弓形虫P35血清IgM抗体免疫胶体金检测试纸条及其制备方法

xiaoxiao2020-7-23  9

专利名称:弓形虫P35血清IgM抗体免疫胶体金检测试纸条及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种利用胶体金免疫层析技术检测血液中弓形虫IgM抗体水平的试 纸条及其制备方法,属于医学和生物学检验领域。
背景技术
弓形虫是由一种弓形虫寄生引起的感染,世界各地的弓形虫感染非常普遍。 1985-1990年我国的23个省、市、自治区的调查,大都在10%以下。正常人感染弓形虫绝大 多数没有症状,或者症状很轻,不知道是什么时候感染的,只有少数人初次感染(或称原发 性感染)时有发热、淋巴结肿大、头痛、肌肉关节痛和腹痛,几天或数周后随着人体产生免 疫力,症状小时,只是形成的包囊在身体里存在几个月、好几年或者更长时间, 一般都是自 愈。吃未煮熟的肉,特别是猪、羊。几乎所有哺乳动物和鸟类,如鼠类、猪、羊、牛、家兔和鸡、 鸭、鹅等,都可以传染弓形虫,而且感染率很高。人的传染来源主要来自于这些动物的肉类, 如涮肉的温度不够和时间过短,其中的弓形虫没有杀死,就有传染的危险。生肉或切肉案板 的污染同样可以传染。污染的羊、牛奶也可以传染。 现有检测弓形虫抗体的方法主要是通过酶联免疫吸附(EIA)来检测,该方法有不 足之处。主要表现以下几方面需要专门的仪器设备来配合使用;试剂要求低温保存;检测 人员需要经过专业的培训;操作过程相对比较复杂,检测所需的时间较长;检测所需费用 较高,不能实现单人份检测;不利于在基层单位及临床的推广使用。也有采用虫体抗原的胶 体金诊断试剂,但由于抗原是多种蛋白的复合物,假阳性较多,采用基因重组抗原则可以有 效克服以上缺陷。弓形虫表面抗原P35可以有效激发机体的免疫反应,可用来检测人血清 中的抗P35抗体,用于弓形虫感染的诊断。

发明内容
为克服现有弓形虫抗体检测技术的不足,本发明提供一种快速检测弓形虫P35血 清IgM抗体的试纸条。不需要任何仪器设备辅助的快速检测试剂。本发明根据胶体金免 疫层析技术特点和弓形虫P35基因重组抗原系统特点,设计新的原材料,试剂和工艺流程, 应用本发明提供的试纸条检测弓形虫IgM抗体水平,具有简单,快速,灵敏和特异性好等特 点,30分钟以内出结果,并且价格低,适用于基层检测和临床初筛。 本发明所述试纸条是由PVC底板(1)上依次接合吸水垫(2)、特定包被的硝酸纤维 膜(3)、涂覆胶体金标记弓形虫P35基因重组抗原的玻璃纤维胶体金结合垫(6)、样品垫(7) 而组成的条形物。检测样品经过样品垫和结合垫再经层析作用在NC膜上出现检测线和质 控线,用肉眼判断结果。在NC膜上仅仅出现一条质控线,结果为阴性,在NC膜上同时出现 检测线和质控线,结果为阳性性,不出现线条表示试纸条或测试卡失效。30分钟内出结果。
本发明所述试纸条吸水垫为一种滤纸,包括吸水纸和滤油纸,切成要求大小直接 使用。贴在底板的末端,起吸水作用。
本发明所述试纸条上特定包被的NC膜是一种专门用于胶体金试纸条的材料,由 一层滤膜和胶膜组成,成巻筒装,NC膜上喷2条线,分别为检测线和质控线,检测线喷涂的 是鼠抗人IgM(y链),质控线喷涂的是兔抗P35 ;NC膜贴在底板的中间,两端分别与结合垫 和吸水垫连接。 本发明所述试纸条上结合垫为玻璃纤维纸,喷涂上胶体金标记弓形虫P35基因重 组抗原,再37t:干燥,结合垫上与样品垫衔接,下与NC膜衔接。 本发明所述试纸条样品垫为玻璃纤维纸,用硼酸缓冲液浸泡处理,缓冲液ra为
7. 2,浸泡处理后,37t:干燥过夜,在试剂条中起过滤样品的作用,位于结合垫上,贴在底板 上。 本发明还提供上述试纸条在制备弓形虫P35血清IgM抗体诊断试纸条中的应用, 诊断试纸条还包括标识条,此标识条为两个带有标识的不干胶纸,分别粘贴在试纸条的两 端,带有箭头端是贴在样品垫和结合垫上,由此端浸入待测样品,靠另一端的吸水垫的吸水 作用,使样品经过NC膜。 本发明还提供上述试纸条在制备弓形虫P35血清IgM抗体测试卡中的应用,测试 卡还包括塑料卡,此塑料卡是一个用塑料特制的卡,由上下2片组成,上下片可嵌合在一 起,下片主要有一个放试纸条的槽和与上片结合的卡齿,上片主要包括一个检测孔、一个样 品孔以及与下片结合的卡齿,检测孔旁边分别印有T和C字样,T表示检测线的位置,C表示 质控线的位置,检测孔是观察结果的窗口,样品孔是滴加样品的位置。此塑料卡起保护试纸 条的作用,并且更美观,减少污染和保护操作者的安全。
本发明所述试纸条的制备方法,包括如下步骤 1)弓形虫P35基因重组抗原,自制或购买,分子量35kDa,纯度10ug上样 SDS-PAGE —条带。 2)鼠抗人-IgM(ii链),自制或购买。 3)兔抗P35制备方法通过弓形虫P35基因重组抗原免疫家兔,提取兔血清,纯化
后得到兔抗P35。 4)胶体金的制备 a量取一定量的洗液于洁净的烧瓶中,煮沸5分钟;
b量取一定量的超纯水于该烧瓶中,煮沸5分钟; c弃去超纯水,称取适量三蒸水于该烧瓶中,加热至沸腾,加入适量1%氯金酸,加 热至沸腾; d搅拌下加入6 10毫升1 %柠檬酸三钠,沸腾5-10分钟;
5)胶体金探针标记 取胶体金100毫升,调节胶体金溶液ra值8. 0,搅拌加入1毫升弓形虫P35基因重 组抗原,再缓慢加入1毫升10% BSA充分混匀,搅拌,离心弃上清,加入工作液溶解;
6)制备检测弓形虫血清IgM抗体的胶体金免疫试纸条 用喷涂机将标记弓形虫P35基因重组抗原的胶体金溶液喷在玻璃纤维膜上,37t: 干燥;将制备好的试剂条板上NC膜用喷膜机分别喷上鼠抗人-IgM(ii链)和质控抗体(兔 抗P35),喷完后37t:干燥过夜;将吸水垫、已包被的硝酸纤维膜、玻璃纤维胶体金结合垫、 样品垫依次粘于底板上,裁成细条,即成一种检测弓形虫血清IgM抗体的胶体金免疫试纸
4条。 上述胶体金制备过程中,优选后的条件为三蒸水200毫升,氯金酸10毫升,柠檬酸三钠7.5毫升。 本发明的有益效果应用本发明提供的试纸条检测人体内弓形虫P35血清IgM抗体水平,成本低廉,操作简单、快速、灵敏,且特异性好,不需要特殊检测仪器设备,因此可广泛应用于各级医疗检验场所,尤其是基层医疗机构,包括乡镇卫生院等均可开展。本发明有益于弓形虫IgM抗体筛查的普及,进而对于弓形虫事件发生的预防有极为重要的意义。


图1为本发明的结构示意图 1 :PVC底板;2 :吸水垫;3 :特定包被的硝酸纤维膜;4 :检测线;5 :质控线;6 :结合垫;7:样品垫。 图2为本发明的检测结果示意图 a :阳性;b :阴性;C :无效;4 :检测线;5 :质控线。 图3为本发明的试纸条外观示意图 a :样本垫;b :结合垫;C :检测线;d :质控线;e :试纸条名称 图4为本发明的测试卡外观示意图 a :样本孔;b :测试孔;T :检测线;C :质控线。
具体实施例方式
下面结合具体实施方式
对本发明作进一步说明,凡依照本发明公开内容所作出的
本领域等同替换,均属于本发明的保护范围。
实施例1 : 弓形虫P35血清IgM抗体胶体金免疫试纸条制备方法,它包括如下步骤
1、胶体金的制备 量取一定量的洗液于洁净的250ml三角烧瓶中,煮沸5分钟;量取一定量的超纯水于该烧瓶中,煮沸5分钟;弃去超纯水,称取200ml超纯水于该烧瓶中,加热至沸腾,加入1%氯金酸10ml,边煮边搅拌,加热至沸腾;搅拌下加入1%柠檬酸三钠10ml,沸水下快速搅拌,直到氯金酸溶液的颜色慢慢稳定,呈红色后,继续沸腾5分钟,制成小颗粒胶体金。
2、制备检测弓形虫P35血清IgM抗体的胶体金免疫试纸条 用喷涂机将标记弓形虫P35基因重组抗原的胶体金溶液喷涂在玻璃纤维膜上,
37t:干燥;将制备好的试剂条板上NC膜用喷膜机分别喷上鼠抗人-IgM(ii链)和质控抗体
(兔抗P35)。喷完后37t:干燥过夜。将吸水垫、已包被的硝酸纤维膜、玻璃纤维胶体金结合
垫、样品垫依次粘于底板上,裁成细条,即成一种检测弓形虫P35血清IgM抗体的胶体金免
疫试纸条。
实施例2 : 弓形虫P35血清IgM抗体的胶体金免疫诊断试纸条制备方法,它包括如下步骤
将两个带有标识的不干胶纸(标识条)分别粘贴在实施例2中所制备试纸条的两端,带有箭头端是贴在样品垫和结合垫上,由此端浸入待测样品,靠另一端的吸水垫的吸水作用,使样品经过NC膜。即成一种检测弓形虫P35血清IgM抗体的胶体金免疫诊断试纸条。
见图3。
实施例3 : 弓形虫P35血清IgM抗体的胶体金免疫诊断测试卡制备方法,它包括如下步骤
将实施例2中所制备试纸条放入塑料卡下片试纸条槽中,与上片嵌合,即成一种检测同型半胱氨酸的胶体金免疫诊断测试卡,见图4。此塑料卡是一个用塑料特制的卡,由上下2片组成,上下片可嵌合在一起,下片主要有一个放试纸条的槽和与上片结合的卡齿,上片主要包括一个检测孔(见图4b)、一个样品孔(见图4a)以及与下片结合的卡齿,检测孔旁边分别印有T和C字样,T表示检测线的位置,C表示质控线的位置,检测孔是观察结果的窗口 ,样品孔是滴加样品的位置。
实施例4 : 弓形虫P35血清IgM抗体免疫胶体金诊断层析试纸条使用方法 如图3所示,将试纸条样品垫插入待测液中,浸润后取出,水平放置,约30分钟后,
仅在质控线C处出现一条线,结果为阴性;在检测线T和质控线C处分别出现一条线,结果
为阳性;不出现线条表示测试条失效。
实施例5 : 弓形虫P35血清IgM抗体免疫胶体金诊断层析测试卡使用方法 如图4所示,将样本加入样本孔a,加样量75微升 80微升,水平放置,约30分钟
后,仅在测试孔b的质控线C处出现一条线,结果为阴性;在测试孔b的检测线T和质控线
C处分别出现一条线,结果为阳性;不出现线条表示测试卡失效。
权利要求
一种检测弓形虫P35血清IgM抗体的免疫胶体金层析试纸条,其特征在于所述试纸条是由PVC底板(1)上的依次接合吸水垫(2)、特定包被的硝酸纤维膜(NC膜)(3)、NC膜上有检测线(4)和质控线(5),喷涂胶体金标记弓形虫P35基因重组抗原的玻璃纤维胶体金结合垫(6)、样品垫(7)而组成的条形物。所述试纸条其特征在于所述吸水垫(2)为一种滤纸,包括吸水纸和滤油纸;吸水垫贴在底板的末端。所述试纸条其特征在于所述特定包被的NC膜(3)由一层滤膜和胶膜组成,NC膜上喷涂鼠抗人-IgM(μ链)和兔抗P35;NC膜贴在底板的中间,两端分别与结合垫和吸水垫连接。所述试纸条其特征在于所述结合垫(6)为玻璃纤维纸,喷涂上胶体金标记的弓形虫P35基因重组抗原,再37℃干燥,结合垫上与样品垫衔接,下与NC膜衔接。所述试纸条,其特征在于所述样品垫(7)为玻璃纤维纸,用硼酸缓冲液浸泡,缓冲液PH为7.2,浸泡处理后,37℃干燥过夜;样品垫位于结合垫上。所述的试纸条在制备弓形虫血清IgM抗体诊断试纸条中的应用,其特征在于诊断试纸条还包括标识条,此标识条为两个带有标识的不干胶纸,分别粘贴在试纸条的两端,带有箭头端是贴在样品垫和结合垫上,由此端浸入待测样品,靠另一端的吸水垫的吸水作用,使样品经过NC膜。所述的试纸条在制备弓形虫血清IgM抗体测试卡中的应用,其特征在于测试卡还包括塑料卡,此塑料卡是一个用塑料特制的卡,由上下2片组成,上下片可嵌合在一起,下片主要有一个放试纸条的槽和与上片结合的卡齿,上片主要包括一个检测孔、一个样品孔以及与下片结合的卡齿,检测孔旁边分别印有T和C字样,T表示检测线的位置,C表示质控线的位置,检测孔是观察结果的窗口,样品孔是滴加样品的位置。
2. —种检测弓形虫血清IgM抗体的免疫胶体金层析试纸条的制备方法,包括如下步骤1、弓形虫P35基因重组抗原自制或购买,分子量35kDa,纯度10ug上样SDS-PAGE —条带。2、鼠抗人-IgM(ii链)自制或购买。3、兔抗P35制备方法通过形虫P35基因重组抗原免疫家兔,提取兔血清,纯化后得到兔抗P35。 4、胶体金的制备a)量取一定量的洗液于洁净的烧瓶中,煮沸5分钟;b)量取一定量的超纯水于该烧瓶中,煮沸5分钟;C)弃去超纯水,称取适量三蒸水于该烧瓶中,加热至沸腾,加入适量1%氯金酸,加热至沸腾;d)搅拌下加入6 10毫升1%柠檬酸三钠,沸腾5-10分钟;5、胶体金探针标记取胶体金100毫升,调节胶体金溶液ra值8.0,搅拌加入l毫升弓形虫P35基因重组抗原,再缓慢加入l毫升10% BSA充分混匀,搅拌,离心弃上清,加入工作液溶解;6、制备检测弓形虫血清IgM抗体的胶体金免疫试纸条用喷涂机将标记弓形虫P35基因重组抗原的胶体金溶液喷涂在玻璃纤维膜上,37t:干燥;将制备好的试剂条板上NC膜用喷膜机分别喷上鼠抗人-IgM(i!链)和质控抗体(兔抗P35),喷完后37t:干燥过夜;将吸水垫、已包被的硝酸纤维膜、玻璃纤维胶体金结合垫、样品垫依次粘于底板上,裁成细条,即成一种检测弓形虫血清IgM抗体的胶体金免疫试纸条。所述制备方法其特征在于c)步中所述三蒸水为200毫升,所述氯金酸为10毫升,d)步中所述柠檬酸三钠为7. 5毫升。
全文摘要
本发明属于医学和生物学检测领域,涉及一种检测弓形虫P35血清IgM抗体免疫胶体金检测试纸条及其制备方法。该试纸条是由PVC底板(1)上的依次接合吸水垫(2)、特定包被的硝酸纤维膜(NC膜)(3)、NC膜上有检测线(4)和质控线(5),喷涂胶体金标记弓形虫P35基因重组抗原的玻璃纤维胶体金结合垫(6)、样品垫(7)而组成的条形物。应用本发明所提供的试纸条检测人血清中弓形虫IgM抗体水平,具有操作简单、快速、灵敏和特异性好等特点,操作人员无需专业培训,按说明书即可完成操作,具有良好的应用前景。
文档编号G01N33/552GK101793895SQ200910304120
公开日2010年8月4日 申请日期2009年7月8日 优先权日2009年7月8日
发明者华艳, 吕传臣, 马运国 申请人:北京现代高达生物技术有限责任公司

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