新的转运蛋白构建物和转运蛋白货物结合分子的制作方法
专利名称：新的转运蛋白构建物和转运蛋白货物结合分子的制作方法
新的转运蛋白构建物和转运蛋白货物结合分子本发明涉及新的通式(I)D1LLLxDm(LLLyDn)a的转运蛋白构建物及其变体。本发明还涉及转运蛋白货物结合分子，特别是具有货物部分的新的转运蛋白构建物结合物，货物部分例如蛋白质或肽、核酸、细胞毒性剂、有机分子等。此外，本发明公开了包括这些结合物的 (药物)组合物和牵涉这样的转运蛋白构建物的治疗方法和用途。使感兴趣的物质，如核酸、蛋白质或细胞毒性剂，而且还有其它(治疗上有用的) 化合物能够从外部介质有效地转移进组织或细胞，特别是转移到细胞核的技术在生物技术领域相当受关注。这些技术可适于体外和体内运输并翻译核酸进细胞，并因此适于蛋白质或肽生产、适于基因表达调节、适于细胞毒性效应或凋亡效应的诱导、适于细胞内过程的分析以及适于运输各种不同货物进细胞(或细胞核)的影响的分析等。感兴趣货物从外部介质到组织或细胞的这种转移的一个重要应用是基因治疗，其中所述货物通常是核酸或基因。管该技术在过去十年已显示一些相当有前景的发展，但是基因转移通常受限于基因转移载体不能有效地将生物活性货物转移进将被治疗的宿主的细胞质或细胞核而不影响宿主基因组或改变活性货物的生物学性质。在这方面，已发展了几项技术，以努力更有效地将例如核酸，如DNA或RNA，转染进细胞。通过基因转移的方法将核酸转染进患者的细胞或组织是分子医学的重要方法并在众多疾病的治疗和预防中起关键作用。基因转移方法的代表性例子包括普通(物理的或物理化学的)方法如用磷酸钙或 DEAE-葡聚糖共沉淀核酸，这是能使核酸穿透质膜然后进入细胞和/或细胞核的方法。然而，该技术遭受低转移效率和高百分比细胞死亡的困扰。另外，由于其本身的性质，该方法局限于体外或离体方法，但不适用于体内情况。对于涉及体外电穿孔的方法同样如此。体外电穿孔基于高压电流的使用，使细胞膜变得可透过，以允许新的核酸，例如DNA或RNA引入细胞。然而，这样的方法通常不适于体内。此外，该技术同样遭受低转移效率和高百分比细胞死亡的困扰。另外熟知的物理或物理化学方法包括(裸)核酸的(直接)注射或生物射弹基因转移。生物射弹基因转移(也称作生物射弹粒子轰击)是在康奈尔大学开发的方法，其允许将遗传物质引入组织或培养细胞。生物射弹基因转移通常通过表面包被金属的颗粒，如金或银颗粒而完成，并通过使用基因枪将包括被吸附的DNA的这些金属颗粒射进细胞。与上面所讨论的相似，该方法局限于体外或离体方法，但通常不适用于体内情况。其它方法利用所谓的转运分子的转运能力。将在该上下文中使用的转运分子通常可以被分为病毒载体，即转运分子，其包括病毒元件(viral element)；以及非病毒载体。当今可利用的最成功的基因治疗策略依赖于病毒载体，如腺病毒、腺伴随病毒、逆转录病毒和疱疹病毒。这些病毒载体通常应用对DNA和核酸具有强亲和力的病毒相关物质的结合物。由于其感染性质，病毒或病毒载体具有非常高的转染速率。以在转染的细胞中不形成功能性感染颗粒的方式，基因修饰通常使用的病毒载体。然而，尽管有这个安全措施， 但是存在许多与涉及免疫原性、细胞毒性和插入诱变的病毒载体有关的问题。举例来说，不能排除引入的治疗上有活性的基因或病毒基因的不受控增殖的危险，例如，由于可能的重组事件。另外，病毒结合物难于利用并通常在治疗之前需要长期的制备(参考，例如，美国专利号 5，521，291)。尽管非病毒载体不象病毒载体一样有效，但是已开发了许多非病毒载体以在基因治疗中提供更安全的选择。最常见的非病毒载体中的一些包括聚乙稀亚胺、树状聚体、壳聚糖、聚赖氨酸和基于肽的转运蛋白系统，例如许多种类的肽，它们通常本性是阳离子的并能与核酸诸如质粒DNA通过静电相互作用而相互作用。为了成功的输送，非病毒载体，特别是基于肽的转运系统必须能克服许多障碍。这样的障碍包括在运输期间货物部分，例如DNA或其它化合物的保护，以及货物部分在体内早期降解或代谢的预防。在核酸，如DNA和RNA分子的情况下，非病毒载体必须另外能特异性地输送这些分子，以在靶细胞中有效表达基因。尤其是对于核酸，如DNA和RNA分子，非病毒载体目前必须克服4个障碍以达到成功地输送基因(参考，例如 Martin et al. ,The AAPS Journal 2007 ；9 (I)Article 3)。非病毒载体必须能1)紧密地结合并保护核酸，2)它必须能靶向特异的细胞表面受体，3)非病毒载体必须能分裂内体膜，和4)它必须将核酸货物输送到核并允许编码的蛋白质或肽序列的翻译。这样的非病毒载体，特别是基于肽的非病毒载体，相对于其它非病毒策略有利，因为它们一般而言能到达所有这4个目的，然而，关于不同的障碍具有不同的效率。举例来说，富含碱性残基如赖氨酸和/或精氨酸的阳离子肽能有效地将核酸如 DNA浓缩成可以稳定于血清中的小的紧密的颗粒。此外，肽配体与多聚物/核酸复合物 (polyplex)的连接允许靶向特异受体和/或特异细胞类型。如上述的多聚物/核酸复合物或阳离子聚合物通常与带负电荷的核酸形成复合物，所述复合物导致核酸的浓缩，并保护这些核酸免于降解。利用多聚物/核酸复合物(阳离子聚合物)向运细胞运输通常通过受体介导的胞吞作用而发生。因此，通过例如结合到表面受体并触发胞吞作用的多聚物/核酸复合物聚左旋赖氨酸(PLL)，将DNA偶联到独特的分子，如转铁蛋白。多聚物/核酸复合物(阳离子聚合物)包括例如聚左旋赖氨酸(PLL)、壳聚糖、聚乙稀亚胺(PEI)、聚甲基丙烯酸二甲胺乙酯(polydimethylaminoethylmethacrylate) (PD-MAEMA)、聚酰胺(PAMAM)。这样的作用还从纳米颗粒/核酸复合物(nanoplexes)(纳米颗粒系统)或脂质/核酸复合物 (lipoplexes)(脂质体系统)得知。纳米颗粒/核酸复合物(纳米颗粒系统)通常包括聚丙烯酸酯、聚酰胺、聚苯乙烯、氰基丙烯酸酯、聚乳酸(polylactat) (PLA)、聚(乳酸乙醇酸共聚物)(PLGA)等的使用。脂质/核酸复合物或脂质体系统通常包括能模拟细胞膜的阳离子脂质的使用。因此，脂质带有正电荷的部分与核酸带有负电荷的部分相互作用，并因而能够与细胞膜融合。脂质/核酸复合物或脂质体系统包括，例如D0TMA、DOPE、D0SPA、DOTAP, DC-Cho 1、EDMPC 等。在该上下文中，受体介导的胞吞作用在实验系统中同样被广泛利用，以向细胞靶内向输送货物如核酸或治疗剂。在受体介导的胞吞作用期间，含有货物的复合物被位于细胞膜中的对该货物特异的受体或者位于细胞膜组分中的特异抗体选择性地内在化。针对包括IgG Fe、生长抑素、胰岛素、IGF-I和-II、转铁蛋白、EGF、GLP-I、VLDL或整合素受体等在内的许多受体，已经描述了胞吞作用活性。通过受体介导的胞吞作用，已经广泛检验了不同的肽或蛋白质序列在基因转移方法中的用途。令人惊奇地，通过噬菌体展示技术的应用，已经深深地推动了指导有效的受体介导的胞吞作用的肽序列的分离。噬菌体展示文库是极其强大的工具，其为细胞受体提供分子变体的实际上无限的来源以及短肽，所述变体包括对天然配体或货物部分的修饰。相似的文库也已被直接注射进小鼠中，并且肽序列已被成功地分离，所述序列显示对脑和肾的13倍的选择性。前蛋白转化酶可作为可用于将分子运输至细胞的肽或蛋白质序列的例子。前蛋白转化酶是细胞表面受体的例子，其通过受体介导的胞吞作用变得内在化。已经显示，这些蛋白质是造成肽激素、神经肽和许多其它蛋白质的前体转变成其生物学活性形式的原因。前蛋白转化酶家族的所有切割位点遵从共有序列R-X-X-R。哺乳动物前蛋白转化酶在其组织分布的基础上可以分成三组。弗林蛋白酶、PACE4、PC5/PC6和LPCIPC7/PC8/SPC7在广泛范围的组织和细胞系中表达。相反，PC2和PC1/PC3的表达限于神经内分泌组织，如胰岛、垂体、肾上腺髓质和许多脑区域。PC4的表达高度局限于睾丸生精细胞。神经内分泌特异转化酶——PC2和PC1/PC3主要位于分泌颗粒中。也已经报道PC5/PC6A位于分泌颗粒中。此外，间接的证据已经表明，一部分前蛋白转化酶分子存在于细胞表面上，并且已经显示，弗林蛋白酶在TGN和细胞表面之间循环。总之，这些性质表明，前蛋白转化酶将细胞外配体运输进细胞内间隙。所谓的易位蛋白(translocatory protein)或蛋白转导结构域(PTDs)也是有利的。来源于易位蛋白或蛋白转导结构域(PTDs)的肽序列通常能在其酸性环境中选择性地裂解内体膜，导致多聚物/核酸复合物的胞质释放。易位蛋白被认为是能影响大分子在细胞(易位蛋白)之间转运的一组肽，如HIV-I TAT(HIV)、触角(果蝇属(Drosophila)触角)、 HSV VP22(单纯疱疹)、FGF或乳铁蛋白等。相反，蛋白转导结构域(PTDs)被认为是能指导与这些序列共价结合的蛋白质和肽通过细胞膜进入细胞的一组肽(Leifert and Whitton Translocatory proteins and protein transduction domains :a critical analysis of their biological effects and the underlying mechanisms. Molecular Therapy Vol. 8 No. 1 2003)。易位蛋白共有的以及PTDs共有的是碱性区，由于所述碱性区能结合聚阴离子如核酸，其被认为是造成融和肽转运的主要原因。利用受体依赖的非饱和吸附胞吞作用，在没有结合到其上的情况下，PTDs可以发挥与阳离子转染试剂相似的作用。当给予基于疫苗的肽时，为了实现或增强CTL应答，PTDs通常与蛋白质或肽偶联(参考综述Melikov and Chernomordik， Arginine-rich cell penetrating(poly-)peptides s :from endosomal uptake to nuclear delivery, Cell.Mol.Life Sci·2005)。令人遗憾的是，由于肽酶，基于肽的转运蛋白系统典型地在体内遭受蛋白质水解性降解，导致截短的转运蛋白(和/或货物)序列。可将这样的肽酶区分为外肽酶和内肽酶，它们都是能通过被称作蛋白水解的过程催化蛋白质分裂成较小的肽部分甚至分裂成单个氨基酸的酶。在该上下文中，内肽酶是典型地蛋白水解肽酶，其破坏非末端氨基酸(即分子内)的肽键。内肽酶对某些氨基酸是典型地特异的。内肽酶的例子包括例如胰蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、胃蛋白酶和内肽酶V等。已知胰蛋白酶在Arg或Lys之后切割，除非后面跟着ftx)。已知糜蛋白酶在Phe、Trp或Tyr之后切割，除非后面跟着ftx)。 糜蛋白酶在Asn、His、Met或Leu之后较慢地切割。弹性蛋白酶在Ala、Gly、Ser或Val之后切割，除非后面跟着1^0。嗜热菌蛋白酶是一种热稳定的内切蛋白酶，其在IleJetJhe、Trp, Tyr或Val之前切割，除非前面是ftx)。嗜热菌蛋白酶有时在Ala、Asp、His或Thr之后切割。已知胃蛋白酶在Leu、Phe、Trp或Tyr之前切害I]，除非前面是ftx)。最后，已知内肽酶V8在Glu之后切割。与内肽酶不同，外肽酶是催化将氨基酸从多肽链的末端去除并因此切割所述多肽链末端的酶。可根据它们的切割位点将外肽酶区分为氨肽酶和羧肽酶。氨肽酶是典型地锌依赖性酶并由小肠的腺体产生。氨肽酶通常切割来自肽或蛋白质序列的氨基末端的单个氨基酸。羧肽酶是水解肽键的羧基末端(C末端)的典型的酶。人类、动物和植物含有几种类型的具有范围从分解代谢到蛋白质成熟的不同功能的羧肽酶，该酶是存在于胰液中的消化酶，将从肽的羧基端切割单个氨基酸。特定的例子是羧肽酶N(CPN)，由两个具有酶活性的小亚基和两个保护酶抵御降解的大亚基组成的血浆锌金属蛋白酶。CPN切割来自生物学上有活性的肽诸如补体过敏毒素、激肽和血纤肽的羧基末端氨基酸精氨酸和赖氨酸。为了改变如上面所定义的基于肽的转运蛋白系统的蛋白酶剪切，基于肽的转运蛋白系统可完全由D-氨基酸组成，因此形成“逆反肽序列(retro-inverso peptide sequences) 术语“逆反(肽)序列”指线性肽序列的异构体，其中序列的方向是反向的， 每个氨基酸残基的手性是颠倒的(参见例如Jameson et al.，Nature，368，744-746 (1994)； Brady et al.，Nature，368，692-693 (1994))。组合D-对映体氨基酸和反向合成的优点是交换每个酰胺键的羰基和氨基的位置，而保持侧链基团在每个α碳的位置。由于基于肽的转运蛋白的肽序列天然存在的L-对映体氨基酸的构象改变为D-对映体氨基酸，体内蛋白酶剪切的危险消除了，这对货物部分转染进细胞的目的是有利的和高度有效的。相反，术语 “反向序列”指序列的方向是反向的序列(但是每个氨基酸残基的手性不是颠倒的(例如D -Arg-L-Arg-L-Arg 一 L-Ar g-L-Ar g-D-Ar g)0然而，尽管作为如上面所定义的转运蛋白分子有效地工作，但是这样的基于肽的转运蛋白的肽序列天然存在的L-对映体氨基酸的构象改变为D-对映体氨基酸使承担在细胞的整个生命期间这些转运蛋白在细胞中显著积累或在更长时间里这些转运蛋白在(周围)组织或器官中显著积累的危险。因此，即使期间切割开或代谢连接的货物部分，这样的转运蛋白仍可残留在细胞中并参与进一步的细胞间和细胞内过程，导致未知的和不需要的副作用。因此，在本领域中需要提供可选的非病毒转运蛋白分子，优选地是如上面所定义的基于肽的转运蛋白系统，其避免在细胞或组织中这样的不需要的积累但仍然允许货物部分有效地转移进细胞。如所附的权利要求书中所定义的主题，特别是如权利要求书中所定义的新的转运蛋白构建物和其结合物(转运蛋白货物结合分子)解决了上面的目的。利用如权利要求书中所定义的新的转运蛋白构建物和其结合物的方法和用途进一步解决了上面的目的。根据本发明的第一个方面，通过包括通式(I) (SEQ ID NO 1)的至少一个序列的新型转运蛋白构建物或由通式(I) (SEQ ID NO 1)的至少一个序列组成的新型转运蛋白构建物解决本发明的目的D1LLLxDm(LLLyDn)a其中D是D-氨基酸；L是L-氨基酸；
a是0-3，优选地0_2，更优选地0、1、2或3，甚至更优选地0、1或2，最优选地1 ；1、m和η相互独立地是1或2，优选地1 ；χ和y相互独立地是0、1或2，优选地1。如本文所用，术语“转运蛋白构建物”指含有氨基酸的化合物，其能易位跨过生物膜。如本文所用，术语“运输序列”(或转运蛋白序列)指提供跨过生物膜易位的氨基酸序列。因此，根据本发明转运蛋白构建物包括允许转运蛋白构建物易位跨过生物膜的运输序列。因此，根据通式(I)的新的转运蛋白构建物有效地允许并可提供货物部分，例如蛋白质或肽、核酸、小的有机分子、抗原、细胞毒性剂等，运输进器官、组织、细胞(例如将被治疗的)、细胞亚区室和/或细胞核。有利地，发明的根据通式(I)的转运蛋白构建物足够稳定以防止在将货物部分运输到其靶位之前被蛋白酶降解。另一方面，发明的根据通式(I)的转运蛋白构建物不是永久地存在于细胞中，可在相当长的期限内被蛋白酶降解以避免不良副作用诸如新的发明转运蛋白或其结合物在细胞中的不需要的积累。如本发明人所令人惊讶地发现，只有通过上面定义的通式(I)的发明模式(本文也被描述为D-/L-模式)，可将这样的有益性质给予运输序列，特别是在本领域已知的任何运输序列，用如通式(I)中所定义的L-氨基酸的特定内容代替D-氨基酸的特定的内容和位置。该发明的D-/L-模式允许熟练的技术人员将如上面所定义的本发明新型转运蛋白构建物在细胞中的体内或体外持久性足够精确地定义为足够长的时间，以保证在相当长的期限内本发明新型转运蛋白构建物被蛋白酶降解之前本发明新型转运蛋白构建物给予到和进入细胞或细胞核。该细胞中本发明新型转运蛋白构建物的体内或体外持久性实际上依赖用如通式(I)中所定义的L-氨基酸的特定内容代替的D-氨基酸的特定内容和位置。此外，显示发明的上面定义的通式(I)的D-/L-模式的转运蛋白构建物足够短以避免诸如下面定义的转运蛋白货物结合分子中本发明新型转运蛋白构建物对货物部分的空间位阻。它还允许这样的本发明新型转运蛋白构建物的有成本效益的制备。另外，可容易地形成上面定义的通式(I)的转运蛋白肽或蛋白与蛋白质或肽、核酸诸如DNA和RNA分子或与细胞毒性剂或甚至小的有机分子等的结合物。根据上面定义的通式(I)，本发明新型转运蛋白构建物包括根据如通式(I)所提出的特定D-/L-模式的L-氨基酸和D-氨基酸。在本发明的背景中，L-氨基酸，也称作L-对映体氨基酸，优选地是选自天然存在的氨基酸或其衍生物的氨基酸。天然存在的氨基酸典型地选自标准的(蛋白原的)氨基酸丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸、以及选自非标准氨基酸诸如鸟氨酸、瓜氨酸、同型半胱氨酸、S-腺苷甲硫氨酸、羟脯氨酸、硒代半胱氨酸、吡咯赖氨酸、羊毛硫氨酸、2-氨基异丁酸、脱氢丙氨酸、Y -氨基丁酸等。来自这样的L-氨基酸或L-对映体氨基酸的衍生物典型地包括这些氨基酸的任何天然或非天然存在的衍生物，包括，但不限于如上所定义的氨基酸，其包括翻译后修饰或合成修饰，包括乙酰化作用(在肽序列的N端，在赖氨酸残基处等)、脱乙酰作用、烷化诸如甲基化、乙基化等(优选地在肽序列内的赖氨酸或精氨酸残基处)、脱烷基化诸如脱甲基化、脱乙基作用等、酰胺化(优选地在肽序列的C端)、甲酰化、Y-羧化作用、谷氨酰化(glutamylation)、糖基化(优选地在肽序列内的天冬酰胺、赖氨酸、羟赖氨酸、丝氨酸或苏氨酸残基处等)、血红素或血红素部分的加成、羟基化、碘化作用、类异戊二烯部分诸如法尼基或栊牛儿基栊牛儿醇(geranylgeraniol)等的异戊二烯化加成)、硫辛酰化 (Iipoylation)((硫辛酸官能团的连接)，诸如异戊二烯化、GPI锚的形成，包括豆蔻酰化、 法尼基化、栊牛儿基忙栊儿基化(geranylgernaylation)等、氧化、磷酸化(例如对肽序列内的丝氨酸、酪氨酸(tytosine)、苏氨酸或组氨酸部分等)、硫酸化作用(例如酪氨酸的硫酸化作用)、硒化(selenoylation)、硫酸化作用等。L-氨基酸的衍生物也包括、但不限于修饰的L-氨基酸，其已经通过引入以下标记之一被修饰(i)放射性标记，即放射性磷酸化或带有硫、氢、碳、氮等的放射性标记；(ii)彩色染料(例如，地高辛配基(digoxygenin)等)；(iii)荧光基团(例如，荧光素、罗丹明、如下面所定义的荧光染料蛋白等)；(iv)化学发光基团；(ν)根据(i)至(iv)所述的两种或更多种标记的组合。L-氨基酸衍生物的尤其特别的例子包括、但不限于AMC (氨基甲基香豆素)、Dabcyl ( 二甲氨基苯基偶氮卞酉先(dimethylaminophenylazobenzoyl)) > Dansyl (二甲氨基萘磺酰(dimethylaminonaphtalenesulfonyl))、FAM(羧基荧光素 (carboxyfluoroscein)), Mca(甲氧基香豆素乙酰基)、Xan (咕吨基)、Abu (氨基丁酸)、 β -Ala ( β -丙氨酸)、E-Ahx (6-氨基己酸)、α -Aib ( α -氨基异丁酸)、Ams (氨基丝氨酸 (aminoserine))、Cha (环己胺)、Dab ( 二氨基丁酸)、Hse (高丝氨酸)、Hyp (羟脯氨酸)、 Mpr (巯基丙酸)、Nal萘丙氨酸(naphtylalanine) ,Nva (正缬氨酸)、0rn (鸟氨酸)、Phg (苯甘氨酸)、Sar (肌氨酸)、kc (硒代半胱氨酸)、Thi (噻吩丙氨酸)等。此外，针对如上面所定义的本发明新型转运蛋白构建物选择的L-对映体氨基酸可进一步选自上面定义的L-对映体氨基酸或其衍生物的特定组合。这样的组合可包括1、 2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多个上面定义的L-对映体氨基酸或其衍生物。组合还可能是通式(I)或如本文所定义的任何子式的定义之内任何上面定义的L-对映体氨基酸或其衍生物和任何上面定义的D-对映体氨基酸或其衍生物之间。这样的氨基酸的特定组合可显示对肽酶的较高或较低的稳定性，因此可提供另外的可能性以提供如上面所定义的本发明新型转运蛋白构建物对较高或较低稳定性的体内或体外稳定性。举例来说，本发明新型转运蛋白构建物可含有以D型和/或L型(即作为D-对映体氨基酸或作为L-对映体氨基酸或混合的D-和L-对映体氨基酸)，优选地以L型的二肽序列Arg-Lys，其显示对肽酶的较低的稳定性，因此可用于使本发明新型转运蛋白构建物的肽序列不稳定，因此进一步减少其体内半衰期。在本发明的上下文中，D-氨基酸，也被称作D-对映体氨基酸，优选地是非天然的 (非蛋白原的)“逆反”氨基酸，其中这些非天然的(非蛋白原的)“逆反”氨基酸优选地衍生自如上面所定义的天然存在的L-氨基酸和/或它们的衍生物。在本文中，术语“逆反” 指如上面所定义的天然存在的L-氨基酸(和从此制备的肽)的异构体，其中天然存在的 L-氨基酸残基的手性在相应的D-氨基酸中是反向的(参见，例如Jameson et al. ,Nature, 368,744-746(1994) ；Brady et al.，Nature，368，692-693 (1994))。换言之，在 D-氨基酸的肽键中，羰基和氨基基团的位置被调换，同时在每一个α碳，侧链的位置是保留的。因此，D-氨基酸可被插入到由L-氨基酸组成或包括L-氨基酸的肽序列中，因此可通过本领域已知的方法将D-氨基酸与如上面所定义的L-氨基酸结合。本领域已知的这样的方法包括，例如，但不限于液相肽合成方法或固体肽合成方法，例如根据Merrifield的固体肽合成方法、t-Boc固相肽合成、Fmoc固相肽合成、基于BOP (苯并三唑-1-基-氧-三-(二甲氨基)_磷六氟磷酸盐)的固相肽合成等。根据上面的通式(I)的D-/L-模式，D-氨基酸在本发明新型转运蛋白构建物中的含量另外提供许多种有用的性质。例如，这样的新的转运蛋白构建物更有效地进入细胞并是更稳定(尤其是体内)并显示较相应的基于L-氨基酸序列的转运蛋白构建物较低的免疫原性。然而，它们不象完全由D-氨基酸制备的转运蛋白构建物在细胞中是持久的，特别是由于几乎所有的分解酶，象蛋白酶或肽酶，在相邻的 L-氨基酸之间切割肽键的事实。所以，由D-对映体氨基酸和L-对映体氨基酸组成的肽在很大程度上抵抗快速蛋白水解分解，而不导致由于缺少蛋白酶的降解而在细胞中积累。上面定义的根据通式(I)的本发明新型转运蛋白构建物，优选地包括如上面所定义的L-氨基酸和D-氨基酸或它们的衍生物。这样的衍生物可以以约0%、约10%、约20%、 约30 %、约40 %、约50 %、约60 %、约70 %、约80 %、约90 %或甚至约100 %的含量包含在整个本发明新型转运蛋白构建物中。换言之，整个本发明转运蛋白肽可含有约1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26 和更多个这样的衍生物，其中可能的衍生物的最大数目当然受限于包含在上面定义的根据通式(I)的本发明新型转运蛋白构建物的氨基酸的最大数目。根据上面定义的通式(I)，本发明新型转运蛋白构建物包括L-氨基酸和D-氨基酸的特定的D-/L-模式，其由整数a、1、m、η、χ和y限定。根据通式(I)的上面的定义，a是限定如通式(I)D1LLLxDm(LLLyDn)a中所定义的亚组(LLLyD)的重复数的决定因子。根据上面的定义，a可以是选自0-3，优选地选自0_2，更优选地选自10-1的任何数，或可选自单个数0、1、2或3，更优选地选自单个数0、1或2，最优选地a = 1。根据a = 0、1、2或3的特定的重复数，根据通式(I)D1LLLxDm(LLLyDn)a的本发明新型转运蛋白构建物可由以下子式(Ia)至(Id)的至少之一组成或包括以下子式(Ia) 至(Id)的至少之一(Ia) =D1LLLxDm (SEQ ID NO 2)；(Ib) =D1LLLxDmLLLyDn (SEQ ID NO 3)；(Ic) =D1LLLxDmLLLyDnLLLyDn(SEQ ID NO 4)或(Id) =D1LLLxDmLLLyDnLLLyDnLLLyDn(SEQ ID NO :5)。此外，根据通式(I)的上面的定义，l、m和η是限定出现在如本文所定义的通式 (I)和子式(Ia)至(Id)中的D-氨基酸数的整数。整数l、m和η可相互独立地选择。这对于决定因子η特别如此，其可在如本文所定义的通式(I)或子式(Ia)至(Id)中出现几次，即如果η出现几次，每个η可相互独立地选择。根据上面的定义，整数1、m和η相互独立地可以是选自1-2的任何数，或可选自单个数1或2，更优选地1、m和/或η = 1。另外，根据通式(I)的上面的定义，χ和y是限定出现在如本文所定义的通式(I) 和子式(Ia)至(Id)中的L-氨基酸数的整数。整数χ和y可相互独立地选择。根据上面的定义，整数χ和y相互独立地可以是选自0-2的任何数，优选地选自0-1，或可选自单个数 0、1或2，更优选地选自单个数1或2，最优选地x和/或y = 1。
根据一个特别优选的实施方式，本发明的目的通过包括特定子式(Ie)的至少一个序列或由特定子式(Ie)的至少一个序列组成的新型转运蛋白构建物解决DLLLD (LLLD)a(SEQ ID NO 6)；其中D、L和a是如上面针对通式⑴或子式(Ia)至(Id)所定义的。根据另一个特别优选的实施方式，本发明的目的通过包括特定子式(If)的至少一个序列或由特定子式(If)的至少一个序列组成的新型转运蛋白构建物解决DLLLDLLLD(SEQ ID NO 7)；其中D和L是如上面针对通式(I)或子式(Ia)至(Id)所定义的。根据通式(I)或根据任何子式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)或(If)的本发明新型转运蛋白构建物，特别地是包括新的D-/L-模式转运蛋白构建物，可与本领域已知的任何运输序列一起使用或应用于本领域已知的任何运输序列，其中那些运输序列的邻接的(连续的)氨基酸的选择数目通过如通式⑴或任何子式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)或(If) 所定义的氨基酸数目确定。这样的运输序列典型地指导货物部分运输进细胞或细胞核或另外的特定靶区并可包括，但不限于，如上面所定义的易位蛋白，例如衍生自HIVTAT (HIV)，例如天然蛋白诸如例如TAT蛋白(例如美国专利号5，804，604和5，674，980中所描述的，这些参考文献中的每个通过引用被并入本文)，例如衍生自HIV tat (HIV) ,HSV VP22 (单纯疱疹)(在例如 WO 97/05265 ；Elliott and 0' Hare, Cell 88 :223-233(1997)中被描述)、 非病毒蛋白(Jackson et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :10691-10695 (1992))，运输序列，其衍生自触角足，特别是衍生自果蝇属触角(例如其触角载体序列)、FGF、乳铁蛋白等， 或衍生自碱性肽，例如具有长度为5至15个氨基酸，优选地10至12个氨基酸，并包括至少 80%，更优选地85%或甚至90%的碱性氨基酸，诸如例如精氨酸、赖氨酸和/或组氨酸的肽，或可选自例如富含精氨酸的肽序列，诸如I 9、R8、R7、R6、R5等，衍生VP22，衍生自PTD-4衍生的蛋白或肽，衍生自RGD-K16,衍生自PEPT1/2或PEPT1/2衍生的蛋白或肽，衍生自SynB3 或SynB3衍生的蛋白或肽，衍生自PC抑制剂，衍生自P21衍生的蛋白或肽，或衍生自JNKI 衍生的蛋白或肽。此外，在此公开了用作运输序列的天然蛋白之一的变体、片段和衍生物。形成如上面所定义的根据通式(I)或任何子式(la)、(lb)、(Ic)、(Id)、(Ie)或 (If)的新的转运蛋白构建物基础的运输序列的特定例子可选自，但不限于所谓的TAT细胞渗透序列，其衍生自HIV-I TAT蛋白的碱性运输序列。优选地，HIV-I TAT蛋白的碱性运输序列可包括来自人免疫缺陷病毒HIV-I TAT蛋白的序列，例如如在例如通过引用被并入本文的美国专利号5，804，604和5，674，980中所描述的。在该上下文中，全长HIV-I TAT蛋白具有由HIV TAT基因的两个外显子编码的86个氨基酸残基[SEQ ID NO :8]。TAT氨基酸 1-72由外显子1编码，而氨基酸73-86由外显子2编码。全长TAT蛋白被表征为含有两个赖氨酸和六个精氨酸(氨基酸49-57)的碱性区和含有七个半胱氨酸残基(氨基酸22-37)的富含半胱氨酸区。碱性区(即氨基酸49-57)被认为对核定位是重要的。Ruben，S.et al.， J. Virol. 63 :1-8(1989) ；Hauber, J. et al.，J. Virol. 631181-1187 (1989)。富含半胱氨酸区介导体外金属连接的二聚体的形成(Franke 1, A. D. et al, Science 240:70-73(1988)； Frankel，A.D· et al. , Proc. Natl. Acad. Sci USA 85 :6297-6300(1988))并它作为对反式作用子的活性是必需的(Garcia, J. A. et al.，EMBO J. 7 :3143(1988) ；Sadaie, Μ. R. et al.， J. Virol. 63 :1 (1989))。如在其它调节蛋白中，N端区可参与防护细胞内蛋白酶(Bachmair，A.et al. ,Cell 56:1019-1032(1989))。利用通式(I)或子式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie) 或(If)的任何一个的优选的TAT运输序列，优选地被表征为TAT碱性区氨基酸序列(天然存在的tat蛋白的氨基酸49-57)的存在；TAT富含半胱氨酸区氨基酸序列(天然存在的TAT 蛋白的氨基酸22-36)的缺失和TAT外显子2编码的羧基端结构域(天然存在的TAT蛋白的氨基酸73-86)的缺失。根据更优选的实施方式，形成如上面所定义的根据通式(I)或任何子式(Ia)、 (lb)、(Ic), (Id)、(Ie)或(If)的新的转运蛋白构建物基础的运输序列可选自含有TAT残基48-57或49至57的氨基酸序列，最优选地是根据SEQ ID NOs 8至14任何一个的TAT 序歹丨J，或选自通用 TAT 序歹Ij NH2-Xnb-RKKRRQRRR-Xnb-C00H (L 类 TAT (s)) [SEQ ID NO 16]和 /或XXXXRKKRRQ RRRXXXX (L类TAT) [SEQ ID NO: 15]。在该上下文中，每个X典型地代表这样的氨基酸残基，其优选地选自如本文所定义的任何(天然存在的)氨基酸残基。此外，每个Xnb可选自任何如本文所定义的氨基酸残基，其中n(X的重复数)是0-5、5-10、 10-15、15-20、20-30或更多。优选地，Xnb代表衍生自根据SEQ ID NO 8 (TAT (1-86))的序列的一段连续肽残基。可选地，形成如上面所定义的根据通式(I)或任何子式(la)、 (lb)、(Ic), (Id)、(Ie)或(If)的新的转运蛋白构建物基础的运输序列可选自，例如， 含有氨基酸序列 NH2-GRKKRRQRRR-C00H(L-TAT (sla)) [SEQ ID NO 17]或氨基酸序列 NH2-RKKRRQRRR-C00H(L-TAT(slb)) [SEQ ID NO :18]的肽。本领域的技术人员将理解这样的短语，象根据通式(I)或根据任何子式(la)、 (lb)、(Ic), (Id)、(Ie)或(If)的序列可与特定的(运输)序列一起使用或应用于特定的 (运输)序列，或可形成通式(I)或任何子式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)或(If)等的转运蛋白肽构建物的基础，旨在举例说明请求保护一个序列，其显示关于以下的某些特征i)表征特定氨基酸实体的侧链残基序列，和ii)所述的序列中的D和L氨基酸的序列。为了给出示例性的例子如果子式(If)与TAT (1-86) (SEQ ID NO 8) 一起使用或应用于TAT(l-86) (SEQ ID NO :8)，那么侧链残基的序列⑴如SEQ ID NO :8中所显示。然而，该请求保护的序列不是纯的L-氨基酸序列，而是某处包括子式(If)的基序。这样的实施方式的例子将是以下序列(以小写字母表示的D-氨基酸，以大写字母表示的L氨基酸)MEPVDPRLEP WKHPGSQPKT ACTNCYCKKC CFHCQVCFIT KALGISYGrK KRrQRRrPPQ GSQTHQVSLS KQPTSQSRGD PTGPKEo由于SEQ ID NO 8包括86个氨基酸，所以当然存在将子式(If)的基序放在该序列中别处的几个另外的可能性。还可想象在特别的实施方式中该序列可包括通式和/或子式一个以上的基序。形成如上面所定义的通式(I)或任何子式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)或(If)的转运蛋白构建物基础的运输序列的特别优选的例子可选自，但不限于，根据以下表1所定义的序列或其部分，或其任何片段或变体或衍生物(只要它保留跨过生物膜易位的功能)。表 权利要求
1.转运蛋白构建物，其包括通式(I) (SEQ ID NO 1)的至少一个序列 D1LLLxDm(LLLyDn)a 其中D是D-氨基酸； L是L-氨基酸； a 是 0-3 ；1.m和η相互独立地是1或2； χ和y相互独立地是0、1或2。
2.根据权利要求1的转运蛋白构建物，其中所述转运蛋白构建物包括根据以下子式 (Ia)至(Id) (SEQ ID NOs :2至5)之一的至少一个序列(Ia) =D1LLLxDm ；(Ib) =D1LLLxDmLLLyDn ；(Ic) =D1LLLxDmLLLyDnLLLyDn ；或(I d) D1LLLxDmLLLyDnLLLyDnLLLyDn。
3.根据权利要求1或2的转运蛋白构建物，其中所述转运蛋白构建物包括根据以下子式(Ie) (SEQ ID NO 6)的至少一个序列DLLLD(LLLD)a。
4.根据权利要求1、2或3中任一项的转运蛋白构建物，其中所述转运蛋白构建物包括根据以下子式(If) (SEQ ID NO 7)的至少一个序列DLLLDLLLD。
5.根据权利要求1-4中任一项的转运蛋白构建物，其中将根据通式(I)或根据任何子式(la)、(lb)、(Ic)、(Id)、(Ie)或(If)的所述序列与运输序列一起使用，或应用于运输序列，所述运输序列衍生自HIV-I TAT蛋白(SEQ ID NO 8)；优选衍生自含有HIV-1 TAT 蛋白(SEQ ID NO 8)的TAT残基48-57或49至57的氨基酸序列；或衍生自HSV VP22 (单纯疱疹(Herpes simplex))；或衍生自触角足载体序列(果蝇属触角足(Drosophila antermapedia))、FGF、乳铁蛋白；或衍生自碱性的肽，该肽的长度为5至15个氨基酸，优选地10至12个氨基酸，并包括至少80 %，更优选地85 %或甚至90 %的选自精氨酸、赖氨酸和/或组氨酸的碱性氨基酸，或可选自富含精氨酸的肽序列，包括&、R8> r7、R6> R5 ；衍生自 VP22 ；衍生自PTD-4衍生的蛋白或肽；衍生自RGD-Kni ；衍生自PEPT1/2或PEPT1/2衍生的蛋白或肽；衍生自SynB3或SynB3衍生的蛋白或肽；衍生自PC抑制剂；衍生自P21衍生的蛋白或肽；衍生自JNKI衍生的蛋白或肽；或衍生自这些运输序列之一的变体、片段和衍生物。
6.根据权利要求1至5中任一项的转运蛋白构建物，其中将根据通式(I)或根据任何子式(la)、(lb)、(Ic), (Id)、(Ie)或(If)的所述序列与以下序列之一或其反向序列或这些序列的变体或片段一起使用，或应用于下序列之一或其反向序列或这些序列的变体或片段
7.根据权利要求1至6中任一项的转运蛋白构建物，其中所述转运蛋白构建物包括根据rXXXrXXXr (SEQ ID NO :252)的至少一个序列，其中R代表D-对映体精氨酸； X是任何L-氨基酸；其中每个X可单独地并独立于SEQ ID NO 252内的任何其它X而选择。
8.根据权利要求8的转运蛋白构建物，其中所述6个XL-氨基酸的至少4个单独地选自由K或R组成的L氨基酸。
9.根据权利要求1至8中任一项的转运蛋白构建物，其中所述转运蛋白构建物包括所述子式(If)DLLLDLLLD (SEQ ID NO :7)，并且其中所述转运蛋白序列选自以下序列
10.根据权利要求1至9中任一项的转运蛋白构建物，其中所述转运蛋白构建物包括所述子式(If)DLLLDLLLD (SEQ ID NO :7)，并且其中将所述转运蛋白序列与运输序列一起使用或应用于运输序列，所述运输序列衍生自HIV-I TAT蛋白，在所述TAT衍生的序列的位置2 具有酪氨酸(Y)，所述序列优选地选自序列TAT(s2-91) (SEQ ID NO :116)。
11.根据权利要求5至10中任一项的转运蛋白构建物，其中将根据通式(I)或根据任何子式(la)、(lb)、(Ic)、(Id)、(Ie)或(If)的所述转运蛋白序列与权利要求5至10中列出的任何所述运输序列的变体或片段一起使用或应用于权利要求5至10中列出的任何所述运输序列的变体或片段，其具有权利要求5至10中列出的任何所述运输序列全长的至少10 %、20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、80 %或85 %，优选地至少90 %，更优选地至少 95%和最优选地至少99%。
12.转运蛋白货物结合分子，其包括a)组分(A)，其中组分(A)包括根据权利要求1至11任一项的所述转运蛋白构建物；和b)组分(B)，其包括效应分子。
13.根据权利要求12的转运蛋白货物结合分子，其中所述效应分子选自在治疗上有活性的蛋白或肽、蛋白激酶抑制剂、蛋白激酶c-Jum氨基末端激酶的抑制剂、抗原、抗体、凋亡因子、病理状态中牵涉的蛋白酶，优选地是肽蛋白酶抑制剂、BH3结构域或唯BH3蛋白、编码这些蛋白的核酸、siRNAs、反义RNAs、细胞毒性剂和包括蛋白酶抑制剂的小有机化合物。
14.根据权利要求12或13的转运蛋白货物结合分子，此外包括至少一个不同于组分 ⑶的另外的组分(C)、⑶和/或(E)，其中所述至少一个任选的另外的组分(C)、⑶和/ 或(E)相互独立地选自如针对组分(B)所定义的不同的效应分子或它们的片段或变体。
15.根据权利要求12至14中任一项的转运蛋白货物结合分子，其中组分(A)和(B)与任选的组分(C)、⑶和/或(E)相互共价连接。
16.根据权利要求12至15中任一项的转运蛋白货物结合分子，其中所述至少一个另外的组分(C)、(D)和/或(E)选自信号序列或定位序列，其引导所述发明的转运蛋白货物结合分子到特定的细胞内靶定位或到特定的细胞类型。
17.根据权利要求12至16中任一项的转运蛋白货物结合分子，其中组分(B)和/或所述至少一个另外的组分(C)、⑶和/或(E)是蛋白或肽序列并由L-氨基酸、D-氨基酸或二者的混合物组成。
18.根据权利要求12至17中任一项的转运蛋白货物结合分子，其中组分(A)位于所述转运蛋白货物结合分子的所述C末端，假设组分(B)是蛋白或肽序列。
19.根据权利要求12至18中任一项的转运蛋白货物结合分子，其用作药物。
20.药物组合物，其包括根据权利要求12至19中任一项的转运蛋白货物结合分子和任选地药学上可接受的载体/或赋形剂。
21.根据权利要求1至11中任一项的转运蛋白构建物用于制备转运蛋白货物结合分子的用途。
22.根据权利要求21的转运蛋白构建物的用途，其中所述转运蛋白货物结合分子是如根据权利要求12至18中任一项所定义的。
23.根据权利要求1至11中任一项的转运蛋白构建物或根据权利要求12至18中任一项所定义的转运蛋白货物结合分子用于将货物分子转运进将被治疗的患者的细胞或组织的用途。
24.根据权利要求23的用途，其中所述货物是如根据权利要求12至18中任一项所定义的。
25.根据权利要求23或M的用途，其用于将货物分子转运进白细胞和/或神经元细胞，特别是将被治疗的患者的白细胞和/或神经元细胞。
26.根据权利要求12至18中一项的转运蛋白货物结合分子用于制备药物的用途，该药物用于预防、治疗和/或改善癌症或肿瘤疾病——包括由缺陷型凋亡引起的疾病、炎性疾病、感染疾病、病毒(感染)疾病、与NJK信号传导密切相关的疾病、自身免疫性病症或疾病、心血管疾病、神经元或神经变性疾病、肝病、脊柱疾病、子宫疾病、重度抑郁症、非慢性或慢性炎性消化病、听力丧失、内耳疾病，或用在组织移植中。
全文摘要
本发明涉及通式(I)DlLLLxDm(LLLyDn)a的新转运蛋白构建物和其变体。本发明还涉及转运蛋白货物结合分子，特别是所述新转运蛋白构建物与货物部分的结合物，货物部分例如蛋白或肽、核酸、细胞毒性剂、有机分子等。此外，本发明公开了包括这些结合物的(药物)组合物和涉及这样的转运蛋白构建物的治疗方法和用途。
文档编号A61K47/48GK102256998SQ200980151845
公开日2011年11月23日 申请日期2009年12月22日 优先权日2008年12月22日
发明者C·邦尼 申请人:希根有限责任公司
新的转运蛋白构建物和转运蛋白货物结合分子本发明涉及新的通式(I)D1LLLxDm(LLLyDn)a的转运蛋白构建物及其变体。本发明还涉及转运蛋白货物结合分子，特别是具有货物部分的新的转运蛋白构建物结合物，货物部分例如蛋白质或肽、核酸、细胞毒性剂、有机分子等。此外，本发明公开了包括这些结合物的 (药物)组合物和牵涉这样的转运蛋白构建物的治疗方法和用途。使感兴趣的物质，如核酸、蛋白质或细胞毒性剂，而且还有其它(治疗上有用的) 化合物能够从外部介质有效地转移进组织或细胞，特别是转移到细胞核的技术在生物技术领域相当受关注。这些技术可适于体外和体内运输并翻译核酸进细胞，并因此适于蛋白质或肽生产、适于基因表达调节、适于细胞毒性效应或凋亡效应的诱导、适于细胞内过程的分析以及适于运输各种不同货物进细胞(或细胞核)的影响的分析等。感兴趣货物从外部介质到组织或细胞的这种转移的一个重要应用是基因治疗，其中所述货物通常是核酸或基因。管该技术在过去十年已显示一些相当有前景的发展，但是基因转移通常受限于基因转移载体不能有效地将生物活性货物转移进将被治疗的宿主的细胞质或细胞核而不影响宿主基因组或改变活性货物的生物学性质。在这方面，已发展了几项技术，以努力更有效地将例如核酸，如DNA或RNA，转染进细胞。通过基因转移的方法将核酸转染进患者的细胞或组织是分子医学的重要方法并在众多疾病的治疗和预防中起关键作用。基因转移方法的代表性例子包括普通(物理的或物理化学的)方法如用磷酸钙或 DEAE-葡聚糖共沉淀核酸，这是能使核酸穿透质膜然后进入细胞和/或细胞核的方法。然而，该技术遭受低转移效率和高百分比细胞死亡的困扰。另外，由于其本身的性质，该方法局限于体外或离体方法，但不适用于体内情况。对于涉及体外电穿孔的方法同样如此。体外电穿孔基于高压电流的使用，使细胞膜变得可透过，以允许新的核酸，例如DNA或RNA引入细胞。然而，这样的方法通常不适于体内。此外，该技术同样遭受低转移效率和高百分比细胞死亡的困扰。另外熟知的物理或物理化学方法包括(裸)核酸的(直接)注射或生物射弹基因转移。生物射弹基因转移(也称作生物射弹粒子轰击)是在康奈尔大学开发的方法，其允许将遗传物质引入组织或培养细胞。生物射弹基因转移通常通过表面包被金属的颗粒，如金或银颗粒而完成，并通过使用基因枪将包括被吸附的DNA的这些金属颗粒射进细胞。与上面所讨论的相似，该方法局限于体外或离体方法，但通常不适用于体内情况。其它方法利用所谓的转运分子的转运能力。将在该上下文中使用的转运分子通常可以被分为病毒载体，即转运分子，其包括病毒元件(viral element)；以及非病毒载体。当今可利用的最成功的基因治疗策略依赖于病毒载体，如腺病毒、腺伴随病毒、逆转录病毒和疱疹病毒。这些病毒载体通常应用对DNA和核酸具有强亲和力的病毒相关物质的结合物。由于其感染性质，病毒或病毒载体具有非常高的转染速率。以在转染的细胞中不形成功能性感染颗粒的方式，基因修饰通常使用的病毒载体。然而，尽管有这个安全措施， 但是存在许多与涉及免疫原性、细胞毒性和插入诱变的病毒载体有关的问题。举例来说，不能排除引入的治疗上有活性的基因或病毒基因的不受控增殖的危险，例如，由于可能的重组事件。另外，病毒结合物难于利用并通常在治疗之前需要长期的制备(参考，例如，美国专利号 5，521，291)。尽管非病毒载体不象病毒载体一样有效，但是已开发了许多非病毒载体以在基因治疗中提供更安全的选择。最常见的非病毒载体中的一些包括聚乙稀亚胺、树状聚体、壳聚糖、聚赖氨酸和基于肽的转运蛋白系统，例如许多种类的肽，它们通常本性是阳离子的并能与核酸诸如质粒DNA通过静电相互作用而相互作用。为了成功的输送，非病毒载体，特别是基于肽的转运系统必须能克服许多障碍。这样的障碍包括在运输期间货物部分，例如DNA或其它化合物的保护，以及货物部分在体内早期降解或代谢的预防。在核酸，如DNA和RNA分子的情况下，非病毒载体必须另外能特异性地输送这些分子，以在靶细胞中有效表达基因。尤其是对于核酸，如DNA和RNA分子，非病毒载体目前必须克服4个障碍以达到成功地输送基因(参考，例如 Martin et al. ,The AAPS Journal 2007 ；9 (I)Article 3)。非病毒载体必须能1)紧密地结合并保护核酸，2)它必须能靶向特异的细胞表面受体，3)非病毒载体必须能分裂内体膜，和4)它必须将核酸货物输送到核并允许编码的蛋白质或肽序列的翻译。这样的非病毒载体，特别是基于肽的非病毒载体，相对于其它非病毒策略有利，因为它们一般而言能到达所有这4个目的，然而，关于不同的障碍具有不同的效率。举例来说，富含碱性残基如赖氨酸和/或精氨酸的阳离子肽能有效地将核酸如 DNA浓缩成可以稳定于血清中的小的紧密的颗粒。此外，肽配体与多聚物/核酸复合物 (polyplex)的连接允许靶向特异受体和/或特异细胞类型。如上述的多聚物/核酸复合物或阳离子聚合物通常与带负电荷的核酸形成复合物，所述复合物导致核酸的浓缩，并保护这些核酸免于降解。利用多聚物/核酸复合物(阳离子聚合物)向运细胞运输通常通过受体介导的胞吞作用而发生。因此，通过例如结合到表面受体并触发胞吞作用的多聚物/核酸复合物聚左旋赖氨酸(PLL)，将DNA偶联到独特的分子，如转铁蛋白。多聚物/核酸复合物(阳离子聚合物)包括例如聚左旋赖氨酸(PLL)、壳聚糖、聚乙稀亚胺(PEI)、聚甲基丙烯酸二甲胺乙酯(polydimethylaminoethylmethacrylate) (PD-MAEMA)、聚酰胺(PAMAM)。这样的作用还从纳米颗粒/核酸复合物(nanoplexes)(纳米颗粒系统)或脂质/核酸复合物 (lipoplexes)(脂质体系统)得知。纳米颗粒/核酸复合物(纳米颗粒系统)通常包括聚丙烯酸酯、聚酰胺、聚苯乙烯、氰基丙烯酸酯、聚乳酸(polylactat) (PLA)、聚(乳酸乙醇酸共聚物)(PLGA)等的使用。脂质/核酸复合物或脂质体系统通常包括能模拟细胞膜的阳离子脂质的使用。因此，脂质带有正电荷的部分与核酸带有负电荷的部分相互作用，并因而能够与细胞膜融合。脂质/核酸复合物或脂质体系统包括，例如D0TMA、DOPE、D0SPA、DOTAP, DC-Cho 1、EDMPC 等。在该上下文中，受体介导的胞吞作用在实验系统中同样被广泛利用，以向细胞靶内向输送货物如核酸或治疗剂。在受体介导的胞吞作用期间，含有货物的复合物被位于细胞膜中的对该货物特异的受体或者位于细胞膜组分中的特异抗体选择性地内在化。针对包括IgG Fe、生长抑素、胰岛素、IGF-I和-II、转铁蛋白、EGF、GLP-I、VLDL或整合素受体等在内的许多受体，已经描述了胞吞作用活性。通过受体介导的胞吞作用，已经广泛检验了不同的肽或蛋白质序列在基因转移方法中的用途。令人惊奇地，通过噬菌体展示技术的应用，已经深深地推动了指导有效的受体介导的胞吞作用的肽序列的分离。噬菌体展示文库是极其强大的工具，其为细胞受体提供分子变体的实际上无限的来源以及短肽，所述变体包括对天然配体或货物部分的修饰。相似的文库也已被直接注射进小鼠中，并且肽序列已被成功地分离，所述序列显示对脑和肾的13倍的选择性。前蛋白转化酶可作为可用于将分子运输至细胞的肽或蛋白质序列的例子。前蛋白转化酶是细胞表面受体的例子，其通过受体介导的胞吞作用变得内在化。已经显示，这些蛋白质是造成肽激素、神经肽和许多其它蛋白质的前体转变成其生物学活性形式的原因。前蛋白转化酶家族的所有切割位点遵从共有序列R-X-X-R。哺乳动物前蛋白转化酶在其组织分布的基础上可以分成三组。弗林蛋白酶、PACE4、PC5/PC6和LPCIPC7/PC8/SPC7在广泛范围的组织和细胞系中表达。相反，PC2和PC1/PC3的表达限于神经内分泌组织，如胰岛、垂体、肾上腺髓质和许多脑区域。PC4的表达高度局限于睾丸生精细胞。神经内分泌特异转化酶——PC2和PC1/PC3主要位于分泌颗粒中。也已经报道PC5/PC6A位于分泌颗粒中。此外，间接的证据已经表明，一部分前蛋白转化酶分子存在于细胞表面上，并且已经显示，弗林蛋白酶在TGN和细胞表面之间循环。总之，这些性质表明，前蛋白转化酶将细胞外配体运输进细胞内间隙。所谓的易位蛋白(translocatory protein)或蛋白转导结构域(PTDs)也是有利的。来源于易位蛋白或蛋白转导结构域(PTDs)的肽序列通常能在其酸性环境中选择性地裂解内体膜，导致多聚物/核酸复合物的胞质释放。易位蛋白被认为是能影响大分子在细胞(易位蛋白)之间转运的一组肽，如HIV-I TAT(HIV)、触角(果蝇属(Drosophila)触角)、 HSV VP22(单纯疱疹)、FGF或乳铁蛋白等。相反，蛋白转导结构域(PTDs)被认为是能指导与这些序列共价结合的蛋白质和肽通过细胞膜进入细胞的一组肽(Leifert and Whitton Translocatory proteins and protein transduction domains :a critical analysis of their biological effects and the underlying mechanisms. Molecular Therapy Vol. 8 No. 1 2003)。易位蛋白共有的以及PTDs共有的是碱性区，由于所述碱性区能结合聚阴离子如核酸，其被认为是造成融和肽转运的主要原因。利用受体依赖的非饱和吸附胞吞作用，在没有结合到其上的情况下，PTDs可以发挥与阳离子转染试剂相似的作用。当给予基于疫苗的肽时，为了实现或增强CTL应答，PTDs通常与蛋白质或肽偶联(参考综述Melikov and Chernomordik， Arginine-rich cell penetrating(poly-)peptides s :from endosomal uptake to nuclear delivery, Cell.Mol.Life Sci·2005)。令人遗憾的是，由于肽酶，基于肽的转运蛋白系统典型地在体内遭受蛋白质水解性降解，导致截短的转运蛋白(和/或货物)序列。可将这样的肽酶区分为外肽酶和内肽酶，它们都是能通过被称作蛋白水解的过程催化蛋白质分裂成较小的肽部分甚至分裂成单个氨基酸的酶。在该上下文中，内肽酶是典型地蛋白水解肽酶，其破坏非末端氨基酸(即分子内)的肽键。内肽酶对某些氨基酸是典型地特异的。内肽酶的例子包括例如胰蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、胃蛋白酶和内肽酶V等。已知胰蛋白酶在Arg或Lys之后切割，除非后面跟着ftx)。已知糜蛋白酶在Phe、Trp或Tyr之后切割，除非后面跟着ftx)。 糜蛋白酶在Asn、His、Met或Leu之后较慢地切割。弹性蛋白酶在Ala、Gly、Ser或Val之后切割，除非后面跟着1^0。嗜热菌蛋白酶是一种热稳定的内切蛋白酶，其在IleJetJhe、Trp, Tyr或Val之前切割，除非前面是ftx)。嗜热菌蛋白酶有时在Ala、Asp、His或Thr之后切割。已知胃蛋白酶在Leu、Phe、Trp或Tyr之前切害I]，除非前面是ftx)。最后，已知内肽酶V8在Glu之后切割。与内肽酶不同，外肽酶是催化将氨基酸从多肽链的末端去除并因此切割所述多肽链末端的酶。可根据它们的切割位点将外肽酶区分为氨肽酶和羧肽酶。氨肽酶是典型地锌依赖性酶并由小肠的腺体产生。氨肽酶通常切割来自肽或蛋白质序列的氨基末端的单个氨基酸。羧肽酶是水解肽键的羧基末端(C末端)的典型的酶。人类、动物和植物含有几种类型的具有范围从分解代谢到蛋白质成熟的不同功能的羧肽酶，该酶是存在于胰液中的消化酶，将从肽的羧基端切割单个氨基酸。特定的例子是羧肽酶N(CPN)，由两个具有酶活性的小亚基和两个保护酶抵御降解的大亚基组成的血浆锌金属蛋白酶。CPN切割来自生物学上有活性的肽诸如补体过敏毒素、激肽和血纤肽的羧基末端氨基酸精氨酸和赖氨酸。为了改变如上面所定义的基于肽的转运蛋白系统的蛋白酶剪切，基于肽的转运蛋白系统可完全由D-氨基酸组成，因此形成“逆反肽序列(retro-inverso peptide sequences) 术语“逆反(肽)序列”指线性肽序列的异构体，其中序列的方向是反向的， 每个氨基酸残基的手性是颠倒的(参见例如Jameson et al.，Nature，368，744-746 (1994)； Brady et al.，Nature，368，692-693 (1994))。组合D-对映体氨基酸和反向合成的优点是交换每个酰胺键的羰基和氨基的位置，而保持侧链基团在每个α碳的位置。由于基于肽的转运蛋白的肽序列天然存在的L-对映体氨基酸的构象改变为D-对映体氨基酸，体内蛋白酶剪切的危险消除了，这对货物部分转染进细胞的目的是有利的和高度有效的。相反，术语 “反向序列”指序列的方向是反向的序列(但是每个氨基酸残基的手性不是颠倒的(例如D -Arg-L-Arg-L-Arg 一 L-Ar g-L-Ar g-D-Ar g)0然而，尽管作为如上面所定义的转运蛋白分子有效地工作，但是这样的基于肽的转运蛋白的肽序列天然存在的L-对映体氨基酸的构象改变为D-对映体氨基酸使承担在细胞的整个生命期间这些转运蛋白在细胞中显著积累或在更长时间里这些转运蛋白在(周围)组织或器官中显著积累的危险。因此，即使期间切割开或代谢连接的货物部分，这样的转运蛋白仍可残留在细胞中并参与进一步的细胞间和细胞内过程，导致未知的和不需要的副作用。因此，在本领域中需要提供可选的非病毒转运蛋白分子，优选地是如上面所定义的基于肽的转运蛋白系统，其避免在细胞或组织中这样的不需要的积累但仍然允许货物部分有效地转移进细胞。如所附的权利要求书中所定义的主题，特别是如权利要求书中所定义的新的转运蛋白构建物和其结合物(转运蛋白货物结合分子)解决了上面的目的。利用如权利要求书中所定义的新的转运蛋白构建物和其结合物的方法和用途进一步解决了上面的目的。根据本发明的第一个方面，通过包括通式(I) (SEQ ID NO 1)的至少一个序列的新型转运蛋白构建物或由通式(I) (SEQ ID NO 1)的至少一个序列组成的新型转运蛋白构建物解决本发明的目的D1LLLxDm(LLLyDn)a其中D是D-氨基酸；L是L-氨基酸；
a是0-3，优选地0_2，更优选地0、1、2或3，甚至更优选地0、1或2，最优选地1 ；1、m和η相互独立地是1或2，优选地1 ；χ和y相互独立地是0、1或2，优选地1。如本文所用，术语“转运蛋白构建物”指含有氨基酸的化合物，其能易位跨过生物膜。如本文所用，术语“运输序列”(或转运蛋白序列)指提供跨过生物膜易位的氨基酸序列。因此，根据本发明转运蛋白构建物包括允许转运蛋白构建物易位跨过生物膜的运输序列。因此，根据通式(I)的新的转运蛋白构建物有效地允许并可提供货物部分，例如蛋白质或肽、核酸、小的有机分子、抗原、细胞毒性剂等，运输进器官、组织、细胞(例如将被治疗的)、细胞亚区室和/或细胞核。有利地，发明的根据通式(I)的转运蛋白构建物足够稳定以防止在将货物部分运输到其靶位之前被蛋白酶降解。另一方面，发明的根据通式(I)的转运蛋白构建物不是永久地存在于细胞中，可在相当长的期限内被蛋白酶降解以避免不良副作用诸如新的发明转运蛋白或其结合物在细胞中的不需要的积累。如本发明人所令人惊讶地发现，只有通过上面定义的通式(I)的发明模式(本文也被描述为D-/L-模式)，可将这样的有益性质给予运输序列，特别是在本领域已知的任何运输序列，用如通式(I)中所定义的L-氨基酸的特定内容代替D-氨基酸的特定的内容和位置。该发明的D-/L-模式允许熟练的技术人员将如上面所定义的本发明新型转运蛋白构建物在细胞中的体内或体外持久性足够精确地定义为足够长的时间，以保证在相当长的期限内本发明新型转运蛋白构建物被蛋白酶降解之前本发明新型转运蛋白构建物给予到和进入细胞或细胞核。该细胞中本发明新型转运蛋白构建物的体内或体外持久性实际上依赖用如通式(I)中所定义的L-氨基酸的特定内容代替的D-氨基酸的特定内容和位置。此外，显示发明的上面定义的通式(I)的D-/L-模式的转运蛋白构建物足够短以避免诸如下面定义的转运蛋白货物结合分子中本发明新型转运蛋白构建物对货物部分的空间位阻。它还允许这样的本发明新型转运蛋白构建物的有成本效益的制备。另外，可容易地形成上面定义的通式(I)的转运蛋白肽或蛋白与蛋白质或肽、核酸诸如DNA和RNA分子或与细胞毒性剂或甚至小的有机分子等的结合物。根据上面定义的通式(I)，本发明新型转运蛋白构建物包括根据如通式(I)所提出的特定D-/L-模式的L-氨基酸和D-氨基酸。在本发明的背景中，L-氨基酸，也称作L-对映体氨基酸，优选地是选自天然存在的氨基酸或其衍生物的氨基酸。天然存在的氨基酸典型地选自标准的(蛋白原的)氨基酸丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸、以及选自非标准氨基酸诸如鸟氨酸、瓜氨酸、同型半胱氨酸、S-腺苷甲硫氨酸、羟脯氨酸、硒代半胱氨酸、吡咯赖氨酸、羊毛硫氨酸、2-氨基异丁酸、脱氢丙氨酸、Y -氨基丁酸等。来自这样的L-氨基酸或L-对映体氨基酸的衍生物典型地包括这些氨基酸的任何天然或非天然存在的衍生物，包括，但不限于如上所定义的氨基酸，其包括翻译后修饰或合成修饰，包括乙酰化作用(在肽序列的N端，在赖氨酸残基处等)、脱乙酰作用、烷化诸如甲基化、乙基化等(优选地在肽序列内的赖氨酸或精氨酸残基处)、脱烷基化诸如脱甲基化、脱乙基作用等、酰胺化(优选地在肽序列的C端)、甲酰化、Y-羧化作用、谷氨酰化(glutamylation)、糖基化(优选地在肽序列内的天冬酰胺、赖氨酸、羟赖氨酸、丝氨酸或苏氨酸残基处等)、血红素或血红素部分的加成、羟基化、碘化作用、类异戊二烯部分诸如法尼基或栊牛儿基栊牛儿醇(geranylgeraniol)等的异戊二烯化加成)、硫辛酰化 (Iipoylation)((硫辛酸官能团的连接)，诸如异戊二烯化、GPI锚的形成，包括豆蔻酰化、 法尼基化、栊牛儿基忙栊儿基化(geranylgernaylation)等、氧化、磷酸化(例如对肽序列内的丝氨酸、酪氨酸(tytosine)、苏氨酸或组氨酸部分等)、硫酸化作用(例如酪氨酸的硫酸化作用)、硒化(selenoylation)、硫酸化作用等。L-氨基酸的衍生物也包括、但不限于修饰的L-氨基酸，其已经通过引入以下标记之一被修饰(i)放射性标记，即放射性磷酸化或带有硫、氢、碳、氮等的放射性标记；(ii)彩色染料(例如，地高辛配基(digoxygenin)等)；(iii)荧光基团(例如，荧光素、罗丹明、如下面所定义的荧光染料蛋白等)；(iv)化学发光基团；(ν)根据(i)至(iv)所述的两种或更多种标记的组合。L-氨基酸衍生物的尤其特别的例子包括、但不限于AMC (氨基甲基香豆素)、Dabcyl ( 二甲氨基苯基偶氮卞酉先(dimethylaminophenylazobenzoyl)) > Dansyl (二甲氨基萘磺酰(dimethylaminonaphtalenesulfonyl))、FAM(羧基荧光素 (carboxyfluoroscein)), Mca(甲氧基香豆素乙酰基)、Xan (咕吨基)、Abu (氨基丁酸)、 β -Ala ( β -丙氨酸)、E-Ahx (6-氨基己酸)、α -Aib ( α -氨基异丁酸)、Ams (氨基丝氨酸 (aminoserine))、Cha (环己胺)、Dab ( 二氨基丁酸)、Hse (高丝氨酸)、Hyp (羟脯氨酸)、 Mpr (巯基丙酸)、Nal萘丙氨酸(naphtylalanine) ,Nva (正缬氨酸)、0rn (鸟氨酸)、Phg (苯甘氨酸)、Sar (肌氨酸)、kc (硒代半胱氨酸)、Thi (噻吩丙氨酸)等。此外，针对如上面所定义的本发明新型转运蛋白构建物选择的L-对映体氨基酸可进一步选自上面定义的L-对映体氨基酸或其衍生物的特定组合。这样的组合可包括1、 2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多个上面定义的L-对映体氨基酸或其衍生物。组合还可能是通式(I)或如本文所定义的任何子式的定义之内任何上面定义的L-对映体氨基酸或其衍生物和任何上面定义的D-对映体氨基酸或其衍生物之间。这样的氨基酸的特定组合可显示对肽酶的较高或较低的稳定性，因此可提供另外的可能性以提供如上面所定义的本发明新型转运蛋白构建物对较高或较低稳定性的体内或体外稳定性。举例来说，本发明新型转运蛋白构建物可含有以D型和/或L型(即作为D-对映体氨基酸或作为L-对映体氨基酸或混合的D-和L-对映体氨基酸)，优选地以L型的二肽序列Arg-Lys，其显示对肽酶的较低的稳定性，因此可用于使本发明新型转运蛋白构建物的肽序列不稳定，因此进一步减少其体内半衰期。在本发明的上下文中，D-氨基酸，也被称作D-对映体氨基酸，优选地是非天然的 (非蛋白原的)“逆反”氨基酸，其中这些非天然的(非蛋白原的)“逆反”氨基酸优选地衍生自如上面所定义的天然存在的L-氨基酸和/或它们的衍生物。在本文中，术语“逆反” 指如上面所定义的天然存在的L-氨基酸(和从此制备的肽)的异构体，其中天然存在的 L-氨基酸残基的手性在相应的D-氨基酸中是反向的(参见，例如Jameson et al. ,Nature, 368,744-746(1994) ；Brady et al.，Nature，368，692-693 (1994))。换言之，在 D-氨基酸的肽键中，羰基和氨基基团的位置被调换，同时在每一个α碳，侧链的位置是保留的。因此，D-氨基酸可被插入到由L-氨基酸组成或包括L-氨基酸的肽序列中，因此可通过本领域已知的方法将D-氨基酸与如上面所定义的L-氨基酸结合。本领域已知的这样的方法包括，例如，但不限于液相肽合成方法或固体肽合成方法，例如根据Merrifield的固体肽合成方法、t-Boc固相肽合成、Fmoc固相肽合成、基于BOP (苯并三唑-1-基-氧-三-(二甲氨基)_磷六氟磷酸盐)的固相肽合成等。根据上面的通式(I)的D-/L-模式，D-氨基酸在本发明新型转运蛋白构建物中的含量另外提供许多种有用的性质。例如，这样的新的转运蛋白构建物更有效地进入细胞并是更稳定(尤其是体内)并显示较相应的基于L-氨基酸序列的转运蛋白构建物较低的免疫原性。然而，它们不象完全由D-氨基酸制备的转运蛋白构建物在细胞中是持久的，特别是由于几乎所有的分解酶，象蛋白酶或肽酶，在相邻的 L-氨基酸之间切割肽键的事实。所以，由D-对映体氨基酸和L-对映体氨基酸组成的肽在很大程度上抵抗快速蛋白水解分解，而不导致由于缺少蛋白酶的降解而在细胞中积累。上面定义的根据通式(I)的本发明新型转运蛋白构建物，优选地包括如上面所定义的L-氨基酸和D-氨基酸或它们的衍生物。这样的衍生物可以以约0%、约10%、约20%、 约30 %、约40 %、约50 %、约60 %、约70 %、约80 %、约90 %或甚至约100 %的含量包含在整个本发明新型转运蛋白构建物中。换言之，整个本发明转运蛋白肽可含有约1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26 和更多个这样的衍生物，其中可能的衍生物的最大数目当然受限于包含在上面定义的根据通式(I)的本发明新型转运蛋白构建物的氨基酸的最大数目。根据上面定义的通式(I)，本发明新型转运蛋白构建物包括L-氨基酸和D-氨基酸的特定的D-/L-模式，其由整数a、1、m、η、χ和y限定。根据通式(I)的上面的定义，a是限定如通式(I)D1LLLxDm(LLLyDn)a中所定义的亚组(LLLyD)的重复数的决定因子。根据上面的定义，a可以是选自0-3，优选地选自0_2，更优选地选自10-1的任何数，或可选自单个数0、1、2或3，更优选地选自单个数0、1或2，最优选地a = 1。根据a = 0、1、2或3的特定的重复数，根据通式(I)D1LLLxDm(LLLyDn)a的本发明新型转运蛋白构建物可由以下子式(Ia)至(Id)的至少之一组成或包括以下子式(Ia) 至(Id)的至少之一(Ia) =D1LLLxDm (SEQ ID NO 2)；(Ib) =D1LLLxDmLLLyDn (SEQ ID NO 3)；(Ic) =D1LLLxDmLLLyDnLLLyDn(SEQ ID NO 4)或(Id) =D1LLLxDmLLLyDnLLLyDnLLLyDn(SEQ ID NO :5)。此外，根据通式(I)的上面的定义，l、m和η是限定出现在如本文所定义的通式 (I)和子式(Ia)至(Id)中的D-氨基酸数的整数。整数l、m和η可相互独立地选择。这对于决定因子η特别如此，其可在如本文所定义的通式(I)或子式(Ia)至(Id)中出现几次，即如果η出现几次，每个η可相互独立地选择。根据上面的定义，整数1、m和η相互独立地可以是选自1-2的任何数，或可选自单个数1或2，更优选地1、m和/或η = 1。另外，根据通式(I)的上面的定义，χ和y是限定出现在如本文所定义的通式(I) 和子式(Ia)至(Id)中的L-氨基酸数的整数。整数χ和y可相互独立地选择。根据上面的定义，整数χ和y相互独立地可以是选自0-2的任何数，优选地选自0-1，或可选自单个数 0、1或2，更优选地选自单个数1或2，最优选地x和/或y = 1。
根据一个特别优选的实施方式，本发明的目的通过包括特定子式(Ie)的至少一个序列或由特定子式(Ie)的至少一个序列组成的新型转运蛋白构建物解决DLLLD (LLLD)a(SEQ ID NO 6)；其中D、L和a是如上面针对通式⑴或子式(Ia)至(Id)所定义的。根据另一个特别优选的实施方式，本发明的目的通过包括特定子式(If)的至少一个序列或由特定子式(If)的至少一个序列组成的新型转运蛋白构建物解决DLLLDLLLD(SEQ ID NO 7)；其中D和L是如上面针对通式(I)或子式(Ia)至(Id)所定义的。根据通式(I)或根据任何子式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)或(If)的本发明新型转运蛋白构建物，特别地是包括新的D-/L-模式转运蛋白构建物，可与本领域已知的任何运输序列一起使用或应用于本领域已知的任何运输序列，其中那些运输序列的邻接的(连续的)氨基酸的选择数目通过如通式⑴或任何子式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)或(If) 所定义的氨基酸数目确定。这样的运输序列典型地指导货物部分运输进细胞或细胞核或另外的特定靶区并可包括，但不限于，如上面所定义的易位蛋白，例如衍生自HIVTAT (HIV)，例如天然蛋白诸如例如TAT蛋白(例如美国专利号5，804，604和5，674，980中所描述的，这些参考文献中的每个通过引用被并入本文)，例如衍生自HIV tat (HIV) ,HSV VP22 (单纯疱疹)(在例如 WO 97/05265 ；Elliott and 0' Hare, Cell 88 :223-233(1997)中被描述)、 非病毒蛋白(Jackson et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :10691-10695 (1992))，运输序列，其衍生自触角足，特别是衍生自果蝇属触角(例如其触角载体序列)、FGF、乳铁蛋白等， 或衍生自碱性肽，例如具有长度为5至15个氨基酸，优选地10至12个氨基酸，并包括至少 80%，更优选地85%或甚至90%的碱性氨基酸，诸如例如精氨酸、赖氨酸和/或组氨酸的肽，或可选自例如富含精氨酸的肽序列，诸如I 9、R8、R7、R6、R5等，衍生VP22，衍生自PTD-4衍生的蛋白或肽，衍生自RGD-K16,衍生自PEPT1/2或PEPT1/2衍生的蛋白或肽，衍生自SynB3 或SynB3衍生的蛋白或肽，衍生自PC抑制剂，衍生自P21衍生的蛋白或肽，或衍生自JNKI 衍生的蛋白或肽。此外，在此公开了用作运输序列的天然蛋白之一的变体、片段和衍生物。形成如上面所定义的根据通式(I)或任何子式(la)、(lb)、(Ic)、(Id)、(Ie)或 (If)的新的转运蛋白构建物基础的运输序列的特定例子可选自，但不限于所谓的TAT细胞渗透序列，其衍生自HIV-I TAT蛋白的碱性运输序列。优选地，HIV-I TAT蛋白的碱性运输序列可包括来自人免疫缺陷病毒HIV-I TAT蛋白的序列，例如如在例如通过引用被并入本文的美国专利号5，804，604和5，674，980中所描述的。在该上下文中，全长HIV-I TAT蛋白具有由HIV TAT基因的两个外显子编码的86个氨基酸残基[SEQ ID NO :8]。TAT氨基酸 1-72由外显子1编码，而氨基酸73-86由外显子2编码。全长TAT蛋白被表征为含有两个赖氨酸和六个精氨酸(氨基酸49-57)的碱性区和含有七个半胱氨酸残基(氨基酸22-37)的富含半胱氨酸区。碱性区(即氨基酸49-57)被认为对核定位是重要的。Ruben，S.et al.， J. Virol. 63 :1-8(1989) ；Hauber, J. et al.，J. Virol. 631181-1187 (1989)。富含半胱氨酸区介导体外金属连接的二聚体的形成(Franke 1, A. D. et al, Science 240:70-73(1988)； Frankel，A.D· et al. , Proc. Natl. Acad. Sci USA 85 :6297-6300(1988))并它作为对反式作用子的活性是必需的(Garcia, J. A. et al.，EMBO J. 7 :3143(1988) ；Sadaie, Μ. R. et al.， J. Virol. 63 :1 (1989))。如在其它调节蛋白中，N端区可参与防护细胞内蛋白酶(Bachmair，A.et al. ,Cell 56:1019-1032(1989))。利用通式(I)或子式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie) 或(If)的任何一个的优选的TAT运输序列，优选地被表征为TAT碱性区氨基酸序列(天然存在的tat蛋白的氨基酸49-57)的存在；TAT富含半胱氨酸区氨基酸序列(天然存在的TAT 蛋白的氨基酸22-36)的缺失和TAT外显子2编码的羧基端结构域(天然存在的TAT蛋白的氨基酸73-86)的缺失。根据更优选的实施方式，形成如上面所定义的根据通式(I)或任何子式(Ia)、 (lb)、(Ic), (Id)、(Ie)或(If)的新的转运蛋白构建物基础的运输序列可选自含有TAT残基48-57或49至57的氨基酸序列，最优选地是根据SEQ ID NOs 8至14任何一个的TAT 序歹丨J，或选自通用 TAT 序歹Ij NH2-Xnb-RKKRRQRRR-Xnb-C00H (L 类 TAT (s)) [SEQ ID NO 16]和 /或XXXXRKKRRQ RRRXXXX (L类TAT) [SEQ ID NO: 15]。在该上下文中，每个X典型地代表这样的氨基酸残基，其优选地选自如本文所定义的任何(天然存在的)氨基酸残基。此外，每个Xnb可选自任何如本文所定义的氨基酸残基，其中n(X的重复数)是0-5、5-10、 10-15、15-20、20-30或更多。优选地，Xnb代表衍生自根据SEQ ID NO 8 (TAT (1-86))的序列的一段连续肽残基。可选地，形成如上面所定义的根据通式(I)或任何子式(la)、 (lb)、(Ic), (Id)、(Ie)或(If)的新的转运蛋白构建物基础的运输序列可选自，例如， 含有氨基酸序列 NH2-GRKKRRQRRR-C00H(L-TAT (sla)) [SEQ ID NO 17]或氨基酸序列 NH2-RKKRRQRRR-C00H(L-TAT(slb)) [SEQ ID NO :18]的肽。本领域的技术人员将理解这样的短语，象根据通式(I)或根据任何子式(la)、 (lb)、(Ic), (Id)、(Ie)或(If)的序列可与特定的(运输)序列一起使用或应用于特定的 (运输)序列，或可形成通式(I)或任何子式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)或(If)等的转运蛋白肽构建物的基础，旨在举例说明请求保护一个序列，其显示关于以下的某些特征i)表征特定氨基酸实体的侧链残基序列，和ii)所述的序列中的D和L氨基酸的序列。为了给出示例性的例子如果子式(If)与TAT (1-86) (SEQ ID NO 8) 一起使用或应用于TAT(l-86) (SEQ ID NO :8)，那么侧链残基的序列⑴如SEQ ID NO :8中所显示。然而，该请求保护的序列不是纯的L-氨基酸序列，而是某处包括子式(If)的基序。这样的实施方式的例子将是以下序列(以小写字母表示的D-氨基酸，以大写字母表示的L氨基酸)MEPVDPRLEP WKHPGSQPKT ACTNCYCKKC CFHCQVCFIT KALGISYGrK KRrQRRrPPQ GSQTHQVSLS KQPTSQSRGD PTGPKEo由于SEQ ID NO 8包括86个氨基酸，所以当然存在将子式(If)的基序放在该序列中别处的几个另外的可能性。还可想象在特别的实施方式中该序列可包括通式和/或子式一个以上的基序。形成如上面所定义的通式(I)或任何子式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)或(If)的转运蛋白构建物基础的运输序列的特别优选的例子可选自，但不限于，根据以下表1所定义的序列或其部分，或其任何片段或变体或衍生物(只要它保留跨过生物膜易位的功能)。表 权利要求
1.转运蛋白构建物，其包括通式(I) (SEQ ID NO 1)的至少一个序列 D1LLLxDm(LLLyDn)a 其中D是D-氨基酸； L是L-氨基酸； a 是 0-3 ；1.m和η相互独立地是1或2； χ和y相互独立地是0、1或2。
2.根据权利要求1的转运蛋白构建物，其中所述转运蛋白构建物包括根据以下子式 (Ia)至(Id) (SEQ ID NOs :2至5)之一的至少一个序列(Ia) =D1LLLxDm ；(Ib) =D1LLLxDmLLLyDn ；(Ic) =D1LLLxDmLLLyDnLLLyDn ；或(I d) D1LLLxDmLLLyDnLLLyDnLLLyDn。
3.根据权利要求1或2的转运蛋白构建物，其中所述转运蛋白构建物包括根据以下子式(Ie) (SEQ ID NO 6)的至少一个序列DLLLD(LLLD)a。
4.根据权利要求1、2或3中任一项的转运蛋白构建物，其中所述转运蛋白构建物包括根据以下子式(If) (SEQ ID NO 7)的至少一个序列DLLLDLLLD。
5.根据权利要求1-4中任一项的转运蛋白构建物，其中将根据通式(I)或根据任何子式(la)、(lb)、(Ic)、(Id)、(Ie)或(If)的所述序列与运输序列一起使用，或应用于运输序列，所述运输序列衍生自HIV-I TAT蛋白(SEQ ID NO 8)；优选衍生自含有HIV-1 TAT 蛋白(SEQ ID NO 8)的TAT残基48-57或49至57的氨基酸序列；或衍生自HSV VP22 (单纯疱疹(Herpes simplex))；或衍生自触角足载体序列(果蝇属触角足(Drosophila antermapedia))、FGF、乳铁蛋白；或衍生自碱性的肽，该肽的长度为5至15个氨基酸，优选地10至12个氨基酸，并包括至少80 %，更优选地85 %或甚至90 %的选自精氨酸、赖氨酸和/或组氨酸的碱性氨基酸，或可选自富含精氨酸的肽序列，包括&、R8> r7、R6> R5 ；衍生自 VP22 ；衍生自PTD-4衍生的蛋白或肽；衍生自RGD-Kni ；衍生自PEPT1/2或PEPT1/2衍生的蛋白或肽；衍生自SynB3或SynB3衍生的蛋白或肽；衍生自PC抑制剂；衍生自P21衍生的蛋白或肽；衍生自JNKI衍生的蛋白或肽；或衍生自这些运输序列之一的变体、片段和衍生物。
6.根据权利要求1至5中任一项的转运蛋白构建物，其中将根据通式(I)或根据任何子式(la)、(lb)、(Ic), (Id)、(Ie)或(If)的所述序列与以下序列之一或其反向序列或这些序列的变体或片段一起使用，或应用于下序列之一或其反向序列或这些序列的变体或片段
7.根据权利要求1至6中任一项的转运蛋白构建物，其中所述转运蛋白构建物包括根据rXXXrXXXr (SEQ ID NO :252)的至少一个序列，其中R代表D-对映体精氨酸； X是任何L-氨基酸；其中每个X可单独地并独立于SEQ ID NO 252内的任何其它X而选择。
8.根据权利要求8的转运蛋白构建物，其中所述6个XL-氨基酸的至少4个单独地选自由K或R组成的L氨基酸。
9.根据权利要求1至8中任一项的转运蛋白构建物，其中所述转运蛋白构建物包括所述子式(If)DLLLDLLLD (SEQ ID NO :7)，并且其中所述转运蛋白序列选自以下序列
10.根据权利要求1至9中任一项的转运蛋白构建物，其中所述转运蛋白构建物包括所述子式(If)DLLLDLLLD (SEQ ID NO :7)，并且其中将所述转运蛋白序列与运输序列一起使用或应用于运输序列，所述运输序列衍生自HIV-I TAT蛋白，在所述TAT衍生的序列的位置2 具有酪氨酸(Y)，所述序列优选地选自序列TAT(s2-91) (SEQ ID NO :116)。
11.根据权利要求5至10中任一项的转运蛋白构建物，其中将根据通式(I)或根据任何子式(la)、(lb)、(Ic)、(Id)、(Ie)或(If)的所述转运蛋白序列与权利要求5至10中列出的任何所述运输序列的变体或片段一起使用或应用于权利要求5至10中列出的任何所述运输序列的变体或片段，其具有权利要求5至10中列出的任何所述运输序列全长的至少10 %、20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、80 %或85 %，优选地至少90 %，更优选地至少 95%和最优选地至少99%。
12.转运蛋白货物结合分子，其包括a)组分(A)，其中组分(A)包括根据权利要求1至11任一项的所述转运蛋白构建物；和b)组分(B)，其包括效应分子。
13.根据权利要求12的转运蛋白货物结合分子，其中所述效应分子选自在治疗上有活性的蛋白或肽、蛋白激酶抑制剂、蛋白激酶c-Jum氨基末端激酶的抑制剂、抗原、抗体、凋亡因子、病理状态中牵涉的蛋白酶，优选地是肽蛋白酶抑制剂、BH3结构域或唯BH3蛋白、编码这些蛋白的核酸、siRNAs、反义RNAs、细胞毒性剂和包括蛋白酶抑制剂的小有机化合物。
14.根据权利要求12或13的转运蛋白货物结合分子，此外包括至少一个不同于组分 ⑶的另外的组分(C)、⑶和/或(E)，其中所述至少一个任选的另外的组分(C)、⑶和/ 或(E)相互独立地选自如针对组分(B)所定义的不同的效应分子或它们的片段或变体。
15.根据权利要求12至14中任一项的转运蛋白货物结合分子，其中组分(A)和(B)与任选的组分(C)、⑶和/或(E)相互共价连接。
16.根据权利要求12至15中任一项的转运蛋白货物结合分子，其中所述至少一个另外的组分(C)、(D)和/或(E)选自信号序列或定位序列，其引导所述发明的转运蛋白货物结合分子到特定的细胞内靶定位或到特定的细胞类型。
17.根据权利要求12至16中任一项的转运蛋白货物结合分子，其中组分(B)和/或所述至少一个另外的组分(C)、⑶和/或(E)是蛋白或肽序列并由L-氨基酸、D-氨基酸或二者的混合物组成。
18.根据权利要求12至17中任一项的转运蛋白货物结合分子，其中组分(A)位于所述转运蛋白货物结合分子的所述C末端，假设组分(B)是蛋白或肽序列。
19.根据权利要求12至18中任一项的转运蛋白货物结合分子，其用作药物。
20.药物组合物，其包括根据权利要求12至19中任一项的转运蛋白货物结合分子和任选地药学上可接受的载体/或赋形剂。
21.根据权利要求1至11中任一项的转运蛋白构建物用于制备转运蛋白货物结合分子的用途。
22.根据权利要求21的转运蛋白构建物的用途，其中所述转运蛋白货物结合分子是如根据权利要求12至18中任一项所定义的。
23.根据权利要求1至11中任一项的转运蛋白构建物或根据权利要求12至18中任一项所定义的转运蛋白货物结合分子用于将货物分子转运进将被治疗的患者的细胞或组织的用途。
24.根据权利要求23的用途，其中所述货物是如根据权利要求12至18中任一项所定义的。
25.根据权利要求23或M的用途，其用于将货物分子转运进白细胞和/或神经元细胞，特别是将被治疗的患者的白细胞和/或神经元细胞。
26.根据权利要求12至18中一项的转运蛋白货物结合分子用于制备药物的用途，该药物用于预防、治疗和/或改善癌症或肿瘤疾病——包括由缺陷型凋亡引起的疾病、炎性疾病、感染疾病、病毒(感染)疾病、与NJK信号传导密切相关的疾病、自身免疫性病症或疾病、心血管疾病、神经元或神经变性疾病、肝病、脊柱疾病、子宫疾病、重度抑郁症、非慢性或慢性炎性消化病、听力丧失、内耳疾病，或用在组织移植中。
全文摘要
本发明涉及通式(I)DlLLLxDm(LLLyDn)a的新转运蛋白构建物和其变体。本发明还涉及转运蛋白货物结合分子，特别是所述新转运蛋白构建物与货物部分的结合物，货物部分例如蛋白或肽、核酸、细胞毒性剂、有机分子等。此外，本发明公开了包括这些结合物的(药物)组合物和涉及这样的转运蛋白构建物的治疗方法和用途。
文档编号A61K47/48GK102256998SQ200980151845
公开日2011年11月23日 申请日期2009年12月22日 优先权日2008年12月22日
发明者C·邦尼 申请人:希根有限责任公司
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