完全人源性流感m2特异性抗体的制作方法
专利名称：完全人源性流感m2特异性抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及特异性结合流感Mk抗原的人源性抗体，优选涉及特异性结合流感 M2e抗原的完全人源性抗体。本发明还涉及这种抗体的独立轻链和/或重链，涉及编码所述抗体或它们的轻链和/或重链的核酸，以及涉及用于表达所述抗体的表达载体。此外，本发明涉及所述抗体在治疗和/或防止A型流感病毒感染中的应用，优选所述抗体在治疗和 /或防止人A型流感病毒感染中的应用。相关技术A型流感病毒仍然是人类疾病的主要病因，每年造成三至五百万例严重疾病，以及 250，000-500，000人死亡。可以获得的有效A型流感疫苗是通过诱导对抗血凝素(HA)的中和抗体而发挥作用的。因为HA由于突变(抗原漂移)而经历持续的变化，每年产生新的A 型流感抗原变体，这需要疫苗的持续更新。节段病毒基因组的偶然重配导致HA或神经氨酸酶(NA)从一种亚型被替换为其他亚型，该过程被称为抗原转换，这使有效的接种疫苗进一步复杂化。采用以HA为靶点的单克隆抗体(mAbs)的被动免疫非常有效，然而由于抗原转换和漂移，其与当前疫苗一样具有不足之处。因此，用于主动和被动免疫方案的理想靶点是保守的病毒蛋白。基质蛋白2(M2) 符合要求，并在过去数十年中作为对抗流感感染的有效靶点而受到相当多的关注(Zebedee SL, Lamb RA Influenza A virus M2 protein :monoclonal antibody restriction of virus growth and detection of M2 in virions. J Virol 1988,62:2762—2772)。M2 为四聚体离子通道，其参与内涵体中的病毒脱壳以及高尔基体反面网状结构中的病毒成熟。 在过去一百年中，至少部分是由于M2蛋白与基质蛋白I(Ml)共转录的事实，它的23个氨基酸细胞外结构域在人A型流感病毒分离株中保持高度保守。但是M2大量表达于感染细胞上，只有极少数M2分子存在于A型流感病毒膜。根据这些观察，表明M2特异性抗体保护是通过由ADCC除去感染的细胞，而不是通过经过病毒中和来防止感染(Jegerlehner A， Schmitz N,Storni T,Bachmann MF Influenza A vaccine based on the extracellular domain of M2 :weak protection mediated via antibody -dependent NK cell activity. J. Immunol. 2004，172 :5598-5605)。采用单克隆抗体的被动免疫与接种疫苗相比具有几个优势。具体地，它可以治疗对疫苗响应差的人，如老人、幼儿或免疫受损的个体。此外，被动免疫是在快速保护至关紧要的情况下，如用于暴露后治疗或用于急性暴露的预防所选择的治疗选项。已报道许多M2 细胞外结构域(Mk)-特异性mAbs在预防性环境中保护小鼠对抗致死攻击。这些mAbs包括源自转染色体小鼠的完全人源性抗体(Wang R et al. ,Antiviral Res. 2008,80 :168-177 ； W02006/061723A2 ；以及W003/078600A》，但至今没有报道过天然人源性M2e_特异性抗体。 然而为了应用于人类受试者，天然人源性抗体是首选的。与源自噬菌体展示或转染色体小鼠的人源化和完全人源性抗体形成相比，天然人源性抗体兼具免疫原性最小和可能的脱靶 (off-target)反应性和毒性最小的优势。此外，人源抗体具有经过亲和力成熟处理，获得高亲和力抗体的优势。
发明概述基于文库的筛选，完成对A型流感M2蛋白细胞外结构域显示出高亲和力的53个人源性scFv的鉴定、分离和克隆。从典型的scFv克隆中产生完全人源性单克隆IgGl抗体。人源性抗体，特别是完全人源性抗体是有利的，因为当向人类受试者给药时，它们显示出不太严重的副作用。不受任何理论限制，这是因为人源性抗体，特别是完全人源性抗体一般且优选不被人的免疫系统识别。已令人惊奇的发现，所选择的抗体克隆在它们的轻链可变区(LCVR)和它们的重链可变区(HCVR)中显示相同和/或高度相似的CDR序列的不同组合。基于CDR的特定组合，可以区分出不同类型的LCVR和HCVR(参见表1和幻。然而，所有克隆的LCVR和HCVR是高度相似的，正如可以从表1和2中提供的序列信息中推断出来的。因此，结论是本发明的抗体在克隆上是相关的。表3提供了 LCVR和HCVR类型的不同组合的概况，所述类型根据在所选择克隆中发现的它们的CDR来定义。该表还显示在53个克隆之间这些组合的每一种的丰度。进一步地，已令人惊奇地发现本发明的抗体对流感M2e 抗原显示出特别高的亲和力，特别是对A型流感M2蛋白的细胞外结构域显示出特别高的亲和力。已发现，抗体和RNAse-A型流感Mk抗原结合物之间的解离常数(Kd)低至皮摩尔级。 表位作图揭示被抗体克隆D005识别的最小表位包括于氨基酸序列LLTEVETP(SEQ ID NO 93)中。大部分已知的A型流感毒株的M2蛋白包括这种表位。因此，已发现本发明的抗体对源自A型流感病毒不同毒株的A型流感M2蛋白的细胞外结构域的不同变体显示相似的高亲和力。还证实本发明的抗体特异性结合至在其表面表达重组A型流感M2蛋白的细胞。 此外，发现本发明的抗体表现出优先结合至与细胞相连的A型流感M2蛋白。此外，已发现本发明的抗体在A型流感病毒颗粒环境中能够特异性结合A型流感M2蛋白。最重要地，已证实在用于A型流感病毒感染的小鼠模型中，本发明的抗体在治疗和/或防止A型流感病毒感染中非常有效。与本领域内已知的其他A型流感M2特异性人源性抗体不同，本发明的抗体在感染后第一日或第二日以单剂量给药时具有治疗活性。因此，在此公开的抗体在治疗中以及在预防性环境中作为对抗A型流感病毒感染的药物是有用的。表1 完全人源性M2特异性单克隆抗体的LCVR的⑶R。根据它们⑶R序列的组合， 可以区分出九种类型的LCVR(1A至;3B)。基于LC⑶R序列的相似性，可以区分3组LCVR IA 至 1E、2A 至 2B 及 3A 至!3B。
权利要求
1.一种分离的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体特异性结合流感Mk抗原，并且其中所述单克隆抗体为人源性单克隆抗体，优选完全人源性单克隆抗体，并且其中所述抗体包括至少一个抗原结合位点，其中所述抗原结合位点包括(a)一个LCVR，其中所述LCVR包括(i) 一个LC CDRl，其中所述LC CDRl由SEQ ID NO 1、2、3、4、5和6中任何一种表示的肽组成；(ii) 一个LC CDR2，其中所述LC CDR2由SEQ ID NO :7表示的肽组成；禾口 (iii) 一个LC CDR3，其中所述LC CDR3由SEQ ID NO 8、9、10禾口 11 中任何一种表示的肽组成；以及(b)一个HCVR，其中所述HCVR包括(i) 一个HC CDRl，其中所述HC CDRl由SEQ ID NO 12表示的肽组成；(ii) 一个HC CDR2，其中所述HC CDR2由SEQ ID NOs 13和14中任何一种表示的肽组成；和(iii) 一个HC CDR3，其中所述HC CDR3由SEQ ID NOs 15、16、17、 18和19中任何一种表示的肽组成。
2.权利要求1所述的单克隆抗体，其中所述至少一个抗原结合位点识别包含于氨基酸序列 LLTEVETP(SEQ ID NO 93)的表位。
3.前述权利要求中任一项所述的单克隆抗体，其中所述LC⑶Rl由SEQ ID NO 1、4和6中任何一种表示的肽组成， 所述LC CDR2由SEQ ID NO 7表示的肽组成， 所述LC CDR3由SEQ ID NO 8表示的肽组成， 所述HC CDRl由SEQ ID NO 12表示的肽组成， 所述HC⑶R2由SEQ ID NO 13表示的肽组成，以及所述HC CDR3由SEQ ID NO 15表示的肽组成。
4.前述权利要求中任一项所述的单克隆抗体，其中 所述LC CDRl由SEQ ID NO 1表示的肽组成， 所述LC CDR2由SEQ ID NO 7表示的肽组成， 所述LC CDR3由SEQ ID NO 8表示的肽组成， 所述HC CDRl由SEQ ID NO 12表示的肽组成， 所述HC⑶R2由SEQ ID NO 13表示的肽组成，以及所述HC CDR3由SEQ ID NO 15表示的肽组成。
5.前述权利要求中任一项所述的单克隆抗体，其中所述LCVR的位点5至113由SEQID NO 20、21和22中任何一种表示的肽组成，并且其中优选所述LCVR的位点1至4由SEQ ID N0:24表示的肽组成。
6.前述权利要求中任一项所述的单克隆抗体，其中所述HCVR的位点7至121由SEQID NO 23表示的肽组成，并且其中优选所述HCVR的位点1至6由SEQ ID NO 25表示的肽组成。
7.前述权利要求中任一项所述的单克隆抗体，其中所述LCVR的位点5至113由SEQ ID NO 20、21和22中任何一种表示的肽组成，并且其中所述HCVR的位点7至121由SEQ ID NO: 23表示的肽组成。
8.前述权利要求中任一项所述的单克隆抗体，其中所述LCVR的位点5至113由SEQID NO 20表示的肽组成，并且其中所述HCVR的位点7至121由SEQ ID NO 23表示的肽组成， 并且其中优选所述LCVR的位点1至4由SEQ ID NO 24表示的肽组成，并且其中进一步优选所述HCVR的位点1至6由SEQ ID NO 25表示的肽组成。
9.前述权利要求中任一项所述的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体为IgG，优选IgGl。
10.前述权利要求中任一项所述的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体包括至少一条轻链，并且其中所述单克隆抗体进一步包括至少一条重链，其中所述轻链包括以下氨基酸序列或优选由以下氨基酸序列组成SEQ ID NO 26、27和观中的任何一种，优选SEQ ID NO: 沈，并且其中所述重链包括以下氨基酸序列或优选由以下氨基酸序列组成SEQ ID N0:29。
11.前述权利要求中任一项所述的单克隆抗体，其中所述流感Mk抗原为A型流感M2 蛋白的细胞外结构域，并且其中优选所述流感似e抗原为SEQ ID NO 48至83及90至92 中任何一种表示的肽，并且其中进一步优选所述流感Mk抗原为SEQ ID NO 48表示的肽。
12.前述权利要求中任一项所述的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体和所述流感M2e 抗原的解离常数(Kd)最大为ΙΟΟηΜ，优选最大为ΙΟηΜ，更优选最大为6nM和最优选最大为 5nM，并且其中进一步优选所述流感Mk抗原为SEQ ID NO :48。
13.—种包括前述权利要求中任一项所述的单克隆抗体的药物组合物，其中优选所述药物组合物进一步包括药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
14.权利要求1至12中任一项所述的单克隆抗体或者权利要求13所述的药物组合物， 其用于治疗和/或预防A型流感病毒感染，优选人A型流感病毒感染的方法中。
15.权利要求1至12中任一项所述的单克隆抗体在制备用于治疗和/或预防A型流感病毒感染、优选人A型流感病毒感染的药物中的应用。
16.一种治疗和/或防止A型流感病毒感染的方法，所述方法包括向受试者给予有效量的权利要求1至12中任一项所述的单克隆抗体，或者有效量的权利要求13所述的药物组合物，其中优选所述受试者为人，并且其中进一步优选所述单克隆抗体为IgGl。
全文摘要
本发明涉及特异性结合流感M2e抗原的人源性抗体，优选完全人源性抗体。本发明还涉及这种抗体的独立的轻链和/或重链，编码所述抗体或它们的轻链和/或重链的核酸，以及用于表达所述抗体的表达载体。此外，本发明涉及所述抗体在治疗和/或防止A型流感病毒感染，优选人A型流感病毒感染中的应用。
文档编号A61K31/16GK102238963SQ200980148707
公开日2011年11月9日 申请日期2009年11月30日 优先权日2008年12月4日
发明者妮可·史密茨, 罗杰·贝利, 莫妮卡·鲍尔, 马丁·巴赫曼 申请人:英特塞尔股份公司
技术领域：
本发明涉及特异性结合流感Mk抗原的人源性抗体，优选涉及特异性结合流感 M2e抗原的完全人源性抗体。本发明还涉及这种抗体的独立轻链和/或重链，涉及编码所述抗体或它们的轻链和/或重链的核酸，以及涉及用于表达所述抗体的表达载体。此外，本发明涉及所述抗体在治疗和/或防止A型流感病毒感染中的应用，优选所述抗体在治疗和 /或防止人A型流感病毒感染中的应用。相关技术A型流感病毒仍然是人类疾病的主要病因，每年造成三至五百万例严重疾病，以及 250，000-500，000人死亡。可以获得的有效A型流感疫苗是通过诱导对抗血凝素(HA)的中和抗体而发挥作用的。因为HA由于突变(抗原漂移)而经历持续的变化，每年产生新的A 型流感抗原变体，这需要疫苗的持续更新。节段病毒基因组的偶然重配导致HA或神经氨酸酶(NA)从一种亚型被替换为其他亚型，该过程被称为抗原转换，这使有效的接种疫苗进一步复杂化。采用以HA为靶点的单克隆抗体(mAbs)的被动免疫非常有效，然而由于抗原转换和漂移，其与当前疫苗一样具有不足之处。因此，用于主动和被动免疫方案的理想靶点是保守的病毒蛋白。基质蛋白2(M2) 符合要求，并在过去数十年中作为对抗流感感染的有效靶点而受到相当多的关注(Zebedee SL, Lamb RA Influenza A virus M2 protein :monoclonal antibody restriction of virus growth and detection of M2 in virions. J Virol 1988,62:2762—2772)。M2 为四聚体离子通道，其参与内涵体中的病毒脱壳以及高尔基体反面网状结构中的病毒成熟。 在过去一百年中，至少部分是由于M2蛋白与基质蛋白I(Ml)共转录的事实，它的23个氨基酸细胞外结构域在人A型流感病毒分离株中保持高度保守。但是M2大量表达于感染细胞上，只有极少数M2分子存在于A型流感病毒膜。根据这些观察，表明M2特异性抗体保护是通过由ADCC除去感染的细胞，而不是通过经过病毒中和来防止感染(Jegerlehner A， Schmitz N,Storni T,Bachmann MF Influenza A vaccine based on the extracellular domain of M2 :weak protection mediated via antibody -dependent NK cell activity. J. Immunol. 2004，172 :5598-5605)。采用单克隆抗体的被动免疫与接种疫苗相比具有几个优势。具体地，它可以治疗对疫苗响应差的人，如老人、幼儿或免疫受损的个体。此外，被动免疫是在快速保护至关紧要的情况下，如用于暴露后治疗或用于急性暴露的预防所选择的治疗选项。已报道许多M2 细胞外结构域(Mk)-特异性mAbs在预防性环境中保护小鼠对抗致死攻击。这些mAbs包括源自转染色体小鼠的完全人源性抗体(Wang R et al. ,Antiviral Res. 2008,80 :168-177 ； W02006/061723A2 ；以及W003/078600A》，但至今没有报道过天然人源性M2e_特异性抗体。 然而为了应用于人类受试者，天然人源性抗体是首选的。与源自噬菌体展示或转染色体小鼠的人源化和完全人源性抗体形成相比，天然人源性抗体兼具免疫原性最小和可能的脱靶 (off-target)反应性和毒性最小的优势。此外，人源抗体具有经过亲和力成熟处理，获得高亲和力抗体的优势。
发明概述基于文库的筛选，完成对A型流感M2蛋白细胞外结构域显示出高亲和力的53个人源性scFv的鉴定、分离和克隆。从典型的scFv克隆中产生完全人源性单克隆IgGl抗体。人源性抗体，特别是完全人源性抗体是有利的，因为当向人类受试者给药时，它们显示出不太严重的副作用。不受任何理论限制，这是因为人源性抗体，特别是完全人源性抗体一般且优选不被人的免疫系统识别。已令人惊奇的发现，所选择的抗体克隆在它们的轻链可变区(LCVR)和它们的重链可变区(HCVR)中显示相同和/或高度相似的CDR序列的不同组合。基于CDR的特定组合，可以区分出不同类型的LCVR和HCVR(参见表1和幻。然而，所有克隆的LCVR和HCVR是高度相似的，正如可以从表1和2中提供的序列信息中推断出来的。因此，结论是本发明的抗体在克隆上是相关的。表3提供了 LCVR和HCVR类型的不同组合的概况，所述类型根据在所选择克隆中发现的它们的CDR来定义。该表还显示在53个克隆之间这些组合的每一种的丰度。进一步地，已令人惊奇地发现本发明的抗体对流感M2e 抗原显示出特别高的亲和力，特别是对A型流感M2蛋白的细胞外结构域显示出特别高的亲和力。已发现，抗体和RNAse-A型流感Mk抗原结合物之间的解离常数(Kd)低至皮摩尔级。 表位作图揭示被抗体克隆D005识别的最小表位包括于氨基酸序列LLTEVETP(SEQ ID NO 93)中。大部分已知的A型流感毒株的M2蛋白包括这种表位。因此，已发现本发明的抗体对源自A型流感病毒不同毒株的A型流感M2蛋白的细胞外结构域的不同变体显示相似的高亲和力。还证实本发明的抗体特异性结合至在其表面表达重组A型流感M2蛋白的细胞。 此外，发现本发明的抗体表现出优先结合至与细胞相连的A型流感M2蛋白。此外，已发现本发明的抗体在A型流感病毒颗粒环境中能够特异性结合A型流感M2蛋白。最重要地，已证实在用于A型流感病毒感染的小鼠模型中，本发明的抗体在治疗和/或防止A型流感病毒感染中非常有效。与本领域内已知的其他A型流感M2特异性人源性抗体不同，本发明的抗体在感染后第一日或第二日以单剂量给药时具有治疗活性。因此，在此公开的抗体在治疗中以及在预防性环境中作为对抗A型流感病毒感染的药物是有用的。表1 完全人源性M2特异性单克隆抗体的LCVR的⑶R。根据它们⑶R序列的组合， 可以区分出九种类型的LCVR(1A至;3B)。基于LC⑶R序列的相似性，可以区分3组LCVR IA 至 1E、2A 至 2B 及 3A 至!3B。
权利要求
1.一种分离的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体特异性结合流感Mk抗原，并且其中所述单克隆抗体为人源性单克隆抗体，优选完全人源性单克隆抗体，并且其中所述抗体包括至少一个抗原结合位点，其中所述抗原结合位点包括(a)一个LCVR，其中所述LCVR包括(i) 一个LC CDRl，其中所述LC CDRl由SEQ ID NO 1、2、3、4、5和6中任何一种表示的肽组成；(ii) 一个LC CDR2，其中所述LC CDR2由SEQ ID NO :7表示的肽组成；禾口 (iii) 一个LC CDR3，其中所述LC CDR3由SEQ ID NO 8、9、10禾口 11 中任何一种表示的肽组成；以及(b)一个HCVR，其中所述HCVR包括(i) 一个HC CDRl，其中所述HC CDRl由SEQ ID NO 12表示的肽组成；(ii) 一个HC CDR2，其中所述HC CDR2由SEQ ID NOs 13和14中任何一种表示的肽组成；和(iii) 一个HC CDR3，其中所述HC CDR3由SEQ ID NOs 15、16、17、 18和19中任何一种表示的肽组成。
2.权利要求1所述的单克隆抗体，其中所述至少一个抗原结合位点识别包含于氨基酸序列 LLTEVETP(SEQ ID NO 93)的表位。
3.前述权利要求中任一项所述的单克隆抗体，其中所述LC⑶Rl由SEQ ID NO 1、4和6中任何一种表示的肽组成， 所述LC CDR2由SEQ ID NO 7表示的肽组成， 所述LC CDR3由SEQ ID NO 8表示的肽组成， 所述HC CDRl由SEQ ID NO 12表示的肽组成， 所述HC⑶R2由SEQ ID NO 13表示的肽组成，以及所述HC CDR3由SEQ ID NO 15表示的肽组成。
4.前述权利要求中任一项所述的单克隆抗体，其中 所述LC CDRl由SEQ ID NO 1表示的肽组成， 所述LC CDR2由SEQ ID NO 7表示的肽组成， 所述LC CDR3由SEQ ID NO 8表示的肽组成， 所述HC CDRl由SEQ ID NO 12表示的肽组成， 所述HC⑶R2由SEQ ID NO 13表示的肽组成，以及所述HC CDR3由SEQ ID NO 15表示的肽组成。
5.前述权利要求中任一项所述的单克隆抗体，其中所述LCVR的位点5至113由SEQID NO 20、21和22中任何一种表示的肽组成，并且其中优选所述LCVR的位点1至4由SEQ ID N0:24表示的肽组成。
6.前述权利要求中任一项所述的单克隆抗体，其中所述HCVR的位点7至121由SEQID NO 23表示的肽组成，并且其中优选所述HCVR的位点1至6由SEQ ID NO 25表示的肽组成。
7.前述权利要求中任一项所述的单克隆抗体，其中所述LCVR的位点5至113由SEQ ID NO 20、21和22中任何一种表示的肽组成，并且其中所述HCVR的位点7至121由SEQ ID NO: 23表示的肽组成。
8.前述权利要求中任一项所述的单克隆抗体，其中所述LCVR的位点5至113由SEQID NO 20表示的肽组成，并且其中所述HCVR的位点7至121由SEQ ID NO 23表示的肽组成， 并且其中优选所述LCVR的位点1至4由SEQ ID NO 24表示的肽组成，并且其中进一步优选所述HCVR的位点1至6由SEQ ID NO 25表示的肽组成。
9.前述权利要求中任一项所述的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体为IgG，优选IgGl。
10.前述权利要求中任一项所述的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体包括至少一条轻链，并且其中所述单克隆抗体进一步包括至少一条重链，其中所述轻链包括以下氨基酸序列或优选由以下氨基酸序列组成SEQ ID NO 26、27和观中的任何一种，优选SEQ ID NO: 沈，并且其中所述重链包括以下氨基酸序列或优选由以下氨基酸序列组成SEQ ID N0:29。
11.前述权利要求中任一项所述的单克隆抗体，其中所述流感Mk抗原为A型流感M2 蛋白的细胞外结构域，并且其中优选所述流感似e抗原为SEQ ID NO 48至83及90至92 中任何一种表示的肽，并且其中进一步优选所述流感Mk抗原为SEQ ID NO 48表示的肽。
12.前述权利要求中任一项所述的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体和所述流感M2e 抗原的解离常数(Kd)最大为ΙΟΟηΜ，优选最大为ΙΟηΜ，更优选最大为6nM和最优选最大为 5nM，并且其中进一步优选所述流感Mk抗原为SEQ ID NO :48。
13.—种包括前述权利要求中任一项所述的单克隆抗体的药物组合物，其中优选所述药物组合物进一步包括药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
14.权利要求1至12中任一项所述的单克隆抗体或者权利要求13所述的药物组合物， 其用于治疗和/或预防A型流感病毒感染，优选人A型流感病毒感染的方法中。
15.权利要求1至12中任一项所述的单克隆抗体在制备用于治疗和/或预防A型流感病毒感染、优选人A型流感病毒感染的药物中的应用。
16.一种治疗和/或防止A型流感病毒感染的方法，所述方法包括向受试者给予有效量的权利要求1至12中任一项所述的单克隆抗体，或者有效量的权利要求13所述的药物组合物，其中优选所述受试者为人，并且其中进一步优选所述单克隆抗体为IgGl。
全文摘要
本发明涉及特异性结合流感M2e抗原的人源性抗体，优选完全人源性抗体。本发明还涉及这种抗体的独立的轻链和/或重链，编码所述抗体或它们的轻链和/或重链的核酸，以及用于表达所述抗体的表达载体。此外，本发明涉及所述抗体在治疗和/或防止A型流感病毒感染，优选人A型流感病毒感染中的应用。
文档编号A61K31/16GK102238963SQ200980148707
公开日2011年11月9日 申请日期2009年11月30日 优先权日2008年12月4日
发明者妮可·史密茨, 罗杰·贝利, 莫妮卡·鲍尔, 马丁·巴赫曼 申请人:英特塞尔股份公司
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