Elisa竞争法定量测定peg修饰药物的试剂盒的制作方法

xiaoxiao2020-7-23  8

专利名称:Elisa竞争法定量测定peg修饰药物的试剂盒的制作方法
技术领域
本发明涉及一种生物医药产品,具体地涉及一种ELISA竞争法定量测定PEG修饰药物的试剂盒,属于医药领域。

背景技术
ELISA是酶联接免疫吸附剂测定(Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay))的简称,是以免疫学反应为基础,将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术,可敏感地检测体液中微量的特异性抗体或抗原。由于抗原、抗体的反应在一种固相载体抓聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行,每加入一种试剂孵育后,可通过洗涤除去多余的游离反应物,从而保证试验结果的特异性与稳定性。在实际应用中,通过不同的设计,具体的方法步骤可有多种,即用于检测抗体的间接法、用于检测抗原的双抗体夹心法以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。
聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)是最为常用的修饰蛋白质的聚合物,它是由乙二醇单体HO-(CHCHO)-CH-CH-OH聚合而成。它被广泛用于修饰的原因为具有以下优点1.PEG具有两亲,既可用溶解于水,又可以溶解于大多数的有机溶剂。2.无毒,免疫原性低,体内易于清除,其分子相容性也通过美国FDA认证。3.PEG的分子量很广,选择余地大。4.可将它的许多优良性质赋予修饰后的生物分子。对于各种具有药用潜能的蛋白来说,采用PEG修饰后可有以下三个方面的优点(1)增加稳定性,延长血浆半衰期;(2)降低免疫原性和抗原性;(3)降低毒副作用。此外还可增加蛋白在体内的生物学分布。目前,用于临床的主要有腺苷脱氨酶,干扰素α-2a、α-2b,粒细胞集落刺激因子,生长抑素等的PEG修饰药物,还有几十个的PEG修饰药物正在临床阶段。
对于检测PEG修饰物的修饰度及修饰位点的检测,可用以下方法分光光度法、液相色谱法、电泳法、质谱法、核磁共振、光散射法、傅里叶变换红外光谱法等,但目前这些方法往往受检测灵敏度、专业性、设备实施条件、以及成本等诸多方面的影响,且不能定量测定修饰后的样品浓度。目前,全球尚无ELISA法或其它的免疫方法检测PEG修饰药物的试剂盒供药厂或医院等应用。


发明内容
本发明的目的是提供一种ELISA竞争法定量测定PEG修饰药物的试剂盒,用于PEG修饰药物的定量检测,有效地解决目前PEG修饰药物的检测方法不足的问题。
本发明采用一种全新的设计思想,将竞争法引入试剂盒的设计研发。竞争法是指将特异性抗体与固相联结,形成固相抗体,加入待测标本(含相应抗原)和相应的一定量的酶标抗原,待测标本中的抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合,待测标本中抗原含量越高,则与固相抗体结合亦越多,使得酶标抗原与固相抗体结合的机会就越少,甚至没有机会结合。加入底物后不显色或显色很浅,显色深者为阴性。
本发明为达到以上目的,是通过如下的技术方案来实现的 一种ELISA竞争法定量测定PEG修饰药物的试剂盒,试剂盒内包含有酶标板、稀释液、清洗液、底物液、终止液,其特征在于还包括PEG修饰的蛋白质标准品,PEG与酶的结合物;所述的酶标板是包被有抗PEG单克隆抗体的酶标板;所述的PEG修饰的蛋白质标准品是用PEG和蛋白质或者多肽结合而成,其方法包括用活化的PEG与蛋白质或多肽直接反应,或者是末端改变为不同基团的PEG与蛋白质或者多肽采用双功能基团连接结合而成,或者采用不同的手臂连接而成。本发明的PEG与酶的结合物是以下述方法制成的,包括用活化的PEG与酶直接反应而得,或者是末端改变为不同基团的PEG与酶采用双功能基团连接结合而成,或者采用不同的手臂连接而成,或者是以先处理酶的方法使之能与PEG结合。本发明中所述的PEG与酶的结合物即为酶标记的PEG。
所述的包被有抗PEG单克隆抗体的酶标板是用下述方法制成用KLH-PEG作为免疫抗原免疫新西兰大耳白兔,并取其脾脏与240E细胞(US5675063)融合,ELISA筛选,扩大生产,纯化单克隆抗体,将纯化的单抗包被酶标板封闭后,加入糖溶液处理酶标板。加入糖溶液处理酶标板可以延长固相酶标板上抗体的稳定性。
作为优选,所述的处理酶标板的糖溶液是含有蔗糖、葡萄糖、海藻糖、乳糖、半乳糖中的一种或一种以上的水溶液,其中糖的质量浓度为0.3~20%。
作为优选,包被有抗PEG单克隆抗体的酶标板,其抗体的包被浓度为2μg/ml。
所述的稀释液的配比为0.5-3gBSA,质量分数0.01-0.02%的柳硫汞,0.1-0.3g Tris,0.5-0.7g NaCl,加去离子水至100ml,调节pH至7.4。稀释液的配比优选为每100ml含1gBSA,1ml质量浓度1%的柳硫汞,Tris0.241g,NaCl 0.584g,其余为去离子水,调节pH至7.4后0.22μm低蛋白吸附滤膜过滤除菌。
所述的清洗液的配比为质量浓度0.01-0.02%的柳硫汞,1-3g Tris,5-7g NaCl,1ml Tween-20,加去离子水至100ml,调节pH至7.4。清洗液的配比优选为每100ml含1ml质量浓度1%的柳硫汞,2.41gTris,5.84gNaCl,1ml Tween-20,其余为去离子水,调节pH至7.4后0.22μm低蛋白吸附滤膜过滤除菌。
所述的底物液由底物A液和底物B液组成,其中底物A液的配比为1-2g磷酸氢二钠,0.5-1g柠檬酸,30-50μl质量浓度30%过氧化氢,加去离子水至100ml;底物B液的配比为0.03-0.08gTMB,0.1-0.2g柠檬酸,0.01-0.05gEDTA,20ml甘油,3ml DMSO,加去离子水至100ml。底物A液的优选配比为每100ml含1.84g磷酸氢二钠,0.510g柠檬酸,33μl质量浓度30%过氧化氢,去离子水50ml。底物B液的优选配比为每100ml含0.039gTMB,0.105g柠檬酸,0.0186g EDTA,20ml甘油,3ml DMSO,其余为去离子水。
作为优选,所述的PEG修饰的蛋白质标准品和PEG与酶的结合物,其PEG的分子量是1000-40000道尔顿。本发明的试剂盒是为了检测PEG修饰药物,而目前PEG修饰药物中的PEG比较常用的范围是1000-40000。作为优选,所述的PEG修饰的蛋白质标准品,其蛋白或多肽与活化的PEG的反应基团包括氨基、巯基或羧基;所述PEG与酶的结合物,其酶与活化的PEG反应基团包括氨基、巯基或羧基。蛋白质化学修饰主要包括以下几种酰化反应、氧化反应、还原反应、烷基化反应、芳香环取代反应,其中氨基参与酰化反应、烷基化反应,巯基参与酰化反应、烷基化反应、氧化反应、还原反应,羧基参与烷基化反应。
所述PEG与酶的结合物,其中的酶是辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或葡萄糖氧化酶。这三种酶是比较常用而且易得的酶,且这些酶常用的底物显色后的测定波长在400~500nm之间,而普通用户的酶标仪都配备有400~500nm之间的滤光片,因此这三种酶是比较好的选择。所述的PEG与酶的结合物,其制备方法为先处理酶再将处理后的酶和PEG反应,所述的先处理酶的方法是酶氧化法。先用酶氧化法处理酶,使酶带有活性基团如醛基等,这些活性基团能和PEG的氨基反应,形成PEG-酶的结合物,即为酶标记的PEG。
所述的PEG修饰的蛋白标准品,其采用双功能基团连接法的双功能基团包括碳二亚胺及其衍生物、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯或戊二醛;所述的PEG与酶的结合物,其双功能基团连接法的双功能基团包括碳二亚胺及其衍生物,4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯或戊二醛。
本发明人以上述方法所制备的包被有抗PEG单克隆抗体(以下简称抗PEG单抗)的酶标板,PEG修饰的蛋白质标准品,PEG与酶的结合物为核心,并结合上述试剂组装成能检测、识别PEG的甲氧基的所有PEG修饰药物,并对该方法进行验证,从而实现了本发明。
本发明的优点为 1.本发明建立的ELISA竞争法定量测定PEG修饰药物的试剂盒能定量测定不同的PEG修饰的不同药物,且所需设备检测都是常规的。
2.本发明的试剂盒检测灵敏度高,检测时间短,准确性高,适用性广。
3.本发明的试剂盒可用于药代动力学的研究或体外实验,应用范围更广。



图1为本发明的技术路线图。
图2为PEG-BSA的纯度考染图。第2道为用PEG修饰的BSA,第三道为修饰前的BSA。
图3为PEG修饰的不同蛋白质与PEG-HRP的竞争ELISA反应曲线,以及其相应的检测灵敏度及检测范围的曲线图。其中,X轴为PEG修饰药物的浓度,Y轴为相应的OD值。

具体实施例方式 以下通过具体的实施例对本发明的试剂盒作进一步详细地说明。
实施例1 一种定量测定PEG修饰药物的免疫法法检测试剂盒,包括设在盒体内的包被有抗PEG单抗的酶标板,PEG-BSA标准品,辣根过氧化物酶标记的PEG,稀释液,清洗液,底物A液,底物B液和终止液。
1.PEG修饰的蛋白质标准品PEG-BSA的制备 ①将50mg的BSA溶解到10ml PBS缓冲液。
②按BSA∶PEG=1∶1-9的比例称取活化的PEG5000溶解到去离子水,立即将二者混合反应1~4小时。此过程在4度冰箱进行。
③加入0.5M Tris 100μl,反应0.5~2h。
④将交联好的PEG-BSA分别装入透析袋中,在pH7.4浓度为0.05mol的PBS中透析过夜,换液3次,此过程在4度冰箱进行。
⑤将透析袋中的BSA-PEG移到离心管。
⑥测定其蛋白浓度,并根据所得的结果调整其浓度至1mg/ml。
⑦将其分装为1ml/管,放入-20℃保存备用。
本发明所述的PEG-BSA的纯度及含量检测分别采用SDS胶鉴定和BCA蛋白定量法。具体方法为 a.SDS胶检测PEG-BSA的蛋白纯度 用样品缓冲液将PEG-BSA和BSA分别稀释至0.25μg/ml,100℃水浴锅变性5min,取20μl样品,十孔梳,10%SDS胶,150V,50分钟-1.5小时。采用考染法进行蛋白位置确定,并扫描胶图分析,其结果如图2所示,交联后的PEG-BSA>90%,交联了PEG的BSA比理论的分子量要高,约150kd。其中1道为mark,2道为交联了PEG的BSA,3道为交联前的BSA。
上述样品缓冲液的配制62mmol/L Tris-HCl(pH 6.8),25%甘油,2%SDS,0.01%溴酚蓝,710mM beta-巯基乙醇,加去离子水定容到1L。
b.蛋白定量采用BCA定量法,采用pierce公司的试剂盒进行定量测定。具体的操作步骤详见pierce公司的产品说明书。
2.辣根过氧化物酶标记PEG的制备 a.辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)标记PEG ①将20mg的HRP溶解到去1ml离子水中。
②按HRP∶PEG=1∶1-9的比例称取活化的PEG溶解到HRP的水溶液,4℃避光反应1~4小时。
③加入0.5M Tris 100μl,4℃反应0.5~2h。
④将交联好的PEG-HRP分别装入透析袋中,pH7.4 0.05mol的PBS透析过夜,换液3次,此过程应在4℃冰箱进行。
⑤加入0.05%柳硫汞防腐,并加入25%的甘油,分装。
⑥放入-20℃保存备用。
b.PEG-HRP的工作浓度和抗体包被浓度的确定 ①包被液NaHCO32.93g,Na2CO31.59g定容至1000ml,pH9.6。
②用包被液将抗体稀释至不同的浓度,8,4,2,1,0.5,0.25,0.125,0.0625μg/ml加入,4℃过夜。
③封闭后,将交联好的HRP-PEG作1∶500,1∶1000,1∶2000,1∶4000,1∶8000,1∶16000,1∶32000,1∶64000稀释后加入,反应45分钟, ④用清洗液清洗3次后,加入底物显色15min。
⑤加入终止液终止显色反应。
⑥根据此实验结果确定其工作浓度为1∶12000,抗体的包被浓度为2μg/ml。
c.包装 在组装本试剂盒时,将HRP-PEG用HRP保护剂——pierce试剂稀释,过滤分装,有效期1年。每个试剂盒150μl,使用时用稀释液稀释60倍。4℃保存,有效期一年。
3.包被有抗PEG单克隆抗体的酶标板的制备 a.抗体制备 取健康成年的新西兰大耳白兔,用KLH-PEG作为免疫抗原免疫(KLH-PEG的制备方法与BSA-PEG相同),第一次以KLH-PEG加福氏完全佐剂乳化后,打兔子的皮下五点法免疫。第二次到第五次以KLH-PEG加福氏不完全佐剂充分乳化后免疫兔子。每次的免疫间隔时间为2周。免疫剂量0.5mg/次。最后于融合前三天,耳静脉注射,强化免疫,免疫剂量增加一倍,不加佐剂。取其脾脏,并分离脾细胞,与240E细胞(US5675063)融合。(融合方法参照陈志南编著的《抗体分子与肿瘤》。)利用ELISA方法筛选出阳性克隆,将阳性克隆用有限稀释法(参照薛庆善的《体外培养的原理》)单克隆化,得到分泌抗体效价最高的单克隆细胞株进行高密度扩大培养,并收集培养上清,用protein A亲和柱纯化。之后IgG定量,并测定其特异性。
b.抗体包被浓度确定 抗体包被浓度在上述2.b步骤中已确定,结果表明最佳的包被浓度为2μg/ml。
c.酶标板的制备,具体为 ①用包被液将抗体稀释至确定的浓度,100μl/孔。4℃过夜。
②每孔加入100μl的1%的BSA封闭,封闭1小时。
③清洗1次。
④加入100μl/孔的10%的海藻糖溶液处理板材1小时。
⑤拍干。
⑥用铝塑膜真空包被板材,每个包装必须加入干燥剂。
4.本试剂盒中其它主要材料的配方 1)稀释液的组分为每100ml含1gBSA,1ml质量浓度1%的柳硫汞,Tris 0.241g,NaCl0.584g,其余为去离子水,调节pH至7.4后,0.22μm低蛋白吸附滤膜过滤除菌。
2)清洗液的组分为每100ml含1ml质量浓度1%的柳硫汞,2.41gTris,5.84g NaCl,1ml Tween-20,其余为去离子水,调节pH至7.4后,0.22μm滤膜过滤除菌。
3)底物A的组分为每100ml含1.84g磷酸氢二钠,0.510g柠檬酸,33μl质量浓度30%过氧化氢,其余为去离子水,,0.22μm滤膜过滤除菌。
4)底物B的组分为每100ml含0.039gTMB,0.105g柠檬酸,0.0186g EDTA,20ml甘油,3ml DMSO,其余为去离子水,0.22μm滤膜过滤除菌。
实施例2 一种定量测定PEG修饰药物的免疫法法检测试剂盒,包括设在盒体内的包被有抗PEG单抗的酶标板,PEG-BSA标准品,碱性磷酸酶标记的PEG,稀释液,清洗液,底物A液,底物B液和终止液。
1.PEG修饰的蛋白质标准品PEG-BSA的制备 具体步骤同实施例1.1,但其中步骤②中所用的PEG为PEG40000。
2.碱性磷酸酶标记PEG的制备 碱性磷酸酶-PEG结合物的交联方法同实施例1中的2。不同的是,步骤a中的⑤,加入0.01%柳硫汞防腐,并加入5%的甘油。
3.包被有抗PEG单克隆抗体的酶标板的制备 同实施例1.3,不同的是,c.步骤中④加入100μl/孔的质量浓度20%的蔗糖和葡萄糖混合溶液处理板材,其中蔗糖和葡萄糖的重量比为1∶4。
4.本试剂盒中其它主要材料的配方 1)稀释液的组分为每100ml含0.5gBSA,1ml质量浓度2%的柳硫汞,Tris 0.1g,NaCl 0.5g,其余为去离子水,调节pH至7.4后,0.22μm低蛋白吸附滤膜过滤除菌。
2)清洗液的组分为每100ml含1ml质量浓度2%的柳硫汞,1g Tris,5g NaCl,1mlTween-20,其余为去离子水,调节pH至7.4后,0.22μm滤膜过滤除菌。
3)底物A的组分为每100ml含1g磷酸氢二钠,0.5g柠檬酸,30μl质量浓度30%过氧化氢,其余为去离子水,0.22μm滤膜过滤除菌。
4)底物B的组分为每100ml含0.03g TMB,0.1g柠檬酸,0.01g EDTA,20ml甘油,3mlDMSO,其余为去离子水,0.22μm滤膜过滤除菌。
实施例3 一种定量测定PEG修饰药物的免疫法法检测试剂盒,包括设在盒体内的包被有抗PEG单抗的酶标板,PEG-BSA标准品,葡萄糖氧化酶标记的PEG,稀释液,清洗液,底物A液,底物B液和终止液。
1.PEG修饰的蛋白质标准品PEG-BSA的制备 具体步骤同实施例1.1,但其中步骤②中所用的PEG为PEG1000。
2.葡萄糖氧化酶标记PEG的制备 葡萄糖氧化酶-PEG结合物的交联方法同实施例1中的2。不同的是,步骤a中的⑤,加入0.1%柳硫汞防腐,并加入50%的甘油。
3.包被有抗PEG单克隆抗体的酶标板的制备 同实施例1.3,不同的是,c.步骤中④加入100μl/孔的质量浓度0.3%的乳糖溶液处理板材。
4.本试剂盒中其它主要材料的配方 1)稀释液的组分为每100ml含3gBSA,1ml质量浓度1.5%的柳硫汞,Tris 0.3g,NaCl0.7g,其余为去离子水,调节pH至7.4后0.22μm低蛋白吸附滤膜过滤除菌。
2)清洗液的组分为每100ml含1ml质量浓度1.5%的柳硫汞,3g Tris,7g NaCl,1mlTween-20,其余为去离子水,调节pH至7.4后0.22μm滤膜过滤除菌。
3)底物A的组分为每100ml含2g磷酸氢二钠,1g柠檬酸,50μl质量浓度30%过氧化氢,其余为去离子水,,0.22μm滤膜过滤除菌。
4)底物B的组分为每100ml含0.08g TMB,0.2g柠檬酸,0.05g EDTA,20ml甘油,3mlDMSO,其余为去离子水,0.22μm滤膜过滤除菌。
实施例4本发明试剂盒的测定程序 1.加样 ①将待测的血清样品或其它样品用稀释液作1∶5稀释。
②取500μl去离子水将冻干的标准品溶解,此时标准品的浓度为200ng/ml。
③用稀释液将标准品稀释至梯度为150,100,70,40,20,10,2,0ng/ml。
④计算本次实验所需的HRP-PEG的量,用稀释液60倍稀释HRP-PEG。
⑤分别取等量①和④步骤所得的液体在转移板中充分混匀,同时分别取等量③和④步骤所得的液体在转移板中充分混匀之后分别取50μl加到包被有抗PEG单抗的酶标板中。30℃恒温孵育45分钟。
2.清洗 ①用去离子水将清洗液10倍稀释。
②倒出酶标板中的反应液体,每孔加入200μl的清洗液,清洗3次,并拍干。
3.加底物 ①将底物A和底物B作等体积混合。
②每孔加入100μl,37度显色1小时。
4.终止每孔加100μl终止液终止反应。
5.测定用酶标仪在450nm处测定每孔的OD值。
6.结果判定去除0ng/ml的OD值。将结果放入excel表格。以标准品浓度为横坐标,OD值为纵坐标,选择合适的曲线,并得出线性方程式。将样品的OD值代入线性方程式,即可按公式计算出样品的PEG含量。
实施例5本发明试剂盒的检测灵敏度及检测范围的测定 灵敏度通常用检测限(LOD)表示,LOD指能使标准液与抗体的结合水平发生统计学意义上的显著改变所需的标准物最小浓度,一般取B0(零浓度标准点)10次测定结果的平均值(X)减去其2倍标准差(SD),即按照如下公式进行计算 Y=[(X-2SD)/X]×100%,将y值代入标准曲线得到相应的质量浓度,即为该试剂盒理论上的检测下限(LOD),本实验的具体步骤如下 1.加样 ①同实施例4.1的步骤②,并准备2份0ng/ml的BSA-PEG。
②同实施例4.1的步骤③。
③同实施例4.1的步骤④。
分别取2份等量的0ng/ml的BSA-PEG和③步骤所得溶液在转移板中充分混匀,同时分别取等量②和③步骤所得溶液在转移板中充分混匀之后分别取50μl加到包被有抗PEG单抗的酶标板中。30℃恒温孵育45分钟。
2,3,4,5,6步骤同实施例4的2,3,4,5,6步骤。
7.重复上述测定10次。
8.按Y=[(X-2SD)/X]×100%,计算y值。其中X为10次测定结果的平均值,SD为标准差。
9.将y值代入标准曲线得到相应的质量浓度,即为该试剂盒理论上的检测下限(LOD),即灵敏度。测定出的理论值为0.36ng/ml,但考虑实际工作的需要,本试剂盒的检测灵敏度最终确定为1ng/ml。
用稀释液将标准品稀释为系列浓度,按照实施例4中的2-6步骤完成试验,并做出浓度与之对应的OD的标准曲线图,得出在0ng~75ng/ml时曲线较好,因此将检测范围定为0ng~75ng/ml,在此范围内能得到准确的检测结果,标准曲线如图3中所示。
实施例6本试剂盒的应用广泛性实验 a)将BSA-PEG,ADI-PEG,Mouse IgG用稀释液分别稀释为200,150,70,40,20,10,2,0ng/ml。
b)计算本次实验所需的HRP-PEG的量,用稀释液60倍稀释HRP-PEG。
c)分别取等量的a)和b)步骤所得的溶液在转移板中充分混匀,之后分别取50μl加到包被有抗PEG单抗的酶标板中。
d)同实施例4所述2-6步骤操作。
结果如图3所示,实验证明本试剂盒可用于上述3种PEG修饰物的检测,本发明中开发的PEG抗体能专一识别末端是甲氧基团的PEG,本发明的试剂盒理论上可以定量检测所有末端含有甲氧基团的PEG,即不论PEG修饰何种药物蛋白,只要PEG修饰药物中的PEG末端仍然含有甲氧基团,就能被本发明试剂盒定量检测出。通过用BSA-PEG,ADI-PEG,Mouse IgG-PEG测试可以看出,本发明的试剂盒均能定量检测这三种PEG修饰物,因此本发明试剂盒可以用于大多数PEG修饰药物的定量检测。
实施例7本试剂盒的精密度、准确性、重复性实验 1.精密度的测定 将标准品分别用细胞培养液和人血浆稀释3个不同的浓度,每个浓度3个复孔。按照竞争法ELISA重复测定20次,应用标准曲线的回归方程式计算出各浓度的测定值,计算批内和批间的变异系数,结果见表1和表2。
表1细胞培养液
表2人血浆
精密度是指同一样本用建立的方法重复取样分析,观察各次结果之间的变异系数Cv=标准差(S)/平均数(x)×100%的大小,变异系数越小,表明重复性越好,精密度越高。结论试剂盒的精密度好,重复性强,批次间差异符合要求。
2.回收率测定 将PEG-BSA分别用细胞培养液和人血浆分别稀释三个梯度,每个浓度6个重复,重复测定3次,并按下面的公式进行计算 回收率(100%)=实测浓度/添加浓度×100% 结果见表3 表3 结论不论是待检测的样品是血清,血浆或培养液,都能通过此试剂盒的测定得到较为准确的PEG修饰物的含量。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明,不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。如实施例1中所述的处理酶标板的糖溶液可以是含有蔗糖、葡萄糖、海藻糖、乳糖、半乳糖中的一种或一种以上的水溶液,其中糖的质量浓度为0.3~20%。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,做出的若干简单推演或替换,都应当视为属于本发明所提交的权利要求书确定的专利保护范围。
权利要求
1.一种ELISA竞争法定量测定PEG修饰药物的试剂盒,试剂盒内包含有酶标板、稀释液、清洗液、底物液、终止液,其特征在于还包括PEG修饰的蛋白质标准品,PEG与酶的结合物,所述的酶标板是包被有抗PEG单克隆抗体的酶标板,所述的PEG修饰的蛋白质标准品是用PEG和蛋白质或者多肽结合而成。
2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于所述的包被有抗PEG单克隆抗体的酶标板是用下述方法制成用KLH-PEG作为免疫抗原免疫新西兰大耳白兔,并取其脾脏与240E细胞融合,ELISA筛选,扩大生产,纯化单克隆抗体,将纯化的单克隆抗体包被酶标板封闭后,用糖溶液处理酶标板。
3.根据权利要求2所述的试剂盒,其特征在于所述的处理酶标板的糖溶液是含有蔗糖、葡萄糖、海藻糖、乳糖、半乳糖中的一种或一种以上的水溶液,其中糖的浓度为0.3~20%。
4.根据权利要求1或2或3所述的试剂盒,其特征在于包被有抗PEG单克隆抗体的酶标板,其抗体的包被浓度为2μg/ml。
5.根据权利要求1或2或3所述的试剂盒,其特征在于所述的PEG与酶的结合物,其制备方法为先处理酶再将处理后的酶和PEG反应,所述的先处理酶的方法是酶氧化法。
6.根据权利要求4所述的试剂盒,其特征在于所述的PEG与酶的结合物,其制备方法为先处理酶再将处理后的酶和PEG反应,所述的先处理酶的方法是酶氧化法。
7.根据权利要求1或2或3所述的试剂盒,其特征在于所述的PEG修饰的蛋白质标准品和PEG与酶的结合物,其PEG的分子量是1000-40000道尔顿;所述的PEG修饰的蛋白质标准品,其蛋白或多肽与活化的PEG的反应基团包括氨基、巯基或羧基;所述PEG与酶的结合物,其酶与活化的PEG反应基团包括氨基、巯基或羧基。
8.根据权利要求1或2或3所述的试剂盒,其特征在于所述PEG与酶的结合物,其中的酶是辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或葡萄糖氧化酶。
9.根据权利要求1或2或3所述的试剂盒,其特征在于所述的PEG修饰的蛋白标准品,其采用双功能基团连接法的双功能基团包括碳二亚胺及其衍生物、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯或戊二醛;所述的PEG与酶的结合物,其双功能基团连接法的双功能基团包括碳二亚胺及其衍生物,4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯或戊二醛。
10.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于
所述的稀释液的配比为0.5-3gBSA,质量分数0.01-0.02%的柳硫汞,0.1-0.3g Tris,0.5-0.7g NaCl,加去离子水至100ml,调节pH至7.4;
清洗液的配比为质量分数0.01-0.02%的柳硫汞,1-3g Tris,5-7g NaCl,1mlTween-20,加去离子水至100ml,调节pH至7.4;
底物液由底物A液和底物B液组成,其中底物A液的配比为1-2g磷酸氢二钠,0.5-1g柠檬酸,30-50μl质量浓度30%过氧化氢,加去离子水至100ml;
底物B液的配比为0.03-0.08gTMB,0.1-0.2g柠檬酸,0.01-0.05g EDTA,20ml甘油,3ml DMSO,加去离子水至100ml。
全文摘要
本发明涉及一种ELISA竞争法定量测定PEG修饰药物的试剂盒,试剂盒内包含有酶标板、稀释液、清洗液、底物液、终止液,还包括PEG修饰的蛋白质标准品和PEG与酶的结合物,所述的酶标板是包被有抗PEG单克隆抗体的酶标板,所述的PEG修饰的蛋白质标准品是用PEG和蛋白质或者多肽结合而成。本发明的优点是检测灵敏度高,检测时间短,准确性高,能定量检测PEG修饰的药物,适用性广,可用于PEG修饰的不同药物的定量检测以及体内体外的定量检测。
文档编号G01N33/543GK101603965SQ20091030140
公开日2009年12月16日 申请日期2009年4月8日 优先权日2009年4月8日
发明者余国良 申请人:宜康(杭州)生物技术有限公司

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