的级分并通过超速离心步骤G°C，5000rpm，15min)来浓缩。为了获得毒素溶液，添加20%甘油并将样品保存于-20°C。还通过SDS-PAGE来监测纯化步骤。通过Coomassie染色来显现蛋白质。通过比较 SDS凝胶中毒素量与BSA标准品来测定最终毒素样品的浓度。比较通过光学调节(optical adjustment)及通过计算机分析来进行。制备疫苗制备物，即通过添加DTT和IP6来诱导毒素的自身催化裂解。毒素A裂解在H2O中以终体积50 μ 1通过添加3mM IP6和50mM DTT来实施。毒素B裂解在H2O中以终体积100 μ 1通过添加ImM IP6和150mM DTT来实施。自身裂解在旋转台上于37°C实施过夜。通过细胞毒性测定法和SDS PAGE分析来分析所得裂解产物。细胞毒性测定法用 CHO-Kl细胞和Caco细胞来实施，因为Caco细胞显示较高的针对毒素A的敏感性。Caco细胞在含有10% FCS和0. 5%青霉素/链霉素的MEM培养基中在96微量滴定孔上于37°C和 5% CO2培养48小时。细胞毒性测定法显示M小时后毒素A至少IO3倍和毒素B至少IO4 倍的细胞毒性降低。裂解效率用Coomassie染色的SDS PAGE分析来显现。用Sigma佐剂系统(用单磷酰基脂质A和合成二棒分枝酸海藻糖来水包油乳化) 制备含各灭活毒素(类毒素)的疫苗剂。通过比较SDS凝胶中的毒素量与BSA标准品来测定类毒素浓度。通过光学调节(optical adjustment)及通过计算机分析来进行比较。佐剂如制造商所述用PBS重建，并与各类毒素样品1 1混合。艰难梭菌感染的经典模型生物体是叙利亚仓鼠。叙利亚仓鼠对感染反应非常灵敏，而且形成与人的类似的临床体征和病理改变。如此，仓鼠感染模型是一种非常严格的模型，以受感染动物100%死亡结束。在试验中，加入时体重60_80g的叙利亚仓鼠购自Charles River, D-97633， Sulzfeld, Germany.动物在到达测试机构时随机化至各组并给予至少5天的充足适应期。 给动物接种疫苗3次，间隔2周。最后一次免疫接种后14天，用艰难梭菌实施感染。在艰难梭菌的口服攻击前M小时，给每只动物口服施用ang克林霉素。通过破坏肠道的正常菌群，抗生素克林霉素的施用使动物易患艰难梭菌感染。在攻击后的7天时段里，进行仔细的每日临床检查并记录临床发现。在研究期间的数个时间点采集血液样品并对血清分析抑制毒素A和毒素B对培养细胞的细胞毒性的抗体。因此，CH0-K1细胞以5000个细胞/孔在96孔板中在含有10% FCS,0. 5% L-谷氨酰胺和0. 5%青霉素/链霉素的DMEM/F10培养基中接种并于37°C和5% CO2温育过夜。在培养基中制备仓鼠血清的稀释液并与毒素A和B稀释液一起于37°C温育1小时。毒素稀释至 3小时和M小时后引起> 90%的细胞变圆的浓度。3小时和M小时后如前所述以显微术确定细胞变圆。中和滴度定义为完全抑制M小时后细胞变圆的最大血清稀释度的倒数值。该研究的目的是确定不同剂量的灭活毒素A和B组合的重复皮下免疫接种是否是生物相容的及针对艰难梭菌感染的保护是否能得到诱导。因此，使用了 12只雄性叙利亚仓鼠，它们在到达测试机构时被随机化至4个组。每个组由3只动物组成。各组在不同日子以渐增剂量接种疫苗以能够在疫苗接种后与潜在毒性效应反应。
权利要求
1.一种制造对抗产生AB毒素的细菌病原体之疫苗的方法，其包括(a)在产生该AB毒素的条件下培养该病原体，并收获该培养物；(b)于活体外使该AB毒素经酶裂解；及(c)将步骤(b)之组合物与医药上可接受的载体组合。
2.如权利要求1之方法，其中使用磷酸肌醇(较佳六磷酸肌醇)作为该酶裂解的辅助因子。
3.如权利要求1或2之方法，其中该等细胞系在收获后，自该培养基分离，且裂解该培养基中之AB毒素。
4.如权利要求1至3中任一项之方法，其中在裂解前自该收获物(较佳自该培养基) 纯化该AB毒素。
5.如权利要求1至4中任一项之方法，其中该病原体为梭菌(Clostridium)属，较佳为艰难梭菌(C. difficile)、索氏梭菌(C. sordellii)、肉毒梭菌(C. botulinum)、产气荚膜梭菌(C.perfrmgens)、破伤风梭菌(C. tetani)、或诺氏梭菌(C. novyi)，或为弧菌(Vibrio)属，较佳为霍乱弧菌(V. cholerae)、副溶血弧菌(V. parahaemolyticus)、 创伤弧菌(V. vulnificus)、灿烂弧菌(V. splendidus)、或鳗弧菌(V. anguillarum)， 或为致病杆菌(Xenorhabdus)属，较佳为嗜线虫致病杆菌(X. nematophila)、伯氏致病杆菌(X. bovienii)，或为耶尔森氏菌(Yersinia)属，较佳为假结核耶尔森氏菌(Y. pseudotuberculosis)、鼠疫耶尔森氏菌(Y. pestis)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Y. enterocolitica)、或莫氏耶尔森氏菌(Y. mollaretti)，或为博德特氏菌属(Bordetella)，较佳为百日咳博德特氏菌(B. pertussis)、副百日咳博德特氏菌 (B. parapertussis)、或支气管炎博德特氏菌(B. bronchiseptica)，或为放线杆菌属 (Actmobacillus)，较佳为胸膜肺炎放线杆菌(A. pleuropneumoniae)、或猪放线杆菌 (A. suis)及大肠杆菌(E. coli)。
6.如权利要求5之方法，其中该病原体为艰难梭菌，且在裂解前自毒素B纯化毒素A。
7.如权利要求1至6中任一项之方法，其中将佐剂添加至该组合物中。
8.利用如权利要求1至7中任一项之方法所制造之疫苗。
9.如权利要求8之疫苗，其包含艰难梭菌的类毒素A和/或类毒素B。
10.对抗梭菌诱发之腹泻的疫苗，其包含艰难梭菌的类毒素A和/或类毒素B，其中所述类毒素A和/或类毒素B系藉由自身催化裂解自毒素A和/或毒素B生成的，任选与医药上可接受的载体一起。
11.如前述权利要求任一项制造之疫苗用于接种包括人类之动物，以抵抗产生AB毒素之病原体的感染的用途。
12.对包括人类之动物接种对抗产生AB毒素之病原体之感染的疫苗的方法，包括对包括人类之动物投与有效量之根据权利要求1至7中任一项制造的疫苗。
全文摘要
本发明系关于一种制造对抗产生AB毒素之细菌病原体，如梭菌(Clostridium)之疫苗的方法，其包括(a)在产生该AB毒素的条件下培养该病原体，并收获该培养物，(b)于活体外使该AB毒素经酶裂解，较佳使用六磷酸肌醇作为辅助因子，及(c)将步骤(b)之组合物与医药上可接受的载体组合。
文档编号A61K39/08GK102238960SQ200980148516
公开日2011年11月9日 申请日期2009年12月1日 优先权日2008年12月3日
发明者杰西卡·赖内克 申请人:贝林格尔.英格海姆维特梅迪卡有限公司
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