获得无赋形剂抗体溶液的方法
专利名称：获得无赋形剂抗体溶液的方法
获得无赋形剂抗体溶液的方法本发明涉及通过超滤-渗滤获得无赋形剂抗体溶液的方法。抗体分子，作为蛋白质药物类别的一部分，极易发生物理和化学降解，诸如变性和聚集、脱酰胺、氧化和水解。蛋白质稳定性受到该蛋白质自身特性(例如氨基酸序列)以及外部影响因素(诸如温度、溶剂PH、赋形剂、界面或剪切率)的影响。所以，限定最佳的配制条件以保护蛋白质免于在生产、贮存和施用过程中发生降解反应是重要的。(Manning, Μ. C.，K. Patel 等(1989)，“蛋白质药物的稳定性(Stability of protein pharmaceuticals)，，，Pharm Res 6(11) :903-18 ；Zheng, J. Y.禾口 L. J. Janis (2005)，"pH、 缓冲液种类和贮存温度对人源化单克隆抗体的理化稳定性的影响(Influence of pH， buffer species， and storage temperature on physicochemical stability of a humanized monoclonal antibody LA298)，，，Int J Pharm.)抗体经由皮下(s.c.)或肌内(i.m.)途径施用要求在最终制剂中具有高的蛋白质浓度，因为s. c.或i.m.途径经常需要高剂量以及有限的给药体积。(Siire， S. J.，Ζ. Shahrokh等(2004)，“研制蛋白质高浓缩物制剂的挑战(Challenges in the development of high protein concentration formulations)J Pharm Sci 93(6) 1390-402 ；Roskos, L. K.，C. G. Davis等(2004)，“治疗性单克隆抗体的临床药理学(The clinical pharmacology of therapeutic monoclonal antibodies)”， Drug Development Research 61(3) :108-120.)蛋白质高浓缩物的大规模生产可以通过超滤方法、干燥方法(诸如冷冻干燥或喷雾干燥)和沉淀方法实现。(Shire, S. J.，Ζ. Shahrokh等(2004)， “研制蛋白质高浓缩物制剂的挑战(Challenges in the development of high protein concentration formulations)，，，J Pharm Sci 93(6) :1390_402o )Andya等(美国专利6，267, 958、美国专利6，85，940)描述了一种稳定的抗体冻干制剂，将其用适当的稀释体积重构以达到需要的浓度。该制剂包含冻干保护剂、缓冲剂和表面活性剂。膜过滤是生命科学中广泛使用的一项技术，最常用于蛋白质的分离、纯化或浓缩。根据膜的类型，可以将其分为微滤(膜孔径大小为0.1-10 μ m)或超滤(膜孔径大小为0.001-0. 1 μ m)。超滤膜用于浓缩溶解的分子(蛋白质、肽类、核酸类、碳水化合物和其它生物分子)、脱盐或交换缓冲剂和粗分级(gross fractionation)。超滤膜截留大于膜孔径的分子，而可100%透过的较小的分子诸如盐、溶剂和水自由通过膜。有两种主要的膜过滤方法单通/死端/直流过滤PFF)，在该方法中待过滤的流体垂直地指向膜；错流/切向流过滤(TFF)，在该方法中流体以与膜表面呈切向的方向流动。TFF通过再循环截留物 (retentate)解决膜堵塞问题。在大分子浓缩中，膜富集想要的生物种类的含量。由外部手段产生的压力迫使液体通过半透膜。大于膜的标称截留分子量(MWCO)的溶质被截留。所需的压力可以通过使用压缩气体、泵抽、离心或毛细管作用产生。通过交替进行超滤和再稀释或者通过连续的超滤和稀释以保持恒定的体积从溶液中除去小分子形成渗滤方法。超滤对于除去或交换盐、糖、非水溶剂或快速改变离子和PH环境是理想的。一般来说，超滤装置包含进料溶液(feed solution)，该进料溶液含有大分子(例如抗体)、溶质(诸如缓冲剂成分、盐、氨基酸或糖)和溶剂(例如水)，经由外力(例如通过泵抽)使其通过超滤盒(ultrafiltration cassette)。进料流被分离成滤液流和截留物流。该滤液由溶剂和能够通过半透膜的所有溶质组成，并离开系统循环。大分子被截留在截留物流中，并回到进料槽(feed tank)中。在浓缩方法中，溶剂被不断地除去，并且大分子浓度增加，而能够通过膜的溶质的浓度保持不变。在渗滤方法中，通过向进料槽中加入渗滤缓冲液来补偿排出的滤液体积。渗滤缓冲液包含不同于初始进料溶液的溶质组分。大分子的浓度保持不变，而从初始进料组合物到渗滤缓冲液组合物，溶质组成在不断地变化。浓缩和渗滤这两种方法可以以不同的顺序结合起来。美国专利6，566，329描述了人生长激素冻干制剂的生产，其中使用脱盐柱作为中间方法步骤进行hGH脱盐得到不含盐和其它赋形剂的hGH纯水溶液。本项工作的范围为研制冻干制剂，其限制于最大浓度为70mg/mL的低溶解性的hGH，并且使用了脱盐柱。WO 99/55362教导了 IGF-I的喷雾干燥制剂。应用纯rhIGH_l作为其制备一个中间体。然而，使用透析盒进行缓冲液交换，并得到在水中的纯IGF-1，其表现出强混浊和沉淀，即强烈的不稳定信号，并且IGF-I在水中的溶解度与最大溶解度为2%ig/mL的含有赋形剂的制剂相比明显降低。Gokarn 等，J. Pharm. Sci. 2007 年 11 月 19 0,97(8) :3051-3066 显示了高浓度抗体制剂的自我缓冲能力，因此证明了从蛋白质制剂中排除缓冲剂成分的可能性。然而， 为确保所述抗体制剂的稳定性和等渗性，向无缓冲剂制剂中加入山梨醇是必要的。在 W02006/138181中，Gokarn等也描述了高浓度抗体制剂的自我缓冲能力，其中简述了使用分子排阻色谱法、透析和/或切向流过滤(超滤-渗滤)，但是，仅在抗衡离子的存在下，制备除去残留缓冲剂的无缓冲剂组合物的方法。本发明的目的是开发用于制备无赋形剂抗体溶液的方法，其不具有现有技术的缺点或者至少部分地避免了这些缺点。通过如独立权利要求所述的方法可以达到这一目的。将含有各种溶质(诸如缓冲盐、盐、氨基酸、糖或糖醇)的抗体溶液通过渗滤进行缓冲液对纯水的交换，导致仅由抗体和溶剂组成的溶液。任选地，可以在渗滤步骤之前和之后加入浓缩步骤。令人惊讶的是，所获得的抗体的无赋形剂蛋白质制剂在渗滤和浓缩过程中保持总体蛋白质稳定性。本发明的第一个方面涉及超滤和渗滤除抗体外含有至少一种溶质的抗体溶液的方法，该方法包括用溶剂渗滤抗体溶液并使所述的混合物与半透膜接触，以便使在抗体溶液中存在的且具有低于膜的截留分子量(MWCO)的分子量的至少一种溶质通过膜，同时截留抗体，从而获得仅含有抗体和溶剂的改良的抗体溶液。优选地，所述的溶剂为水，并且至少一种溶质选自缓冲盐、盐、氨基酸、糖和糖醇。用于本发明的抗体的实例为免疫球蛋白分子，例如IgG分子。IgG的特征在于含有两条重链和两条轻链，并且这些分子包含两个抗原结合位点。所述的抗原结合位点包含由重链的部分(VH)和轻链的部分(VL)组成的“可变区”。通过VH域和VL域的并列(juxtaposition)形成抗原-结合位点。关于抗体分子或免疫球蛋白分子的一般信息也可参见常见的教科书，如Abkis “细胞和分子免疫学(Cellular and MolecularImmunology) ”，W. B. Sounders 公司 O003)。上文所述的超滤和渗滤除抗体外含有至少一种溶质的抗体溶液的方法优选致使产生抗体浓度为30-280mg/mL、更优选为80-200mg/mL的无赋形剂抗体溶液。上文所述的方法可以用来制备液体或干燥形式的最终产品。因此，本发明方法还包含将所述的仅含有抗体和溶剂的抗体溶液加工成冻干物、稳定的液体制剂和/或重构 (reconstituted)制剂的步骤。抗体优选是单克隆抗体，尤其优选是选自IgGl、IgG2或IgG4的单克隆抗体。本发明的第二个方面涉及通过本发明方法可获得的纯化的抗体溶液。优选地，所述的抗体为单克隆抗体，甚至更优选当所述的抗体为单克隆抗体时，其选自IgGl、IgG2或 IgG4。本发明的第三个方面涉及通过冻干上文所述的本发明的纯化的抗体溶液得到的冻干的抗体制剂。定义术语“无赋形剂抗体溶液”或“仅含有抗体和溶剂的抗体溶液”意指含有抗体的水溶液，其中小分子溶质仅以至多为检测限的浓度(例如至多到0. 02-0. OSmM的范围)存在。 也就是说，使用用于检测它们的标准分析技术，所述的含有抗体的水溶液基本上无任何超过特定检测限的小分子溶质。术语“截留物”意指含有截留的蛋白质的溶液。术语“进料”意指进入超滤盒的溶液。在通过半透膜期间，进料被分离成截留物和滤液。术语“滤液”意指通过膜的溶液，其含有没有被膜截留的溶剂和溶质。术语“渗滤”意指向产品中加入洗涤流体并用膜过滤装置过滤该产品，其导致产品中可过滤组分的浓度降低，即这些物质被洗脱出来，而产品中的不可过滤的组分不一定会被浓缩或者产品不一定会变粘稠。所用的洗涤流体为在产品之外的洗涤流体，诸如单独供给的水或溶剂。术语“膜超滤”意指使用半透膜按照分子大小、形状和/或电荷分离水溶液中的种类(species)的压力改变的、对流方法。本文所用的术语“抗体”与术语“抗体分子”同义，其在本发明中包括抗体分子，如完全免疫球蛋白分子，例如 IgMs, IgDs, IgEs, IgAs 或 IgGs (如 IgGl、IgG2、IgG2b、IgG3 或 IgG4)，和这些免疫球蛋白分子的部分，如Fab-片段、Fab，-片段、F(ab)2_片段、嵌合F(ab)2 或嵌合Fab’片段、嵌合Fab-片段或分离的VH-或CDR-区(所述的分离的VH-或CDR-区为例如被整合或设计进相应的“骨架区”)。相应地，术语“抗体”也包括免疫球蛋白的已知亚型和修饰体，如单链抗体或单链Fv片段(scAB/scFv)或双特异性抗体构建体，所述的亚型和修饰体的特征为包含至少一个如本文所定义的糖基化的VH区。这种亚型或修饰体的具体实例可以是VH-VL或VL-VH模板中的sc (单链)抗体，其中所述的VH包含本文所述的糖基化。也考虑例如在VH-VL-VH-VL、VL-VH-VH-VL, VH-VL-VL-VH模板中的双特异性scFvs。 术语“抗体”还包含双抗体(diabodies)和包含连接到至少一个抗原结合部分/肽的作为载体的抗体Fc域的分子，例如在WO 00/24782中所述的肽抗体。在本发明制剂中可以包含的抗体尤其是重组产生的抗体。这些抗体可以在哺乳动物细胞-培养系统例如在CHO细胞中产生。抗体分子可以通过下文所述的例如用于纯化特异性糖基化抗体亚型的色谱步骤和过滤步骤的序列进行进一步的纯化。本文所用的与根据本发明的制剂相关的术语“冻干物”表示由本身为本领域公知的冷冻-干燥法生产的制剂。通过冷冻然后在真空下升华除去溶剂(例如水)，并在升高的温度下脱附残留的水。在制药领域，冻干物通常具有大约0.1-5% (w/w)的残留水分，以粉末或物理上稳定的饼状物的形式存在。冻干物的特征在于加入重构介质后溶解。本文所用的与根据本发明的制剂相关的术语“重构制剂”表示冻干的并通过加入重构介质再溶解的制剂。重构介质包括但不限于注射用水(WFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、 氯化钠溶液(例如0.9% (w/v) NaCl)，葡萄糖溶液(例如5 %葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0. 01%聚山梨醇20)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)和其组合。本文所用的与根据本发明的制剂相关的术语“稳定的液体制剂”表示在生产、 贮存和应用过程中保持其物理和化学完整性的制剂。在Reubsaet, J. L.，J. H. Beijnen 等(1998)，“用于研究蛋白质和肽类降解-化学不稳定性的分析技术(Analytical techniq ues used to study the degradation of proteins and peptides :chemical instability) ”，J Pharm Biomed Anal 17(6-7) :955-78和Wang，W. (1999)，“液体蛋白质药物的不稳定性、稳定化和配制(Instability, stabilization, and formulation of liquid protein pharmaceuticals) 'Mnt J Pharm 185(2) :1四_88 中提供和综述了用来评价蛋白质稳定性的各种分析技术。稳定性可以通过在选定的气候条件下贮存选定的时间，通过应用物理应力(诸如以选定的振摇频率振摇选定的时间)或者通过在选定的速率和温度下反复冻融进行评价。本文所用的与根据本发明的制剂相关的术语“药学上可接受的”表示依从当前药物国际管理要求的制剂。药学上可接受的制剂含有通常公认用于预期应用途径和安全浓度范围的赋形剂。此外，其在生产、贮存和应用期间应提供足够的稳定性。而且，用于肠胃外应用途径的制剂应考虑对比人血液组成的等渗性和euhydric pH要求。无赋形剂抗体溶液的制备避免了在抗体溶液的生产和贮存过程中赋形剂诱导的不稳定性，并避免故意存在于处理溶液或制剂中的抗衡离子的使用。赋形剂通常在抗体制剂中作为添加剂使用，其也可能含有低水平的杂质，所述的杂质可能导致抗体分子的化学不稳定性反应。例如，蔗糖在蛋白质制剂中常用作稳定剂，据报道其含有低痕量的金属离子，所述的金属离子可能导致甲硫氨酸残基氧化(Rowe RC, Sheskey PJ, Owen SC, Q005)药物赋形剂手册(Handbook of Pharmaceutical Excipients)，第 5版APhA Publications)。 而且，赋形剂可能与加工设备的表面相接触，其导致浸出液的蓄积。例如，氯化钠在蛋白质制剂中也常用作等渗剂，据报道它的存在在较高的温度下当与不锈钢表面接触后会增加治疗性抗体的氧化(Lam 等，(1997) J. Pharm. Sci. 86(11) :1250-1255)。高度浓缩的无赋形剂抗体制剂的制备避免了不恰当的赋形剂组合物的制备。在低离子强度和蛋白质高浓度下的缓冲液交换导致透过超滤膜的缓冲离子分布不均。这种后果(所谓的Dorman效应)导致作为蛋白质浓度函数的缓冲剂浓度的改变和制剂pH的变化 (Stoner ^ (2004) J. Pharm. Sci. 93 (9) :2332-2342)。通过向无赋形剂抗体溶液中加入指定量的储备缓冲溶液，无赋形剂抗体溶液的制备可以用作制备更精确的抗体制剂的初始步马聚ο
而且，该方法确保在完成从原料药到最终药物产品的制备方法链期间在抗体制剂中使用相同的赋形剂质量。适当的膜过滤条件可以由技术人员确定。对于浓缩之前的使用注射用水的渗滤， 蛋白质溶液与渗滤溶液的比值应为至少2，更优选至少3或尤其优选5或10。对于根据本发明的渗滤和超滤，适当的滤液流速可以为l-lOOL/m !，优选l-SOL/m !，对于截留物，流速为2-60L/ma!，优选3-50L/ma!，尤其优选8-35L/ma!。膜优选是超滤膜；适当的截留分子量可以为Ι-lOOkD，优选5-100kD，尤其优选30-50kD。过滤可以在I-IOOpsi、优选10_90psi、 尤其优选15-70psi的跨膜压(TMP)下进行。
实施例实施例1通过外力(例如通过泵抽)使含有大分子(例如抗体)、溶质(诸如缓冲剂成分、 盐、氨基酸或糖)和溶剂(例如水)的进料溶液通过超滤盒。进料流被分离成滤液流和截留物流。滤液由溶剂和能够通过半透膜的所有溶质组成，并离开系统循环。大分子被截留在截留物流中并回到进料槽。在浓缩方法中，溶剂被不断地除去，并且大分子浓度增加，而能够通过膜的溶质的浓度保持不变。在渗滤方法中，通过向进料槽中加入渗滤缓冲液来补偿排出的滤液体积。渗滤缓冲液包含不同于初始进料溶液的溶质组分。大分子的浓度保持不变，而从初始进料组合物到渗滤缓冲液组合物，溶质组成在不断地变化。浓缩和渗滤这两种方法可以以不同的顺序结合起来。起始溶液由在20mM组氨酸缓冲液中浓度为大约50-60mg/mL的抗β淀粉样肽的 IgG(如PCT/EP2006/011914的实施例1中所述的抗体Α)组成。首先预浓缩抗体物质，然后渗滤，随后在无赋形剂抗体溶液中浓缩达到最终目标浓度。采用无其它赋形剂的注射用水 (WFI)进行渗滤。渗滤缓冲液与蛋白质溶液的比值为至少5。半透膜由再生纤维素组成，具有400cm2的膜面积和30kD MWCO0表5列出在根据本发明的方法期间得到的方法参数的概述。表1至表4列出用于表明方法之后和方法期间物质的完整性的物质参数诸如体积(L)、 蛋白质浓度(g/L)、蛋白质质量(g)、pH、在截留物中每克蛋白质的重量克分子渗透压浓度 (mOsm/g)、滤液中的重量克分子渗透压浓度(mOsm/kg)、收率(％ )、缓冲液浓度(mM)以及通过分子排阻色谱法测定的单体含量(％ )。在整个方法中由于除去了可渗透的溶质，截留物中每克蛋白质的重量克分子渗透压浓度显著降低了。使用分子排阻(SE)-HPLC方法测定缓冲剂浓度，并表明缓冲液赋形剂基本上被除去了，低于分析方法的限度。通过方法后滤液中重量克分子渗透压浓度值小于 5m0sm/kg也可以间接表明无赋形剂。表1超滤/渗滤(UFDF)运行(Run) 070813A，超滤之前和之后的制剂参数
权利要求
1.超滤和渗滤除抗体外含有至少一种溶质的抗体溶液的方法，该方法包括用溶剂渗滤该抗体溶液，并使所述的混合物与半透膜接触以便使抗体溶液中存在的且分子量低于膜截留分子量的至少一种溶质通过膜，同时截留抗体从而获得仅含有抗体和溶剂的抗体溶液。
2.如权利要求1中所述的方法，其中溶剂为水。
3.如前述权利要求中任意一项所述的方法，其中所述的仅含有抗体和溶剂的抗体溶液具有30-280mg/mL、优选50_200mg/mL的抗体浓度。
4.如前述权利要求中任意一项所述的方法，其还包括将所述的仅含有抗体和溶剂的抗体溶液加工成稳定的液体制剂的步骤。
5.如前述权利要求中任意一项所述的方法，其还包括将所述的仅含有抗体和溶剂的抗体溶液加工成冻干物或重构制剂的步骤。
6.如前述权利要求中任意一项所述的方法，其中至少一种溶质选自缓冲盐、盐、氨基酸、糖和糖醇。
7.如前述权利要求中任意一项所述的方法，其中半透膜是超滤膜，优选具有2-50kD的截留分子量。
8.如前述权利要求中任意一项所述的方法，其中抗体是单克隆抗体，优选选自IgGl、 IgG2 或 IgG4。
9.通过前述权利要求中任意一项所述的方法可获得的纯化的抗体溶液。
10.前述权利要求中任意一项所述的纯化的抗体溶液，其中抗体是单克隆抗体，优选选自 IgGl、IgG2 或 IgG4。
11.基本上如上文所述的方法和纯化的抗体，尤其参考上述实施例。
全文摘要
本发明涉及超滤和渗滤除抗体外含有至少一种溶质的抗体溶液的方法，该方法包括用溶剂渗滤抗体溶液，并使所述的混合物与半透膜接触以便使抗体溶液中存在的且分子量小于膜截留分子量的至少一种溶质通过膜，同时截留抗体以便获得仅含有抗体和溶剂的改良抗体溶液。
文档编号A61K39/395GK102245206SQ200980149229
公开日2011年11月16日 申请日期2009年12月3日 优先权日2008年12月9日
发明者H-C·马勒, R·米勒 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司
获得无赋形剂抗体溶液的方法本发明涉及通过超滤-渗滤获得无赋形剂抗体溶液的方法。抗体分子，作为蛋白质药物类别的一部分，极易发生物理和化学降解，诸如变性和聚集、脱酰胺、氧化和水解。蛋白质稳定性受到该蛋白质自身特性(例如氨基酸序列)以及外部影响因素(诸如温度、溶剂PH、赋形剂、界面或剪切率)的影响。所以，限定最佳的配制条件以保护蛋白质免于在生产、贮存和施用过程中发生降解反应是重要的。(Manning, Μ. C.，K. Patel 等(1989)，“蛋白质药物的稳定性(Stability of protein pharmaceuticals)，，，Pharm Res 6(11) :903-18 ；Zheng, J. Y.禾口 L. J. Janis (2005)，"pH、 缓冲液种类和贮存温度对人源化单克隆抗体的理化稳定性的影响(Influence of pH， buffer species， and storage temperature on physicochemical stability of a humanized monoclonal antibody LA298)，，，Int J Pharm.)抗体经由皮下(s.c.)或肌内(i.m.)途径施用要求在最终制剂中具有高的蛋白质浓度，因为s. c.或i.m.途径经常需要高剂量以及有限的给药体积。(Siire， S. J.，Ζ. Shahrokh等(2004)，“研制蛋白质高浓缩物制剂的挑战(Challenges in the development of high protein concentration formulations)J Pharm Sci 93(6) 1390-402 ；Roskos, L. K.，C. G. Davis等(2004)，“治疗性单克隆抗体的临床药理学(The clinical pharmacology of therapeutic monoclonal antibodies)”， Drug Development Research 61(3) :108-120.)蛋白质高浓缩物的大规模生产可以通过超滤方法、干燥方法(诸如冷冻干燥或喷雾干燥)和沉淀方法实现。(Shire, S. J.，Ζ. Shahrokh等(2004)， “研制蛋白质高浓缩物制剂的挑战(Challenges in the development of high protein concentration formulations)，，，J Pharm Sci 93(6) :1390_402o )Andya等(美国专利6，267, 958、美国专利6，85，940)描述了一种稳定的抗体冻干制剂，将其用适当的稀释体积重构以达到需要的浓度。该制剂包含冻干保护剂、缓冲剂和表面活性剂。膜过滤是生命科学中广泛使用的一项技术，最常用于蛋白质的分离、纯化或浓缩。根据膜的类型，可以将其分为微滤(膜孔径大小为0.1-10 μ m)或超滤(膜孔径大小为0.001-0. 1 μ m)。超滤膜用于浓缩溶解的分子(蛋白质、肽类、核酸类、碳水化合物和其它生物分子)、脱盐或交换缓冲剂和粗分级(gross fractionation)。超滤膜截留大于膜孔径的分子，而可100%透过的较小的分子诸如盐、溶剂和水自由通过膜。有两种主要的膜过滤方法单通/死端/直流过滤PFF)，在该方法中待过滤的流体垂直地指向膜；错流/切向流过滤(TFF)，在该方法中流体以与膜表面呈切向的方向流动。TFF通过再循环截留物 (retentate)解决膜堵塞问题。在大分子浓缩中，膜富集想要的生物种类的含量。由外部手段产生的压力迫使液体通过半透膜。大于膜的标称截留分子量(MWCO)的溶质被截留。所需的压力可以通过使用压缩气体、泵抽、离心或毛细管作用产生。通过交替进行超滤和再稀释或者通过连续的超滤和稀释以保持恒定的体积从溶液中除去小分子形成渗滤方法。超滤对于除去或交换盐、糖、非水溶剂或快速改变离子和PH环境是理想的。一般来说，超滤装置包含进料溶液(feed solution)，该进料溶液含有大分子(例如抗体)、溶质(诸如缓冲剂成分、盐、氨基酸或糖)和溶剂(例如水)，经由外力(例如通过泵抽)使其通过超滤盒(ultrafiltration cassette)。进料流被分离成滤液流和截留物流。该滤液由溶剂和能够通过半透膜的所有溶质组成，并离开系统循环。大分子被截留在截留物流中，并回到进料槽(feed tank)中。在浓缩方法中，溶剂被不断地除去，并且大分子浓度增加，而能够通过膜的溶质的浓度保持不变。在渗滤方法中，通过向进料槽中加入渗滤缓冲液来补偿排出的滤液体积。渗滤缓冲液包含不同于初始进料溶液的溶质组分。大分子的浓度保持不变，而从初始进料组合物到渗滤缓冲液组合物，溶质组成在不断地变化。浓缩和渗滤这两种方法可以以不同的顺序结合起来。美国专利6，566，329描述了人生长激素冻干制剂的生产，其中使用脱盐柱作为中间方法步骤进行hGH脱盐得到不含盐和其它赋形剂的hGH纯水溶液。本项工作的范围为研制冻干制剂，其限制于最大浓度为70mg/mL的低溶解性的hGH，并且使用了脱盐柱。WO 99/55362教导了 IGF-I的喷雾干燥制剂。应用纯rhIGH_l作为其制备一个中间体。然而，使用透析盒进行缓冲液交换，并得到在水中的纯IGF-1，其表现出强混浊和沉淀，即强烈的不稳定信号，并且IGF-I在水中的溶解度与最大溶解度为2%ig/mL的含有赋形剂的制剂相比明显降低。Gokarn 等，J. Pharm. Sci. 2007 年 11 月 19 0,97(8) :3051-3066 显示了高浓度抗体制剂的自我缓冲能力，因此证明了从蛋白质制剂中排除缓冲剂成分的可能性。然而， 为确保所述抗体制剂的稳定性和等渗性，向无缓冲剂制剂中加入山梨醇是必要的。在 W02006/138181中，Gokarn等也描述了高浓度抗体制剂的自我缓冲能力，其中简述了使用分子排阻色谱法、透析和/或切向流过滤(超滤-渗滤)，但是，仅在抗衡离子的存在下，制备除去残留缓冲剂的无缓冲剂组合物的方法。本发明的目的是开发用于制备无赋形剂抗体溶液的方法，其不具有现有技术的缺点或者至少部分地避免了这些缺点。通过如独立权利要求所述的方法可以达到这一目的。将含有各种溶质(诸如缓冲盐、盐、氨基酸、糖或糖醇)的抗体溶液通过渗滤进行缓冲液对纯水的交换，导致仅由抗体和溶剂组成的溶液。任选地，可以在渗滤步骤之前和之后加入浓缩步骤。令人惊讶的是，所获得的抗体的无赋形剂蛋白质制剂在渗滤和浓缩过程中保持总体蛋白质稳定性。本发明的第一个方面涉及超滤和渗滤除抗体外含有至少一种溶质的抗体溶液的方法，该方法包括用溶剂渗滤抗体溶液并使所述的混合物与半透膜接触，以便使在抗体溶液中存在的且具有低于膜的截留分子量(MWCO)的分子量的至少一种溶质通过膜，同时截留抗体，从而获得仅含有抗体和溶剂的改良的抗体溶液。优选地，所述的溶剂为水，并且至少一种溶质选自缓冲盐、盐、氨基酸、糖和糖醇。用于本发明的抗体的实例为免疫球蛋白分子，例如IgG分子。IgG的特征在于含有两条重链和两条轻链，并且这些分子包含两个抗原结合位点。所述的抗原结合位点包含由重链的部分(VH)和轻链的部分(VL)组成的“可变区”。通过VH域和VL域的并列(juxtaposition)形成抗原-结合位点。关于抗体分子或免疫球蛋白分子的一般信息也可参见常见的教科书，如Abkis “细胞和分子免疫学(Cellular and MolecularImmunology) ”，W. B. Sounders 公司 O003)。上文所述的超滤和渗滤除抗体外含有至少一种溶质的抗体溶液的方法优选致使产生抗体浓度为30-280mg/mL、更优选为80-200mg/mL的无赋形剂抗体溶液。上文所述的方法可以用来制备液体或干燥形式的最终产品。因此，本发明方法还包含将所述的仅含有抗体和溶剂的抗体溶液加工成冻干物、稳定的液体制剂和/或重构 (reconstituted)制剂的步骤。抗体优选是单克隆抗体，尤其优选是选自IgGl、IgG2或IgG4的单克隆抗体。本发明的第二个方面涉及通过本发明方法可获得的纯化的抗体溶液。优选地，所述的抗体为单克隆抗体，甚至更优选当所述的抗体为单克隆抗体时，其选自IgGl、IgG2或 IgG4。本发明的第三个方面涉及通过冻干上文所述的本发明的纯化的抗体溶液得到的冻干的抗体制剂。定义术语“无赋形剂抗体溶液”或“仅含有抗体和溶剂的抗体溶液”意指含有抗体的水溶液，其中小分子溶质仅以至多为检测限的浓度(例如至多到0. 02-0. OSmM的范围)存在。 也就是说，使用用于检测它们的标准分析技术，所述的含有抗体的水溶液基本上无任何超过特定检测限的小分子溶质。术语“截留物”意指含有截留的蛋白质的溶液。术语“进料”意指进入超滤盒的溶液。在通过半透膜期间，进料被分离成截留物和滤液。术语“滤液”意指通过膜的溶液，其含有没有被膜截留的溶剂和溶质。术语“渗滤”意指向产品中加入洗涤流体并用膜过滤装置过滤该产品，其导致产品中可过滤组分的浓度降低，即这些物质被洗脱出来，而产品中的不可过滤的组分不一定会被浓缩或者产品不一定会变粘稠。所用的洗涤流体为在产品之外的洗涤流体，诸如单独供给的水或溶剂。术语“膜超滤”意指使用半透膜按照分子大小、形状和/或电荷分离水溶液中的种类(species)的压力改变的、对流方法。本文所用的术语“抗体”与术语“抗体分子”同义，其在本发明中包括抗体分子，如完全免疫球蛋白分子，例如 IgMs, IgDs, IgEs, IgAs 或 IgGs (如 IgGl、IgG2、IgG2b、IgG3 或 IgG4)，和这些免疫球蛋白分子的部分，如Fab-片段、Fab，-片段、F(ab)2_片段、嵌合F(ab)2 或嵌合Fab’片段、嵌合Fab-片段或分离的VH-或CDR-区(所述的分离的VH-或CDR-区为例如被整合或设计进相应的“骨架区”)。相应地，术语“抗体”也包括免疫球蛋白的已知亚型和修饰体，如单链抗体或单链Fv片段(scAB/scFv)或双特异性抗体构建体，所述的亚型和修饰体的特征为包含至少一个如本文所定义的糖基化的VH区。这种亚型或修饰体的具体实例可以是VH-VL或VL-VH模板中的sc (单链)抗体，其中所述的VH包含本文所述的糖基化。也考虑例如在VH-VL-VH-VL、VL-VH-VH-VL, VH-VL-VL-VH模板中的双特异性scFvs。 术语“抗体”还包含双抗体(diabodies)和包含连接到至少一个抗原结合部分/肽的作为载体的抗体Fc域的分子，例如在WO 00/24782中所述的肽抗体。在本发明制剂中可以包含的抗体尤其是重组产生的抗体。这些抗体可以在哺乳动物细胞-培养系统例如在CHO细胞中产生。抗体分子可以通过下文所述的例如用于纯化特异性糖基化抗体亚型的色谱步骤和过滤步骤的序列进行进一步的纯化。本文所用的与根据本发明的制剂相关的术语“冻干物”表示由本身为本领域公知的冷冻-干燥法生产的制剂。通过冷冻然后在真空下升华除去溶剂(例如水)，并在升高的温度下脱附残留的水。在制药领域，冻干物通常具有大约0.1-5% (w/w)的残留水分，以粉末或物理上稳定的饼状物的形式存在。冻干物的特征在于加入重构介质后溶解。本文所用的与根据本发明的制剂相关的术语“重构制剂”表示冻干的并通过加入重构介质再溶解的制剂。重构介质包括但不限于注射用水(WFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、 氯化钠溶液(例如0.9% (w/v) NaCl)，葡萄糖溶液(例如5 %葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0. 01%聚山梨醇20)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)和其组合。本文所用的与根据本发明的制剂相关的术语“稳定的液体制剂”表示在生产、 贮存和应用过程中保持其物理和化学完整性的制剂。在Reubsaet, J. L.，J. H. Beijnen 等(1998)，“用于研究蛋白质和肽类降解-化学不稳定性的分析技术(Analytical techniq ues used to study the degradation of proteins and peptides :chemical instability) ”，J Pharm Biomed Anal 17(6-7) :955-78和Wang，W. (1999)，“液体蛋白质药物的不稳定性、稳定化和配制(Instability, stabilization, and formulation of liquid protein pharmaceuticals) 'Mnt J Pharm 185(2) :1四_88 中提供和综述了用来评价蛋白质稳定性的各种分析技术。稳定性可以通过在选定的气候条件下贮存选定的时间，通过应用物理应力(诸如以选定的振摇频率振摇选定的时间)或者通过在选定的速率和温度下反复冻融进行评价。本文所用的与根据本发明的制剂相关的术语“药学上可接受的”表示依从当前药物国际管理要求的制剂。药学上可接受的制剂含有通常公认用于预期应用途径和安全浓度范围的赋形剂。此外，其在生产、贮存和应用期间应提供足够的稳定性。而且，用于肠胃外应用途径的制剂应考虑对比人血液组成的等渗性和euhydric pH要求。无赋形剂抗体溶液的制备避免了在抗体溶液的生产和贮存过程中赋形剂诱导的不稳定性，并避免故意存在于处理溶液或制剂中的抗衡离子的使用。赋形剂通常在抗体制剂中作为添加剂使用，其也可能含有低水平的杂质，所述的杂质可能导致抗体分子的化学不稳定性反应。例如，蔗糖在蛋白质制剂中常用作稳定剂，据报道其含有低痕量的金属离子，所述的金属离子可能导致甲硫氨酸残基氧化(Rowe RC, Sheskey PJ, Owen SC, Q005)药物赋形剂手册(Handbook of Pharmaceutical Excipients)，第 5版APhA Publications)。 而且，赋形剂可能与加工设备的表面相接触，其导致浸出液的蓄积。例如，氯化钠在蛋白质制剂中也常用作等渗剂，据报道它的存在在较高的温度下当与不锈钢表面接触后会增加治疗性抗体的氧化(Lam 等，(1997) J. Pharm. Sci. 86(11) :1250-1255)。高度浓缩的无赋形剂抗体制剂的制备避免了不恰当的赋形剂组合物的制备。在低离子强度和蛋白质高浓度下的缓冲液交换导致透过超滤膜的缓冲离子分布不均。这种后果(所谓的Dorman效应)导致作为蛋白质浓度函数的缓冲剂浓度的改变和制剂pH的变化 (Stoner ^ (2004) J. Pharm. Sci. 93 (9) :2332-2342)。通过向无赋形剂抗体溶液中加入指定量的储备缓冲溶液，无赋形剂抗体溶液的制备可以用作制备更精确的抗体制剂的初始步马聚ο
而且，该方法确保在完成从原料药到最终药物产品的制备方法链期间在抗体制剂中使用相同的赋形剂质量。适当的膜过滤条件可以由技术人员确定。对于浓缩之前的使用注射用水的渗滤， 蛋白质溶液与渗滤溶液的比值应为至少2，更优选至少3或尤其优选5或10。对于根据本发明的渗滤和超滤，适当的滤液流速可以为l-lOOL/m !，优选l-SOL/m !，对于截留物，流速为2-60L/ma!，优选3-50L/ma!，尤其优选8-35L/ma!。膜优选是超滤膜；适当的截留分子量可以为Ι-lOOkD，优选5-100kD，尤其优选30-50kD。过滤可以在I-IOOpsi、优选10_90psi、 尤其优选15-70psi的跨膜压(TMP)下进行。
实施例实施例1通过外力(例如通过泵抽)使含有大分子(例如抗体)、溶质(诸如缓冲剂成分、 盐、氨基酸或糖)和溶剂(例如水)的进料溶液通过超滤盒。进料流被分离成滤液流和截留物流。滤液由溶剂和能够通过半透膜的所有溶质组成，并离开系统循环。大分子被截留在截留物流中并回到进料槽。在浓缩方法中，溶剂被不断地除去，并且大分子浓度增加，而能够通过膜的溶质的浓度保持不变。在渗滤方法中，通过向进料槽中加入渗滤缓冲液来补偿排出的滤液体积。渗滤缓冲液包含不同于初始进料溶液的溶质组分。大分子的浓度保持不变，而从初始进料组合物到渗滤缓冲液组合物，溶质组成在不断地变化。浓缩和渗滤这两种方法可以以不同的顺序结合起来。起始溶液由在20mM组氨酸缓冲液中浓度为大约50-60mg/mL的抗β淀粉样肽的 IgG(如PCT/EP2006/011914的实施例1中所述的抗体Α)组成。首先预浓缩抗体物质，然后渗滤，随后在无赋形剂抗体溶液中浓缩达到最终目标浓度。采用无其它赋形剂的注射用水 (WFI)进行渗滤。渗滤缓冲液与蛋白质溶液的比值为至少5。半透膜由再生纤维素组成，具有400cm2的膜面积和30kD MWCO0表5列出在根据本发明的方法期间得到的方法参数的概述。表1至表4列出用于表明方法之后和方法期间物质的完整性的物质参数诸如体积(L)、 蛋白质浓度(g/L)、蛋白质质量(g)、pH、在截留物中每克蛋白质的重量克分子渗透压浓度 (mOsm/g)、滤液中的重量克分子渗透压浓度(mOsm/kg)、收率(％ )、缓冲液浓度(mM)以及通过分子排阻色谱法测定的单体含量(％ )。在整个方法中由于除去了可渗透的溶质，截留物中每克蛋白质的重量克分子渗透压浓度显著降低了。使用分子排阻(SE)-HPLC方法测定缓冲剂浓度，并表明缓冲液赋形剂基本上被除去了，低于分析方法的限度。通过方法后滤液中重量克分子渗透压浓度值小于 5m0sm/kg也可以间接表明无赋形剂。表1超滤/渗滤(UFDF)运行(Run) 070813A，超滤之前和之后的制剂参数
权利要求
1.超滤和渗滤除抗体外含有至少一种溶质的抗体溶液的方法，该方法包括用溶剂渗滤该抗体溶液，并使所述的混合物与半透膜接触以便使抗体溶液中存在的且分子量低于膜截留分子量的至少一种溶质通过膜，同时截留抗体从而获得仅含有抗体和溶剂的抗体溶液。
2.如权利要求1中所述的方法，其中溶剂为水。
3.如前述权利要求中任意一项所述的方法，其中所述的仅含有抗体和溶剂的抗体溶液具有30-280mg/mL、优选50_200mg/mL的抗体浓度。
4.如前述权利要求中任意一项所述的方法，其还包括将所述的仅含有抗体和溶剂的抗体溶液加工成稳定的液体制剂的步骤。
5.如前述权利要求中任意一项所述的方法，其还包括将所述的仅含有抗体和溶剂的抗体溶液加工成冻干物或重构制剂的步骤。
6.如前述权利要求中任意一项所述的方法，其中至少一种溶质选自缓冲盐、盐、氨基酸、糖和糖醇。
7.如前述权利要求中任意一项所述的方法，其中半透膜是超滤膜，优选具有2-50kD的截留分子量。
8.如前述权利要求中任意一项所述的方法，其中抗体是单克隆抗体，优选选自IgGl、 IgG2 或 IgG4。
9.通过前述权利要求中任意一项所述的方法可获得的纯化的抗体溶液。
10.前述权利要求中任意一项所述的纯化的抗体溶液，其中抗体是单克隆抗体，优选选自 IgGl、IgG2 或 IgG4。
11.基本上如上文所述的方法和纯化的抗体，尤其参考上述实施例。
全文摘要
本发明涉及超滤和渗滤除抗体外含有至少一种溶质的抗体溶液的方法，该方法包括用溶剂渗滤抗体溶液，并使所述的混合物与半透膜接触以便使抗体溶液中存在的且分子量小于膜截留分子量的至少一种溶质通过膜，同时截留抗体以便获得仅含有抗体和溶剂的改良抗体溶液。
文档编号A61K39/395GK102245206SQ200980149229
公开日2011年11月16日 申请日期2009年12月3日 优先权日2008年12月9日
发明者H-C·马勒, R·米勒 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司
最新回复(0)