检测结核杆菌的壳聚糖-纳米金酶免疫传感器及其应用的制作方法
专利名称：检测结核杆菌的壳聚糖-纳米金酶免疫传感器及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种牛奶样品中检测结核杆菌的方法，具体涉及一种针对结核杆菌进 行快速、准确的纳米结构的酶免疫传感器电化学检测的方法。
背景技术：
牛奶是人类主要蛋白质和其它营养素的重要来源，但是它们在生产、运输和加工 过程中易受到病原菌的污染，尤其是结核分枝杆菌。有研究发现分别从尼泊尔、西班牙和巴 西的市售牛奶、生牛奶、牛肺组织和某些起淋巴结组织中检测出牛型结核分枝杆菌等多种 分枝杆菌。参见 Vijay 等，J Vet Med Sci. ,69,819(2007) ；Guti6rre 等，Vet Herit.，29， 41(2006) ；Clarice 等，Mem InstOswaldo Cruz, Rio de Janeiro.，98，319 Q003)。还有文 献表明，一般的巴氏消毒和瞬间高温消毒不能彻底杀灭结核分枝杆菌。参见Cvetnic Z等， Int JTuberc Lung Dis.，11，652 Q007)。人类食用这些被结核杆菌污染的牛奶可导致肺外 结核，临床上的大部分肺外结核患者是因为食用或饮用被结核杆菌污染的牛奶或其它食物。近年来，由于耐药菌株的出现，结核病患者的临床治疗效果下降。所以，针对这类疾病 的预防除了接种疫苗外，更重要的是切断传染源，减少病原菌的接触机会，故必需加强结核 杆菌的检测，特别是加强对牛奶这类易被结核杆菌污染的食品的检测。这对于食品安全具 有非常重要的卫生学意义。传统检测结核杆菌菌的方法是涂片镜检和细菌培养。涂片镜检简单，但是检出率 很低；另外，虽然结核杆菌培养是结核杆菌检验的标准方法，但是由于结核杆菌生长缓慢， 生长一代需要10-20小时，所以细菌培养检测需要1-2个月，这种培养耗时、费力。随着分 子生物学技术的发展，目前用于结核杆菌检测的方法还有基因芯片技术、PCR技术等。虽然 这些方法提高了结核杆菌检测的灵敏度和准确度，而且检测时间缩短了，由原来的1-2个 月缩短到现在的数天或数小时。但是，这些方法需要一个纯培养样本，而且在测检过程要使 用到难保存的Taq聚合酶或其它DNA聚合酶，并且技术难度大，操作者需要经过专门培训， 大规模推广很困难。因此，急需开发灵敏度和准确度高、操作简单、能快速检测结核杆菌的 新方法。纳米结构的生物免疫传感器是近年发展起来的一门前沿性、交叉性的新兴技术。 传感技术与特异性免疫反应结合起来在检测蛋白质和核酸方面有着非常高的灵敏度。纳米 材料的引入使得传感技术的灵敏度进一步提高。生物传感器将生物样品固定在电极表面， 将生物的相互作用转化为电信号达到检测生物活动的目的。壳聚糖作为一种多聚体，有很 好的成膜特性，对水高通透性，无毒性和生物相容性，是很好的固定抗体、酶等蛋白在电极 表面的材料。纳米金掺入到修饰电极表面的成膜材料中，不但有利于电子通过起到提高灵 敏度的作用，还有助于保持电极表面蛋白质的生物活性而延长电极的保存时间。
发明内容
本发明的任务是提供一种检测结核杆菌的壳聚糖-纳米金酶免疫传感器，使其具有快速、简单、准确检测结核杆菌的特点，以克服现有结核杆菌检测方法需时太长、准确型 低、操作步骤繁琐的不足。实现本发明的技术方案是本发明提供的这种检测结核杆菌的壳聚糖-纳米金酶免疫传感器，由玻碳电极、 位于该玻碳电极表面的碱性磷酸酶标记的羊抗鼠-壳聚糖-纳米金修饰膜和固定在该修饰 膜表面的结核杆菌单克隆鼠抗体构成。本发明提供的检测结核杆菌的壳聚糖-纳米金酶免疫传感器的制备方法，包括以 下步骤步骤一取玻碳电极(Φ = 3mm)用0. 3 μ m、0. 05 μ m的氧化铝粉抛光成镜面，超声 波清洗3min后三蒸水冲洗，在piranha溶液(30% H2A H2SO4 = 3 7)中浸泡lOmin，然 后分别用三蒸水和乙醇超声波清洗三次；步骤二 将经抛光清洁处理过的玻碳电极插入0. lmg/mL碱性磷酸酶标记的羊抗 鼠抗体(羊抗鼠IgG-ALP)、0. 5%壳聚糖溶液和0. SnM纳米金(粒径15nm)混合溶液中，于 三电极系统下给予电压恒压+3. OV下电沉积修饰5分钟，电极取出后分别用2mL的高纯水 冲洗三次，即制得碱性磷酸酶标记的羊抗鼠-壳聚糖-纳米金膜修饰的玻碳电极(羊抗鼠 IgG-ALP/Ch/Au/GC)；步骤三将步骤二制得的碱性磷酸酶标记的羊抗鼠-壳聚糖-纳米金膜修饰的玻 碳电极插入含有0. lmg/mL的结核杆菌单克隆鼠抗体磷酸缓冲溶液中，于4°C浸泡10小时， 取出后用2mLPH为7. 4浓度为0. OlM磷酸盐缓冲液冲洗电极表面三次，即得到本发明提供 的检测结核杆菌的壳聚糖-纳米金酶免疫传感器(TB鼠抗/羊抗鼠IgG-ALP/Ch/Au/GC)， 4°C储存备用。应用本发明提供的检测结核杆菌的壳聚糖-纳米金酶免疫传感器检测牛奶中结 核杆菌的方法包括以下步骤步骤一按以下步骤(a)或(b)对待检测牛奶样本进行前处理(a)取IOml待检测牛奶样品1900g离心20min，弃上清液，加入PH为7. 4浓度为 0. OlM的PBS液5ml混勻，1900g离心IOmin,弃上清液，往沉淀物中加入0. 5mlPBS,混勻备； 或(b)对牛奶样本进行增菌培养，具体步骤为10ml牛奶样品1900g离心20min，弃 上清液，加入IOml Middledbrook7H9培养液，37°C，厌氧件条件下培养1_2天。然后1900g 离心20min,弃上清液，加入PH为7. 4浓度为0. OlM的PBS液5ml，混勻，1900g离心IOmin, 弃上清液，往沉淀物中加入0. 5mlPBS，混勻备用；步骤二 按权利要求2所述方法制备本发明提供的检测结核杆菌的壳聚糖-纳米 金酶免疫传感器；步骤三标准结核杆菌液的制备选用具有免疫原性减毒活牛分支杆菌制备而来 的卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin, BCG)经 Middledbrook7H9 培养液，37°C，厌氧条件 下培养，充分混勻以0.01M磷酸盐缓冲液PBS(pH = 7.4)为稀释液进行1 10的倍比稀释， 再接种于罗氏斜面培养基，计算出菌落数，调整PBS对Middledbr00k7H9培养液中BCG菌稀 释度，分别配制从IO2 IO7CfVmL之间不同浓度的结核杆菌BCG的PBS混悬液；步骤四测试本发明制备的检测结核杆菌的壳聚糖-纳米金酶免疫传感器(TB鼠抗/羊抗鼠IgG-ALP/Ch/Au/GC)的初始电流值I。；步骤五将本发明制备的检测结核杆菌的壳聚糖-纳米金酶免疫传感器(TB鼠抗 /羊抗鼠IgG-ALP/Ch/Au/GC)分别与前述步骤制备的不同浓度结核杆菌BCG的PBS悬浮液 和待测样品的PBS悬浮液在37°C培育30分钟；然后，测试孵育后的电极的电流值Ip ；步骤六用I0减去Ip获得电流改变差值Δ I，以不同浓度结核杆菌BCG的PBS悬 浮液与本发明制备的检测结核杆菌的壳聚糖-纳米金酶免疫传感器反应前和反应后引起 的电流值改变△ I绘制标准曲线，依标准曲线及待测样品的PBS悬浮液△ I即得出待测样 本中结核杆菌的浓度。以上步骤四所述的测试本发明制备的检测结核杆菌的壳聚糖-纳米金酶免疫传 感器(TB鼠抗/羊抗鼠IgG-ALP/Ch/Au/GC)的初始电流值Itj的具体方法是以本发明制备 的检测结核杆菌的壳聚糖-纳米金酶免疫传感器为工作电极、饱和甘汞电极为参比电极和 钼丝为辅助电极构成的三电极系统，5mM α -萘磷酸的PH为8的Tris-HCl缓冲液为测试工 作液，用差分脉冲法扫描测定电流，扫描条件为起始电压0V、终止电压0. 6V、幅度0. 05V ；记 录在+300mv左右产生的氧化峰，以此氧化峰的电流值为本发明制备的检测结核杆菌的壳 聚糖-纳米金酶免疫传感器的初始电流值I—以上步骤五所述的测试孵育后的电极的电流值Ip的具体方法是将孵育后的电极 在与上述相同的测试工作液和测试条件下，差分脉冲伏安法扫描，记录在+300mv左右产生 的氧化峰电流值IP。本发明用壳聚糖凝胶、纳米金溶液和碱性磷酸酶标记的羊抗鼠混合溶液经电化学 沉积的方法修饰玻碳电极表面而形成纳米结构的敏感膜，再利用抗原抗体特异性反应将结 核杆菌单克隆鼠抗体固定在碱性磷酸酶标记的羊抗鼠-壳聚糖-纳米金膜修饰的玻碳电极 表面，制备成本发明用于检测结核杆菌的酶免疫传感器。通过差分脉冲伏安法测定修饰好 的电极TB鼠抗/羊抗鼠IgG-ALP/Ch/Au/GC与不同浓度结核杆菌悬浮液孵育反应前和后， 电极插入含碱性磷酸酶的底物萘磷酸的测试工作液中，电极表面纳米敏感膜中的碱性磷酸 酶即可催化底物α -萘磷酸，其产生的水解产物在差分脉冲伏安法扫描下氧化峰电流改变 量的大小与结核杆菌浓度相关，采用结核杆菌减毒株卡介苗(BCG)绘制标准曲线，从而可 实现对被测物样品中结核杆菌的快速、准确检测。整个检测过程可在1小时之内完成。本发明制备的壳聚糖-纳米金的酶免疫传感器制备方法简单，利用壳聚糖作为载 体承载酶标抗体来固定结核杆菌抗体保持了抗体的生物活性；结核杆菌单克隆抗体特异性 的识别结核杆菌保证了检测的特异性；电极修饰过程中纳米金的掺入增强了保持抗体活性 的持久性，并且在电化学方法的检测中纳米金有利于电子的传导而获得很高的灵敏度。该方法结合了免疫反应的高特异性、快速的特点和纳米结构敏感膜对电信号放大 作用(即高敏感性)，简化了检测步骤、缩短了检测时间、提高了方法的敏感度。与抗酸染色 法相比，本法结合了纳米结构膜的高敏感性和结核杆菌抗体的高特异性，可以提高检测方 法的敏感性以及减小假阳性现象；本法不需要对待测牛奶样品进行特殊处理，极大的缩短 了检测的时间，与聚合酶链反应(PCR)等方法相比，操作更简单、步骤更少、耗时更省，检测 快速、准确。
图1为壳聚糖-纳米金的酶免疫电极的修饰过程和对结核杆菌的识别的原理示意 图。图2为壳聚糖-纳米金-酶免疫电极TB鼠抗/羊抗鼠IgG-ALP/Ch/Au/GC分别与 不同浓度的结核杆菌BCG 37°C培育30min后在含有5mM α -萘磷酸的为PH为8的Tris-HCl 缓冲液工作液中的差分脉冲伏安法图0cfu/mL(曲线a)、103Cfu/mL(曲线b)、5X 103cfu/ mL(曲线 c)、104cfu/mL(曲线 d)、5X 104cfu/mL(曲线 d)、105cfu/mL(曲线 f)。嵌入图为壳 聚糖-纳米金-酶免疫电极对结核杆菌BCG不同浓度响应值的对数校正曲线。
具体实施例方式实施例1利用壳聚糖-纳米金-酶免疫传感器来快速、准确的检测牛奶中结核杆菌1、牛奶样本前处理研究本法对牛奶样本勿需特殊处理，操作简单，IOml牛奶样品1，900g离心20min，弃上 清液，加入PH为7. 4浓度为0. OlM的PBS液5ml混勻，1，900g离心lOmin，弃上清液，往沉 淀物中加入0. 5mlPBS，混勻备用即可。如为提高检出率，可对牛奶样本进行增菌培养，具体步骤为10ml牛奶样品 1，900g离心20min，弃上清液，加入IOml Middledbrook7H9培养液，37°C，厌氧件条件下培 养1-2天。然后，1，900g离心20min，弃上清液，加入PH为7. 4浓度为0. OlM的PBS液5ml， 混勻，1，900g离心lOmin，弃上清液，往沉淀物中加入0. 5mlPBS，混勻备用。2、壳聚糖-纳米金的酶免疫电极的制备(1)玻碳电极的预处理玻碳电极(Φ = 3mm)在修饰前经O. 3 μ m、0. 05 μ m的氧 化铝粉抛光成镜面，超声波清洗3min后三蒸水冲洗，在piranha溶液(30% H2O2 H2SO4 = 3 7)中浸泡lOmin，然后分别用三蒸水和乙醇超声波清洗三次。(2)制备碱性磷酸酶标记的羊抗鼠-壳聚糖-纳米金膜修饰的玻碳电极(羊抗鼠 IgG-ALP/Ch/Au/GC)将处理好清洁的玻碳电极插入5mL含0. 2mg/mL羊抗鼠IgG-ALPjP 0.8nM纳米金(粒径15nm)的0. 5%壳聚糖溶液中。以该电极为工作电极、饱和甘汞电极为 参比电极和钼丝电极为辅助电极构成的三电极系统下，利用电化学工作站的恒压法给予电 压+3. OV下电沉积修饰5分钟，此步修饰好后的玻碳电极为羊抗鼠IgG-ALP/Ch/Au/GC，取出 后用2ml高纯水冲洗3次。(3)固定结核杆菌单克隆鼠抗体在碱性磷酸酶标记的羊抗鼠-壳聚糖-纳米金膜 修饰的电极上(TB鼠抗/羊抗鼠IgG-ALP/Ch/Au/GC)将5uL浓度为0. lmg/mL的结核杆 菌单克隆鼠抗体溶液(用PH为7.4浓度为0. OlM磷酸盐缓冲液稀释)滴加于电极羊抗鼠 IgG-ALP/Ch/Au/GC表面，置37°C湿盒lh，取出后用2mLPH为7. 4浓度为0. OlM磷酸盐缓冲 液冲洗3次，以冲掉结合不稳定的抗体，4°C储存备用。3、标准结核杆菌液的制备选用具有免疫原性减毒活牛分支杆菌制备而来的卡介苗 (BaciIlusCalmette-Guerin, BCG)经 Middledbrook7H9 培养液，37°C，厌氧条件下培养，充 分混勻以0. OlM磷酸盐缓冲液PBS (pH = 7. 4)为稀释液进行1 10的倍比稀释，再接种于罗氏斜面培养基，计算出菌落数。调整PBS对Middledbr00k7H9培养液中BCG菌稀释度，分 别配制从IO2 107Cfu/mL之间不同浓度的结核杆菌BCG的PBS混悬液。4、测试方法(1)测试壳聚糖-纳米金的酶免疫电极(TB鼠抗/羊抗鼠IgG-ALP/Ch/Au/GC)初 始电流值I。以TB鼠抗/羊抗鼠IgG-ALP/Ch/Au/GC为工作电极、饱和甘汞电极为参比电极 和钼丝为辅助电极构成的三电极系统，5mM α -萘磷酸的PH为8的Tris-HCl缓冲液为测试 工作液，用差分脉冲法扫描测定电流，扫描条件为起始电压0V、终止电压0. 6V、幅度0. 05V。 TB鼠抗/羊抗鼠IgG-ALP/Ch/Au/GC上的碱性磷酸酶(ALP)可以催化测试工作液中的α -萘 磷酸产生的水解产物在+300mv左右产生氧化峰，记录下此氧化峰的电流为测定结核杆菌 前的初始电流值I—(2) TB鼠抗/羊抗鼠IgG-ALP/Ch/Au/GC对结核杆菌的识别利用以结核杆菌细胞 壁抗原为免疫原的结核杆菌抗体对结核杆菌具有高特异性的识别能力这一特性，将TB鼠 抗/羊抗鼠IgG-ALP/Ch/Au/GC分别与不同浓度结核杆菌BCG的PBS悬浮液和待测样品的 PBS悬浮液在37°C培育30分钟，孵育后的电极为TB/TB鼠抗/羊抗鼠IgG-ALP/Ch/Au/GC。(3)测试壳聚糖-纳米金的酶免疫电极与结核杆菌孵育后TB/TB鼠抗/羊抗鼠 IgG-ALP/Ch/Au/GC的电流值Ip :TB/TB鼠抗/羊抗鼠IgG-ALP/Ch/Au/GC在上述测试工作液 和测试条件下，差分脉冲伏安法扫描测得Ip值。由于结核杆菌即与结核杆菌抗体结合，使 得电极表面膜的厚度增加，阻碍电子通过达到电极表面，电极纳米结构膜中的碱性磷酸酶 催化底物α -萘磷酸产生的水解产物在+300mv左右产生氧化峰电流减小。(4)计算壳聚糖-纳米金的酶免疫电极与结核杆菌反应前和后电流值的改变，并 绘制标准曲线获得待检样品结核杆菌浓度用Itj减去Ip获得电流改变差值ΔΙ，ΔΙ改变 的大小与结核杆菌浓度相关，由此以不同浓度的结核杆菌BCG与TB鼠抗/羊抗鼠IgG-ALP/ Ch/Au/GC反应前和后引起的电流值改变△ I绘制标准曲线，从而可计算得出待测样本中结 核杆菌的浓度。实施例2利用壳聚糖-纳米金-酶免疫传感器来快速、准确的检测混合细菌体系(同时含 有大肠杆菌和结核杆菌)中的结核杆菌1、含混合细菌的牛奶样本的制备取IOmL灭菌消毒处理过的牛奶样品，1，900g离 心20min，弃上清液，然后加入含浓度为103Cfu/mL结核杆菌和107cfu/mL大肠杆菌PH为 7. 4浓度为0. OlM的PBS悬浮液5mL混勻，1，900g离心lOmin，弃上清液，往沉淀物中加入 0. 5mlPBS，混勻备用即可。2、壳聚糖-纳米金的酶免疫电极的制备(1)玻碳电极的预处理玻碳电极(Φ = 3mm)在修饰前经O. 3 μ m、0. 05 μ m的氧 化铝粉抛光成镜面，超声波清洗3min后三蒸水冲洗，在piranha溶液(30% H2O2 H2SO4 = 3 7)中浸泡lOmin，然后分别用三蒸水和乙醇超声波清洗三次。(2)制备碱性磷酸酶标记的羊抗鼠-壳聚糖-纳米金膜修饰的玻碳电极(羊抗鼠 IgG-ALP/Ch/Au/GC)将处理好清洁的玻碳电极插入5mL含0. 2mg/mL羊抗鼠IgG-ALPjP 0.8nM纳米金(粒径15nm)的0. 5%壳聚糖溶液中。以该电极为工作电极、饱和甘汞电极为 参比电极和钼丝电极为辅助电极构成的三电极系统下，利用电化学工作站的恒压法给予电压+3. OV下电沉积修饰5分钟，此步修饰好后的玻碳电极为羊抗鼠IgG-ALP/Ch/Au/GC，取出 后用2ml高纯水冲洗3次。(3)固定结核杆菌单克隆鼠抗体在碱性磷酸酶标记的羊抗鼠-壳聚糖-纳米金膜 修饰的电极上(TB鼠抗/羊抗鼠IgG-ALP/Ch/Au/GC)将5uL浓度为0. lmg/mL的结核杆 菌单克隆鼠抗体溶液(用PH为7. 4浓度为0. OlM磷酸盐缓冲液稀释)滴加于电极羊抗鼠 IgG-ALP/Ch/Au/GC表面，置37°C湿盒lh，取出后用2mLPH为7. 4浓度为0. OlM磷酸盐缓冲 液冲洗3次，以冲掉结合不稳定的抗体，4°C储存备用。3、标准结核杆菌液的制备选用具有免疫原性减毒活牛分支杆菌制备而来的卡介苗 (BaciIlusCalmette-Guerin, BCG)经 Middledbrook7H9 培养液，37°C，厌氧条件下培养，充 分混勻以0. OlM磷酸盐缓冲液PBS (pH = 7. 4)为稀释液进行1 10的倍比稀释，再接种于 罗氏斜面培养基，计算出菌落数。调整PBS对Middledbr00k7H9培养液中BCG菌稀释度，分 别配制从IO2 IO7CfVmL之间不同浓度的菌液。4、测试方法(1)测试壳聚糖-纳米金的酶免疫电极(TB鼠抗/羊抗鼠IgG-ALP/Ch/Au/GC)初 始电流值I。以TB鼠抗/羊抗鼠IgG-ALP/Ch/Au/GC为工作电极、饱和甘汞电极为参比电极 和钼丝为辅助电极构成的三电极系统，5mM α -萘磷酸的PH为8的Tris-HCl缓冲液为测试 工作液，用差分脉冲法扫描测定电流，扫描条件为起始电压0V、终止电压0. 6V、幅度0. 05V。 TB鼠抗/羊抗鼠IgG-ALP/Ch/Au/GC上的碱性磷酸酶(ALP)可以催化测试工作液中的α -萘 磷酸产生的水解产物在+300mv左右产生氧化峰，记录下此氧化峰的电流为测定结核杆菌 前的初始电流值I—(2) TB鼠抗/羊抗鼠IgG-ALP/Ch/Au/GC对结核杆菌的识别利用以结核杆菌细胞 壁抗原为免疫原的结核杆菌抗体对结核杆菌具有高特异性的识别能力这一特性，将TB鼠 抗/羊抗鼠IgG-ALP/Ch/Au/GC分别与不同浓度结核杆菌BCG的PBS悬浮液和待测样品的 PBS悬浮液在37°C培育30分钟，孵育后的电极为TB/TB鼠抗/羊抗鼠IgG-ALP/Ch/Au/GC。(3)测试壳聚糖-纳米金的酶免疫电极与结核杆菌孵育后TB/TB鼠抗/羊抗鼠 IgG-ALP/Ch/Au/GC的电流值Ip :TB/TB鼠抗/羊抗鼠IgG-ALP/Ch/Au/GC在上述测试工作液 和测试条件下，差分脉冲伏安法扫描测得Ip值。由于结核杆菌即与结核杆菌抗体结合，使 得电极表面膜的厚度增加，阻碍电子通过达到电极表面，电极纳米结构膜中的碱性磷酸酶 催化底物α -萘磷酸产生的水解产物在+300mv左右产生氧化峰电流减小。(4)计算壳聚糖-纳米金的酶免疫电极与结核杆菌反应前和后电流值的改变，并 绘制标准曲线获得待检样品结核杆菌浓度用Itj减去Ip获得电流改变差值ΔΙ，ΔΙ改变 的大小与结核杆菌浓度相关，由此以不同浓度的结核杆菌BCG与TB鼠抗/羊抗鼠IgG-ALP/ Ch/Au/GC反应前和后引起的电流值改变△ I绘制标准曲线，从而可计算得出待测样本中结 核杆菌的浓度。结果表明在有大肠杆菌的干扰下，仍然可以准确的检出结核杆菌的浓度，说明此 方法对结核杆菌的识别是高特异的。
权利要求
1.一种检测结核杆菌的壳聚糖-纳米金酶免疫传感器，其特征在于，它由玻碳电极、位 于该玻碳电极表面的碱性磷酸酶标记的羊抗鼠-壳聚糖-纳米金修饰膜和固定在该修饰膜 表面的结核杆菌单克隆鼠抗体构成。
2.一种检测结核杆菌的壳聚糖-纳米金酶免疫传感器的制备方法，包括以下步骤步骤一取玻碳电极(Φ = 3mm)用0. 3 μ m、0. 05 μ m的氧化铝粉抛光成镜面，超声波清洗:3min后三蒸水冲洗，在piranha溶液(30% H2A H2SO4 = 3 7)中浸泡lOmin，然后分 别用三蒸水和乙醇超声波清洗三次；步骤二 将经抛光清洁处理过的玻碳电极插入0. lmg/mL碱性磷酸酶标记的羊抗鼠抗 体(羊抗鼠IgG-ALP)、0. 5%壳聚糖溶液和0. 8nM纳米金(粒径15nm)混合溶液中，于三电 极系统下给予电压恒压+3. OV下电沉积修饰5分钟，电极取出后分别用2mL的高纯水冲洗 三次，即制得碱性磷酸酶标记的羊抗鼠-壳聚糖-纳米金膜修饰的玻碳电极；步骤三将步骤二制得的碱性磷酸酶标记的羊抗鼠-壳聚糖-纳米金膜修饰的玻碳电 极插入含有0. lmg/mL的结核杆菌单克隆鼠抗体磷酸缓冲溶液中，于4°C浸泡10小时，取出 后用2mLPH为7. 4浓度为0. OlM磷酸盐缓冲液冲洗电极表面三次，即得到本发明提供的检 测结核杆菌的壳聚糖-纳米金酶免疫传感器，4°C储存备用。
3.—种检测牛奶中结核杆菌的方法，包括以下步骤步骤一按以下步骤(a)或(b)对待检测牛奶样本进行前处理(a)取IOml待检测牛奶样品1900g离心20min,弃上清液，加入PH为7.4浓度为0. OlM 的PBS液5ml混勻，1900g离心lOmin，弃上清液，往沉淀物中加入0. 5mlPBS,混勻备；(b)对牛奶样本进行增菌培养，具体步骤为10ml牛奶样品1900g离心20min，弃上清 液，加入IOml Middledbrook7H9培养液，37°C，厌氧件条件下培养1_2天。然后1900g离心 20min，弃上清液，加入PH为7. 4浓度为0. OlM的PBS液5ml，混勻，1900g离心IOmin,弃上 清液，往沉淀物中加入0. 5mlPBS，混勻备用；步骤二 按权利要求2所述方法制备本发明提供的检测结核杆菌的壳聚糖-纳米金酶 免疫传感器；步骤三标准结核杆菌液的制备选用具有免疫原性减毒活牛分支杆菌制备而来的卡 介苗，经Middledbr00k7H9培养液，37°C，厌氧条件下培养，充分混勻以0. OlM磷酸盐缓冲液 PBS为稀释液进行1 10的倍比稀释，再接种于罗氏斜面培养基，计算出菌落数，调整PBS 对Middledbrook7H9培养液中BCG菌稀释度，分别配制从IO2 107cfu/mL之间不同浓度的 结核杆菌BCG的PBS混悬液；步骤四测试本发明制备的检测结核杆菌的壳聚糖-纳米金酶免疫传感器的初始电流 值I0;步骤五将本发明制备的检测结核杆菌的壳聚糖-纳米金酶免疫传感器分别与前述步 骤制备的不同浓度结核杆菌BCG的PBS悬浮液和待测样品的PBS悬浮液在37°C培育30分 钟，然后，测试孵育后的电极的电流值Ip ；步骤六用Itj减去Ip获得电流改变差值Δ I，以不同浓度结核杆菌BCG的PBS悬浮液 与本发明制备的检测结核杆菌的壳聚糖-纳米金酶免疫传感器反应前和反应后引起的电 流值改变△ I绘制标准曲线，依标准曲线及待测样品的PBS悬浮液△ I即得出待测样本中 结核杆菌的浓度。
4.根据权利要求3所述的检测牛奶中结核杆菌的方法，其特征在于，步骤四所述的 测试本发明制备的检测结核杆菌的壳聚糖-纳米金酶免疫传感器的初始电流值Itj的具 体方法是以本发明制备的检测结核杆菌的壳聚糖-纳米金酶免疫传感器为工作电极、饱 和甘汞电极为参比电极和钼丝为辅助电极构成的三电极系统，5mMa-萘磷酸的PH为8的 Tris-HCl缓冲液为测试工作液，用差分脉冲法扫描测定电流，扫描条件为起始电压0V、终 止电压0. 6V、幅度0. 05V ；记录在+300mv左右产生的氧化峰，以此氧化峰的电流值为本发明 制备的检测结核杆菌的壳聚糖-纳米金酶免疫传感器的初始电流值、。
5.根据权利要求3所述的检测牛奶中结核杆菌的方法，其特征在于，步骤五所述的测 试孵育后的电极的电流值IP的具体方法是将孵育后的电极在权利要求4所述的测试工作 液和测试条件下，差分脉冲伏安法扫描，记录在+300mv左右产生的氧化峰电流值IP。
6.权利要求1所述的检测结核杆菌的壳聚糖-纳米金酶免疫传感器用于检测牛奶中的 结核杆菌。
全文摘要
本发明是一种基于壳聚糖和纳米金的酶免疫传感器，利用结核分支杆菌细胞壁的单克隆抗体能特异的结合结核杆菌，可用于快速检测牛奶中结核杆菌。其特点是用壳聚糖凝胶、纳米金溶液和碱性磷酸酶标记的羊抗鼠抗体混合溶液经电化学沉积法来修饰玻碳电极表面，再利用抗原抗体特异性反应将结核杆菌单克隆鼠抗体固定在碱性磷酸酶标记的羊抗鼠-壳聚糖-纳米金膜修饰的玻碳电极表面，制备用于检测结核杆菌的酶免疫传感器。通过差分脉冲伏安法测定修饰好的电极与结核杆菌孵育反应前后引起的电信号改变进行定量分析。该传感器制备方法简单，具有灵敏度高、检测时间短，操作简单等优点，是一种可快速检测结核杆菌的方法。
文档编号G01N33/535GK102087283SQ20091027309
公开日2011年6月8日 申请日期2009年12月8日 优先权日2009年12月8日
发明者夏纬, 徐顺清, 李媛媛, 许冰 申请人:华中科技大学
技术领域：
本发明涉及一种牛奶样品中检测结核杆菌的方法，具体涉及一种针对结核杆菌进 行快速、准确的纳米结构的酶免疫传感器电化学检测的方法。
背景技术：
牛奶是人类主要蛋白质和其它营养素的重要来源，但是它们在生产、运输和加工 过程中易受到病原菌的污染，尤其是结核分枝杆菌。有研究发现分别从尼泊尔、西班牙和巴 西的市售牛奶、生牛奶、牛肺组织和某些起淋巴结组织中检测出牛型结核分枝杆菌等多种 分枝杆菌。参见 Vijay 等，J Vet Med Sci. ,69,819(2007) ；Guti6rre 等，Vet Herit.，29， 41(2006) ；Clarice 等，Mem InstOswaldo Cruz, Rio de Janeiro.，98，319 Q003)。还有文 献表明，一般的巴氏消毒和瞬间高温消毒不能彻底杀灭结核分枝杆菌。参见Cvetnic Z等， Int JTuberc Lung Dis.，11，652 Q007)。人类食用这些被结核杆菌污染的牛奶可导致肺外 结核，临床上的大部分肺外结核患者是因为食用或饮用被结核杆菌污染的牛奶或其它食物。近年来，由于耐药菌株的出现，结核病患者的临床治疗效果下降。所以，针对这类疾病 的预防除了接种疫苗外，更重要的是切断传染源，减少病原菌的接触机会，故必需加强结核 杆菌的检测，特别是加强对牛奶这类易被结核杆菌污染的食品的检测。这对于食品安全具 有非常重要的卫生学意义。传统检测结核杆菌菌的方法是涂片镜检和细菌培养。涂片镜检简单，但是检出率 很低；另外，虽然结核杆菌培养是结核杆菌检验的标准方法，但是由于结核杆菌生长缓慢， 生长一代需要10-20小时，所以细菌培养检测需要1-2个月，这种培养耗时、费力。随着分 子生物学技术的发展，目前用于结核杆菌检测的方法还有基因芯片技术、PCR技术等。虽然 这些方法提高了结核杆菌检测的灵敏度和准确度，而且检测时间缩短了，由原来的1-2个 月缩短到现在的数天或数小时。但是，这些方法需要一个纯培养样本，而且在测检过程要使 用到难保存的Taq聚合酶或其它DNA聚合酶，并且技术难度大，操作者需要经过专门培训， 大规模推广很困难。因此，急需开发灵敏度和准确度高、操作简单、能快速检测结核杆菌的 新方法。纳米结构的生物免疫传感器是近年发展起来的一门前沿性、交叉性的新兴技术。 传感技术与特异性免疫反应结合起来在检测蛋白质和核酸方面有着非常高的灵敏度。纳米 材料的引入使得传感技术的灵敏度进一步提高。生物传感器将生物样品固定在电极表面， 将生物的相互作用转化为电信号达到检测生物活动的目的。壳聚糖作为一种多聚体，有很 好的成膜特性，对水高通透性，无毒性和生物相容性，是很好的固定抗体、酶等蛋白在电极 表面的材料。纳米金掺入到修饰电极表面的成膜材料中，不但有利于电子通过起到提高灵 敏度的作用，还有助于保持电极表面蛋白质的生物活性而延长电极的保存时间。
发明内容
本发明的任务是提供一种检测结核杆菌的壳聚糖-纳米金酶免疫传感器，使其具有快速、简单、准确检测结核杆菌的特点，以克服现有结核杆菌检测方法需时太长、准确型 低、操作步骤繁琐的不足。实现本发明的技术方案是本发明提供的这种检测结核杆菌的壳聚糖-纳米金酶免疫传感器，由玻碳电极、 位于该玻碳电极表面的碱性磷酸酶标记的羊抗鼠-壳聚糖-纳米金修饰膜和固定在该修饰 膜表面的结核杆菌单克隆鼠抗体构成。本发明提供的检测结核杆菌的壳聚糖-纳米金酶免疫传感器的制备方法，包括以 下步骤步骤一取玻碳电极(Φ = 3mm)用0. 3 μ m、0. 05 μ m的氧化铝粉抛光成镜面，超声 波清洗3min后三蒸水冲洗，在piranha溶液(30% H2A H2SO4 = 3 7)中浸泡lOmin，然 后分别用三蒸水和乙醇超声波清洗三次；步骤二 将经抛光清洁处理过的玻碳电极插入0. lmg/mL碱性磷酸酶标记的羊抗 鼠抗体(羊抗鼠IgG-ALP)、0. 5%壳聚糖溶液和0. SnM纳米金(粒径15nm)混合溶液中，于 三电极系统下给予电压恒压+3. OV下电沉积修饰5分钟，电极取出后分别用2mL的高纯水 冲洗三次，即制得碱性磷酸酶标记的羊抗鼠-壳聚糖-纳米金膜修饰的玻碳电极(羊抗鼠 IgG-ALP/Ch/Au/GC)；步骤三将步骤二制得的碱性磷酸酶标记的羊抗鼠-壳聚糖-纳米金膜修饰的玻 碳电极插入含有0. lmg/mL的结核杆菌单克隆鼠抗体磷酸缓冲溶液中，于4°C浸泡10小时， 取出后用2mLPH为7. 4浓度为0. OlM磷酸盐缓冲液冲洗电极表面三次，即得到本发明提供 的检测结核杆菌的壳聚糖-纳米金酶免疫传感器(TB鼠抗/羊抗鼠IgG-ALP/Ch/Au/GC)， 4°C储存备用。应用本发明提供的检测结核杆菌的壳聚糖-纳米金酶免疫传感器检测牛奶中结 核杆菌的方法包括以下步骤步骤一按以下步骤(a)或(b)对待检测牛奶样本进行前处理(a)取IOml待检测牛奶样品1900g离心20min，弃上清液，加入PH为7. 4浓度为 0. OlM的PBS液5ml混勻，1900g离心IOmin,弃上清液，往沉淀物中加入0. 5mlPBS,混勻备； 或(b)对牛奶样本进行增菌培养，具体步骤为10ml牛奶样品1900g离心20min，弃 上清液，加入IOml Middledbrook7H9培养液，37°C，厌氧件条件下培养1_2天。然后1900g 离心20min,弃上清液，加入PH为7. 4浓度为0. OlM的PBS液5ml，混勻，1900g离心IOmin, 弃上清液，往沉淀物中加入0. 5mlPBS，混勻备用；步骤二 按权利要求2所述方法制备本发明提供的检测结核杆菌的壳聚糖-纳米 金酶免疫传感器；步骤三标准结核杆菌液的制备选用具有免疫原性减毒活牛分支杆菌制备而来 的卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin, BCG)经 Middledbrook7H9 培养液，37°C，厌氧条件 下培养，充分混勻以0.01M磷酸盐缓冲液PBS(pH = 7.4)为稀释液进行1 10的倍比稀释， 再接种于罗氏斜面培养基，计算出菌落数，调整PBS对Middledbr00k7H9培养液中BCG菌稀 释度，分别配制从IO2 IO7CfVmL之间不同浓度的结核杆菌BCG的PBS混悬液；步骤四测试本发明制备的检测结核杆菌的壳聚糖-纳米金酶免疫传感器(TB鼠抗/羊抗鼠IgG-ALP/Ch/Au/GC)的初始电流值I。；步骤五将本发明制备的检测结核杆菌的壳聚糖-纳米金酶免疫传感器(TB鼠抗 /羊抗鼠IgG-ALP/Ch/Au/GC)分别与前述步骤制备的不同浓度结核杆菌BCG的PBS悬浮液 和待测样品的PBS悬浮液在37°C培育30分钟；然后，测试孵育后的电极的电流值Ip ；步骤六用I0减去Ip获得电流改变差值Δ I，以不同浓度结核杆菌BCG的PBS悬 浮液与本发明制备的检测结核杆菌的壳聚糖-纳米金酶免疫传感器反应前和反应后引起 的电流值改变△ I绘制标准曲线，依标准曲线及待测样品的PBS悬浮液△ I即得出待测样 本中结核杆菌的浓度。以上步骤四所述的测试本发明制备的检测结核杆菌的壳聚糖-纳米金酶免疫传 感器(TB鼠抗/羊抗鼠IgG-ALP/Ch/Au/GC)的初始电流值Itj的具体方法是以本发明制备 的检测结核杆菌的壳聚糖-纳米金酶免疫传感器为工作电极、饱和甘汞电极为参比电极和 钼丝为辅助电极构成的三电极系统，5mM α -萘磷酸的PH为8的Tris-HCl缓冲液为测试工 作液，用差分脉冲法扫描测定电流，扫描条件为起始电压0V、终止电压0. 6V、幅度0. 05V ；记 录在+300mv左右产生的氧化峰，以此氧化峰的电流值为本发明制备的检测结核杆菌的壳 聚糖-纳米金酶免疫传感器的初始电流值I—以上步骤五所述的测试孵育后的电极的电流值Ip的具体方法是将孵育后的电极 在与上述相同的测试工作液和测试条件下，差分脉冲伏安法扫描，记录在+300mv左右产生 的氧化峰电流值IP。本发明用壳聚糖凝胶、纳米金溶液和碱性磷酸酶标记的羊抗鼠混合溶液经电化学 沉积的方法修饰玻碳电极表面而形成纳米结构的敏感膜，再利用抗原抗体特异性反应将结 核杆菌单克隆鼠抗体固定在碱性磷酸酶标记的羊抗鼠-壳聚糖-纳米金膜修饰的玻碳电极 表面，制备成本发明用于检测结核杆菌的酶免疫传感器。通过差分脉冲伏安法测定修饰好 的电极TB鼠抗/羊抗鼠IgG-ALP/Ch/Au/GC与不同浓度结核杆菌悬浮液孵育反应前和后， 电极插入含碱性磷酸酶的底物萘磷酸的测试工作液中，电极表面纳米敏感膜中的碱性磷酸 酶即可催化底物α -萘磷酸，其产生的水解产物在差分脉冲伏安法扫描下氧化峰电流改变 量的大小与结核杆菌浓度相关，采用结核杆菌减毒株卡介苗(BCG)绘制标准曲线，从而可 实现对被测物样品中结核杆菌的快速、准确检测。整个检测过程可在1小时之内完成。本发明制备的壳聚糖-纳米金的酶免疫传感器制备方法简单，利用壳聚糖作为载 体承载酶标抗体来固定结核杆菌抗体保持了抗体的生物活性；结核杆菌单克隆抗体特异性 的识别结核杆菌保证了检测的特异性；电极修饰过程中纳米金的掺入增强了保持抗体活性 的持久性，并且在电化学方法的检测中纳米金有利于电子的传导而获得很高的灵敏度。该方法结合了免疫反应的高特异性、快速的特点和纳米结构敏感膜对电信号放大 作用(即高敏感性)，简化了检测步骤、缩短了检测时间、提高了方法的敏感度。与抗酸染色 法相比，本法结合了纳米结构膜的高敏感性和结核杆菌抗体的高特异性，可以提高检测方 法的敏感性以及减小假阳性现象；本法不需要对待测牛奶样品进行特殊处理，极大的缩短 了检测的时间，与聚合酶链反应(PCR)等方法相比，操作更简单、步骤更少、耗时更省，检测 快速、准确。
图1为壳聚糖-纳米金的酶免疫电极的修饰过程和对结核杆菌的识别的原理示意 图。图2为壳聚糖-纳米金-酶免疫电极TB鼠抗/羊抗鼠IgG-ALP/Ch/Au/GC分别与 不同浓度的结核杆菌BCG 37°C培育30min后在含有5mM α -萘磷酸的为PH为8的Tris-HCl 缓冲液工作液中的差分脉冲伏安法图0cfu/mL(曲线a)、103Cfu/mL(曲线b)、5X 103cfu/ mL(曲线 c)、104cfu/mL(曲线 d)、5X 104cfu/mL(曲线 d)、105cfu/mL(曲线 f)。嵌入图为壳 聚糖-纳米金-酶免疫电极对结核杆菌BCG不同浓度响应值的对数校正曲线。
具体实施例方式实施例1利用壳聚糖-纳米金-酶免疫传感器来快速、准确的检测牛奶中结核杆菌1、牛奶样本前处理研究本法对牛奶样本勿需特殊处理，操作简单，IOml牛奶样品1，900g离心20min，弃上 清液，加入PH为7. 4浓度为0. OlM的PBS液5ml混勻，1，900g离心lOmin，弃上清液，往沉 淀物中加入0. 5mlPBS，混勻备用即可。如为提高检出率，可对牛奶样本进行增菌培养，具体步骤为10ml牛奶样品 1，900g离心20min，弃上清液，加入IOml Middledbrook7H9培养液，37°C，厌氧件条件下培 养1-2天。然后，1，900g离心20min，弃上清液，加入PH为7. 4浓度为0. OlM的PBS液5ml， 混勻，1，900g离心lOmin，弃上清液，往沉淀物中加入0. 5mlPBS，混勻备用。2、壳聚糖-纳米金的酶免疫电极的制备(1)玻碳电极的预处理玻碳电极(Φ = 3mm)在修饰前经O. 3 μ m、0. 05 μ m的氧 化铝粉抛光成镜面，超声波清洗3min后三蒸水冲洗，在piranha溶液(30% H2O2 H2SO4 = 3 7)中浸泡lOmin，然后分别用三蒸水和乙醇超声波清洗三次。(2)制备碱性磷酸酶标记的羊抗鼠-壳聚糖-纳米金膜修饰的玻碳电极(羊抗鼠 IgG-ALP/Ch/Au/GC)将处理好清洁的玻碳电极插入5mL含0. 2mg/mL羊抗鼠IgG-ALPjP 0.8nM纳米金(粒径15nm)的0. 5%壳聚糖溶液中。以该电极为工作电极、饱和甘汞电极为 参比电极和钼丝电极为辅助电极构成的三电极系统下，利用电化学工作站的恒压法给予电 压+3. OV下电沉积修饰5分钟，此步修饰好后的玻碳电极为羊抗鼠IgG-ALP/Ch/Au/GC，取出 后用2ml高纯水冲洗3次。(3)固定结核杆菌单克隆鼠抗体在碱性磷酸酶标记的羊抗鼠-壳聚糖-纳米金膜 修饰的电极上(TB鼠抗/羊抗鼠IgG-ALP/Ch/Au/GC)将5uL浓度为0. lmg/mL的结核杆 菌单克隆鼠抗体溶液(用PH为7.4浓度为0. OlM磷酸盐缓冲液稀释)滴加于电极羊抗鼠 IgG-ALP/Ch/Au/GC表面，置37°C湿盒lh，取出后用2mLPH为7. 4浓度为0. OlM磷酸盐缓冲 液冲洗3次，以冲掉结合不稳定的抗体，4°C储存备用。3、标准结核杆菌液的制备选用具有免疫原性减毒活牛分支杆菌制备而来的卡介苗 (BaciIlusCalmette-Guerin, BCG)经 Middledbrook7H9 培养液，37°C，厌氧条件下培养，充 分混勻以0. OlM磷酸盐缓冲液PBS (pH = 7. 4)为稀释液进行1 10的倍比稀释，再接种于罗氏斜面培养基，计算出菌落数。调整PBS对Middledbr00k7H9培养液中BCG菌稀释度，分 别配制从IO2 107Cfu/mL之间不同浓度的结核杆菌BCG的PBS混悬液。4、测试方法(1)测试壳聚糖-纳米金的酶免疫电极(TB鼠抗/羊抗鼠IgG-ALP/Ch/Au/GC)初 始电流值I。以TB鼠抗/羊抗鼠IgG-ALP/Ch/Au/GC为工作电极、饱和甘汞电极为参比电极 和钼丝为辅助电极构成的三电极系统，5mM α -萘磷酸的PH为8的Tris-HCl缓冲液为测试 工作液，用差分脉冲法扫描测定电流，扫描条件为起始电压0V、终止电压0. 6V、幅度0. 05V。 TB鼠抗/羊抗鼠IgG-ALP/Ch/Au/GC上的碱性磷酸酶(ALP)可以催化测试工作液中的α -萘 磷酸产生的水解产物在+300mv左右产生氧化峰，记录下此氧化峰的电流为测定结核杆菌 前的初始电流值I—(2) TB鼠抗/羊抗鼠IgG-ALP/Ch/Au/GC对结核杆菌的识别利用以结核杆菌细胞 壁抗原为免疫原的结核杆菌抗体对结核杆菌具有高特异性的识别能力这一特性，将TB鼠 抗/羊抗鼠IgG-ALP/Ch/Au/GC分别与不同浓度结核杆菌BCG的PBS悬浮液和待测样品的 PBS悬浮液在37°C培育30分钟，孵育后的电极为TB/TB鼠抗/羊抗鼠IgG-ALP/Ch/Au/GC。(3)测试壳聚糖-纳米金的酶免疫电极与结核杆菌孵育后TB/TB鼠抗/羊抗鼠 IgG-ALP/Ch/Au/GC的电流值Ip :TB/TB鼠抗/羊抗鼠IgG-ALP/Ch/Au/GC在上述测试工作液 和测试条件下，差分脉冲伏安法扫描测得Ip值。由于结核杆菌即与结核杆菌抗体结合，使 得电极表面膜的厚度增加，阻碍电子通过达到电极表面，电极纳米结构膜中的碱性磷酸酶 催化底物α -萘磷酸产生的水解产物在+300mv左右产生氧化峰电流减小。(4)计算壳聚糖-纳米金的酶免疫电极与结核杆菌反应前和后电流值的改变，并 绘制标准曲线获得待检样品结核杆菌浓度用Itj减去Ip获得电流改变差值ΔΙ，ΔΙ改变 的大小与结核杆菌浓度相关，由此以不同浓度的结核杆菌BCG与TB鼠抗/羊抗鼠IgG-ALP/ Ch/Au/GC反应前和后引起的电流值改变△ I绘制标准曲线，从而可计算得出待测样本中结 核杆菌的浓度。实施例2利用壳聚糖-纳米金-酶免疫传感器来快速、准确的检测混合细菌体系(同时含 有大肠杆菌和结核杆菌)中的结核杆菌1、含混合细菌的牛奶样本的制备取IOmL灭菌消毒处理过的牛奶样品，1，900g离 心20min，弃上清液，然后加入含浓度为103Cfu/mL结核杆菌和107cfu/mL大肠杆菌PH为 7. 4浓度为0. OlM的PBS悬浮液5mL混勻，1，900g离心lOmin，弃上清液，往沉淀物中加入 0. 5mlPBS，混勻备用即可。2、壳聚糖-纳米金的酶免疫电极的制备(1)玻碳电极的预处理玻碳电极(Φ = 3mm)在修饰前经O. 3 μ m、0. 05 μ m的氧 化铝粉抛光成镜面，超声波清洗3min后三蒸水冲洗，在piranha溶液(30% H2O2 H2SO4 = 3 7)中浸泡lOmin，然后分别用三蒸水和乙醇超声波清洗三次。(2)制备碱性磷酸酶标记的羊抗鼠-壳聚糖-纳米金膜修饰的玻碳电极(羊抗鼠 IgG-ALP/Ch/Au/GC)将处理好清洁的玻碳电极插入5mL含0. 2mg/mL羊抗鼠IgG-ALPjP 0.8nM纳米金(粒径15nm)的0. 5%壳聚糖溶液中。以该电极为工作电极、饱和甘汞电极为 参比电极和钼丝电极为辅助电极构成的三电极系统下，利用电化学工作站的恒压法给予电压+3. OV下电沉积修饰5分钟，此步修饰好后的玻碳电极为羊抗鼠IgG-ALP/Ch/Au/GC，取出 后用2ml高纯水冲洗3次。(3)固定结核杆菌单克隆鼠抗体在碱性磷酸酶标记的羊抗鼠-壳聚糖-纳米金膜 修饰的电极上(TB鼠抗/羊抗鼠IgG-ALP/Ch/Au/GC)将5uL浓度为0. lmg/mL的结核杆 菌单克隆鼠抗体溶液(用PH为7. 4浓度为0. OlM磷酸盐缓冲液稀释)滴加于电极羊抗鼠 IgG-ALP/Ch/Au/GC表面，置37°C湿盒lh，取出后用2mLPH为7. 4浓度为0. OlM磷酸盐缓冲 液冲洗3次，以冲掉结合不稳定的抗体，4°C储存备用。3、标准结核杆菌液的制备选用具有免疫原性减毒活牛分支杆菌制备而来的卡介苗 (BaciIlusCalmette-Guerin, BCG)经 Middledbrook7H9 培养液，37°C，厌氧条件下培养，充 分混勻以0. OlM磷酸盐缓冲液PBS (pH = 7. 4)为稀释液进行1 10的倍比稀释，再接种于 罗氏斜面培养基，计算出菌落数。调整PBS对Middledbr00k7H9培养液中BCG菌稀释度，分 别配制从IO2 IO7CfVmL之间不同浓度的菌液。4、测试方法(1)测试壳聚糖-纳米金的酶免疫电极(TB鼠抗/羊抗鼠IgG-ALP/Ch/Au/GC)初 始电流值I。以TB鼠抗/羊抗鼠IgG-ALP/Ch/Au/GC为工作电极、饱和甘汞电极为参比电极 和钼丝为辅助电极构成的三电极系统，5mM α -萘磷酸的PH为8的Tris-HCl缓冲液为测试 工作液，用差分脉冲法扫描测定电流，扫描条件为起始电压0V、终止电压0. 6V、幅度0. 05V。 TB鼠抗/羊抗鼠IgG-ALP/Ch/Au/GC上的碱性磷酸酶(ALP)可以催化测试工作液中的α -萘 磷酸产生的水解产物在+300mv左右产生氧化峰，记录下此氧化峰的电流为测定结核杆菌 前的初始电流值I—(2) TB鼠抗/羊抗鼠IgG-ALP/Ch/Au/GC对结核杆菌的识别利用以结核杆菌细胞 壁抗原为免疫原的结核杆菌抗体对结核杆菌具有高特异性的识别能力这一特性，将TB鼠 抗/羊抗鼠IgG-ALP/Ch/Au/GC分别与不同浓度结核杆菌BCG的PBS悬浮液和待测样品的 PBS悬浮液在37°C培育30分钟，孵育后的电极为TB/TB鼠抗/羊抗鼠IgG-ALP/Ch/Au/GC。(3)测试壳聚糖-纳米金的酶免疫电极与结核杆菌孵育后TB/TB鼠抗/羊抗鼠 IgG-ALP/Ch/Au/GC的电流值Ip :TB/TB鼠抗/羊抗鼠IgG-ALP/Ch/Au/GC在上述测试工作液 和测试条件下，差分脉冲伏安法扫描测得Ip值。由于结核杆菌即与结核杆菌抗体结合，使 得电极表面膜的厚度增加，阻碍电子通过达到电极表面，电极纳米结构膜中的碱性磷酸酶 催化底物α -萘磷酸产生的水解产物在+300mv左右产生氧化峰电流减小。(4)计算壳聚糖-纳米金的酶免疫电极与结核杆菌反应前和后电流值的改变，并 绘制标准曲线获得待检样品结核杆菌浓度用Itj减去Ip获得电流改变差值ΔΙ，ΔΙ改变 的大小与结核杆菌浓度相关，由此以不同浓度的结核杆菌BCG与TB鼠抗/羊抗鼠IgG-ALP/ Ch/Au/GC反应前和后引起的电流值改变△ I绘制标准曲线，从而可计算得出待测样本中结 核杆菌的浓度。结果表明在有大肠杆菌的干扰下，仍然可以准确的检出结核杆菌的浓度，说明此 方法对结核杆菌的识别是高特异的。
权利要求
1.一种检测结核杆菌的壳聚糖-纳米金酶免疫传感器，其特征在于，它由玻碳电极、位 于该玻碳电极表面的碱性磷酸酶标记的羊抗鼠-壳聚糖-纳米金修饰膜和固定在该修饰膜 表面的结核杆菌单克隆鼠抗体构成。
2.一种检测结核杆菌的壳聚糖-纳米金酶免疫传感器的制备方法，包括以下步骤步骤一取玻碳电极(Φ = 3mm)用0. 3 μ m、0. 05 μ m的氧化铝粉抛光成镜面，超声波清洗:3min后三蒸水冲洗，在piranha溶液(30% H2A H2SO4 = 3 7)中浸泡lOmin，然后分 别用三蒸水和乙醇超声波清洗三次；步骤二 将经抛光清洁处理过的玻碳电极插入0. lmg/mL碱性磷酸酶标记的羊抗鼠抗 体(羊抗鼠IgG-ALP)、0. 5%壳聚糖溶液和0. 8nM纳米金(粒径15nm)混合溶液中，于三电 极系统下给予电压恒压+3. OV下电沉积修饰5分钟，电极取出后分别用2mL的高纯水冲洗 三次，即制得碱性磷酸酶标记的羊抗鼠-壳聚糖-纳米金膜修饰的玻碳电极；步骤三将步骤二制得的碱性磷酸酶标记的羊抗鼠-壳聚糖-纳米金膜修饰的玻碳电 极插入含有0. lmg/mL的结核杆菌单克隆鼠抗体磷酸缓冲溶液中，于4°C浸泡10小时，取出 后用2mLPH为7. 4浓度为0. OlM磷酸盐缓冲液冲洗电极表面三次，即得到本发明提供的检 测结核杆菌的壳聚糖-纳米金酶免疫传感器，4°C储存备用。
3.—种检测牛奶中结核杆菌的方法，包括以下步骤步骤一按以下步骤(a)或(b)对待检测牛奶样本进行前处理(a)取IOml待检测牛奶样品1900g离心20min,弃上清液，加入PH为7.4浓度为0. OlM 的PBS液5ml混勻，1900g离心lOmin，弃上清液，往沉淀物中加入0. 5mlPBS,混勻备；(b)对牛奶样本进行增菌培养，具体步骤为10ml牛奶样品1900g离心20min，弃上清 液，加入IOml Middledbrook7H9培养液，37°C，厌氧件条件下培养1_2天。然后1900g离心 20min，弃上清液，加入PH为7. 4浓度为0. OlM的PBS液5ml，混勻，1900g离心IOmin,弃上 清液，往沉淀物中加入0. 5mlPBS，混勻备用；步骤二 按权利要求2所述方法制备本发明提供的检测结核杆菌的壳聚糖-纳米金酶 免疫传感器；步骤三标准结核杆菌液的制备选用具有免疫原性减毒活牛分支杆菌制备而来的卡 介苗，经Middledbr00k7H9培养液，37°C，厌氧条件下培养，充分混勻以0. OlM磷酸盐缓冲液 PBS为稀释液进行1 10的倍比稀释，再接种于罗氏斜面培养基，计算出菌落数，调整PBS 对Middledbrook7H9培养液中BCG菌稀释度，分别配制从IO2 107cfu/mL之间不同浓度的 结核杆菌BCG的PBS混悬液；步骤四测试本发明制备的检测结核杆菌的壳聚糖-纳米金酶免疫传感器的初始电流 值I0;步骤五将本发明制备的检测结核杆菌的壳聚糖-纳米金酶免疫传感器分别与前述步 骤制备的不同浓度结核杆菌BCG的PBS悬浮液和待测样品的PBS悬浮液在37°C培育30分 钟，然后，测试孵育后的电极的电流值Ip ；步骤六用Itj减去Ip获得电流改变差值Δ I，以不同浓度结核杆菌BCG的PBS悬浮液 与本发明制备的检测结核杆菌的壳聚糖-纳米金酶免疫传感器反应前和反应后引起的电 流值改变△ I绘制标准曲线，依标准曲线及待测样品的PBS悬浮液△ I即得出待测样本中 结核杆菌的浓度。
4.根据权利要求3所述的检测牛奶中结核杆菌的方法，其特征在于，步骤四所述的 测试本发明制备的检测结核杆菌的壳聚糖-纳米金酶免疫传感器的初始电流值Itj的具 体方法是以本发明制备的检测结核杆菌的壳聚糖-纳米金酶免疫传感器为工作电极、饱 和甘汞电极为参比电极和钼丝为辅助电极构成的三电极系统，5mMa-萘磷酸的PH为8的 Tris-HCl缓冲液为测试工作液，用差分脉冲法扫描测定电流，扫描条件为起始电压0V、终 止电压0. 6V、幅度0. 05V ；记录在+300mv左右产生的氧化峰，以此氧化峰的电流值为本发明 制备的检测结核杆菌的壳聚糖-纳米金酶免疫传感器的初始电流值、。
5.根据权利要求3所述的检测牛奶中结核杆菌的方法，其特征在于，步骤五所述的测 试孵育后的电极的电流值IP的具体方法是将孵育后的电极在权利要求4所述的测试工作 液和测试条件下，差分脉冲伏安法扫描，记录在+300mv左右产生的氧化峰电流值IP。
6.权利要求1所述的检测结核杆菌的壳聚糖-纳米金酶免疫传感器用于检测牛奶中的 结核杆菌。
全文摘要
本发明是一种基于壳聚糖和纳米金的酶免疫传感器，利用结核分支杆菌细胞壁的单克隆抗体能特异的结合结核杆菌，可用于快速检测牛奶中结核杆菌。其特点是用壳聚糖凝胶、纳米金溶液和碱性磷酸酶标记的羊抗鼠抗体混合溶液经电化学沉积法来修饰玻碳电极表面，再利用抗原抗体特异性反应将结核杆菌单克隆鼠抗体固定在碱性磷酸酶标记的羊抗鼠-壳聚糖-纳米金膜修饰的玻碳电极表面，制备用于检测结核杆菌的酶免疫传感器。通过差分脉冲伏安法测定修饰好的电极与结核杆菌孵育反应前后引起的电信号改变进行定量分析。该传感器制备方法简单，具有灵敏度高、检测时间短，操作简单等优点，是一种可快速检测结核杆菌的方法。
文档编号G01N33/535GK102087283SQ20091027309
公开日2011年6月8日 申请日期2009年12月8日 优先权日2009年12月8日
发明者夏纬, 徐顺清, 李媛媛, 许冰 申请人:华中科技大学
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