一种检测三聚氰胺含量的胶体硒试纸条的制作方法
专利名称：一种检测三聚氰胺含量的胶体硒试纸条的制作方法
技术领域：
本项发明为一种检测三聚氰胺含量的胶体硒试纸条。具体来说是一种利用单克隆抗体技 术、硒标抗体技术和免疫层析技术组装起来的可快速检测血清、尿液、牛奶等样品中三聚氰 胺的半定量试纸条，属于生物技术领域。
二背景技术：
三聚氰胺(Melamine)，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，主要的用途是作为生产三 聚氰胺甲醛树脂的原料用于制造日用器皿、装饰贴面板、织物整理剂等。
已有研究表明，长期摄取三聚氰胺可能造成人体或动物生殖能力损害、膀胱或肾结石、 甚至导致膀胱癌。
2007年，美国爆发宠物食品受污染事件，造成部分宠物猫狗发生严重肾衰竭而死亡。事 后经调査表明导致宠物中毒的原因主要是因为宠物食品掺杂了《6. 6%三聚氰胺的小麦蛋白 粉。
2008年9月，中国爆发三鹿婴幼儿奶粉受污染事件，导致食用了受污染奶粉的婴幼儿产 生肾结石病症，其主要原因就是奶粉中含有严重超标的三聚氰胺。随后在奶糖、油条、鸡蛋 等食品中也发现含有三聚氰胺，给人们身体健康造成严重威胁。
因此人体内、食品中及畜产品中残留的三聚氰胺含量检测已经成为食品安全和人身健康 的一项常规检测指标，日益受到重视。
现有的检测三聚氰胺的方法主要是用色谱法如GC-MS、 HPLC、 HC-MS等，但是这些方法需 要完备的实验室、专门的操作人员、昂贵的分析仪器、繁杂的检测步骤和不菲的检测费用， 不适合现场进行大批量的快速检测，更不适合用于普通的家庭自检使用。因此亟需开发一种 灵敏性高、检测迅速、特异性高、成本低廉、适合现场即时检测的三聚氰胺检测方法。而目 前基于免疫学原理的ELISA三聚氰胺检测试剂盒，依旧没能摆脱仪器的束缚，费用也较高， 耗时需要1一2个小时，再加上它用的是多克隆抗体，特异性并不高。
本项发明则是基于免疫学原理，研发出针对三聚氰胺的单克隆抗体，再研制成硒标三聚 氰胺快速检测试纸条。该试纸条具有特异性强、灵敏性高、检测速度快、不需要任何仪器设 备、不需要专业人员操作、运行费用低廉、携带方便等特点，可快速检测血清、尿液、牛奶等样品中三聚氰胺，尤其适合现场样品的即时快速检测和家庭自检使用。
发明内容
本发明为一种检测三聚氰胺含量的胶体硒试纸条，它是一种半定量快速检测试纸条。其 原理是用抗三聚氰胺单克隆抗体检测待检样品中的三聚氰胺，从而提高了检测的特异性、灵 敏性，避免了已有的ELISA检测试剂盒所采用的普通抗三聚氰胺抗体检测三聚氰胺时特异性 和灵敏性差的不足。利用胶体纳米硒颗粒标记抗三聚氰胺单克隆抗体，提高了其检测结果可 视性，进一步提高了灵敏性，并且胶体纳米硒颗粒制备要求并不如胶体纳米金严格，降低了 制备该试纸条有效性所需要求条件，拓宽了试纸条有效性检测所需条件范围，摆脱了特定仪 器的束缚，降低了成本要求，使得该试纸条的使用对象更加大众化。
在本项发明中，首先通过用三聚氰胺免疫抗原MEL-KLH (三聚氰胺偶联血蓝蛋白)免疫 小鼠，获得能分泌抗三聚氰胺抗体的小鼠脾细胞，让其与事先驯化好的SP2/0细胞融合，采 用有限稀释法进行筛选单克隆细胞并扩大培养，然后将筛选出来的分泌抗三聚氰胺单克隆抗 体的融合细胞注射小鼠，使其产生腹水。采集腹水，进行抗体提纯即可获得抗三聚氰胺单克 隆抗体。
其后以亚硒酸和抗坏血酸为原料制得胶体纳米硒颗粒，按照最佳条件将抗三聚氰胺单克 隆抗体进行胶体纳米硒标记。将硒标抗三聚氰胺单克隆抗体喷涂在硒标结合区的玻璃纤维上 ，将一定浓度(10yg/L)的三聚氰胺包被抗原MEL-BSA (三聚氰胺偶联牛血清白蛋白)喷涂 在反应显色区上，同时在质控带上则喷涂一定浓度的羊抗鼠IgG抗体。将支撑板、喷涂有三 聚氰胺包被抗原MEL-BSA的检测带和羊抗鼠IgG抗体的质控带的硝酸纤维素滤膜、喷涂有硒标 抗三聚氰胺单克隆抗体的玻璃纤维、吸水垫的滤纸和采样区的玻璃纤维按照说明书附图1顺 序组装好。
测试时，把样品(牛奶或血清、尿液)滴于该试纸条的采样区，样品由于毛细作用进行 侧向层析作用，首先经过硒标结合区，若样品中存在三聚氰胺，则三聚氰胺就会和结合区玻 璃纤维上的硒标抗三聚氰胺单克隆抗体特异结合，形成硒标抗原抗体复合物。这种复合物会 继续随着样品进行侧向层析作用，当经过硝酸纤维素滤膜上的检测带时，检测带上的三聚氰 胺包被抗原MEL-BSA也会和硒标抗三聚氰胺单克隆抗体进行抗原抗体特异反应。不过当样品 中的三聚氰胺浓度含量达到或超过临界浓度(10yg/L)时，其会把硒标抗三聚氰胺单克隆 抗体上的结合位点全部占据，从而使得检测带上的三聚氰胺包被抗原MEL-BSA不能够和硒标 抗原抗体复合物再进行结合，从而使得检测带不显色，而当样品中没有或浓度没有达到三聚
4氰胺临界浓度(10yg/L)时，检测带上的三聚氰胺包被抗原MEL-BSA会和硒标抗三聚氰胺单 克隆抗体结合，从而使得检测带显色。然后这种硒标抗原抗体复合物在硝酸纤维素滤膜上继 续前进，与质控带上的羊抗鼠IgG抗体继续结合进而显色(见说明书附图2)。这样通过两条 带显色与否，就可以便捷、快速、灵敏地检测出样品中三聚氰胺的含量水平。该种方法具有 便捷化、灵敏化、特异化、适时化、快速化、大众化等特点，非常适合现场样品的即时快速 检测，也适合家庭日常生活中人体体液中三聚氰胺的快速检测和食品自检等。 四、说明书
说明书附图1为三聚氰胺含量快速检测试纸条结构示意图。
① 为支撑板，主要成份为PVC板；
② 为采样区，主要成份为玻璃纤维。，主要作用为采集样品；
③ 为硒标结合区，主要成份为浸泡过硒标抗三聚氰胺单克隆抗体的玻璃纤维；
④ 为反应显色区，主要成份为硝酸纤维素滤膜，上面包括检测带和质控带；
⑤ 为喷涂包被有三聚氰胺包被抗原MEL-BSA的检测带；
⑥ 为喷涂包被有羊抗鼠IgG的质控带；
⑦ 为吸水垫，主要成分为滤纸提供吸水作用及手柄作用。
说明书附图2为三聚氰胺含量快速检测试纸条检测结果说明图。①检测结果为阳性的， 检测带不显色，而质控带显色，说明样品中含有三聚氰胺且含量水平已经超过10yg/L;② 检测结果为阴性，检测带显色，质控带也显色，说明样品中不含有三聚氰胺或其含量水平还 未超过10yg/L。③为试纸条失效时的情况，即检测带不显色，质控带也不显色，说明该试 纸条已经失效，须更换一个新的试纸条重新检测。
五具体实施例方式
实施例l抗三聚氰胺单克隆抗体的制备
1) 用三聚氰胺免疫抗原MEL-KLH (三聚氰胺偶联血蓝蛋白)免疫BALB/C小鼠，经过三次 免疫后，测小鼠血清抗体效价，经过加强免疫后，取效价高那只小鼠为脾细胞提供者。
2) 用8-杂氮鸟嘌呤驯化SP2/0细胞，待其驯化好后，按照经典动物细胞融合法将SP2/0 细胞与体内产生高的抗体水平的小鼠脾细胞进行融合。
3) 然后用三聚氰胺包被抗原MEL-BSA(三聚氰胺偶联牛血清白蛋白)包被酶标板，间接 ELISA法检测能够分泌抗三聚氰胺抗体的融合细胞，并按照有限稀释法进行亚克隆，直到筛 选出能够成功分泌抗三聚氰胺单克隆抗体的稳定的融合细胞株。4) 将筛选出的稳定的能够分泌抗三聚氰胺单克隆抗体的阳性细胞株进行扩大培养，并 将其注射进事先经过石蜡驯化的纯系BALB/C小鼠腹腔内，使其产生大量含有分泌抗三聚氰胺 单克隆抗体的腹水。
5) 将收集到的腹水进行浓縮、提纯，进而得到抗三聚氰胺单克隆抗体。 实施例2胶体纳米硒颗粒的制备
1) 在洁净的烧杯中加入一定量(10mL)去离子水，并用磁力搅拌器中速持续搅拌。
2) 加入一定浓度(5%)的壳聚糖0.2mL以稳定其反应体系。
3) 2分钟后，依次加入O. 2ml抗坏血酸和0. lmL亚硒酸。
4) 待其反应5分钟后，依次间隔l分钟缓慢滴加lmL亚硒酸和2mL抗坏血酸。加完后。持 续搅拌反应5分钟，最终制成符合条件的胶体纳米硒颗粒。
实施例3胶体硒标记抗三聚氰胺单克隆抗体
1 )实验确定胶体硒标记抗三聚氰胺单克隆抗体的最佳PH值和最佳浓度。
2) 将制得的胶体硒溶液通过用碳酸钾调整至最佳PH值(PH8. 5)。
3) 将抗三聚氰胺单克隆抗体经过进一步透析、过滤等处理，尽可能去除一些影响硒标 过程的离子和粒子等杂质。
4) 电磁搅拌条件下，将经过处理的抗三聚氰胺单克隆抗体按照探索好的条件浓度逐滴 加入胶体硒溶液中。
5) IO分钟后，加入10。/。BSA至其浓度为P/。，以稳定其反应体系，继续搅拌均匀。
6) IO分钟后，将硒标抗三聚氰胺单克隆抗体溶液经过梯度离心后，获得浓縮后高纯度 的硒标溶液或者将原硒标溶液经过蔗糖透析后达到浓縮效果。再将其经过凝胶层析柱纯化、 TBS洗涤后即可。
实施例4三聚氰胺的半定量快速检测试纸条的装配
1) 将玻璃纤维经过含l。/。BSA和l。/。吐温-20的PBS (PH7. 4， 0. Olmol/L)活化处理后，浸在 硒标抗三聚氰胺单克隆抗体溶液中40min，自然晾干。即将硒标抗三聚氰胺单克隆抗体溶液 包被于玻璃纤维膜上。
2) 在硝酸纤维素滤膜上间隔0.3厘米依次喷涂上三聚氰胺完全抗原(包被抗原MEL-BSA，三聚氰胺偶联牛血清白蛋白，外购)溶液带作为检测带，羊抗鼠IgG抗体为质控带。然 后将硝酸纤维素膜用含1。/。BSA的PBS (PH7.4， 0. Olmol/L)封闭2h，自然晾干。
3) 按照说明书附图l顺序依次组装各个部分用作支撑板的PVC板上沾上双面胶，从右 至左依次贴上裁剪合适的吸水纸、包括有检测带和质控带的硝酸纤维素滤膜、用作反应区域
6的玻璃纤维膜或聚乙酯膜、用作吸收样品的吸水纸或玻璃纤维膜，且相互之间有少许重叠， 以保证层析能够顺利进行。组装好后为保持干燥待用。 实施例5试纸条使用方法
1) 将牛奶，人和动物的体液包括血液和尿液等样品进行预处理
体液(血清或尿液)，不用进行预处理，或者用蒸馏水进行等倍稀释即可。
食品(奶粉等)或动物食品(饲料或宠物食品)，将样品混匀后称取少量样品(lg)于
离心管中管中，加入DMS0溶液约10mL，震荡混匀，以10000rpm/min超速离心10min。取上清 液lml，备用。
2) 将微量样本滴入采样区，或将试纸条直接插入样品中即可开始检测。5-10分钟后即 可观察结果。
3) 结果判定(结合说明书附图2):
如果检测带不显色，而质控带显色，则说明样品呈阳性，样品中含有三聚氰胺且其含量 已经达到或超过10y g/L，如说明书附图2中①所示；
如果检测带显色，质控带也显色，则说明样品呈阴性，样品中不含有三聚氰胺或其含量 水平较低，其浓度不超过10ug/L，如说明书附图2中②所示；
如果检测带不显色，质控带也不显色，则说明该试纸条已经失效，不能使用。更换新的 试纸条后重新检测，如说明书附图2中③所示。
权利要求
1.本项发明所述的一种检测三聚氰胺含量的胶体硒试纸条，主要结构包括支撑板，采样区，硒标结合区，反应显色区，吸水垫等部分。其主要特征在于硒标结合区包被有硒标抗三聚氰胺单克隆抗体，检测带包被有三聚氰胺包被抗原MEL-BSA。利用竞争法原理使得样品中的三聚氰胺跟检测带上的三聚氰胺包被抗原MEL-BSA竞争与硒标抗三聚氰胺单克隆抗体结合显色，从而可以判断出所检样品中是否含有三聚氰胺或对其进行半定量。
2.根据权利要求l中所述的一种检测三聚氰胺含量的胶体硒试纸条， 其特征在于所述的检测带的主要成份是浓度为10yg/L的三聚氰胺包被抗原MEL-BSA，其可 以跟样品中的三聚氰胺竞争与硒标抗三聚氰胺单克隆抗体结合。
3.根据权利要求l中所述的一种检测三聚氰胺含量的胶体硒试纸条， 其特征在于所述的三聚氰胺包被抗原MEL-BSA是指一种由三聚氰胺与大分子载体蛋白牛血 清白蛋白人工偶联合成的具有免疫原性的复合物。
4.根据权利要求l中所述的一种检测三聚氰胺含量的胶体硒试纸条， 其特征在于所述的硒标抗三聚氰胺单克隆抗体是指由胶体纳米硒颗粒与抗三聚氰胺单克隆 抗体结合而成的复合物，当其与检测带上的三聚氰胺完全抗原结合时，硒标抗三聚氰胺单克 隆抗体会被阻断在检测带上并累积显色。
5.根据权利要求l中所述的一种检测三聚氰胺含量的胶体硒试纸条， 其特征在于所述的抗三聚氰胺单克隆抗体为一种针对三聚氰胺的鼠源单克隆抗体，可以用 来特异结合样品中的三聚氰胺以及检测带上的三聚氰胺包被抗原MEL-BSA。
6.根据权利要求l中所述的一种检测三聚氰胺含量的胶体硒试纸条， 其特征在于所述的该试纸条可用于快速检测牛奶等食品、饲料及血液或尿液等体液中是否 含有三聚氰胺，并进行半定量测定，从而为人体健康及畜产品的合格与否作出快速评估。
全文摘要
本发明为一种检测三聚氰胺含量的胶体硒试纸条。该试纸条主要由支撑板、样品采样区、硒标结合区、显色反应区、吸水垫等部分组成。依据抗原抗体特异结合、免疫层析显色标记等原理，建立由胶体纳米硒颗粒标记的抗三聚氰胺的单克隆抗体与三聚氰胺特异反应显色体系，并通过抗原与抗体竞争反应显色，建立样品中三聚氰胺含量与检测带显色的对应关系，从而可以依据显色区中条带是否显色来判断样品中是否含有三聚氰胺或对其进行半定量。本项发明具有特异性强、灵敏性高、检测速度快、操作简单、方便携带等优点，能够快速、灵敏地判断出所测样本如牛奶、饲料、畜产品、血液、尿液等中是否含有三聚氰胺或其含量是否超标，从而对食品安全和人们正常身体健康作出评估判断。适合牛奶、饲料、畜产品、血液等的现场快速筛查，也可以用于家庭日常生活自检和人自身的三聚氰胺含量检测。
文档编号G01N33/558GK101539577SQ20091030043
公开日2009年9月23日 申请日期2009年2月17日 优先权日2009年2月17日
发明者徐志良, 李红玉 申请人:李红玉;兰州大学
技术领域：
本项发明为一种检测三聚氰胺含量的胶体硒试纸条。具体来说是一种利用单克隆抗体技 术、硒标抗体技术和免疫层析技术组装起来的可快速检测血清、尿液、牛奶等样品中三聚氰 胺的半定量试纸条，属于生物技术领域。
二背景技术：
三聚氰胺(Melamine)，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，主要的用途是作为生产三 聚氰胺甲醛树脂的原料用于制造日用器皿、装饰贴面板、织物整理剂等。
已有研究表明，长期摄取三聚氰胺可能造成人体或动物生殖能力损害、膀胱或肾结石、 甚至导致膀胱癌。
2007年，美国爆发宠物食品受污染事件，造成部分宠物猫狗发生严重肾衰竭而死亡。事 后经调査表明导致宠物中毒的原因主要是因为宠物食品掺杂了《6. 6%三聚氰胺的小麦蛋白 粉。
2008年9月，中国爆发三鹿婴幼儿奶粉受污染事件，导致食用了受污染奶粉的婴幼儿产 生肾结石病症，其主要原因就是奶粉中含有严重超标的三聚氰胺。随后在奶糖、油条、鸡蛋 等食品中也发现含有三聚氰胺，给人们身体健康造成严重威胁。
因此人体内、食品中及畜产品中残留的三聚氰胺含量检测已经成为食品安全和人身健康 的一项常规检测指标，日益受到重视。
现有的检测三聚氰胺的方法主要是用色谱法如GC-MS、 HPLC、 HC-MS等，但是这些方法需 要完备的实验室、专门的操作人员、昂贵的分析仪器、繁杂的检测步骤和不菲的检测费用， 不适合现场进行大批量的快速检测，更不适合用于普通的家庭自检使用。因此亟需开发一种 灵敏性高、检测迅速、特异性高、成本低廉、适合现场即时检测的三聚氰胺检测方法。而目 前基于免疫学原理的ELISA三聚氰胺检测试剂盒，依旧没能摆脱仪器的束缚，费用也较高， 耗时需要1一2个小时，再加上它用的是多克隆抗体，特异性并不高。
本项发明则是基于免疫学原理，研发出针对三聚氰胺的单克隆抗体，再研制成硒标三聚 氰胺快速检测试纸条。该试纸条具有特异性强、灵敏性高、检测速度快、不需要任何仪器设 备、不需要专业人员操作、运行费用低廉、携带方便等特点，可快速检测血清、尿液、牛奶等样品中三聚氰胺，尤其适合现场样品的即时快速检测和家庭自检使用。
发明内容
本发明为一种检测三聚氰胺含量的胶体硒试纸条，它是一种半定量快速检测试纸条。其 原理是用抗三聚氰胺单克隆抗体检测待检样品中的三聚氰胺，从而提高了检测的特异性、灵 敏性，避免了已有的ELISA检测试剂盒所采用的普通抗三聚氰胺抗体检测三聚氰胺时特异性 和灵敏性差的不足。利用胶体纳米硒颗粒标记抗三聚氰胺单克隆抗体，提高了其检测结果可 视性，进一步提高了灵敏性，并且胶体纳米硒颗粒制备要求并不如胶体纳米金严格，降低了 制备该试纸条有效性所需要求条件，拓宽了试纸条有效性检测所需条件范围，摆脱了特定仪 器的束缚，降低了成本要求，使得该试纸条的使用对象更加大众化。
在本项发明中，首先通过用三聚氰胺免疫抗原MEL-KLH (三聚氰胺偶联血蓝蛋白)免疫 小鼠，获得能分泌抗三聚氰胺抗体的小鼠脾细胞，让其与事先驯化好的SP2/0细胞融合，采 用有限稀释法进行筛选单克隆细胞并扩大培养，然后将筛选出来的分泌抗三聚氰胺单克隆抗 体的融合细胞注射小鼠，使其产生腹水。采集腹水，进行抗体提纯即可获得抗三聚氰胺单克 隆抗体。
其后以亚硒酸和抗坏血酸为原料制得胶体纳米硒颗粒，按照最佳条件将抗三聚氰胺单克 隆抗体进行胶体纳米硒标记。将硒标抗三聚氰胺单克隆抗体喷涂在硒标结合区的玻璃纤维上 ，将一定浓度(10yg/L)的三聚氰胺包被抗原MEL-BSA (三聚氰胺偶联牛血清白蛋白)喷涂 在反应显色区上，同时在质控带上则喷涂一定浓度的羊抗鼠IgG抗体。将支撑板、喷涂有三 聚氰胺包被抗原MEL-BSA的检测带和羊抗鼠IgG抗体的质控带的硝酸纤维素滤膜、喷涂有硒标 抗三聚氰胺单克隆抗体的玻璃纤维、吸水垫的滤纸和采样区的玻璃纤维按照说明书附图1顺 序组装好。
测试时，把样品(牛奶或血清、尿液)滴于该试纸条的采样区，样品由于毛细作用进行 侧向层析作用，首先经过硒标结合区，若样品中存在三聚氰胺，则三聚氰胺就会和结合区玻 璃纤维上的硒标抗三聚氰胺单克隆抗体特异结合，形成硒标抗原抗体复合物。这种复合物会 继续随着样品进行侧向层析作用，当经过硝酸纤维素滤膜上的检测带时，检测带上的三聚氰 胺包被抗原MEL-BSA也会和硒标抗三聚氰胺单克隆抗体进行抗原抗体特异反应。不过当样品 中的三聚氰胺浓度含量达到或超过临界浓度(10yg/L)时，其会把硒标抗三聚氰胺单克隆 抗体上的结合位点全部占据，从而使得检测带上的三聚氰胺包被抗原MEL-BSA不能够和硒标 抗原抗体复合物再进行结合，从而使得检测带不显色，而当样品中没有或浓度没有达到三聚
4氰胺临界浓度(10yg/L)时，检测带上的三聚氰胺包被抗原MEL-BSA会和硒标抗三聚氰胺单 克隆抗体结合，从而使得检测带显色。然后这种硒标抗原抗体复合物在硝酸纤维素滤膜上继 续前进，与质控带上的羊抗鼠IgG抗体继续结合进而显色(见说明书附图2)。这样通过两条 带显色与否，就可以便捷、快速、灵敏地检测出样品中三聚氰胺的含量水平。该种方法具有 便捷化、灵敏化、特异化、适时化、快速化、大众化等特点，非常适合现场样品的即时快速 检测，也适合家庭日常生活中人体体液中三聚氰胺的快速检测和食品自检等。 四、说明书
说明书附图1为三聚氰胺含量快速检测试纸条结构示意图。
① 为支撑板，主要成份为PVC板；
② 为采样区，主要成份为玻璃纤维。，主要作用为采集样品；
③ 为硒标结合区，主要成份为浸泡过硒标抗三聚氰胺单克隆抗体的玻璃纤维；
④ 为反应显色区，主要成份为硝酸纤维素滤膜，上面包括检测带和质控带；
⑤ 为喷涂包被有三聚氰胺包被抗原MEL-BSA的检测带；
⑥ 为喷涂包被有羊抗鼠IgG的质控带；
⑦ 为吸水垫，主要成分为滤纸提供吸水作用及手柄作用。
说明书附图2为三聚氰胺含量快速检测试纸条检测结果说明图。①检测结果为阳性的， 检测带不显色，而质控带显色，说明样品中含有三聚氰胺且含量水平已经超过10yg/L;② 检测结果为阴性，检测带显色，质控带也显色，说明样品中不含有三聚氰胺或其含量水平还 未超过10yg/L。③为试纸条失效时的情况，即检测带不显色，质控带也不显色，说明该试 纸条已经失效，须更换一个新的试纸条重新检测。
五具体实施例方式
实施例l抗三聚氰胺单克隆抗体的制备
1) 用三聚氰胺免疫抗原MEL-KLH (三聚氰胺偶联血蓝蛋白)免疫BALB/C小鼠，经过三次 免疫后，测小鼠血清抗体效价，经过加强免疫后，取效价高那只小鼠为脾细胞提供者。
2) 用8-杂氮鸟嘌呤驯化SP2/0细胞，待其驯化好后，按照经典动物细胞融合法将SP2/0 细胞与体内产生高的抗体水平的小鼠脾细胞进行融合。
3) 然后用三聚氰胺包被抗原MEL-BSA(三聚氰胺偶联牛血清白蛋白)包被酶标板，间接 ELISA法检测能够分泌抗三聚氰胺抗体的融合细胞，并按照有限稀释法进行亚克隆，直到筛 选出能够成功分泌抗三聚氰胺单克隆抗体的稳定的融合细胞株。4) 将筛选出的稳定的能够分泌抗三聚氰胺单克隆抗体的阳性细胞株进行扩大培养，并 将其注射进事先经过石蜡驯化的纯系BALB/C小鼠腹腔内，使其产生大量含有分泌抗三聚氰胺 单克隆抗体的腹水。
5) 将收集到的腹水进行浓縮、提纯，进而得到抗三聚氰胺单克隆抗体。 实施例2胶体纳米硒颗粒的制备
1) 在洁净的烧杯中加入一定量(10mL)去离子水，并用磁力搅拌器中速持续搅拌。
2) 加入一定浓度(5%)的壳聚糖0.2mL以稳定其反应体系。
3) 2分钟后，依次加入O. 2ml抗坏血酸和0. lmL亚硒酸。
4) 待其反应5分钟后，依次间隔l分钟缓慢滴加lmL亚硒酸和2mL抗坏血酸。加完后。持 续搅拌反应5分钟，最终制成符合条件的胶体纳米硒颗粒。
实施例3胶体硒标记抗三聚氰胺单克隆抗体
1 )实验确定胶体硒标记抗三聚氰胺单克隆抗体的最佳PH值和最佳浓度。
2) 将制得的胶体硒溶液通过用碳酸钾调整至最佳PH值(PH8. 5)。
3) 将抗三聚氰胺单克隆抗体经过进一步透析、过滤等处理，尽可能去除一些影响硒标 过程的离子和粒子等杂质。
4) 电磁搅拌条件下，将经过处理的抗三聚氰胺单克隆抗体按照探索好的条件浓度逐滴 加入胶体硒溶液中。
5) IO分钟后，加入10。/。BSA至其浓度为P/。，以稳定其反应体系，继续搅拌均匀。
6) IO分钟后，将硒标抗三聚氰胺单克隆抗体溶液经过梯度离心后，获得浓縮后高纯度 的硒标溶液或者将原硒标溶液经过蔗糖透析后达到浓縮效果。再将其经过凝胶层析柱纯化、 TBS洗涤后即可。
实施例4三聚氰胺的半定量快速检测试纸条的装配
1) 将玻璃纤维经过含l。/。BSA和l。/。吐温-20的PBS (PH7. 4， 0. Olmol/L)活化处理后，浸在 硒标抗三聚氰胺单克隆抗体溶液中40min，自然晾干。即将硒标抗三聚氰胺单克隆抗体溶液 包被于玻璃纤维膜上。
2) 在硝酸纤维素滤膜上间隔0.3厘米依次喷涂上三聚氰胺完全抗原(包被抗原MEL-BSA，三聚氰胺偶联牛血清白蛋白，外购)溶液带作为检测带，羊抗鼠IgG抗体为质控带。然 后将硝酸纤维素膜用含1。/。BSA的PBS (PH7.4， 0. Olmol/L)封闭2h，自然晾干。
3) 按照说明书附图l顺序依次组装各个部分用作支撑板的PVC板上沾上双面胶，从右 至左依次贴上裁剪合适的吸水纸、包括有检测带和质控带的硝酸纤维素滤膜、用作反应区域
6的玻璃纤维膜或聚乙酯膜、用作吸收样品的吸水纸或玻璃纤维膜，且相互之间有少许重叠， 以保证层析能够顺利进行。组装好后为保持干燥待用。 实施例5试纸条使用方法
1) 将牛奶，人和动物的体液包括血液和尿液等样品进行预处理
体液(血清或尿液)，不用进行预处理，或者用蒸馏水进行等倍稀释即可。
食品(奶粉等)或动物食品(饲料或宠物食品)，将样品混匀后称取少量样品(lg)于
离心管中管中，加入DMS0溶液约10mL，震荡混匀，以10000rpm/min超速离心10min。取上清 液lml，备用。
2) 将微量样本滴入采样区，或将试纸条直接插入样品中即可开始检测。5-10分钟后即 可观察结果。
3) 结果判定(结合说明书附图2):
如果检测带不显色，而质控带显色，则说明样品呈阳性，样品中含有三聚氰胺且其含量 已经达到或超过10y g/L，如说明书附图2中①所示；
如果检测带显色，质控带也显色，则说明样品呈阴性，样品中不含有三聚氰胺或其含量 水平较低，其浓度不超过10ug/L，如说明书附图2中②所示；
如果检测带不显色，质控带也不显色，则说明该试纸条已经失效，不能使用。更换新的 试纸条后重新检测，如说明书附图2中③所示。
权利要求
1.本项发明所述的一种检测三聚氰胺含量的胶体硒试纸条，主要结构包括支撑板，采样区，硒标结合区，反应显色区，吸水垫等部分。其主要特征在于硒标结合区包被有硒标抗三聚氰胺单克隆抗体，检测带包被有三聚氰胺包被抗原MEL-BSA。利用竞争法原理使得样品中的三聚氰胺跟检测带上的三聚氰胺包被抗原MEL-BSA竞争与硒标抗三聚氰胺单克隆抗体结合显色，从而可以判断出所检样品中是否含有三聚氰胺或对其进行半定量。
2.根据权利要求l中所述的一种检测三聚氰胺含量的胶体硒试纸条， 其特征在于所述的检测带的主要成份是浓度为10yg/L的三聚氰胺包被抗原MEL-BSA，其可 以跟样品中的三聚氰胺竞争与硒标抗三聚氰胺单克隆抗体结合。
3.根据权利要求l中所述的一种检测三聚氰胺含量的胶体硒试纸条， 其特征在于所述的三聚氰胺包被抗原MEL-BSA是指一种由三聚氰胺与大分子载体蛋白牛血 清白蛋白人工偶联合成的具有免疫原性的复合物。
4.根据权利要求l中所述的一种检测三聚氰胺含量的胶体硒试纸条， 其特征在于所述的硒标抗三聚氰胺单克隆抗体是指由胶体纳米硒颗粒与抗三聚氰胺单克隆 抗体结合而成的复合物，当其与检测带上的三聚氰胺完全抗原结合时，硒标抗三聚氰胺单克 隆抗体会被阻断在检测带上并累积显色。
5.根据权利要求l中所述的一种检测三聚氰胺含量的胶体硒试纸条， 其特征在于所述的抗三聚氰胺单克隆抗体为一种针对三聚氰胺的鼠源单克隆抗体，可以用 来特异结合样品中的三聚氰胺以及检测带上的三聚氰胺包被抗原MEL-BSA。
6.根据权利要求l中所述的一种检测三聚氰胺含量的胶体硒试纸条， 其特征在于所述的该试纸条可用于快速检测牛奶等食品、饲料及血液或尿液等体液中是否 含有三聚氰胺，并进行半定量测定，从而为人体健康及畜产品的合格与否作出快速评估。
全文摘要
本发明为一种检测三聚氰胺含量的胶体硒试纸条。该试纸条主要由支撑板、样品采样区、硒标结合区、显色反应区、吸水垫等部分组成。依据抗原抗体特异结合、免疫层析显色标记等原理，建立由胶体纳米硒颗粒标记的抗三聚氰胺的单克隆抗体与三聚氰胺特异反应显色体系，并通过抗原与抗体竞争反应显色，建立样品中三聚氰胺含量与检测带显色的对应关系，从而可以依据显色区中条带是否显色来判断样品中是否含有三聚氰胺或对其进行半定量。本项发明具有特异性强、灵敏性高、检测速度快、操作简单、方便携带等优点，能够快速、灵敏地判断出所测样本如牛奶、饲料、畜产品、血液、尿液等中是否含有三聚氰胺或其含量是否超标，从而对食品安全和人们正常身体健康作出评估判断。适合牛奶、饲料、畜产品、血液等的现场快速筛查，也可以用于家庭日常生活自检和人自身的三聚氰胺含量检测。
文档编号G01N33/558GK101539577SQ20091030043
公开日2009年9月23日 申请日期2009年2月17日 优先权日2009年2月17日
发明者徐志良, 李红玉 申请人:李红玉;兰州大学
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