一种快速检测有机磷降解菌降解率的分析方法
专利名称：一种快速检测有机磷降解菌降解率的分析方法
技术领域：
本发明涉及生物降解农药残留技术领域，具体地说是一种快速检测有机磷降解菌降解率的分析方法。
背景技术：
有机磷是广谱性杀虫剂，由于其高效广谱、价格低廉等优点，已在我国大规模使用。由于有机磷的残留造成环境、地下水的污染，也对食品安全造成严重危害，因而解决有 机磷残留尤其是生物降解有机磷已成为当前农残降解领域研究的热点之一。筛选高效降解菌株是微生物降解有机磷农药中最关键的一步。目前检测降解菌株 降解率的普遍方法是采用色谱法。该方法检测精确，但是需要预处理，操作过程较复杂，历 时较长。因而寻找一种快速、有效的检测方法也有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速检测有机磷降解菌降解率的分析方法。为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下检测有机磷降解菌降解率的分析方法将有机磷降解菌株以体积比5% -10%接 种量接种于有机磷_无机盐培养基中发酵培养，待发酵后离心取上清液，上清液即待测样 品溶液；每10毫升待测样品溶液中加入0. 2-0. 4mL指示剂二硝基酚，然后采用水定容到 50ml，而后向溶液中加入10%碳酸钠溶液或5%硫酸溶液，待溶液至呈微黄色再加入5mL钼 锑抗显色剂，摇勻，加水定容，在室温条件下，放置20-30min显色；待显色后在700nm进行比 色测定，从校准曲线上查得相应的含磷量，所得含磷量与机磷农药中总磷浓度得比即为机 磷降解菌降解率。所述有机磷-无机盐培养基的组成为MgS047H20 0. 20-0. 3g， (MM)2SO4O. 50-0. 6g，KH2PO4O. 50-0. 6g，NaCl 1. 0-1. 2g，K2HPO4L 50-1. 8g，有机磷为 100-500mg,加蒸馏水至1000ml，调pH至7. 0-7. 5。所述发酵培养条件为30-32°C，180-200r/ min,发酵24-48h。所述二硝基酚指示剂准确称取0. 2g 2,6- 二硝基酚溶于IOOmL水中； 0. 5%酒石酸锑钾溶液准确称取化学纯酒石酸锑钾0. 5g溶于IOOmL水中；硫酸钼锑贮备 液量取126mL浓硫酸，缓缓加入到400mL水中，不断搅拌，冷却。另称取经磨细的钼酸铵 IOg溶于300mL水中，冷却。然后将硫酸溶液缓缓倒入钼酸铵溶液中；再加入0. 5%酒石酸锑 钾溶液IOOmL,冷却后，加水稀释至IOOOmL,摇勻，贮于棕色试剂瓶中；钼锑抗显色剂准确称 取1. 5g左旋抗坏血酸溶于IOOmL钼锑贮备液中。所述校准曲线分别吸取5mg/L磷标准溶液 0、2、4、6、8mL，并分别加入与样品溶液等体积的空白溶液及二硝基酚指示剂、10%碳酸钠溶液 或5%硫酸溶液调节溶液至刚呈微黄色；加入钼锑抗显色剂摇勻，加水定容，即得含磷量分别 为0. 0,0. 2,0. 4,0. 6,0. 8mg/L的标准溶液系列；摇勻，于室温放置20_30min后，在波长700nm 处，测定其吸光度，以吸光度为纵坐标，磷浓度(mg/L)为横坐标，绘制校准曲线。
本发明所具有的优点1、利用本发明的分析方法，可用于生化样品的直接分析，不需任何预处理。2、本发明所需要的仪器简单，便于操作，且所用化学试剂均为常用试剂，成本较 低。
图1为磷含量标准曲线图。
具体实施例方式实施例11)将有机磷降解菌株巨大芽孢杆菌以体积10%接种量接入敌敌畏_无机盐培养 基，其中敌敌畏的浓度为200mg/L(总磷浓度为28. Omg/L)。30°C，180r/min培养48h。2)将发酵液于8°C，6000r/min.离心30min.所获得的上清液即为本发明中的待测 样品溶液。3)吸取待测样品溶液5mL，加入0. 1_0. 2mL 二硝基酚指示剂，然后用水将其定容 于50mL容量瓶中，而后加入5%体积百分比的硫酸溶液调节溶液至刚呈微黄色。准确加入 5mL钼锑抗显色剂，摇勻，加水定容。在室温条件下，放置30min显色。将显色的样品溶液在 分光光度计上，用700nm、lCm光径比色皿，以空白试验为参比液调节仪器零点，进行比色测 定，读取吸光值为0. 686。从校准曲线上查得相应的含磷量。4)校准曲线分别吸取5mg/L磷标准溶液0、2、4、6、8mL，并分别加入与样品溶液等 体积的空白溶液及二硝基酚指示剂、10%碳酸钠溶液或5%硫酸溶液调节溶液至刚呈微黄 色；加入钼锑抗显色剂摇勻，加水定容，即得含磷量分别为0. 0,0. 2,0. 4,0. 6,0. 8mg/L的标 准溶液系列；摇勻，于室温放置20-30min后，在波长700nm处，测定其吸光度，以吸光度为纵 坐标，磷浓度(mg/L)为横坐标，绘制校准曲线(参见图1)。5)将步骤3测定的吸光值从校准曲线上查得相应的含磷量，所得含磷量与机磷农 药中总磷浓度得比即为机磷降解菌降解率。最终计算巨大芽孢杆菌降解率为40. 64% (常 规气相色谱法测定值为40. 86% )0实施例21)将有机磷降解菌株氧化微杆菌以体积比5%接种量接入敌敌畏_无机盐培养 基，其中辛硫磷的浓度为400mg/L(总磷浓度为41. 6mg/L)。30°C，180r/min培养24h。2)将发酵液于8°C，6000r/min.离心20min.所获得的上清液即为本发明中的待测 样品溶液。3)吸取待测样品溶液2. 5mL，加入0.05-0. lmL 二硝基酚指示剂，然后用水将其定 容于50mL容量瓶中，而后加入10%体积百分比碳酸钠溶液调节溶液至刚呈微黄色。准确加 入5mL钼锑抗显色剂，摇勻，加水定容。在室温条件下，放置20min显色。将显色的样品溶 液在分光光度计上，用700nm、lCm光径比色皿，以空白试验为参比液调节仪器零点，进行比 色测定，读取吸光值为0. 592。从校准曲线上查得相应的含磷量，所得含磷量与机磷农药中 总磷浓度得比即为机磷降解菌降解率。最终计算氧化微杆菌的降解率为45. 39% (常规气 相色谱法测定值为45. 63% )
权利要求
一种快速检测有机磷降解菌降解率的分析方法，其特征在于将有机磷降解菌株以体积比5％-10％接种量接种于有机磷-无机盐培养基中发酵培养，待发酵后离心取上清液，上清液即待测样品溶液；每10毫升待测样品溶液中加入0.2-0.4mL指示剂二硝基酚，然后采用水定容到50ml，而后向溶液中加入10％碳酸钠溶液或5％硫酸溶液，待溶液至呈微黄色再加入5mL钼锑抗显色剂，摇匀，加水定容，在室温条件下，放置20-30min显色；待显色后在700nm进行比色测定，从校准曲线上查得相应的含磷量，所得含磷量与机磷农药中总磷浓度得比即为机磷降解菌降解率。
2.按权利要求1所述的快速检测有机磷降解菌降解率的分析方法，其特征在于 所述有机磷-无机盐培养基的组成为MgS047H20 0. 20-0. 3g，(NH4) 2S040. 50-0. 6g， KH2P040. 50-0. 6g, NaCl 1. 0-1. 2g, K2HP041. 50-1. 8g,有机磷为 100_500mg，加蒸馏水至 1000ml，调 pH 至 7. 0-7.5。
3.按权利要求1所述的快速检测有机磷降解菌降解率的分析方法，其特征在于所述 发酵培养条件为 30-32°C，180-200r/min，发酵 24_48h。
4.按权利要求1所述的快速检测有机磷降解菌降解率的分析方法，其特征在于所述 二硝基酚指示剂准确称取0. 2g 2,6- 二硝基酚溶于IOOmL水中；0. 5%酒石酸锑钾溶液 准确称取化学纯酒石酸锑钾0. 5g溶于IOOmL水中；硫酸钼锑贮备液量取126mL浓硫酸， 缓缓加入到400mL水中，不断搅拌，冷却。另称取经磨细的钼酸铵IOg溶于300mL水中，冷 却。然后将硫酸溶液缓缓倒入钼酸铵溶液中；再加入0. 5%酒石酸锑钾溶液IOOmL,冷却后， 加水稀释至IOOOmL,摇勻，贮于棕色试剂瓶中；钼锑抗显色剂准确称取1. 5g左旋抗坏血酸 溶于IOOmL钼锑贮备液中。
5.按权利要求1所述的快速检测有机磷降解菌降解率的分析方法，其特征在于所述 校准曲线分别吸取5mg/L磷标准溶液0、2、4、6、8mL，并分别加入与样品溶液等体积的空白 溶液及二硝基酚指示剂、10%碳酸钠溶液或5%硫酸溶液调节溶液至刚呈微黄色；加入钼 锑抗显色剂摇勻，加水定容，即得含磷量分别为0. 0,0. 2,0. 4,0. 6,0. 8mg/L的标准溶液系 列；摇勻，于室温放置20-30min后，在波长700nm处，测定其吸光度，以吸光度为纵坐标，磷 浓度(mg/L)为横坐标，绘制校准曲线。
全文摘要
本发明涉及生物降解农药残留技术领域，具体地说是一种快速检测有机磷降解菌降解率的分析方法。将有机磷降解菌株以体积比5％-10％接种量接种于有机磷-无机盐培养基中发酵培养，待发酵后离心取上清液，上清液即待测样品溶液；每10毫升待测样品溶液中加入0.2-0.4mL指示剂二硝基酚，然后采用水定容到50ml，而后向溶液中加入10％碳酸钠溶液或5％硫酸溶液，待溶液至呈微黄色再加入5mL钼锑抗显色剂，摇匀，加水定容，在室温条件下，放置20-30min显色；待显色后在700nm进行比色测定，从校准曲线上查得相应的含磷量，所得含磷量与机磷农药中总磷浓度得比为机磷降解菌降解率。利用本发明的分析方法，可用于生化样品的直接分析，不需任何预处理。
文档编号G01N21/78GK101806742SQ200910300399
公开日2010年8月18日 申请日期2009年2月13日 优先权日2009年2月13日
发明者张惠文, 李新宇, 李旭, 苏振成, 蔡颖慧 申请人:中国科学院沈阳应用生态研究所
技术领域：
本发明涉及生物降解农药残留技术领域，具体地说是一种快速检测有机磷降解菌降解率的分析方法。
背景技术：
有机磷是广谱性杀虫剂，由于其高效广谱、价格低廉等优点，已在我国大规模使用。由于有机磷的残留造成环境、地下水的污染，也对食品安全造成严重危害，因而解决有 机磷残留尤其是生物降解有机磷已成为当前农残降解领域研究的热点之一。筛选高效降解菌株是微生物降解有机磷农药中最关键的一步。目前检测降解菌株 降解率的普遍方法是采用色谱法。该方法检测精确，但是需要预处理，操作过程较复杂，历 时较长。因而寻找一种快速、有效的检测方法也有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速检测有机磷降解菌降解率的分析方法。为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下检测有机磷降解菌降解率的分析方法将有机磷降解菌株以体积比5% -10%接 种量接种于有机磷_无机盐培养基中发酵培养，待发酵后离心取上清液，上清液即待测样 品溶液；每10毫升待测样品溶液中加入0. 2-0. 4mL指示剂二硝基酚，然后采用水定容到 50ml，而后向溶液中加入10%碳酸钠溶液或5%硫酸溶液，待溶液至呈微黄色再加入5mL钼 锑抗显色剂，摇勻，加水定容，在室温条件下，放置20-30min显色；待显色后在700nm进行比 色测定，从校准曲线上查得相应的含磷量，所得含磷量与机磷农药中总磷浓度得比即为机 磷降解菌降解率。所述有机磷-无机盐培养基的组成为MgS047H20 0. 20-0. 3g， (MM)2SO4O. 50-0. 6g，KH2PO4O. 50-0. 6g，NaCl 1. 0-1. 2g，K2HPO4L 50-1. 8g，有机磷为 100-500mg,加蒸馏水至1000ml，调pH至7. 0-7. 5。所述发酵培养条件为30-32°C，180-200r/ min,发酵24-48h。所述二硝基酚指示剂准确称取0. 2g 2,6- 二硝基酚溶于IOOmL水中； 0. 5%酒石酸锑钾溶液准确称取化学纯酒石酸锑钾0. 5g溶于IOOmL水中；硫酸钼锑贮备 液量取126mL浓硫酸，缓缓加入到400mL水中，不断搅拌，冷却。另称取经磨细的钼酸铵 IOg溶于300mL水中，冷却。然后将硫酸溶液缓缓倒入钼酸铵溶液中；再加入0. 5%酒石酸锑 钾溶液IOOmL,冷却后，加水稀释至IOOOmL,摇勻，贮于棕色试剂瓶中；钼锑抗显色剂准确称 取1. 5g左旋抗坏血酸溶于IOOmL钼锑贮备液中。所述校准曲线分别吸取5mg/L磷标准溶液 0、2、4、6、8mL，并分别加入与样品溶液等体积的空白溶液及二硝基酚指示剂、10%碳酸钠溶液 或5%硫酸溶液调节溶液至刚呈微黄色；加入钼锑抗显色剂摇勻，加水定容，即得含磷量分别 为0. 0,0. 2,0. 4,0. 6,0. 8mg/L的标准溶液系列；摇勻，于室温放置20_30min后，在波长700nm 处，测定其吸光度，以吸光度为纵坐标，磷浓度(mg/L)为横坐标，绘制校准曲线。
本发明所具有的优点1、利用本发明的分析方法，可用于生化样品的直接分析，不需任何预处理。2、本发明所需要的仪器简单，便于操作，且所用化学试剂均为常用试剂，成本较 低。
图1为磷含量标准曲线图。
具体实施例方式实施例11)将有机磷降解菌株巨大芽孢杆菌以体积10%接种量接入敌敌畏_无机盐培养 基，其中敌敌畏的浓度为200mg/L(总磷浓度为28. Omg/L)。30°C，180r/min培养48h。2)将发酵液于8°C，6000r/min.离心30min.所获得的上清液即为本发明中的待测 样品溶液。3)吸取待测样品溶液5mL，加入0. 1_0. 2mL 二硝基酚指示剂，然后用水将其定容 于50mL容量瓶中，而后加入5%体积百分比的硫酸溶液调节溶液至刚呈微黄色。准确加入 5mL钼锑抗显色剂，摇勻，加水定容。在室温条件下，放置30min显色。将显色的样品溶液在 分光光度计上，用700nm、lCm光径比色皿，以空白试验为参比液调节仪器零点，进行比色测 定，读取吸光值为0. 686。从校准曲线上查得相应的含磷量。4)校准曲线分别吸取5mg/L磷标准溶液0、2、4、6、8mL，并分别加入与样品溶液等 体积的空白溶液及二硝基酚指示剂、10%碳酸钠溶液或5%硫酸溶液调节溶液至刚呈微黄 色；加入钼锑抗显色剂摇勻，加水定容，即得含磷量分别为0. 0,0. 2,0. 4,0. 6,0. 8mg/L的标 准溶液系列；摇勻，于室温放置20-30min后，在波长700nm处，测定其吸光度，以吸光度为纵 坐标，磷浓度(mg/L)为横坐标，绘制校准曲线(参见图1)。5)将步骤3测定的吸光值从校准曲线上查得相应的含磷量，所得含磷量与机磷农 药中总磷浓度得比即为机磷降解菌降解率。最终计算巨大芽孢杆菌降解率为40. 64% (常 规气相色谱法测定值为40. 86% )0实施例21)将有机磷降解菌株氧化微杆菌以体积比5%接种量接入敌敌畏_无机盐培养 基，其中辛硫磷的浓度为400mg/L(总磷浓度为41. 6mg/L)。30°C，180r/min培养24h。2)将发酵液于8°C，6000r/min.离心20min.所获得的上清液即为本发明中的待测 样品溶液。3)吸取待测样品溶液2. 5mL，加入0.05-0. lmL 二硝基酚指示剂，然后用水将其定 容于50mL容量瓶中，而后加入10%体积百分比碳酸钠溶液调节溶液至刚呈微黄色。准确加 入5mL钼锑抗显色剂，摇勻，加水定容。在室温条件下，放置20min显色。将显色的样品溶 液在分光光度计上，用700nm、lCm光径比色皿，以空白试验为参比液调节仪器零点，进行比 色测定，读取吸光值为0. 592。从校准曲线上查得相应的含磷量，所得含磷量与机磷农药中 总磷浓度得比即为机磷降解菌降解率。最终计算氧化微杆菌的降解率为45. 39% (常规气 相色谱法测定值为45. 63% )
权利要求
一种快速检测有机磷降解菌降解率的分析方法，其特征在于将有机磷降解菌株以体积比5％-10％接种量接种于有机磷-无机盐培养基中发酵培养，待发酵后离心取上清液，上清液即待测样品溶液；每10毫升待测样品溶液中加入0.2-0.4mL指示剂二硝基酚，然后采用水定容到50ml，而后向溶液中加入10％碳酸钠溶液或5％硫酸溶液，待溶液至呈微黄色再加入5mL钼锑抗显色剂，摇匀，加水定容，在室温条件下，放置20-30min显色；待显色后在700nm进行比色测定，从校准曲线上查得相应的含磷量，所得含磷量与机磷农药中总磷浓度得比即为机磷降解菌降解率。
2.按权利要求1所述的快速检测有机磷降解菌降解率的分析方法，其特征在于 所述有机磷-无机盐培养基的组成为MgS047H20 0. 20-0. 3g，(NH4) 2S040. 50-0. 6g， KH2P040. 50-0. 6g, NaCl 1. 0-1. 2g, K2HP041. 50-1. 8g,有机磷为 100_500mg，加蒸馏水至 1000ml，调 pH 至 7. 0-7.5。
3.按权利要求1所述的快速检测有机磷降解菌降解率的分析方法，其特征在于所述 发酵培养条件为 30-32°C，180-200r/min，发酵 24_48h。
4.按权利要求1所述的快速检测有机磷降解菌降解率的分析方法，其特征在于所述 二硝基酚指示剂准确称取0. 2g 2,6- 二硝基酚溶于IOOmL水中；0. 5%酒石酸锑钾溶液 准确称取化学纯酒石酸锑钾0. 5g溶于IOOmL水中；硫酸钼锑贮备液量取126mL浓硫酸， 缓缓加入到400mL水中，不断搅拌，冷却。另称取经磨细的钼酸铵IOg溶于300mL水中，冷 却。然后将硫酸溶液缓缓倒入钼酸铵溶液中；再加入0. 5%酒石酸锑钾溶液IOOmL,冷却后， 加水稀释至IOOOmL,摇勻，贮于棕色试剂瓶中；钼锑抗显色剂准确称取1. 5g左旋抗坏血酸 溶于IOOmL钼锑贮备液中。
5.按权利要求1所述的快速检测有机磷降解菌降解率的分析方法，其特征在于所述 校准曲线分别吸取5mg/L磷标准溶液0、2、4、6、8mL，并分别加入与样品溶液等体积的空白 溶液及二硝基酚指示剂、10%碳酸钠溶液或5%硫酸溶液调节溶液至刚呈微黄色；加入钼 锑抗显色剂摇勻，加水定容，即得含磷量分别为0. 0,0. 2,0. 4,0. 6,0. 8mg/L的标准溶液系 列；摇勻，于室温放置20-30min后，在波长700nm处，测定其吸光度，以吸光度为纵坐标，磷 浓度(mg/L)为横坐标，绘制校准曲线。
全文摘要
本发明涉及生物降解农药残留技术领域，具体地说是一种快速检测有机磷降解菌降解率的分析方法。将有机磷降解菌株以体积比5％-10％接种量接种于有机磷-无机盐培养基中发酵培养，待发酵后离心取上清液，上清液即待测样品溶液；每10毫升待测样品溶液中加入0.2-0.4mL指示剂二硝基酚，然后采用水定容到50ml，而后向溶液中加入10％碳酸钠溶液或5％硫酸溶液，待溶液至呈微黄色再加入5mL钼锑抗显色剂，摇匀，加水定容，在室温条件下，放置20-30min显色；待显色后在700nm进行比色测定，从校准曲线上查得相应的含磷量，所得含磷量与机磷农药中总磷浓度得比为机磷降解菌降解率。利用本发明的分析方法，可用于生化样品的直接分析，不需任何预处理。
文档编号G01N21/78GK101806742SQ200910300399
公开日2010年8月18日 申请日期2009年2月13日 优先权日2009年2月13日
发明者张惠文, 李新宇, 李旭, 苏振成, 蔡颖慧 申请人:中国科学院沈阳应用生态研究所
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