乙型脑炎病毒抗体效价标准血清及其制备方法

xiaoxiao2020-7-23  8

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专利名称:乙型脑炎病毒抗体效价标准血清及其制备方法
技术领域
本发明涉及乙型脑炎病毒抗体效价标准血清及其制备方法,属于生物制品标准物质领域。
背景技术
流行性乙型脑炎(印idemic encephalitis B)简称乙脑,是病死率及致残率均较 高的急性虫媒传染病,随着居住环境的改善和疫苗的应用使其发病率有了大幅的下降,但 该病病的死亡率仍较高,为仅次于结核排序居第二位的乙类传染病。乙型脑炎人免疫球蛋 白(Human encephalitis B Immunoglobulin)简称HEIG,有报道称HEIG具有治疗乙型脑炎 疾病的前景,但在药学研究方面,由于没有参考或标准血清,也没有同类可比较产品,如何 研制及以国际单位标定HEIG效价是个难题。国家生物标准品系指用国际生物标准品标定的,或由我国自行研制的(尚无国际 生物参考品者)用于定量测定某一制品效价或毒素的标准物质,其生物学活性以国际单位 或单位表示。国家标准物质的制备与标定由国家药品检定机构负责。采用细胞蚀斑减少中和法测定乙型脑炎灭活疫苗效价时使用的是鼠源性参考血 清,由于异源性,采用酶联免疫试剂检测人血清乙脑病毒IgG抗体时无法使用中国生物制 品标准物质目录收载编号为250008的乙型脑炎病毒血清国家参考试剂。在新药研究中,普遍存在标准品的应用超前于国家药品检定机构制备与标定的情况,鉴于新药研究的连续性以及标准物质在新药研究中在量值溯源、产品定性、质量控制、 药理毒理以及临床研究的重要性与密切联系,研究者先期进行标准参考品的研制是必要 的。破伤风、狂犬、乙肝免疫球蛋白等产品由科技先进国家率先建立生物活性(效价) 标准物质,该标准由国际生物标准物质委员会所接受与提供该标准物质,目的是在世界范 围统一质量控制标准。乙脑属东南亚地区性虫媒病毒传染病,HEIG的效价是该产品的核心 质量标准,探索、建立符合以国际单位标定基本原理、产品研究与临床应用的效价标准是当 前本领域急需解决的技术难题。

发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种乙型脑炎病毒抗体效价标准血清, 以作为衡量乙型脑炎人免疫球蛋白效价的标准。本发明乙型脑炎病毒抗体效价标准血清,采用乙型脑炎病毒IgG抗体诊断试剂盒 检测,其 OD45tlnm 值为 1.019 士 0. 051。其中,上述的乙型脑炎病毒IgG抗体诊断试剂盒为北京金豪制药股份有限公司生 产,其检验原理为该试剂盒采用乙型脑炎病毒抗原包被酶联板,辣根过氧化物酶(HRP)标 记的羊抗人IgG抗体为示踪物,TMB显色系统,间接ELISA方法检测人血清或血浆中的乙型 脑炎病毒IgG抗体。
进一步的,本发明乙型脑炎病毒抗体效价标准血清,采用乙型脑炎病毒IgG抗体 诊断试剂盒检测,OD45tlnm值为1. 019时,其效价值计为10U/ml。进一步的,上述乙型脑炎病毒抗体效价标准血清,酶法测定其生物活性的变异程 度< 20% ;该标准血清的乙脑病毒IgG抗体效价与乙型脑炎人免疫球蛋白的含量或浓度呈 线性相关。其中,上述乙型脑炎病毒抗体效价标准血清,采用乙型脑炎病毒IgG抗体诊断试 剂盒检测,其OD45tlnm值彡普通血清OD45tlnm值的4倍(一般取200份以上的普通血清,测定其 平均OD45tlnm值)。进一步的,采用乙型脑炎病毒IgG抗体诊断试剂盒检测,其OD45tlnm值为普 通血清OD45tlnm值的4 10倍。本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种上述乙型脑炎病毒抗体效价标准 血清的制备方法,该法发包括如下步骤采用乙型脑炎病毒IgG抗体诊断试剂盒检测,以 OD450nm值>普通血清OD45tlnm值4倍的血清为合格血清,取> 100份合格血清等量混合,稀释 或浓缩调整,使血清的OD45tlnm值为1. 019士0. 051,即得。进一步的,上述的阳性血浆采用乙型脑炎病毒IgG抗体诊断试剂盒检测,其OD45tlnm 值为普通混合血浆OD45tlnm均值的4 10倍。本发明所要解决的第三个技术问题是提供上述乙型脑炎病毒抗体效价标准血清 在定性或 定量检测人血清或血浆中乙型脑炎病毒IgG抗体中的用途。本发明所要解决的第四个技术问题是提供一种乙型脑炎诊断试剂盒,该试剂盒含 有上述的乙型脑炎病毒抗体效价标准血清作为阳性对照品。本发明乙型脑炎IgG抗体定量诊断试剂盒可采用常规试剂盒制备方法制备而得。 如本发明试剂盒的主要组成成分包括检测乙脑IgG抗体酶联板、样品稀释液(常规的血清 稀释液即可)、酶结合物、乙脑IgG抗体阳性对照(即本发明乙型脑炎病毒抗体效价标准血 清)、乙脑IgG抗体阴性对照、显色剂A、显色剂B (采用TMB显色系统)。本发明所要解决的第五个技术问题是提供一种定量检测乙型脑炎IgG抗体的方 法,该方法包括如下步骤a、样品按1 100稀释,取乙脑IgG抗体酶联反应板,在反应板上预留一个空白 孔,不加任何液体;在反应板上分别设2孔阴性对照和2孔阳性对照,阴性对照孔中直接各 加100 μ 1阴性对照液、阳性对照孔中直接各加100 μ 1乙型脑炎病毒抗体效价标准血清,其 余孔加稀释好的样品100μ 1,置37°C反应30min ;b、洗涤反应板,甩弃前次反应液,反复洗涤5次,最后在吸水纸上拍干;C、每孔加入辣根氢化酶100 μ 1,置37°C反应30min ;d、按步骤b方法洗涤反应板5次;e、每孔依次加入显色剂100μ 1,37°C避光显色lOmin,每孔加入2mol/L的硫酸溶 液50 μ 1混勻终止反应;其中,所述显色剂的制备方法为先将TMBWO. lmol/L的浓度溶于 二甲亚砜,再将其以lmmol/L和H2O2以3. 0mmol/L的浓度溶于0. 2mol/L的醋酸钠/枸橼酸 缓冲液(PH值为4.0);f、选择酶标仪波长450nm,测定各孔OD值;g、按上述方法测定乙型脑炎病毒抗体效价标准血清不同稀释度样品的OD检测 值,作标准曲线,根据待测样品的OD值,即可定量测定待测样品的效价。
本发明的有益效果为本发明乙型脑炎病毒抗体效价标准血清为乙型脑炎人免疫 球蛋白的药学研究提供了参考,可以与乙脑疫苗、乙脑人免疫球蛋白相结合判断乙脑病毒 易感水平、评价乙脑疫苗免疫效果;还可以定量判断乙型脑炎人免疫球蛋白的预防或治疗 效果。本发明乙型脑炎诊断试剂盒可以用于定量检测人血清或血浆中乙型脑炎病毒IgG抗 体,用于乙型脑炎病毒感染的辅助诊断,具有广阔的应用前景。


图1采用乙型脑炎病毒抗体效价标准血清制作效价标准曲线图。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明的具体实施方式
做进一步的描述。建立乙型脑炎病毒抗体效价标准血清,首先需要评估乙脑病毒IgG酶联免疫试剂 盒研制品定量检测受试品的特异性、准确性、精密度、线性、检测范围、重现性等参数,使该 方法的可比性与可靠性被公认;同时,借鉴与研究其它特异性免疫球蛋白产品标准物质的 特点,探讨其建立的基本原理与方法学,使研制的标准物质满足科学性与适用性的普遍要 求,最终能够被国家药品检定、国际生物标准物质机构认可并在HEIG产品质控及乙型脑炎 研究领域广泛应用。准确性或称为精密度,相对与化学药品而言,生物制品由于没有纯的标准物质, 往往难以获得确切的准确数据。生物学测定数据变异较大,生物制品质量控制分析方法与 验证技术要求酶法测定生物活性的变异程度< 20%。特异性线性回归相关程度反映特异性程度,确定标准血清的乙脑病毒抗体效价与被分析物的含量(浓度)呈线性相关。范围根据线性的研究,确定试剂盒符合线性、精密度与准确性的的范围矫正系数同一受试品在不同时间检测时,受温度、湿度、实验时间或地点等试验 条件的影响会导致检测数据出现偏差。为了系统的比较相关数据,采用标准参数/变异参 数=变异系数,检测参数X变异系数=标准参数的方法进行校正。科学性标准血清的效价设置为10U/ml,使阳性、普通、阴性血清效价之间应具有 合理的差值,差值的选择兼顾了原料血浆的可获取性与产品临床效果的难以替代性;标准 血清效价设置为10U/ml,其符合以国际单位标定相关免疫球蛋白产品原料血浆采集标准也 是10U/ml基本原理。适用性借鉴其它特异性免疫球蛋白生产时设置10IU/ml为合格原料血浆的效价 标准,采用兼容性的现行工艺可制备100IU/ml特异性免疫球蛋白产品;在特定的疫苗免疫 程序下,在效价峰值期能够实现> 50%的收浆率,原料血浆适用规模化生产;更重要的是, 与普通免疫球蛋白比较存在> 10倍的效价差值,阴性血清与普通血清的效价比 2倍,如 果与免疫球蛋白来自低感染人群原料比较时,则效价差值> 40倍,符合其它特异性免疫球 蛋白与免疫球蛋白比较时效价差值属性并能够在临床研究时充分体现特异性免疫球蛋白 的疗效。实施例一本发明乙型脑炎病毒抗体效价标准血清的制备疫苗免疫方法取冻干乙脑减毒活疫苗(中国生物技术集团成都生物制品研究所,批号200612A095-2,每支1人份)冻干乙脑减毒活疫苗加灭菌注射用水0. 5ml重溶后, 上臂外侧三角肌附着处皮肤用酒精消毒,皮下注射0. 5ml。初次免疫与加强免疫初次免疫与 加强免疫间隔3个月。标准血清疫苗加强免疫14天后,静脉采血分离血清,采用乙型脑炎病毒IgG抗体 诊断试剂盒检测,以0D45(lnm值>普通血清0D45(tam值4倍的血清为合格血清,取200份合格血 清,每份0. 2ml等量混合,稀释,使血清的OD450nm值为1. 019士0. 051,即得。批号20081031。检测试剂及仪器市售乙型脑炎病毒IgG抗体诊断试剂盒,北京金豪制药股份有 限公司生产(各种免疫球蛋白均使用该试剂盒检测),批号20080428。使用酶标仪(美国 BIO-RAD, Model 550)检测 0D 值。采用上述方法作为制备标准血清的理由是由于隐性感染的存在,乙脑疫苗免疫 前献浆员群体血清(普通血清)检测0D值在统计学上呈正态分布。尽管在没有标准血清的 情况下,无法设置阴性血清的基线效价标准,但本发明的前期研究得知经过试验得知阴性 血清与普通血清存在> 2倍的差值。乙脑疫苗加强免疫后献浆员群体血清(阳性血清)检 测0D值在统计学上也呈正态分布,采用乙型脑炎病毒IgG抗体诊断试剂盒筛选收集0D45Qnm 值>普通混合血清4倍(一般为4 10倍)的阳性血清,效价逻辑上阳性血清与阴性血清 的差值彡10倍。实施例2采用本发明乙型脑炎IgG抗体定量诊断试剂盒检测乙型脑炎IgG抗体本实施例是通过以本发明乙型脑炎病毒抗体效价标准血清代替北京金豪制药股 份有限公司生产的,批号为20080428的乙型脑炎IgG抗体诊断试剂盒中的阳性对照部分, 制成了新的乙型脑炎IgG抗体定量诊断试剂盒进行检测。该试剂盒的组成为检测乙脑IgG 抗体酶联反应板、样品稀释液、酶结合物、本发明乙型脑炎病毒抗体效价标准血清作为乙脑 IgG抗体阳性对照、乙脑IgG抗体阴性对照、显色剂A、显色剂B (采用TMB显色系统)。具体检测步骤如下1、样品按1 100稀释。在检测测乙脑IgG抗体酶联板上预留一个空白孔,不加 任何液体;每次试验设2孔阴性对照(直接加100 u 1阴性对照)、2孔阳性对照(直接加 100 ill阳性对照);每孔加稀释好的样本lOOiil,置37°C反应30min。2、用蒸馏水将洗涤液20倍稀释后洗板。甩弃前次反应液,在每孔内加入稀释后的 洗涤液400 yl,甩弃洗涤液,如此反复洗涤5次,最后在吸水纸上拍干。3、每孔加入酶结合物lOOiU,置37°C反应30min。4、洗板5次,同操作步骤2。5、每孔依次加入显色剂A、显色剂B各50iil,37°C避光显色lOmin,每孔加入终止 液50 ill混勻终止反应。6、选择酶标仪波长450nm(美国BI0-RAD,Model 550),测定各孔0D值。结果见表 1 7、普通对照血清200余份普通献浆员乙脑疫苗免疫前等量混合血清,批号 20080420。8、阳性对照血清乙脑疫苗加强免疫14天后静脉采血分离血清,采用乙型脑炎病 毒IgG抗体诊断试剂盒按>普通血清4倍0D45(tam值的标准获得合格免疫血清,按> 100份合 格血清的比例等量混合,该血清的0D45(tam值为1. 019,其效价标定为10U/ml。批号20081031。
9、效价计算按上述方法测定乙型脑炎病毒抗体效价标准血清6个不同稀释度样 品的OD检测值,作标准曲线,添加趋势线后显示的公式为y = 0. lOOlx+O. 0131,式中y为 OD450nm值,χ为效价,根据待测样品的OD45tlnm值,即可得知待测样品的效价,结果见表1。表1乙脑阳性对照血清的OD检测值与抗体效价值 从表1可以看出,采用本发明乙型脑炎IgG抗体定量诊断试剂盒可以定量检测与 标定受试品中乙型脑炎病毒抗体效价。试验例一本发明乙型脑炎病毒抗体效价标准血清效价定位合理性的评估1、试验材料a、普通对照血清200余份普通献浆员乙脑疫苗免疫前等量混合血清,批号 20080420。b、肌注人免疫球蛋白批号200605204,蛋白含量101.6g/L,3ml/瓶。C、静注免人疫球蛋白批号200705110蛋白含量54g/L,规格1.25g/瓶。d、巨细胞病毒人免疫球蛋白巨细胞病毒免疫球蛋白,Massachusetts Public Health Biologic Laboratories USA Lot :MIVCMV_198 失效期6-19_2006 (2004年始_20°C 保存)。e、乙肝人免疫球蛋白批号200802101蛋白含量83. lg/L,2ml/瓶,乙肝标定效价 107.3IU/ml。f、破伤风人免疫球蛋白批号200804304蛋白含量111. lg/L,3ml/瓶,破伤风标定 效价 120IU/ml。注除特异性免疫球蛋白除巨细胞病毒人免疫球蛋白外,其余免疫球蛋白均为四 川远大蜀阳药业股份有限公司生产的产品。g、试剂盒市售乙型脑炎病毒IgG抗体诊断试剂盒,北京金豪制药股份有限公司生产(各 种免疫球蛋白均使用该试剂盒检测),检测试剂批号=20080428。使用美国酶标仪(美国 BIO-RAD, Model 550)检测 OD 值。2、操作方法a、实施例1制备的乙型脑炎病毒抗体效价标准血清按2倍系列稀释成6个浓度 (分别为 1 IOOU 200,1 400,1 800,1 1600,1 3200),作为阳性对照血清,分别计为阳1、阳2、阳3、阳4、阳5、阳6。b、其它血清、免疫免疫球蛋白与特异性免疫球蛋白按1 100稀释。c、检测方法按北京金豪制药股份有限公司生产的乙型脑炎病毒IgG抗体诊断试 剂盒使用说明书进行。3、数据统计方法a、包括阳性对照血清6个稀释度样品的每个受试品做8个平行样品检测,分别除去相对较高与较低2个0D检测值后采用CASI0fx-3650p计算器SD模式, 统计每个受试品6个平行样的0D均值与标准差。b、阳性对照血清6个稀释度样品的0D均值、标准偏差采用Excel制表,选择x y 散点图、线性回归、添加趋势线显示公式与R平方值的模式制作标准曲线。c、按照添加趋势线后显示的公式分别计算受试品乙脑抗体效价值与变异系数 (CV),计算方法cv =(标定值-检测值)/标定值。4、结果及分析a、乙脑阳性对照血清的0D检测值与抗体效价值数据,见表2。表2乙脑阳性对照血清的0D检测值与抗体效价值 从表2可知,除阳6数据的变异为55. 2% (低浓度检测时存在较大的背景噪音) 外,其它样品的数据具较好的平行性(变异系数均<20%)。从表2数据可以看出,试验采 用的试剂盒的准确性与精密度参数可以被接受。阳性对照血清乙脑病毒抗体效价标准曲线如图1所示,从图1可以看出,阳性对照 血清的效价与含量(或浓度)呈线性相关。试剂盒符合线性、精密度与准确性的的范围是 0. 625-10mU/0. lml (受试品采用100倍稀释,加样0. 1ml,换算用为U/ml表示)。b、受试品乙脑病毒抗体0D检测均值与效价检测结果,见表3。表3受试品乙脑病毒抗体0D检测均值与效价
设阳性对照血清在相对稳定实验条件下得出的数据为标准数据,阳性对照血清标 准数据(表2所示)/阳性血清检测数据(表3所示)=矫正系数。表3中的校正值按校 正系数则为0. 886(1. 019/1. 15)。经校正后的阳性血清效价(10. 06)与表1 (10. 05)的效价
基本相同。乙脑人免疫球蛋产品的设计效价为125U/ml,与普通免疫球蛋白(7.25U/ml))比 较,存在17. 24 1 (125/7. 25)的效价差值,阴性血清(见表6,<普通血清OD值的血清) 的效价比普通血清效价低2. 48倍(0. 072/0. 029),如果采用来自低感染人群原料制备免 疫球蛋白时,效价差值为1 42. 75(17. 24X2. 48),该特点符合其它特异性免疫球蛋白 与免疫球蛋白比较同一特异性效价时效价差值属性乙肝1 26. 75(888. 2/33. 2)、狂犬 1 17(187/11)、破伤风 1 49. 77 (1095/22)、巨细胞 1 2. 39(1477/619)并能够在临床 研究时充分体现特异性免疫球蛋白疗效。表4免疫球蛋白靶抗原的特异性抗体效价比较 受试品,HVIG 水痘免疫球蛋白、HCIG 巨细胞病毒免疫球蛋白、HRIG 狂犬病免疫 球蛋白、HBIG 乙肝免疫球蛋白、HTIG 破伤风免疫球蛋白、mlgG 肌注免疫球蛋白、vlgG 静 注免疫球蛋白。C、试验的重现性,见表5。
表5不同日期、人员检测普通与阳性血清乙脑抗体效价的0D值与标准差 3个检验人员(分别标为C、G、W)在不同时间内采用普通与阳性(100倍稀释)血 清检测7次,从表5可以看出,阳性血清的0D值与标准差能够在变异程度< 20%范围内重 现,普通血清在第2次检测时变异程度约50%,表明低浓度检测时重现性较差。d、疫苗免疫程序与取4倍0D45(lnm值收浆的结果,见表6。表6疫苗免疫程序与取4倍0D45(tam值收浆的结果 从表6可以看出,在特定的疫苗免疫程序下试验用的阳性血清设置为10U/ml时, 在效价峰值期能够实现> 50%的收浆率,说明本发明乙脑人免疫球蛋白标准血清,可以适 应工业上使用,以规模化生产乙脑人免疫球蛋白产品。
权利要求
乙型脑炎病毒抗体效价标准血清,其特征在于采用乙型脑炎病毒IgG抗体诊断试剂盒检测,其OD450nm值为1.019±0.051。
2.根据权利要求1所述的乙型脑炎病毒抗体效价标准血清,其特征在于采用乙型脑 炎病毒IgG抗体诊断试剂盒检测,OD45tlnm值为1. 019时,其效价值计为10U/ml。
3.根据权利要求1所述的乙型脑炎病毒抗体效价标准血清,其特征在于酶法测定其 生物活性的变异程度< 20 %。
4.根据权利要求1所述的乙型脑炎病毒抗体效价标准血清,其特征在于采用乙型脑 炎病毒IgG抗体诊断试剂盒检测,其OD45tlnm值>普通血清4倍。
5.根据权利要求4所述的乙型脑炎病毒抗体效价标准血清,其特征在于采用乙型脑 炎病毒IgG抗体诊断试剂盒检测,其OD45tlnm值为普通血清OD45tlnm均值的4 10倍。
6.权利要求1 5任一项所述的乙型脑炎病毒抗体效价标准血清的制备方法,其特征 在于采用乙型脑炎病毒IgG抗体诊断试剂盒检测,以OD45tlnm值>普通血清OD45tlnm值4倍 的血清为合格血清,取> 100份合格血清等量混合,稀释或浓缩调整,使血清的OD45tlmm值为 1. 019士0. 051,即得。
7.根据权利要求6所述的乙型脑炎病毒抗体效价标准血清的制备方法,其特征在于 所述的免疫血清采用乙型脑炎病毒IgG抗体诊断试剂盒检测,其OD45tlnm值为普通血清OD45tlnm 均值的4 10倍。
8.权利要求1 5任一项所述的乙型脑炎病毒抗体效价标准血清在定性或定量检测人 血清或血浆中乙型脑炎病毒IgG抗体中的用途。
9.乙型脑炎IgG抗体定量诊断试剂盒,其特征在于含有权利要求1 5任一项所述 的乙型脑炎病毒抗体效价标准血清作为阳性对照品。
10.一种定量检测乙型脑炎IgG抗体的方法,其特征在于包括如下步骤a、样品按1 100稀释,取乙脑IgG抗体酶联反应板,在反应板上预留一个空白孔, 不加任何液体;在反应板上分别设2孔阴性对照和2孔阳性对照,阴性对照孔中直接各加 100 μ 1阴性对照液、阳性对照孔中直接各加100 μ 1乙型脑炎病毒抗体效价标准血清,其余 孔加稀释好的样品100μ 1,置37°C反应30min ;b、洗涤反应板,甩弃前次反应液,反复洗涤5次,最后在吸水纸上拍干;c、每孔加入酶结合物100μ 1,置37°C反应30min ;d、按步骤b方法洗涤反应板5次;e、每孔依次加入显色剂100μ1,37°C避光显色lOmin,每孔加入2mol/L的硫酸溶液 50 μ 1混勻终止反应;其中,所述显色剂的制备方法为先将TMB以0. lmol/L的浓度溶于二 甲亚砜,再将其以lmmol/L和H2O2以3. 0mmol/L的浓度溶于0. 2mol/L的醋酸钠/枸橼酸缓 冲液;f、选择酶标仪波长450nm,测定各孔OD值;g、按上述方法测定乙型脑炎病毒抗体效价标准血清不同稀释度样品的OD检测值,作 标准曲线,根据待测样品的OD值,即可定量测定待测样品的效价。
全文摘要
本发明涉及乙型脑炎病毒抗体效价标准血清及其制备方法,属于生物制品标准物质领域。本发明所解决的技术问题是提供一种乙型脑炎病毒抗体效价标准血清以作为衡量乙型脑炎人免疫球蛋白效价量值的参考标准。本发明乙型脑炎病毒抗体效价标准血清,其特征在于采用乙型脑炎病毒IgG抗体诊断试剂盒检测,其OD450nm值为1.019±0.051。本发明乙型脑炎病毒抗体效价标准血清为乙型脑炎人免疫球蛋白的药学研究提供了参考,可以定量判断乙型脑炎人免疫球蛋白的预防或治疗效果,具有广阔的应用前景。
文档编号G01N33/543GK101839914SQ20091030098
公开日2010年9月22日 申请日期2009年3月20日 优先权日2009年3月20日
发明者陈光清, 高玲, 魏宪义 申请人:四川远大蜀阳药业股份有限公司;魏宪义;陈光清

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