一种用于核酸实时检测的探针的制作方法
专利名称：一种用于核酸实时检测的探针的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子检测领域，特别涉及一种用于核酸实时检测的新型探针。本发明还涉及 到双环探针技术的应用。
背景技术：
目前已经有多种核酸扩增技术被发明，尤其是聚合酶链式反应(PCR)技术可以在 1.5-3小时内特异地扩增靶核酸序列至几百万倍。近年来，由于实时PCR仪的出现使普通PCR 不再需要凝胶电泳分析，从而不必PCR后操作，杜绝了PCR污染。因此实时PCR技术在临床上 应用越来越广泛。
实时荧光PCR检测技术最早使用荧光染料，例如SYBR GREEN， EVE GREEN，以指示PCR反 应。染料法尽管简单，然而其无法识别非特异扩增，尤其是由于引物二聚体引起的非特扩增 ，因此在实际应用中受到很大限制。随后，实时荧光PCR检测技术中开始应用标记荧光的核 酸探针，例如5'-核酸外切酶技术中使用的T叫man探针、分子信标、荧光能量转移探针(相 邻探针)、蝎子引物、点亮探针等。实时PCR中加入探针对PC財广增产物具有第二识别步骤， 从而避免了非特异扩增，结果更加可靠。不过，如前所述的探针普遍存在设计复杂，荧光本 底高，对单碱基突变识别能力有限的缺点。
本发明涉及使用一种对核酸实时检测的新式探针。该探针在设计思路上与前述的当前探 针根本不同。此探针设计简单、易于合成、荧光本底低。本发明的双环探针检测技术是基于 对耙核酸的直接杂交，该探针由于5'端和3'端都具有与探针内部互补的序列，可以形成2 个环形结构，5'端和3'端标记的荧光基团和淬灭剂能够充分靠近、淬灭荧光，所以在PCR 退火时荧光本底低，而2个环形结构也很易于打开，因此对靶序列的杂交效率高。
发明内容
本发明的技术方案如下
该探针为一条寡核苷酸，寡核苷酸的5端和3端分别存在3-6个碱基，在一定条件下可以 和探针内部序列结合为双链，使探针形成2个环状结构，寡核苷酸的5'端还标记有荧光基团 或荧光供体，3'端标记有淬灭剂或者荧光受体。在一定条件下，探针部分是双链，形成2个 环形结构，当探针与耙序列杂交时，部分双链结构被打开，环形结构消失，探针被耙序列打开，荧光强度随之发生改变。合适条件下，该探针可以与它完全互补的靶序列结合；而只要 耙序列里含有一个碱基的突变，该探针仍然能够保持部分双链和环形结构；或一定设计的探 针可以跨越靶序列多变区，而对多种可能的变异靶序列仍然保持较高较一致的杂交效率。根 据此，本发明的探针可以被用于实时PCR中耙核酸的检测。
本发明的探针所使用的核苷酸可以是DNA， RNA， LNA (锁核酸)，或PNA (肽核酸)，或 任何非自然核苷组成。
双环探针的设计方法
探针内部双链结合区域Tm值在大多数情况下，探针的互补碱基为6-20bp，其Tm值与扩 增引物Tm值相当或高于退火温度2-5'C。根据本发明的一部分具体实施方案的实验结果，如 用于单碱基突变区分检测的实时PCR的双环探针互补区Tm值可以高于退火温度3-8'C 。对于作 为拥有多变区靶序列的共用探针，双链结合部分的Tm值，可以高于退火温度5-12'C。
探针的长度 一般情况，探针总长度为12-80bp，靶序列结合区8-40bp，探针内部互补 区即双链结合区6-20bp， 5'端成环结合域长度3-10bp， 3端成环结合域长度也为3-10bp。
荧光标记位置荧光基团和淬灭剂都可以标记在探针的5'端或3'端，但是一端只能标 记荧光基团和淬灭剂的一种。
非自然核苷酸的使用任何非自然核苷酸，如LNA，均可以在探针的任何位置使用。
双环探针的最适检测结构双环探针可以用于实时PCR中特异耙序列的扩增检测。荧光 基团的信号在退火阶段被检测。目前双环探针适用的实时PCR仪器包括Applied Biosystems (ABI)公司的7300、 7500、 7700， Bio-Rad公司的IQ Cycler, Roche公司的 LightCycler2. 0、 LightCycler480， Corbett Research公司的Rotor-Gene 3000、 6000， Strategene公司的MX3000P和MX3005P等等。
双环探针的积极效果
设计简单双环探针设计时没有太多要求，探针序列为扩增耙序列的一部分，只要探针 的双链结合区的Tm值与相应的PCR反应体系中的引物或使用的退火温度保持一致或高出。任 何设计过PCR引物的人员都可以设计。
荧光本底低荧光报告基团和淬灭基团非常靠近，淬灭效果佳。
适用范围广对于目前现存的荧光探针而言，其对于AT富集区和GC富集区的困难模板， 有着很好的应用性。
易于设计简并探针设计时在保证有效的特异性的情况下，可对存在着小区域的多变碱
基的多型别模板能很好的指示，现有的多种探针大多数是能过增加与相应的模板匹配探针条数来解决问题，而双环探针则能很好的通过设计解决该问题。见图2b。
合成简单无需任何特别的仪器，只需普通的DNA合成仪即可完成合成。
特异性高由于本探针存在一个自身的反向互补双链结构，只有但耙序列与探针结合区
的结合力大与反向互补双链结合的能量，探针才可以与靶序列发生杂交，放出荧光信号。如 果与靶序列中存在突变，如单碱基的改变，该探针可以保持自身环形结构的稳定。另外，由 于自身存在一个反向互补双链结构，设计时可以调节互补区域的长短，来调整探针的特异性
图l、双环探针及其反应原理的示意图2a、双环探针在PCR循环检测时的反应原理示意说明；
图2b、双环探针在PCR循环检测时与不匹配耙序列杂交反应机制
图3、双环探针用于实时PCR检测；模板连续10倍稀释；
图4、双环探针SNP区分杂交能力；
图5、 2条双环探针在实时PCR中用于检测单碱基突变； 图6 、双环探针在实时PCR中用于多变耙序列的检测。
具体实施方式
双环探针构成
本发明的双环探针为一条寡核苷酸，寡核苷酸的5'端和3'端都存在可以与探针内部互 补、结合的3-10个碱基，在一定条件下此2个区域的序列可以与探针内部结合为双链，使探 针形成2个环状结构，寡核苷酸的5'端还标记有荧光基团或荧光受体，3'端标记有淬灭剂 或者荧光受体；探针内部形成双链区的碱基同样可以标记上荧光基团或荧光受体，也可以是 淬灭剂或者荧光受体。双环探针在不同的条件下可以有不同的形态，荧光值也随之变化。当 探针自身杂交为部分双链，形成2个环形结构和部分双链结构时，荧光基团和淬灭剂，或者 荧光供体和受体，十分靠近，荧光基团或荧光供体被淬灭剂或荧光受体淬灭，在荧光基团或 荧光供体反射波长范围内探针没有荧光。当在变性条件下，比如酸性、碱性或高温条件下， 探针的双链部分被打开，环形结构消失，荧光基团或荧光供体与淬灭剂或荧光受体远离，荧 光基团或荧光供体放出荧光。在一定的杂交条件下，比如PCR的退火阶段，探针可以和反应 液中的靶序列结合，探针的双链部分被打开，环形结构消失，荧光基团或荧光供体与淬灭剂或荧光受体远离，荧光基团或荧光供体放出荧光。 双环探针与耙序列反应
双环探针可以与溶液中单链寡核苷酸发生反应。双环探针的环状部分以及探针内部双链 结合区可以和耙序列结合形成一种热力学更稳定的复式结构。双环探针环形结构的消失引起 荧光的产生。双环探针可以在该反应中，将完全匹配的耙序列检测出来，见图l。
根据图l，双环探针由三段不同长度的寡核苷酸l、 2、 3组成。5'端的3-10个寡核苷酸组 成的区域l，与探针内部碱基互补，可与探针内部结合成双链，在本例中称为5'端成环结合 域，5'端用荧光剂4标记；3'末端最后3-10个寡核苷酸组成的区域3，与探针内部碱基互补， 可与探针内部结合成双链，在本例中称为3'端成环结合域，3'端用淬灭剂5标记；探针还包 括中间较长的区域2，此区域碱基与靶序列互补，在本例中称为靶序列结合部位。区域3的中 间部分6-20个碱基可以探针的区域l和区域2结合形成双链，从而使探针5'端和3'端形成环形 结构。当5'端和3'端同时成环时，该探针不发荧光因为荧光剂与淬灭剂紧密靠近。变性后成 环结构打开，在靶DNA 6存在时，靶序列结合部位与靶DNA结合，使荧光剂与淬灭剂远离开。 从而发出荧光。
双环探针用于核酸扩增体系
如前所述，本发明的双环探针可以与单链靶序列发生杂交反应。从实验中，我们进一步 发现双环探针也可以用于检测在PCR体系中不断指数扩增放大的靶序列。在PCR反应每个循环 周期中包括高温变性、低温退火和延伸三个阶段。双环探针在变性阶段由于高温变性使双 链不能形成而产生荧光；在退火阶段，假若没有靶序列存在，探针反向互补区域将结合成双 链，探针形成一个环形结构，荧光基团和淬灭剂靠近，而不产生荧光；但是当有耙序列存在 时，探针将与耙序列杂交，探针自身形成的部分双链打开，环形结构随即消失，从而产生荧 光。在延伸阶段，探针会从靶序列上解离。通过对PCR每个循环的退火阶段的荧光信号的检 测，在实时状态中扩增产物就可以被检测到了。见图2。
根据图2所示一种双环探针11和双链扩增产物21，在媒介PCR周期中二者都存在于PC財广 增反应中。探针11包括5'端成环结合域链12、耙序列结合部位链13和3'端成环结合域链14， 5'端由荧光剂15标记，3'端由淬灭剂16标记。扩增产物21包括互补的链22、 23。在高温变性 时，成哑铃状的探针5'端环和3'端环打开，扩增产物的链22、 23分离。当温度低于退火温度 时(为PCR引物退火)，探针11的靶序列结合部位链13和其互补的扩增产物的靶链杂交。荧 光剂15不被淬灭剂淬灭，而发出荧光。
只要调节探针自身双链结合部分互补碱基的数量以及环形区域碱基数量，就可以调节探针对突变碱基或不匹配碱基的区分检测能力。对单碱基突变区分，双链结合部分要有一定的 Tm值和碱基数量，探针区域2 Tm值约比双链结合部分Tm值高2-5'C。对于作为拥有多变区耙 序列的共用探针，双链结合部分的Tm值不需太高，低于探针区域2 Tm值5-1(TC。
实施例l:乙肝病毒双环探针实时PCR检测
为考察双环探针应用在实时PCR检测的有效性，PCR模板为一系列稀释的标准DNA样品。 反应体系总体积为50y 1，包括5 yl 10Xbuffer (160 mM [NH4]2S04， 670 mM Tris-HC1 pH 8.8， and 0.1 % w/v Tween 20)， 1.5 yl 25 mM MgCl2，每种dNTP 400线上下游引物 0.4 yM，探针O. 1 yM， 1.0 U Taq DNA聚合酶，5yl模板DNA。实时PCR反应在RotorGene 3000实时PCR仪上进行。反应条件为96。C预变性2min，随后96。C变性15 s， 68°C-59°C ( 每循环一次温度下降rC) 15 s， 72°C 延伸15 s， IO个循环；94°C 3 min; 94°C 15 s， 58°C 20 s (检测FAM、荧光信号)，72°C 15 s，共35个循环。标准DNA连续IO倍梯度稀释， H20作为阴性对照。双环探针包括一段与扩增产物互补的核酸序列。上下游引物扩增乙肝病 毒的S区基因(NC-003977)，扩增174bp。其上游引物为5'-caacatcaggattcctaggacc-3' ，下游引物为5'-ggtgagtgattggaggttg-3'，探针的靶序列靠近上游引物，序列为
FM-5' - AGTCTAG CAGACT :TAGAC TCGTCGT 3GAC TTCACC ACG_ 3' -B恥
^-^_ 。探针上带有方框标示的碱基为
探针内自身双链结合区，5端和3端带有下划线标示的碱基为参与形成探针内双链结合区的碱基。
在PC財广增时荧光实时检测测量了35个循环，其结果如图4所示。初始的靶浓度在稀释物 最浓时的线41，线42、 43、 44分别表示当模板被连续10倍稀释3个梯度后的荧光曲线。线45 说明无靶(水)的对比。
与引物相同浓度或为引物浓度的1/2 1/4，双环探针可以很快与耙序列杂交结合，显出 荧光信号。没有耙序列存在时，探针自身互补的碱基分子内杂交，形成稳定的双环结构和一 段双链结构，荧光基团和淬灭基团靠近，自身荧光被淬灭。因此，双环探针可以用于实时核 酸扩增检测，可以用于检测乙肝病毒的PCR检测技术中。
实施例2:双环探针用于区分单碱基突变耙序列
选择人类血小板同种异型抗原(human platelet alloantigen， HPA)的HPA-l基因为研 究对象。HPA-l由于单碱基的突变即T〉C突变导致HPA-la和HPA-lb两个抗原。双环探针设计为 针X寸HPA—la抗原其因序歹[J为. 5'—昍X—J1100 G^JAGGTCAGCCC^GAGGC:AGGtrGCCTC卜Dabcyl-3"
带有下划线的碱基为突变发生碱基，带有外框的碱基为成环结合区碱基。合成的杂交序列比探针在两端各多出2个碱基。HPA-la耙序列为5'-GCCCTGCCTCTGGGCTCACCTCG-3'，带有下划 线的碱基为突变发生碱基；HPA-lb靶序列为5'-GCCCTGCCTCGGGGCTCACCTCG-3'，带有下划 线的碱基为突变发生碱基；采用25 yl反应体系，内含1X buffer (67 mM Tris-HC1， 16.6 mM (NH4)2S04， 85 y g/mL BSA， pH 8.0) ， 2. 0 mM MgCl2， 0.4 yM探针和1.6 y M杂交序列 。反应程序为94。C 1 min; 94。C 10 s， 56。C 15 s， 40个循环。使用Rotor-Gene 3000实 时PCR仪在每次杂交时(即56"C时)采集HEX荧光数据。
图4表示对完全互补的靶序列(线31)和突变的靶序列(线32)的实时荧光信号 (Fluoresoenoe)观测。可以发现荧光强度上升了30倍以上。如果在耙序列中有一个单核苷酸 或一个以上的核苷酸突变，将不会产生荧光信号。
实施例3:实时PCR中用双环探针检测SNP
选择人类血小板同种异型抗原(human platelet alloantigen， HPA)的HPA-4基因，由 于该基因内存在一个G〉A的突变，而导致产生HPA-4a和HPA-4b两个血小板抗原，HPA-4a为野 生型，HPA-4b为突变型。针对两个抗原的基因序列分别设计双环探针，两个探针只相差l个 碱基，并选择已知基因型的3个典型样品进行试验。l个为纯和HPA-4a样品，l个为纯和 HPA-4b样品，l个为杂合样品，同时含有HPA-4a和HPA-4b。试验时同时做一个无(阴性)样 品即H20对照。野生型(HPA-4a)探针序列为
5" -FM- XAAAGCT 3GTCAGCTn^GCATCTGGGT :CAGATG -BHQ- 3'
5" -HEX-TTGCATCTACCCAGATGC^AMGCTCACCTCAGCTT_B恥-3;
，突变型(HPA-4b)探针序列为 ，带有下划线的碱基为突变发生碱基
，带有外框的碱基为成环结合区碱基。上游引物为5'-GGACCTGTCTTACTCCATGAAGG-3';下 游引物为5'-GAAGCCAATCCGCAGGTTAC-3'。
反应总体系为25 yL，包括2.5 yl 10Xbuffer (160 mM [NH4]2S04， 670 mM Tris-HC1 pH 8.8， and 0.1 % w/v Tween 20)， 1.5 yl 25 mM MgCl2，每种dNTP 400 y M，每种引物 0.4 yM，每种探针O. 1 yM， 1.0 U Taq DNA聚合酶，20 ng模板DNA。实时PCR反应在 RotorGene 3000实时PCR仪上进行。反应条件为96°C预变性2min，随后96。C变性15 s， 68°C-59°C (每循环一次温度下降rC) 15 s， 72°C 延伸15 s， IO个循环；94°C 3 min; 94°C 15 s， 58°C 20 s (检测FAM和HEX种荧光信号)，72°C 15 s，共35个循环。
图5显示了实时荧光PCR循环数据的结果。相当于野生型靶的探针发出的荧光被正方实心 表示，相当于突变异种靶的探针发出的荧光被实心圆环表示。
相对于阴性样本，野生型探针(曲线51)，及突变型探针(曲线52)，均没有发出荧光。结果显示仅当模板包括在反应中相应荧光强度增强。当两个靶均在样本中时，野生型探针 (曲线57)，及突变探针(曲线58)，荧光强度显著增加。但是，对于野生型靶，荧光强度 显著增强来自于野生型探针(曲线55)，而不是突变异种型探针(曲线56)。相反，对于突 变型靶，荧光强度显著增强来自于突变型探针(曲线53)，而不是野生型探针(曲线54)。 结果显示仅仅是匹配的探针可以产生正确的信号。野生模板与突变异种模板的100%完全检测 。这证明了根据本发明的探针通过一个单核苷区分了靶。当无模板时无信号被发现，当有两 个模板时，两个信号均被发现。
实施列4:双环探针用作简并探针检测多变靶序列
在实时PCR的临床应用中，尤其是对传染病中致病微生物的检测，常常碰到致病微生物 型别多，变异快，即便是该致病微生物的保守基因也很能找到每个型别都相同的序列，用来 引物和探针设计，往往需要针对多个型别设计多个检测探针，不仅增加了成本，也增加了实 验设计的难度。
本例使用双环探针进行解脲支原体(UU)的实时PCR检测。解脲支原体可以分为14个标
准血清型。选用解脲支原体较保守的区域解脲酶基因区域设计扩增引物和探针。上游引物为
:5'-GATCACATTTCCACTTATTTGAAACA-3';下游引物为5'-AAACGACGTCCATAAGCAACTTTA-3'。 FAM-5， - ICAGGTGC |aCCACAAGCACCTC CTACGATmiGTTC|AAATCGTAG|~3" -B恥
探针为
^带有下划线的碱
基为多变区碱基，带有外框的碱基为成环结合区碱基。
反应总体系为25 yL，包括2.5 yl 10Xbuffer (160 mM [NH4]2S04， 670 mM Tris-HC1 pH 8.8， and 0.1 % w/v Tween 20)， 1.5 yl 25 mM MgCl2，每种dNTP 400 y M，每种引物 0.4 yM，每种探针O. 1 yM， 1.0 U Taq DNA聚合酶，20 ng模板DNA。实时PCR反应在 RotorGene 3000实时PCR仪上进行。反应条件为96°C预变性2min，随后96。C变性15 s， 68°C-59°C (每循环一次温度下降rC) 15 s， 72°C 延伸15 s， IO个循环；94°C 3 min; 94°C 15 s， 58°C 20 s (检测FAM荧光信号)，72°C 15 s，共35个循环。
图6显示了实时荧光PCR循环数据的结果。A、 B、 C、 D、 E、 F代表不同解脲支原体血清型 样品的检测结果，无论哪种血清型，探针都很好地给予检出。
权利要求
1.一种用于核酸实时检测的探针，包括与靶序列互补的单链靶序列结合部位；位于所述的单链靶序列结合部位5’端的5’端成环结合域；和位于所述的单链靶序列结合部位3’端的3’端成环结合域；其中5’端成环结合域及3’端成环结合域分别与所述的靶序列结合部位中的一段序列互补，使探针成为2个环状结构；所述探针的5’端或3’端中的一端标记有荧光基团或荧光供体，另一端标记有淬灭剂或者荧光受体。
2.如权利要求l所述的一种用于核酸实时检测的探针，其特征在于 所述的5'端成环结合域的长度为3-10个碱基。
3.如权利要求l所述的一种用于核酸实时检测的探针，其特征在于 所述的3'端成环结合域的长度为3-10个碱基。
4.如权利要求l所述的一种用于核酸实时检测的探针，其特征在于 所述的探针总长度为12-80bp，其中靶序列结合区8-40bp。
5.如权利要求l所述的一种用于核酸实时检测的探针，其特征在于 所述的探针中的核苷酸为DNA或RNA。
6.如权利要求l所述的一种用于核酸实时检测的探针，其特征在于 所述的靶序列结合部位、5'端成环结合域及3'端成环结合域中，至少有一个包括至少一个 非自然的核苷。
7.一种实时核酸靶序列扩增及检测方法，其中靶扩增产物采用荧光 标记探针检测，包括使用一种单链核酸探针对所述的靶序列进行杂交检测，其包括 与耙序列互补的单链耙序列结合部位； 位于所述的单链耙序列结合部位5'端的5'端成环结合域；和位于所述的单链靶序列结合部位3'端的3'端成环结合域；其中5'端成环结合域及3'端成环结合域分别与所述的靶序列结合部位中的一段序列互补，使探针成为2个环状结构；所述探针的5'端或3'端中的一端标记有荧光基团或荧光供体，另一端标记有淬灭剂 或者荧光受体。
8. 如权利要求7所述的一种实时核酸靶序列扩增及检测方法，其特征 在于所述的5'端成环结合域的长度为3-10个碱基。
9. 如权利要求7所述的一种实时核酸靶序列扩增及检测方法，其特征 在于所述的3'端成环结合域的长度为3-10个碱基。
10. 如权利要求7所述的一种实时核酸靶序列扩增及检测方法，其特 征在于所述的探针总长度为12-80bp，耙序列结合区8-40bp。
11. 如权利要求7所述的一种实时核酸靶序列扩增及检测方法，其特 征在于所述的探针中的核苷酸为DNA或RNA。
12. 如权利要求7所述的一种实时核酸靶序列扩增及检测方法，其特 征在于所述的耙序列结合部位、5'端成环结合域及3'端成环结合域中，至少有一个包括 至少一个非自然的核苷。
13. 一种用于核酸实时检测的探针，其特征在于该探针为一条寡核 苷酸，寡核苷酸的5端和3端分别存在3-6个碱基，在合适条件下可以和探针内部序列结合为 双链，使探针形成2个环状结构，寡核苷酸的5'端或3'端中的一端标记有荧光基团或荧光 供体，5'端或3'端的另一端标记有淬灭剂或者荧光受体；当探针与靶序列杂交时，部分双 链结构被打开，环形结构消失，探针被靶序列打开，荧光强度随之发生改变。
14. 一种检测核酸靶序列的方法，包括，在怀疑带有靶序列中的样品 中加入如权利要求1一6或13中任一项所述的探针，并测量指示与所述的靶序列杂交的荧光标 记的荧光的增加情况。
全文摘要
本发明提供了一种用于核酸实时检测的探针，属于分子检测领域。该探针包括与靶序列互补的单链靶序列结合部位；5’端成环结合域和3’端成环结合域；其中5’端成环结合域及3’端成环结合域分别与所述的靶序列结合部位中的一段序列互补，使探针成为2个环状结构。由于本探针存在一个自身的反向互补双链结构。因此本发明的探针特异性强，另外，由于自身存在一个反向互补双链结构，设计时可以调节互补区域的长短，来调整探针的特异性。
文档编号G01N21/64GK101671744SQ200910300518
公开日2010年3月17日 申请日期2009年2月24日 优先权日2009年2月24日
发明者何东华, 郑立谋, 力 阮 申请人:厦门艾德生物医药科技有限公司
技术领域：
本发明涉及分子检测领域，特别涉及一种用于核酸实时检测的新型探针。本发明还涉及 到双环探针技术的应用。
背景技术：
目前已经有多种核酸扩增技术被发明，尤其是聚合酶链式反应(PCR)技术可以在 1.5-3小时内特异地扩增靶核酸序列至几百万倍。近年来，由于实时PCR仪的出现使普通PCR 不再需要凝胶电泳分析，从而不必PCR后操作，杜绝了PCR污染。因此实时PCR技术在临床上 应用越来越广泛。
实时荧光PCR检测技术最早使用荧光染料，例如SYBR GREEN， EVE GREEN，以指示PCR反 应。染料法尽管简单，然而其无法识别非特异扩增，尤其是由于引物二聚体引起的非特扩增 ，因此在实际应用中受到很大限制。随后，实时荧光PCR检测技术中开始应用标记荧光的核 酸探针，例如5'-核酸外切酶技术中使用的T叫man探针、分子信标、荧光能量转移探针(相 邻探针)、蝎子引物、点亮探针等。实时PCR中加入探针对PC財广增产物具有第二识别步骤， 从而避免了非特异扩增，结果更加可靠。不过，如前所述的探针普遍存在设计复杂，荧光本 底高，对单碱基突变识别能力有限的缺点。
本发明涉及使用一种对核酸实时检测的新式探针。该探针在设计思路上与前述的当前探 针根本不同。此探针设计简单、易于合成、荧光本底低。本发明的双环探针检测技术是基于 对耙核酸的直接杂交，该探针由于5'端和3'端都具有与探针内部互补的序列，可以形成2 个环形结构，5'端和3'端标记的荧光基团和淬灭剂能够充分靠近、淬灭荧光，所以在PCR 退火时荧光本底低，而2个环形结构也很易于打开，因此对靶序列的杂交效率高。
发明内容
本发明的技术方案如下
该探针为一条寡核苷酸，寡核苷酸的5端和3端分别存在3-6个碱基，在一定条件下可以 和探针内部序列结合为双链，使探针形成2个环状结构，寡核苷酸的5'端还标记有荧光基团 或荧光供体，3'端标记有淬灭剂或者荧光受体。在一定条件下，探针部分是双链，形成2个 环形结构，当探针与耙序列杂交时，部分双链结构被打开，环形结构消失，探针被耙序列打开，荧光强度随之发生改变。合适条件下，该探针可以与它完全互补的靶序列结合；而只要 耙序列里含有一个碱基的突变，该探针仍然能够保持部分双链和环形结构；或一定设计的探 针可以跨越靶序列多变区，而对多种可能的变异靶序列仍然保持较高较一致的杂交效率。根 据此，本发明的探针可以被用于实时PCR中耙核酸的检测。
本发明的探针所使用的核苷酸可以是DNA， RNA， LNA (锁核酸)，或PNA (肽核酸)，或 任何非自然核苷组成。
双环探针的设计方法
探针内部双链结合区域Tm值在大多数情况下，探针的互补碱基为6-20bp，其Tm值与扩 增引物Tm值相当或高于退火温度2-5'C。根据本发明的一部分具体实施方案的实验结果，如 用于单碱基突变区分检测的实时PCR的双环探针互补区Tm值可以高于退火温度3-8'C 。对于作 为拥有多变区靶序列的共用探针，双链结合部分的Tm值，可以高于退火温度5-12'C。
探针的长度 一般情况，探针总长度为12-80bp，靶序列结合区8-40bp，探针内部互补 区即双链结合区6-20bp， 5'端成环结合域长度3-10bp， 3端成环结合域长度也为3-10bp。
荧光标记位置荧光基团和淬灭剂都可以标记在探针的5'端或3'端，但是一端只能标 记荧光基团和淬灭剂的一种。
非自然核苷酸的使用任何非自然核苷酸，如LNA，均可以在探针的任何位置使用。
双环探针的最适检测结构双环探针可以用于实时PCR中特异耙序列的扩增检测。荧光 基团的信号在退火阶段被检测。目前双环探针适用的实时PCR仪器包括Applied Biosystems (ABI)公司的7300、 7500、 7700， Bio-Rad公司的IQ Cycler, Roche公司的 LightCycler2. 0、 LightCycler480， Corbett Research公司的Rotor-Gene 3000、 6000， Strategene公司的MX3000P和MX3005P等等。
双环探针的积极效果
设计简单双环探针设计时没有太多要求，探针序列为扩增耙序列的一部分，只要探针 的双链结合区的Tm值与相应的PCR反应体系中的引物或使用的退火温度保持一致或高出。任 何设计过PCR引物的人员都可以设计。
荧光本底低荧光报告基团和淬灭基团非常靠近，淬灭效果佳。
适用范围广对于目前现存的荧光探针而言，其对于AT富集区和GC富集区的困难模板， 有着很好的应用性。
易于设计简并探针设计时在保证有效的特异性的情况下，可对存在着小区域的多变碱
基的多型别模板能很好的指示，现有的多种探针大多数是能过增加与相应的模板匹配探针条数来解决问题，而双环探针则能很好的通过设计解决该问题。见图2b。
合成简单无需任何特别的仪器，只需普通的DNA合成仪即可完成合成。
特异性高由于本探针存在一个自身的反向互补双链结构，只有但耙序列与探针结合区
的结合力大与反向互补双链结合的能量，探针才可以与靶序列发生杂交，放出荧光信号。如 果与靶序列中存在突变，如单碱基的改变，该探针可以保持自身环形结构的稳定。另外，由 于自身存在一个反向互补双链结构，设计时可以调节互补区域的长短，来调整探针的特异性
图l、双环探针及其反应原理的示意图2a、双环探针在PCR循环检测时的反应原理示意说明；
图2b、双环探针在PCR循环检测时与不匹配耙序列杂交反应机制
图3、双环探针用于实时PCR检测；模板连续10倍稀释；
图4、双环探针SNP区分杂交能力；
图5、 2条双环探针在实时PCR中用于检测单碱基突变； 图6 、双环探针在实时PCR中用于多变耙序列的检测。
具体实施方式
双环探针构成
本发明的双环探针为一条寡核苷酸，寡核苷酸的5'端和3'端都存在可以与探针内部互 补、结合的3-10个碱基，在一定条件下此2个区域的序列可以与探针内部结合为双链，使探 针形成2个环状结构，寡核苷酸的5'端还标记有荧光基团或荧光受体，3'端标记有淬灭剂 或者荧光受体；探针内部形成双链区的碱基同样可以标记上荧光基团或荧光受体，也可以是 淬灭剂或者荧光受体。双环探针在不同的条件下可以有不同的形态，荧光值也随之变化。当 探针自身杂交为部分双链，形成2个环形结构和部分双链结构时，荧光基团和淬灭剂，或者 荧光供体和受体，十分靠近，荧光基团或荧光供体被淬灭剂或荧光受体淬灭，在荧光基团或 荧光供体反射波长范围内探针没有荧光。当在变性条件下，比如酸性、碱性或高温条件下， 探针的双链部分被打开，环形结构消失，荧光基团或荧光供体与淬灭剂或荧光受体远离，荧 光基团或荧光供体放出荧光。在一定的杂交条件下，比如PCR的退火阶段，探针可以和反应 液中的靶序列结合，探针的双链部分被打开，环形结构消失，荧光基团或荧光供体与淬灭剂或荧光受体远离，荧光基团或荧光供体放出荧光。 双环探针与耙序列反应
双环探针可以与溶液中单链寡核苷酸发生反应。双环探针的环状部分以及探针内部双链 结合区可以和耙序列结合形成一种热力学更稳定的复式结构。双环探针环形结构的消失引起 荧光的产生。双环探针可以在该反应中，将完全匹配的耙序列检测出来，见图l。
根据图l，双环探针由三段不同长度的寡核苷酸l、 2、 3组成。5'端的3-10个寡核苷酸组 成的区域l，与探针内部碱基互补，可与探针内部结合成双链，在本例中称为5'端成环结合 域，5'端用荧光剂4标记；3'末端最后3-10个寡核苷酸组成的区域3，与探针内部碱基互补， 可与探针内部结合成双链，在本例中称为3'端成环结合域，3'端用淬灭剂5标记；探针还包 括中间较长的区域2，此区域碱基与靶序列互补，在本例中称为靶序列结合部位。区域3的中 间部分6-20个碱基可以探针的区域l和区域2结合形成双链，从而使探针5'端和3'端形成环形 结构。当5'端和3'端同时成环时，该探针不发荧光因为荧光剂与淬灭剂紧密靠近。变性后成 环结构打开，在靶DNA 6存在时，靶序列结合部位与靶DNA结合，使荧光剂与淬灭剂远离开。 从而发出荧光。
双环探针用于核酸扩增体系
如前所述，本发明的双环探针可以与单链靶序列发生杂交反应。从实验中，我们进一步 发现双环探针也可以用于检测在PCR体系中不断指数扩增放大的靶序列。在PCR反应每个循环 周期中包括高温变性、低温退火和延伸三个阶段。双环探针在变性阶段由于高温变性使双 链不能形成而产生荧光；在退火阶段，假若没有靶序列存在，探针反向互补区域将结合成双 链，探针形成一个环形结构，荧光基团和淬灭剂靠近，而不产生荧光；但是当有耙序列存在 时，探针将与耙序列杂交，探针自身形成的部分双链打开，环形结构随即消失，从而产生荧 光。在延伸阶段，探针会从靶序列上解离。通过对PCR每个循环的退火阶段的荧光信号的检 测，在实时状态中扩增产物就可以被检测到了。见图2。
根据图2所示一种双环探针11和双链扩增产物21，在媒介PCR周期中二者都存在于PC財广 增反应中。探针11包括5'端成环结合域链12、耙序列结合部位链13和3'端成环结合域链14， 5'端由荧光剂15标记，3'端由淬灭剂16标记。扩增产物21包括互补的链22、 23。在高温变性 时，成哑铃状的探针5'端环和3'端环打开，扩增产物的链22、 23分离。当温度低于退火温度 时(为PCR引物退火)，探针11的靶序列结合部位链13和其互补的扩增产物的靶链杂交。荧 光剂15不被淬灭剂淬灭，而发出荧光。
只要调节探针自身双链结合部分互补碱基的数量以及环形区域碱基数量，就可以调节探针对突变碱基或不匹配碱基的区分检测能力。对单碱基突变区分，双链结合部分要有一定的 Tm值和碱基数量，探针区域2 Tm值约比双链结合部分Tm值高2-5'C。对于作为拥有多变区耙 序列的共用探针，双链结合部分的Tm值不需太高，低于探针区域2 Tm值5-1(TC。
实施例l:乙肝病毒双环探针实时PCR检测
为考察双环探针应用在实时PCR检测的有效性，PCR模板为一系列稀释的标准DNA样品。 反应体系总体积为50y 1，包括5 yl 10Xbuffer (160 mM [NH4]2S04， 670 mM Tris-HC1 pH 8.8， and 0.1 % w/v Tween 20)， 1.5 yl 25 mM MgCl2，每种dNTP 400线上下游引物 0.4 yM，探针O. 1 yM， 1.0 U Taq DNA聚合酶，5yl模板DNA。实时PCR反应在RotorGene 3000实时PCR仪上进行。反应条件为96。C预变性2min，随后96。C变性15 s， 68°C-59°C ( 每循环一次温度下降rC) 15 s， 72°C 延伸15 s， IO个循环；94°C 3 min; 94°C 15 s， 58°C 20 s (检测FAM、荧光信号)，72°C 15 s，共35个循环。标准DNA连续IO倍梯度稀释， H20作为阴性对照。双环探针包括一段与扩增产物互补的核酸序列。上下游引物扩增乙肝病 毒的S区基因(NC-003977)，扩增174bp。其上游引物为5'-caacatcaggattcctaggacc-3' ，下游引物为5'-ggtgagtgattggaggttg-3'，探针的靶序列靠近上游引物，序列为
FM-5' - AGTCTAG CAGACT :TAGAC TCGTCGT 3GAC TTCACC ACG_ 3' -B恥
^-^_ 。探针上带有方框标示的碱基为
探针内自身双链结合区，5端和3端带有下划线标示的碱基为参与形成探针内双链结合区的碱基。
在PC財广增时荧光实时检测测量了35个循环，其结果如图4所示。初始的靶浓度在稀释物 最浓时的线41，线42、 43、 44分别表示当模板被连续10倍稀释3个梯度后的荧光曲线。线45 说明无靶(水)的对比。
与引物相同浓度或为引物浓度的1/2 1/4，双环探针可以很快与耙序列杂交结合，显出 荧光信号。没有耙序列存在时，探针自身互补的碱基分子内杂交，形成稳定的双环结构和一 段双链结构，荧光基团和淬灭基团靠近，自身荧光被淬灭。因此，双环探针可以用于实时核 酸扩增检测，可以用于检测乙肝病毒的PCR检测技术中。
实施例2:双环探针用于区分单碱基突变耙序列
选择人类血小板同种异型抗原(human platelet alloantigen， HPA)的HPA-l基因为研 究对象。HPA-l由于单碱基的突变即T〉C突变导致HPA-la和HPA-lb两个抗原。双环探针设计为 针X寸HPA—la抗原其因序歹[J为. 5'—昍X—J1100 G^JAGGTCAGCCC^GAGGC:AGGtrGCCTC卜Dabcyl-3"
带有下划线的碱基为突变发生碱基，带有外框的碱基为成环结合区碱基。合成的杂交序列比探针在两端各多出2个碱基。HPA-la耙序列为5'-GCCCTGCCTCTGGGCTCACCTCG-3'，带有下划 线的碱基为突变发生碱基；HPA-lb靶序列为5'-GCCCTGCCTCGGGGCTCACCTCG-3'，带有下划 线的碱基为突变发生碱基；采用25 yl反应体系，内含1X buffer (67 mM Tris-HC1， 16.6 mM (NH4)2S04， 85 y g/mL BSA， pH 8.0) ， 2. 0 mM MgCl2， 0.4 yM探针和1.6 y M杂交序列 。反应程序为94。C 1 min; 94。C 10 s， 56。C 15 s， 40个循环。使用Rotor-Gene 3000实 时PCR仪在每次杂交时(即56"C时)采集HEX荧光数据。
图4表示对完全互补的靶序列(线31)和突变的靶序列(线32)的实时荧光信号 (Fluoresoenoe)观测。可以发现荧光强度上升了30倍以上。如果在耙序列中有一个单核苷酸 或一个以上的核苷酸突变，将不会产生荧光信号。
实施例3:实时PCR中用双环探针检测SNP
选择人类血小板同种异型抗原(human platelet alloantigen， HPA)的HPA-4基因，由 于该基因内存在一个G〉A的突变，而导致产生HPA-4a和HPA-4b两个血小板抗原，HPA-4a为野 生型，HPA-4b为突变型。针对两个抗原的基因序列分别设计双环探针，两个探针只相差l个 碱基，并选择已知基因型的3个典型样品进行试验。l个为纯和HPA-4a样品，l个为纯和 HPA-4b样品，l个为杂合样品，同时含有HPA-4a和HPA-4b。试验时同时做一个无(阴性)样 品即H20对照。野生型(HPA-4a)探针序列为
5" -FM- XAAAGCT 3GTCAGCTn^GCATCTGGGT :CAGATG -BHQ- 3'
5" -HEX-TTGCATCTACCCAGATGC^AMGCTCACCTCAGCTT_B恥-3;
，突变型(HPA-4b)探针序列为 ，带有下划线的碱基为突变发生碱基
，带有外框的碱基为成环结合区碱基。上游引物为5'-GGACCTGTCTTACTCCATGAAGG-3';下 游引物为5'-GAAGCCAATCCGCAGGTTAC-3'。
反应总体系为25 yL，包括2.5 yl 10Xbuffer (160 mM [NH4]2S04， 670 mM Tris-HC1 pH 8.8， and 0.1 % w/v Tween 20)， 1.5 yl 25 mM MgCl2，每种dNTP 400 y M，每种引物 0.4 yM，每种探针O. 1 yM， 1.0 U Taq DNA聚合酶，20 ng模板DNA。实时PCR反应在 RotorGene 3000实时PCR仪上进行。反应条件为96°C预变性2min，随后96。C变性15 s， 68°C-59°C (每循环一次温度下降rC) 15 s， 72°C 延伸15 s， IO个循环；94°C 3 min; 94°C 15 s， 58°C 20 s (检测FAM和HEX种荧光信号)，72°C 15 s，共35个循环。
图5显示了实时荧光PCR循环数据的结果。相当于野生型靶的探针发出的荧光被正方实心 表示，相当于突变异种靶的探针发出的荧光被实心圆环表示。
相对于阴性样本，野生型探针(曲线51)，及突变型探针(曲线52)，均没有发出荧光。结果显示仅当模板包括在反应中相应荧光强度增强。当两个靶均在样本中时，野生型探针 (曲线57)，及突变探针(曲线58)，荧光强度显著增加。但是，对于野生型靶，荧光强度 显著增强来自于野生型探针(曲线55)，而不是突变异种型探针(曲线56)。相反，对于突 变型靶，荧光强度显著增强来自于突变型探针(曲线53)，而不是野生型探针(曲线54)。 结果显示仅仅是匹配的探针可以产生正确的信号。野生模板与突变异种模板的100%完全检测 。这证明了根据本发明的探针通过一个单核苷区分了靶。当无模板时无信号被发现，当有两 个模板时，两个信号均被发现。
实施列4:双环探针用作简并探针检测多变靶序列
在实时PCR的临床应用中，尤其是对传染病中致病微生物的检测，常常碰到致病微生物 型别多，变异快，即便是该致病微生物的保守基因也很能找到每个型别都相同的序列，用来 引物和探针设计，往往需要针对多个型别设计多个检测探针，不仅增加了成本，也增加了实 验设计的难度。
本例使用双环探针进行解脲支原体(UU)的实时PCR检测。解脲支原体可以分为14个标
准血清型。选用解脲支原体较保守的区域解脲酶基因区域设计扩增引物和探针。上游引物为
:5'-GATCACATTTCCACTTATTTGAAACA-3';下游引物为5'-AAACGACGTCCATAAGCAACTTTA-3'。 FAM-5， - ICAGGTGC |aCCACAAGCACCTC CTACGATmiGTTC|AAATCGTAG|~3" -B恥
探针为
^带有下划线的碱
基为多变区碱基，带有外框的碱基为成环结合区碱基。
反应总体系为25 yL，包括2.5 yl 10Xbuffer (160 mM [NH4]2S04， 670 mM Tris-HC1 pH 8.8， and 0.1 % w/v Tween 20)， 1.5 yl 25 mM MgCl2，每种dNTP 400 y M，每种引物 0.4 yM，每种探针O. 1 yM， 1.0 U Taq DNA聚合酶，20 ng模板DNA。实时PCR反应在 RotorGene 3000实时PCR仪上进行。反应条件为96°C预变性2min，随后96。C变性15 s， 68°C-59°C (每循环一次温度下降rC) 15 s， 72°C 延伸15 s， IO个循环；94°C 3 min; 94°C 15 s， 58°C 20 s (检测FAM荧光信号)，72°C 15 s，共35个循环。
图6显示了实时荧光PCR循环数据的结果。A、 B、 C、 D、 E、 F代表不同解脲支原体血清型 样品的检测结果，无论哪种血清型，探针都很好地给予检出。
权利要求
1.一种用于核酸实时检测的探针，包括与靶序列互补的单链靶序列结合部位；位于所述的单链靶序列结合部位5’端的5’端成环结合域；和位于所述的单链靶序列结合部位3’端的3’端成环结合域；其中5’端成环结合域及3’端成环结合域分别与所述的靶序列结合部位中的一段序列互补，使探针成为2个环状结构；所述探针的5’端或3’端中的一端标记有荧光基团或荧光供体，另一端标记有淬灭剂或者荧光受体。
2.如权利要求l所述的一种用于核酸实时检测的探针，其特征在于 所述的5'端成环结合域的长度为3-10个碱基。
3.如权利要求l所述的一种用于核酸实时检测的探针，其特征在于 所述的3'端成环结合域的长度为3-10个碱基。
4.如权利要求l所述的一种用于核酸实时检测的探针，其特征在于 所述的探针总长度为12-80bp，其中靶序列结合区8-40bp。
5.如权利要求l所述的一种用于核酸实时检测的探针，其特征在于 所述的探针中的核苷酸为DNA或RNA。
6.如权利要求l所述的一种用于核酸实时检测的探针，其特征在于 所述的靶序列结合部位、5'端成环结合域及3'端成环结合域中，至少有一个包括至少一个 非自然的核苷。
7.一种实时核酸靶序列扩增及检测方法，其中靶扩增产物采用荧光 标记探针检测，包括使用一种单链核酸探针对所述的靶序列进行杂交检测，其包括 与耙序列互补的单链耙序列结合部位； 位于所述的单链耙序列结合部位5'端的5'端成环结合域；和位于所述的单链靶序列结合部位3'端的3'端成环结合域；其中5'端成环结合域及3'端成环结合域分别与所述的靶序列结合部位中的一段序列互补，使探针成为2个环状结构；所述探针的5'端或3'端中的一端标记有荧光基团或荧光供体，另一端标记有淬灭剂 或者荧光受体。
8. 如权利要求7所述的一种实时核酸靶序列扩增及检测方法，其特征 在于所述的5'端成环结合域的长度为3-10个碱基。
9. 如权利要求7所述的一种实时核酸靶序列扩增及检测方法，其特征 在于所述的3'端成环结合域的长度为3-10个碱基。
10. 如权利要求7所述的一种实时核酸靶序列扩增及检测方法，其特 征在于所述的探针总长度为12-80bp，耙序列结合区8-40bp。
11. 如权利要求7所述的一种实时核酸靶序列扩增及检测方法，其特 征在于所述的探针中的核苷酸为DNA或RNA。
12. 如权利要求7所述的一种实时核酸靶序列扩增及检测方法，其特 征在于所述的耙序列结合部位、5'端成环结合域及3'端成环结合域中，至少有一个包括 至少一个非自然的核苷。
13. 一种用于核酸实时检测的探针，其特征在于该探针为一条寡核 苷酸，寡核苷酸的5端和3端分别存在3-6个碱基，在合适条件下可以和探针内部序列结合为 双链，使探针形成2个环状结构，寡核苷酸的5'端或3'端中的一端标记有荧光基团或荧光 供体，5'端或3'端的另一端标记有淬灭剂或者荧光受体；当探针与靶序列杂交时，部分双 链结构被打开，环形结构消失，探针被靶序列打开，荧光强度随之发生改变。
14. 一种检测核酸靶序列的方法，包括，在怀疑带有靶序列中的样品 中加入如权利要求1一6或13中任一项所述的探针，并测量指示与所述的靶序列杂交的荧光标 记的荧光的增加情况。
全文摘要
本发明提供了一种用于核酸实时检测的探针，属于分子检测领域。该探针包括与靶序列互补的单链靶序列结合部位；5’端成环结合域和3’端成环结合域；其中5’端成环结合域及3’端成环结合域分别与所述的靶序列结合部位中的一段序列互补，使探针成为2个环状结构。由于本探针存在一个自身的反向互补双链结构。因此本发明的探针特异性强，另外，由于自身存在一个反向互补双链结构，设计时可以调节互补区域的长短，来调整探针的特异性。
文档编号G01N21/64GK101671744SQ200910300518
公开日2010年3月17日 申请日期2009年2月24日 优先权日2009年2月24日
发明者何东华, 郑立谋, 力 阮 申请人:厦门艾德生物医药科技有限公司
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