胞内细菌感染的处理的制作方法
专利名称：胞内细菌感染的处理的制作方法
技术领域：
本发明涉及用防卫素多肽在吞噬性细胞中处理胞内细菌感染。背景金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是多种在社区和医院遭受的感染的主要病原体，所述感染的范围从轻微感染如皮炎或伤口感染至严重的涉及败血病的疾病，包括关节炎、心内膜炎、肺炎和脑膜炎。对葡萄球菌疾病的治疗常常是困难的，因为甚至在用抗微生物剂长期治疗之后， 感染也常常持续或复发。葡萄球菌感染的持续可涉及细菌发病机制的几个方面。由几位作者报道的重要特征是细菌侵入吞噬细胞并在细胞内存活的能力。细菌的胞内累积使得抗微生物剂的使用复杂化，因为胞内活性取决于几个因素如药物穿透并在细胞中累积的能力，以及药物代谢和胞内分布。许多抗生素药剂无法进入吞噬细胞，此外，研究显示对于能够穿透细胞的药物，抗微生物活性和细菌对疗法的应答性常常受到削弱(impaired)。几位作者已描述了抗生素针对胞内金黄色葡萄球菌的体外活性，但许多报道得到争议性结果。Seral等显示胞内浓度和累积对于活性仅为部分预见性的，且仍不清楚哪个参数决定抗生素的胞内活性。Gresham等显示感染金黄色葡萄球菌的多形核嗜中性白细胞(PMN)含有足够量的生活的胞内细菌使得通过将这些细胞腹膜内注射于健康小鼠导致感染。而且，他们阐明了将PMN的迁移限制于感染位点导致增强的宿主防御。这些数据可表明细菌的胞内存活是金黄色葡萄球菌感染发病机制的重要因素之一。许多药物，包括常用的糖肽类如万古霉素，针对金黄色葡萄球菌的胞内作用不佳。 此外，甲氧西林抗性(MRSA)金黄色葡萄球菌发生率的增加和多抗药性株的出现进一步使得这些感染的治疗复杂化。因此，对针对这些类型的感染的新型化合物的需要正在增加。菌丝霉素(Plectasin)是来源于腐生子囊菌淡黑假黑盘菌(Pseudoplectania nigrella)的防卫素。该抗微生物肽在体外和体内均针对多种革兰氏阳性细菌包括金黄色葡萄球菌的菌株显示有力的抗微生物作用。此外，其与常用的抗葡萄球菌化合物相比具有新型的对细菌作用模式。然而，这个或任何其他新型抗微生物肽据我们所知从未在胞内感染模型中得到过测试。假如新药如菌丝霉素，具有进入细胞并杀灭胞内细菌的能力，这对于未来对葡萄球菌感染的治疗而言会是有利之处。存在多种使用人或动物细胞系的体外模型以供研究胞内抗微生物活性。然而，仅有极少的研究在动物中进行。
本发明涉及通过施用防卫素针对存在于人或动物吞噬性细胞(phagocyticcell) (吞噬细胞(phagocyte))如巨噬细胞之内的葡萄球菌的抗细菌作用。
发明内容
我们现已发现某些防卫素多肽可用于处理吞噬性细胞(吞噬细胞)如巨噬细胞中的胞内细菌感染。相应地，在第一个方面，本发明提供具有抗细菌活性的多肽在制备用于在吞噬性细胞如巨噬细胞中治疗性处理胞内细菌感染的药物中的用途，所述多肽包括与SEQ ID NO 1的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述细菌感染是葡萄球菌感染。在第二个方面，本发明提供了用于在吞噬性细胞如巨噬细胞中处理胞内细菌感染的方法，包括向需要此种处理的人或动物以用于在吞噬性细胞中处理所述胞内细菌感染的有效量施用抗细菌多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO :1的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述处理包括至少17mg/kg的所述多肽的第一剂量。用于本发明用途或用于在吞噬性细胞如巨噬细胞中根据本发明处理胞内细菌感染的多肽在下文中命名为“(根据)本发明的多肽”。发明详述定义抗细菌活性术语“抗细菌活性”于本文定义为一种能够杀死细菌细胞或抑制细菌细胞生长的活性。在本发明的上下文中，术语“抗细菌的”旨在意指有杀细菌的和/或抑制细菌的作用，其中术语“杀细菌的”应被理解为能够杀死细菌细胞，而其中术语“抑制细菌的”应被理解为能够抑制细菌的生长。当细菌细胞的生长受到抑制时，细胞处于非生长状态，即其无法繁殖。在优选的实施方案中，术语“抗细菌活性”定义为针对链球菌(Streptococci)(优选月市炎链球菌(Streptococcus pneumoniae))或葡萄球菌(Staphylococci)(优选金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus)的杀细菌和/或抑制细菌活性。就本发明而言，抗细菌活性可根据由Lehrer等，Journal of Immunological Methods, Vol. 137 (2)pp. 167-174(1991)所述的方法测定。或者，抗细菌活性可根据来自 CLSI (临床和实验室标准学会(Clinical and Laboratory Standards Institute)；之前称为国家临床与实验室标准委员会(National Committee of Clinical and Laboratory Standards))的 NCCLS 指南确定。将具有抗细菌活性的化合物以浓度为500 μ g/mL ；优选浓度为250 μ g/mL ；更优选浓度为100 μ g/mL ；甚至更优选浓度为50 μ g/mL ；最优选浓度为25 μ g/mL ；且特别是浓度为10 μ g/mL的所述具有抗微生物活性的多肽在相关微生物生长底物中于37°C温育M小时后(优选16小时后，更优选8小时后，最优选4小时后，且特别是2小时后)可具有将肺炎链球菌(ATCC 49619)的活细胞数减少至1/100的能力。具有抗细菌活性的化合物当以500 μ g/mL的浓度加入；优选当以250 μ g/mL的浓度加入；更优选当以100 μ g/mL的浓度加入；甚至更优选当以50 μ g/mL的浓度加入；最优选当以10μ g/mL的浓度加入；以及特别是当以5μ g/mL的浓度加入时，在相关微生物生长底物中于37°C也可具有将肺炎链球菌(ATCC 49619)的长出(outgrowth)抑制8小时的能力。本发明的多肽具有至少20 %，优选至少40 %，更优选至少50 %，更优选至少60 %， 更优选至少70 %，更优选至少80 %，甚至更优选至少90 %，最优选至少95 %，且甚至最优选至少100%的由SEQ ID NO 1的氨基酸序列组成的多肽的抗微生物活性。防卫素(Defensin)术语“防卫素”用于本文意指本领域的技术人员识别为属于防卫素类抗微生物肽的多肽。为确定某多肽是否为根据本发明的防卫素，优选将其氨基酸序列通过使用可免费获得的HMMER软件包与PFAM数据库的隐蔽马尔科夫模型序型(hidden markov model profile) (HMM 序型(HMM profile))比较(参见实施例 5)。PFAM防卫素家族包括防卫素1或“哺乳动物防卫素”(登录号PF00323)、防卫素2 或“节肢动物防卫素”(登录号PF01097)、防卫素β或“β防卫素”(登录号PF00711)、防卫素_prop印或“防卫素前肽”(登录号PF00879)与γ-硫素(gamma-thionin)或“ γ -硫素家族”(登录号PF00304)。防卫素可属于α -防卫素类、β -防卫素类、θ -防卫素类、昆虫或节肢动物防卫素类、或植物防卫素类。来自这些类中每一类的防卫素享有共同的结构特征，如半胱氨酸样式。但重要的是注意类的归属并不表明防卫素的来源。举例而言，来自真菌的防卫素可属于昆虫防卫素类。如SEQ ID NO 1所示的防卫素是来源于菌丝霉素的合成防卫素(参见WO 03/044049)，其属于昆虫防卫素类。菌丝霉素显示为SEQ ID NO :2。在一个实施方案中，根据本发明的防卫素的氨基酸序列包含4、5、6、7或8个半胱氨酸残基，优选4、5或6个半胱氨酸残基，更优选4或6个半胱氨酸残基，且最优选6个半胱氨酸残基。防卫素也可为享有任何防卫素类的特性特征的合成防卫素。这样的防卫素的实例包括(但不限于)α-防卫素ΗΝΡ-1(人嗜中性粒细胞肽)、ΗΝΡ-2 和 ΗΝΡ-3 ； β -防卫素-12、Drosomycin, Heliomicin, γ 1-嘌呤硫素 (Y Ι-purothionin)、昆虫防卫素 Α，和 PCT 申请 WO 99/53053,WO 02/06324,WO 02/085934、 WO 03/044049, WO 2006/131504、WO 2006/050737 和 W02006/053565 中所公开的防卫素。分离的多肽术语“分离的变体”或“分离的多肽”用于本文指自来源分离的变体或多肽。在一方面，该变体或多肽为至少纯的，优选至少5%纯的，更优选至少10%纯的， 更优选至少20%纯的，更优选至少40%纯的，更优选至少60%纯的，甚至更优选至少80% 纯的，且最优选至少90 %纯的，如通过SDS-PAGE所测定的。基本上纯的多肽术语“基本上纯的多肽”于本文代表一种多肽制备物，其含有以重量计至多10 %，优选至多8 %，更优选至多6 %，更优选至多5 %，更优选至多4 %，更优选至多3%，甚至更优选至多2%，最优选至多1%，且甚至最优选至多0. 5%的与其天然或重组结合的其它多肽物质。因此，优选所述基本上纯的多肽按该制备物中存在的总多肽物质的重量计为至少92%纯的，优选至少94%纯的，更优选至少95%纯的，更优选至少96% 纯的，更优选至少96 %纯的，更优选至少97 %纯的，更优选至少98 %纯的，甚至更优选至少 99%纯的，最优选至少99. 5%纯的，且甚至最优选100%纯的。本发明的多肽优选处于基本上纯的形式。这可以通过以公知的重组方法或以经典的纯化方法制备该多肽来完成。同一性两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性通过参数“同一性” 描述。就本发明而言，两个氨基酸序列之间的同一性程度使用如于EMBOSS包(EMBOSS 欧洲分子生物开放软件组(The European Molecular Biology Open Software Suite)， Rice 等，2000，Trends in Genetics 16 :276-277 ;http://emboss, org)的 Needle 程序，优选3. 0. 0或更新的版本中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970， J. Mol. Biol. 48 =443-453)来确定。所使用的任选参数为缺口产生罚分(gap open penalty) 为10，缺口延伸罚分为0. 5，和EBL0SUM62(BL0SUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。使用标记为“最长同一性”的Needle的输出(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性并如下计算(相同的残基X100)/(比对的长度-比对中缺口的总数)就本发明而言，两个脱氧核糖核苷酸序列之间的同一性程度使用如于EMBOSS 包(EMBOSS 欧洲分子生物开放软件组，Rice等，2000，如上；http //emboss, org)的 Needle程序，优选3. 0. 0或更晚版本中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和 mmsch，1970，如上)测定。所使用的任选参数为缺口产生罚分10，缺口延伸罚分0.5，和 EDNAFULL(NCBI NUC4. 4的EMBOSS版本)取代矩阵。使用标记为“最长同一性”的Needle 的输出(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性并如下计算(相同的脱氧核糖核苷酸X100)/(比对的长度-比对中缺口的总数)。等位变体术语“等位变体(allelic variant) ”在本文中表示占据相同染色体基因座的基因的任何两种或更多种可选形式。等位变异通过突变天然地发生，并且可导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。修饰术语“修饰”在本文的意思是，对由SEQ ID NO 1的氨基酸序列组成的多肽的任何化学修饰，以及对编码所述多肽的DNA的遗传操作。所述修饰可以是一处或多处一个或多个(数个)氨基酸的取代、缺失和/或插入，以及一处或多处一个或多个(数个)氨基酸侧链的置换；或在氨基酸序列中使用具有相似特征的非天然氨基酸。特别地，所述修饰可为酰胺化，例如C-端的酰胺化。具有抗细菌活性的多肽在第一方面，本发明涉及具有与SEQ ID NO :1 ( S卩，成熟多肽)有至少80%，优选至少85%，更优选至少90%，最优选至少95%，且特别地至少97%同一性程度的氨基酸序列的分离的多肽，其具有抗细菌活性(以下称“同源多肽”)。在一个优选的方面，所述同源多肽具有与SEQ ID NO :1的氨基酸序列相差至多六个氨基酸，优选至多五个氨基酸，更优选至多四个氨基酸，甚至更优选至多三个氨基酸，最优选至多两个氨基酸，且特别是一个氨基酸的氨基酸序列。本发明的多肽优选包含SEQ ID NO=I的氨基酸序列或其等位变体。在一个优选的方面，多肽包含SEQ ID NO :1的氨基酸序列。在另一个优选的方面，多肽由SEQ ID N0:1的氨基酸序列或其等位变体组成。在另一个优选的方面，多肽由SEQ ID NO :1的氨基酸序列组成。
优选地，氨基酸改变对性质是较不重要的(of a minor nature)，即不显著影响多肽的折叠和/或活性的保守的氨基酸取代或插入；单缺失；小的氨基-或羧基-末端延伸；多至大约20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或其它功能来促进纯化的小延伸，如多组氨酸标签(poly histidine tag)、抗原表位(antigenic印itope)或结合域 (binding domain)。保守取代的实例是在以下组之内碱性氨基酸组(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、 酸性氨基酸组(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸组(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸组(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸组(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不改变比活性(specific activity)的氨基酸取代是本领域已知的，并且由例如H. Neurath和R. L. Hill，1979，于The Proteins, Academic Press, New York 中描述。最普遍发生的交换是 Ala/^er、Val/Ile、 Asp/Glu、Thr/Ser,Ala/Gly,Ala/Thr,Ser/Asn,Ala/Val、Ser/Gly,Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/ Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu 禾口 Asp/Gly。除了 20个基本氨基酸，非基本氨基酸(如4-羟脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、2_氨基异丁酸、异缬氨酸和α-甲基丝氨酸)可以取代野生型多肽的氨基酸残基。有限数量的非保守氨基酸、不由遗传密码编码的氨基酸和非天然氨基酸可以取代氨基酸残基。“非天然氨基酸”在蛋白质合成后已经过修饰，和/或在它们的侧链具有不同于基本氨基酸的化学结构。非天然氨基酸能够以化学方法合成，并且优选是商业上能够获得的，且包括六氢吡啶羧酸(pipecolic acid)、噻唑烧羧酸(thiazolidine carboxylic acid)、脱氢脯氨酸、3-和 4-甲基脯氨酸，和3，3-二甲基脯氨酸。能够根据本领域已知的方法，例如定位诱变或丙氨酸分区诱变法(Cunningham和 Wells, 1989, Science 244 :1081-1085)来鉴定亲本多肽中的必需氨基酸。在后一技术中， 将单一丙氨酸突变引入到分子中的每个残基，并且测试所得突变分子的生物活性(即，抗细菌活性)以鉴定对于所述分子的活性关键的氨基酸残基。同样参见Hilton等，1996， J. Biol. Chem. 271 :4699_4708。生物相互作用也能够通过对结构的物理分析而测定，如通过以下这些技术如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记，连同推定的接触位点氨基酸的突变来测定。参见例如de Vos等，1992，Science 255 :306-312 ;Smith等，1992， J. Mol. Biol. 224 :899-904 ；Wlodaver 等，1992，FEBSLett. 309 :59_64。必需氨基酸的身份 (identity)也能够根据分析与多肽的同一性来推断，所述多肽与根据本发明的多肽相关。能够使用已知的诱变、重组和/或改组(shuffling)方法，然后是有关的筛选方法，例如那些由 Reidhaar-Olson 禾Π Sauer, 1988，Science 241 :53-57 ；Bowie 禾Π Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 :2152-2156 ；WO 95/17413;或 WO 95/22625 公开的那些方法来进行并测试单个或多个氨基酸取代。能够使用的其它方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，Lowman 等，1991，Biochem. 30 :10832-10837 ；美国专利 No. 5，223，409 ；WO 92/06204)和区域定向的诱变(Derbyshire 等，1986，Gene 46 :145 ；Ner 等，1988，DNA 7 127)。诱变/改组方法能够与高通量、自动化的筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性。能够从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并且使用本领域内标准方法快速测序。这些方法允许快速测定感兴趣的多肽中单个氨基酸残基的重要性，并且能够应用于未知结构的多肽。在一个优选实施方案中，本发明的多肽是防卫素多肽，优选昆虫或节肢动物防卫素多肽。N-端延伸本发明的多肽的N-端延伸可适当地由1至50个氨基酸，优选2-20个氨基酸，尤其是3-15个氨基酸组成。在一个实施方案中，N-端肽延伸不包含Arg(R)。在另一个实施方案中，N-端延伸包含kex2或kex2_样切割位点，如在下文进一步定义的。在一个优选的实施方案中，N-端延伸为肽，其包含至少两个Glu (E)和/或Asp (D)氨基酸残基，如包含以下序列之一的N-端延伸EAE、EE、DE和DD。Kex2 位点Kex2位点(参见，例如，Methods in Enzymology Vol 185，D. Goeddel编，Academic Press Inc. (1990), San Diego, CA, "Gene Expression Technology，，)禾口 kex2_ 样位点为在一些蛋白质的前肽编码区和成熟区之间存在的二元的(dibasic)识别位点(即，切割位
点)ο插入kex2位点或kex2_样位点已在某些情况中显示改进了于前肽切割位点处的正确内肽酶加工，导致蛋白质分泌水平增加。在本发明的上下文中，插入kex2或kex2_样位点导致在N-端延伸中某个位置处获得切割的可能性，造成抗细菌多肽与SEQ ID NO :1中所示的成熟多肽相比得到延长。融合的多肽本发明的多肽也包括融合的多肽或可切割的融合多肽，其中另一多肽融合于本发明的多肽或其片段的N-端或C-端。通过将编码另一多肽的核苷酸序列(或其部分)融合于本发明的核苷酸序列(或其部分)来产生融合的多肽。产生融合多肽的技术是本领域已知的，并包括连接编码所述多肽的编码序列以使它们在阅读框中，并且使融合的多肽的表达在相同启动子和终止子的控制下。方法和用途本发明涉及本发明多肽在吞噬性细胞优选巨噬细胞中处理胞内细菌感染的用途。 相应地，本发明多肽可用于制备兽用或人用治疗剂或预防剂以供在吞噬性细胞优选巨噬细胞中处理胞内细菌感染。胞内细菌感染意指造成感染的细菌存在(reside)于人或动物细胞内。在一个优选实施方案中，所述胞内细菌感染是胞内革兰氏阳性细菌感染；更优选地，所述胞内细菌感染是胞内葡萄球菌Staphylococcus)感染；更优选地，所述胞内细菌感染是胞内金黄色葡萄球菌感染。本发明的多肽可用于治疗慢性肉芽肿病(CGD)，其为其中免疫系统的细胞(吞噬性细胞)难以形成用于杀灭摄取的病原体如金黄色葡萄球菌的活性氧化合物(最重要地， 超氧自由基)的疾病。这导致在许多器官中形成肉芽肿。罹患CGD的患者由于其免疫系统对抗造成疾病的生物(其部分存在于胞内)的能力下降而屡次遭受感染发作。因为本发明多肽能够在胞内呈现针对由吞噬性细胞摄取的病原体的抗细菌活性，其可用于制备用于治疗慢性肉芽肿病的药物。本发明的多肽可以以足以杀灭存在于人或动物细胞内的葡萄球菌属菌种如金黄色葡萄球菌或抑制其生长的量使用。将本发明多肽的配制物施用于正遭受吞噬性细胞优选巨噬细胞中的胞内细菌感染或对其易感的宿主。在一个实施方案中，所述胞内细菌感染是由葡萄球菌属菌种如金黄色葡萄球菌的感染造成的。施用可为局部化的或全身性的。一般而言，本发明的抗细菌多肽的剂量足以减少微生物种群至少llog，且可杀灭2或更多个log。将本发明的多肽以减少微生物种群同时最小化任何副作用的剂量施用。考虑的是所述组合物可在医师的指导下获得并用于体内用途。可采用多种施用方法。所述多肽配制物可口服给予，或可血管内、肌肉内、皮下、腹膜注射、通过气溶胶、眼部(opthalmically)、膀胱内、局部等方式。治疗性配制物的剂量变化会很大，取决于待施用的具体抗细菌多肽、施用的频率、施用的方式、药剂自宿主的清除等。初始剂量可较大，然后为较小的维持剂量。优选初始剂量至少为17mg/kg。在许多情况中，口服施用会需要比静脉内施用更高的剂量。可对酰胺键以及氨基与羧基端进行修饰以在口服施用时具有较好的稳定性。例如，羧基端可以是酰胺化的。配制物本发明的多肽可掺入多种配制物中用于治疗性施用。更具体地，本发明的多肽可通过与适合的、药学上可接受的载体或稀释剂组合而配制成药物组合物，且可配制成固体、半固体、液体或气体形式的制备物，如片剂、胶囊、粉末、颗粒、软膏(ointment)、乳霜 (cream)、泡沫、溶液、栓剂、注射剂、吸入剂、凝胶、微球、洗剂(lotion)和气雾剂。如此，所述多肽的施用可以多种方式实现，其包括经口施用、含服施用、直肠施用、肠胃外施用、腹膜内施用、皮内施用、透皮施用、气管内施用等。本发明的抗细菌多肽可在施用后为全身性的或可为局部化的。本发明的多肽可单独施用、彼此组合施用或其可与其他已知化合物(例如，穿孔素(perforin)、抗炎剂、抗生素等)组合使用。在药物剂型中，所述多肽可以其药学上可接受的盐的形式施用。以下方法和赋形剂仅为示例性的而非以任何方式进行限制。对于口服制备物，所述多肽可单独使用或与适合的添加剂组合以制造片剂、粉末、 颗粒或胶囊，例如，与常规的添加剂，如乳糖、甘露醇、玉米淀粉或马铃薯淀粉组合；与粘合剂(binder)，如结晶纤维素、纤维素衍生物、阿拉伯树胶(acacia)、玉米淀粉或明胶组合； 与崩解剂，如玉米淀粉、马铃薯淀粉或羧甲基纤维素钠组合；与润滑剂，如滑石或硬脂酸镁组合；以及如果需要，与稀释剂、缓冲剂、湿润剂、防腐剂和调味剂结合。所述多肽可通过将其溶解、悬浮或乳化于水性或非水性溶剂例如植物油或其它类似的油、合成的脂肪酸甘油酯、高级脂肪酸的酯或丙二醇中，以及如果需要，与常规的添加剂例如增溶剂、等张剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂一起，而配制成用于注射的制备物。所述多肽可用于气溶胶配制物中以经由吸入施用。本发明的多肽可配制于加压的可接受推进剂如二氯二氟甲烷、丙烷、氮等中。此外，所述多肽可通过与多种基底(base)(例如乳化基底或水溶性基底)混合而制成栓剂。本发明的多肽可经由栓剂而直肠施用。栓剂可包括媒介物，例如可可脂、碳蜡 (carbowax)和聚乙二醇，其在体温融化，但在室温固化。
可提供用于口服或直肠施用的单位剂型，如糖浆、酏剂和悬浮剂，其中每个剂量单位(例如茶匙量、汤匙量、片剂或栓剂)包含预定量的组合物，所述组合物含有一种或多种本发明的多肽。类似地，用于注射或静脉内施用的单位剂型可包含在组合物中的本发明多肽，而所述组合物为无菌水、生理盐水或另一药学上可接受的载体中的溶液。用于持续释放配制物的移植物是本领域中公知的。移植物以生物可降解的或非生物可降解的聚合物配制成微球、厚片(slab)等。例如，乳酸和/或乙醇酸的聚合物形成可侵蚀性聚合物，其被宿主良好地耐受。包含本发明的抗细菌多肽的移植物置于接近感染的位点，使得活性剂的局部浓度相对于身体的其余部分增加。术语“单位剂型”用于本文意指物理上离散的单位，其适合作为用于人和动物受试者的单元剂量，每个单元包含预定量的本发明多肽，该量经计算为足够产生期望效果的量，所述多肽与药学上可接受的稀释剂、载体或媒介物组合。本发明的单位剂型的规格取决于所采用的具体多肽和待实现的效果、以及在宿主中与所述多肽相关的药效动力学 (pharmacodynamics)0药学上可接受的赋形剂，如媒介物、佐剂、载体或稀释剂，是公众容易获得的。此外，药学上可接受的辅助物质，如PH调整和缓冲剂、张度调节剂(tonicity adjusting agent)、稳定剂、润湿剂等，是公众容易获得的。用于全身性施用的典型剂量的范围为0. Ipg至100毫克每公斤受试者重量每次施用。典型剂量可为每天服用二到六次每次一片，或每天服用一次每次一颗延时-释放的 (time-release)胶囊或片剂，且包含成比例更高含量的活性成分。延时-释放效果可通过在不同PH值溶解的胶囊材料、通过由于渗透压缓慢释放的胶囊、或通过任何其它已知的控制释放方法而获得。本领域的技术人员容易理解的是剂量水平可作为具体多肽、症状的严重性和受试者对副作用的敏感性的函数而变化。一些特定多肽比其他更为有效。给定多肽的优选剂量可由本领域的技术人员通过多种手段容易地确定。一个优选的手段为测量给定多肽的生理潜力(physiological potency)。使用脂质体作为递送媒介物是一种受关注的方法。脂质体与目标位点的细胞融合并将内腔的内容物在细胞内递送。维持脂质体与细胞接触一段足够融合的时间，其使用多种方法以维持接触，如分离、结合剂等。在本发明的一个方面，脂质体经设计以气溶胶化用于肺部施用。脂质体可用介导膜融合的纯化蛋白质或肽(如，仙台病毒或流感病毒等)制备。脂质可为已知的脂质体形成性脂质的任何有用组合，包括阳离子脂质或两性离子脂质， 如磷脂酰胆碱。剩下的脂质通常会为中性或酸性脂质，如胆固醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油等。为了制备脂质体，可使用Kato等(1991) J. Biol. Chem. 266 :3361所描述的方法。 简言之，将脂质和包含肽的内腔组合物在适合的水性介质(方便地为盐水介质)中组合，其中总固体在大约1-10重量百分比的范围内。在短时间(大约5-60秒)激烈地搅动后，将管子置于温水浴(大约25-40°C )并重复此循环大约5-10次。然后对所述组合物进行声处理一段方便的时间(一般大约1-10秒)并可进一步通过漩涡震荡而搅动。然后通过加入水性介质扩增体积，一般使体积增加大约1-2倍，然后摇动并冷却。此方法允许将高分子量分子并入内腔中。
具有其它活性剂的配制物为了用于提述方法，本发明的抗细菌多肽可与其它药学活性剂(特别是其它抗微生物剂)一起配制。所关注的其它药剂包括广大范围的抗生素，如于技术领域中已知的。抗生素的类型包括青霉素类，例如青霉素G、青霉素V、甲氧西林(methicillin)、 苯唑西林(oxacillin)、羧节西林(carbenicillin)、萘夫西林(nafcillin)、氨节西林等；青霉素类与β-内酰胺酶抑制剂，头胞菌素类的组合，例如头孢克洛(cefaclor)、头孢唑林(cefazolin)、头孢呋辛(cefuroxime)、拉氧头孢(moxalactam)等；碳青霉烯类 (carbapenems)；单环内酰胺类(moncAactams)；氨基糖苷类；四环素类；大环内酯类；林可霉素类；多粘菌素类；磺胺类；喹诺酮类(quinolones)；氯霉素(cloramphenical)；甲硝唑 (metronidazole)；大观霉素；甲氧节唆(trimethoprim)；万古霉素等。抗霉菌剂(包括多烯类，例如两性霉素B (amphotericin B)、制霉菌素； 5-flucosyn ；和唑类，例如咪康唑(miconazol)、酮康唑(ketoconazol)、伊曲康唑(itraconazol)和氟康唑(fluconazol))也是有用的。抗结核药物包括异烟胼 (isoniazid)、乙胺丁醇(ethambutol)、链霉素和利福平(rifampin)。细胞因子(例如干扰素Y、肿瘤坏死因子α、白介素12等)也可包含于本发明的抗细菌多肽的配制物中。体外合成本发明的多肽可通过体外合成使用如本技术领域中已知的常规方法制备。多种商业合成设备是可获得的，例如Applied Biosystems Inc.，Beckman的自动化合成仪等。通过使用合成仪，可以用非天然氨基酸(特别是D-异构体(或D-型)，例如D-丙氨酸与D-异亮氨酸、非对映异构体、具有不同长度或官能团的侧链等)取代天然存在的氨基酸。制备的特定顺序和方式可通过方便性、经济性、所需纯度等确定。可将化学连接提供给多种肽或蛋白质，其包括方便的用于键合的官能团，如用于酰胺或取代的胺形成(例如还原性胺化)的氨基、用于硫醚或二硫键形成的硫醇基、用于酰胺形成的羧基等。如果需要，可在合成过程中或在表达过程中将多个基团(其允许连接至其它分子或表面)导入至肽中。因此，可使用半胱氨酸以制造硫醚、使用组氨酸以连接至金属离子复合物、使用羧基以形成酰胺或酯、使用氨基以形成酰胺等。所述多肽也可根据常规的重组合成方法分离和纯化。可制备表达宿主的裂解物， 而该裂解物使用HPLC、排阻层析、凝胶电泳、亲和层析、或其它纯化技术纯化。一般来说，所使用的组合物会包含按重量计至少20%的期望产物，更通常按重量计至少大约75%，优选按重量计至少大约95 %，以及为了治疗目的，通常按重量计至少大约99. 5 %，其系相对于与产物的制备及其纯化方法有关的污染物而言。通常，百分比会基于总蛋白质。通过以下实施例进一步描述本发明，且所述实施例不应被理解为限制本发明的范围。
实施例在下述实施例中，SEQ ID NO 1所示的防卫素多肽在下文中称作“防卫素2114”， 而SEQ ID NO :2所示的防卫素多肽在下文中称作“菌丝霉素”。实施例1
对干菌丝霍素和防下.素2114在THP-I巨卩策细胞,中胞内作用的体夕卜研究本实施例呈现在受感染的THP-I巨噬细胞中对菌丝霉素和防卫素2114的胞内抗细菌活性的体外研究。细菌菌株的制备对于菌丝霉素研究，使用了两种金黄色葡萄球菌菌株ATCC25923(MSSA)和 E33235(MSSA，axil，来自 Statens Serum Institute，Denmark 的临床分离株)。对于防卫素2114研究，使用了两种金黄色葡萄球菌菌株ATCC25923 (MSSA)、 MRSA(临床败血病分离株，Statens Serum Institute,引用号1-15479)和 VRSA2(Pennsylvania HIP 11983)。将细菌的过夜培养物用人血清(AB阳性，Lonza, USA)调理45分钟。之后将所述细菌使用分光光度计(CECIL 2040)滴定，并对THP-I巨噬细胞计数，然后用4个细菌/细胞进行感染。将THP-I细胞在补充有胎牛血清的RPMI1640培养基中培养。将细菌与细胞在37°C，0)25%培养1小时以允许吞噬作用。洗涤在1小时温育之后，将感染的细胞与庆大霉素(50μ g/mL)温育45分钟以消灭剩余的未经吞噬的细菌。为了在温育之后去除庆大霉素，将细胞用PBS洗涤3x。在第三次洗涤之后，将细胞重悬于RPMI 1640培养基(+10%胎牛血清)中，并将菌丝霉素或防卫素2114 以所需浓度添加(O-USxMIC)。将一个样品与庆大霉素以IxMIC温育以控制胞内生长。在防卫素2114研究中，将活性与万古霉素和达托霉素的活性相比较。将细胞在6孔板中在37°C，0)25%温育M小时。在温育之后，将细胞在PBS中洗涤，并随后在无菌水中重悬以释放胞内细菌。CFU量的确定将样品根据预计的CFU量稀释并涂布于TSA板上，并在35°C温育过夜。在M小时温育之后，对CFU进行计数。细胞蛋白测定可将样品在-20°C储藏长达一周。对样品进行声处理并如Lowry等所述滴定蛋白质，由此获得作为CFU/mg蛋白的结果。对所有样品进行三次重复测试。数据分析体外胞内剂量-应答研究对于剂量-效果关系的分析，采用Hill等式(斜率=1)计算最大相对效力(maximal relative efficacy)，^liax，静止浓度(static concentration, Cstatic)和拟合优度。这些参数使用非线性回归确定。Efflax定义为CFU计数在吞噬后接种物和M小时处理之间的log变化，而Cstatic为导致无明显细菌生长(CFU与起始接种物相同)的浓度(以MIC的倍数计)。结果24小时之后菌丝霉素针对金黄色葡萄球菌ATCC25923和E33235 表1.最大作用，^iax (以及置信区间，Cl)和静止剂量(static dose)，Cstati。，来自
菌丝霉素的体外胞内研究
权利要求
1.具有抗细菌活性的多肽在制备用于治疗性处理吞噬性细胞中胞内细菌感染的药物中的用途，所述多肽包含与SEQ ID NO :1的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列。
2.根据权利要求1的用途，其中所述吞噬性细胞是巨噬细胞。
3.根据权利要求1-2任一项的用途，其中所述细菌感染是金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)感染。
4.根据权利要求1-3任一项的用途，其中所述处理包括至少17mg/kg的所述多肽的第一剂量。
5.具有抗细菌活性的多肽用于处理吞噬性细胞中的胞内细菌感染，所述多肽包含与 SEQ ID NO :1的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列。
6.根据权利要求5使用的多肽，其中所述吞噬性细胞是巨噬细胞。
7.根据权利要求5-6任一项使用的多肽，其中所述细菌感染是金黄色葡萄球菌感染。
8.根据权利要求5-7任一项使用的多肽，其中所述处理包括至少17mg/kg的所述多肽的第一剂量。
9.具有抗细菌活性的多肽在制备用于治疗性处理慢性肉芽肿病的药物中的用途，所述多肽包含与SEQ ID NO 1的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列。
10.具有抗细菌活性的多肽用于处理慢性肉芽肿病，所述多肽包含与SEQID N0:1的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列。
11.处理吞噬性细胞中胞内细菌感染的方法，包括向需要此种处理的人或动物以用于处理吞噬性细胞中所述胞内细菌感染的有效量施用抗细菌多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO 1的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。
12.权利要求11的方法，其中所述吞噬性细胞是巨噬细胞。
13.权利要求11-12任一项的方法，其中所述细菌感染是金黄色葡萄球菌感染。
14.权利要求11-13任一项的方法，其中所述处理包括至少17mg/kg的所述多肽的第一剂量。
15.处理慢性肉芽肿病的方法，包括向需要此种处理的人或动物以用于处理慢性肉芽肿病的有效量施用抗细菌多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO :1的氨基酸序列具有至少90% 同一性的氨基酸序列。
全文摘要
本发明涉及用防卫素多肽治疗胞内细菌感染的方法。
文档编号A61P31/04GK102264383SQ200980152304
公开日2011年11月30日 申请日期2009年10月23日 优先权日2008年10月24日
发明者卡罗林.S.布林科 申请人:诺维信阿德宁生物技术公司
技术领域：
本发明涉及用防卫素多肽在吞噬性细胞中处理胞内细菌感染。背景金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是多种在社区和医院遭受的感染的主要病原体，所述感染的范围从轻微感染如皮炎或伤口感染至严重的涉及败血病的疾病，包括关节炎、心内膜炎、肺炎和脑膜炎。对葡萄球菌疾病的治疗常常是困难的，因为甚至在用抗微生物剂长期治疗之后， 感染也常常持续或复发。葡萄球菌感染的持续可涉及细菌发病机制的几个方面。由几位作者报道的重要特征是细菌侵入吞噬细胞并在细胞内存活的能力。细菌的胞内累积使得抗微生物剂的使用复杂化，因为胞内活性取决于几个因素如药物穿透并在细胞中累积的能力，以及药物代谢和胞内分布。许多抗生素药剂无法进入吞噬细胞，此外，研究显示对于能够穿透细胞的药物，抗微生物活性和细菌对疗法的应答性常常受到削弱(impaired)。几位作者已描述了抗生素针对胞内金黄色葡萄球菌的体外活性，但许多报道得到争议性结果。Seral等显示胞内浓度和累积对于活性仅为部分预见性的，且仍不清楚哪个参数决定抗生素的胞内活性。Gresham等显示感染金黄色葡萄球菌的多形核嗜中性白细胞(PMN)含有足够量的生活的胞内细菌使得通过将这些细胞腹膜内注射于健康小鼠导致感染。而且，他们阐明了将PMN的迁移限制于感染位点导致增强的宿主防御。这些数据可表明细菌的胞内存活是金黄色葡萄球菌感染发病机制的重要因素之一。许多药物，包括常用的糖肽类如万古霉素，针对金黄色葡萄球菌的胞内作用不佳。 此外，甲氧西林抗性(MRSA)金黄色葡萄球菌发生率的增加和多抗药性株的出现进一步使得这些感染的治疗复杂化。因此，对针对这些类型的感染的新型化合物的需要正在增加。菌丝霉素(Plectasin)是来源于腐生子囊菌淡黑假黑盘菌(Pseudoplectania nigrella)的防卫素。该抗微生物肽在体外和体内均针对多种革兰氏阳性细菌包括金黄色葡萄球菌的菌株显示有力的抗微生物作用。此外，其与常用的抗葡萄球菌化合物相比具有新型的对细菌作用模式。然而，这个或任何其他新型抗微生物肽据我们所知从未在胞内感染模型中得到过测试。假如新药如菌丝霉素，具有进入细胞并杀灭胞内细菌的能力，这对于未来对葡萄球菌感染的治疗而言会是有利之处。存在多种使用人或动物细胞系的体外模型以供研究胞内抗微生物活性。然而，仅有极少的研究在动物中进行。
本发明涉及通过施用防卫素针对存在于人或动物吞噬性细胞(phagocyticcell) (吞噬细胞(phagocyte))如巨噬细胞之内的葡萄球菌的抗细菌作用。
发明内容
我们现已发现某些防卫素多肽可用于处理吞噬性细胞(吞噬细胞)如巨噬细胞中的胞内细菌感染。相应地，在第一个方面，本发明提供具有抗细菌活性的多肽在制备用于在吞噬性细胞如巨噬细胞中治疗性处理胞内细菌感染的药物中的用途，所述多肽包括与SEQ ID NO 1的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述细菌感染是葡萄球菌感染。在第二个方面，本发明提供了用于在吞噬性细胞如巨噬细胞中处理胞内细菌感染的方法，包括向需要此种处理的人或动物以用于在吞噬性细胞中处理所述胞内细菌感染的有效量施用抗细菌多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO :1的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述处理包括至少17mg/kg的所述多肽的第一剂量。用于本发明用途或用于在吞噬性细胞如巨噬细胞中根据本发明处理胞内细菌感染的多肽在下文中命名为“(根据)本发明的多肽”。发明详述定义抗细菌活性术语“抗细菌活性”于本文定义为一种能够杀死细菌细胞或抑制细菌细胞生长的活性。在本发明的上下文中，术语“抗细菌的”旨在意指有杀细菌的和/或抑制细菌的作用，其中术语“杀细菌的”应被理解为能够杀死细菌细胞，而其中术语“抑制细菌的”应被理解为能够抑制细菌的生长。当细菌细胞的生长受到抑制时，细胞处于非生长状态，即其无法繁殖。在优选的实施方案中，术语“抗细菌活性”定义为针对链球菌(Streptococci)(优选月市炎链球菌(Streptococcus pneumoniae))或葡萄球菌(Staphylococci)(优选金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus)的杀细菌和/或抑制细菌活性。就本发明而言，抗细菌活性可根据由Lehrer等，Journal of Immunological Methods, Vol. 137 (2)pp. 167-174(1991)所述的方法测定。或者，抗细菌活性可根据来自 CLSI (临床和实验室标准学会(Clinical and Laboratory Standards Institute)；之前称为国家临床与实验室标准委员会(National Committee of Clinical and Laboratory Standards))的 NCCLS 指南确定。将具有抗细菌活性的化合物以浓度为500 μ g/mL ；优选浓度为250 μ g/mL ；更优选浓度为100 μ g/mL ；甚至更优选浓度为50 μ g/mL ；最优选浓度为25 μ g/mL ；且特别是浓度为10 μ g/mL的所述具有抗微生物活性的多肽在相关微生物生长底物中于37°C温育M小时后(优选16小时后，更优选8小时后，最优选4小时后，且特别是2小时后)可具有将肺炎链球菌(ATCC 49619)的活细胞数减少至1/100的能力。具有抗细菌活性的化合物当以500 μ g/mL的浓度加入；优选当以250 μ g/mL的浓度加入；更优选当以100 μ g/mL的浓度加入；甚至更优选当以50 μ g/mL的浓度加入；最优选当以10μ g/mL的浓度加入；以及特别是当以5μ g/mL的浓度加入时，在相关微生物生长底物中于37°C也可具有将肺炎链球菌(ATCC 49619)的长出(outgrowth)抑制8小时的能力。本发明的多肽具有至少20 %，优选至少40 %，更优选至少50 %，更优选至少60 %， 更优选至少70 %，更优选至少80 %，甚至更优选至少90 %，最优选至少95 %，且甚至最优选至少100%的由SEQ ID NO 1的氨基酸序列组成的多肽的抗微生物活性。防卫素(Defensin)术语“防卫素”用于本文意指本领域的技术人员识别为属于防卫素类抗微生物肽的多肽。为确定某多肽是否为根据本发明的防卫素，优选将其氨基酸序列通过使用可免费获得的HMMER软件包与PFAM数据库的隐蔽马尔科夫模型序型(hidden markov model profile) (HMM 序型(HMM profile))比较(参见实施例 5)。PFAM防卫素家族包括防卫素1或“哺乳动物防卫素”(登录号PF00323)、防卫素2 或“节肢动物防卫素”(登录号PF01097)、防卫素β或“β防卫素”(登录号PF00711)、防卫素_prop印或“防卫素前肽”(登录号PF00879)与γ-硫素(gamma-thionin)或“ γ -硫素家族”(登录号PF00304)。防卫素可属于α -防卫素类、β -防卫素类、θ -防卫素类、昆虫或节肢动物防卫素类、或植物防卫素类。来自这些类中每一类的防卫素享有共同的结构特征，如半胱氨酸样式。但重要的是注意类的归属并不表明防卫素的来源。举例而言，来自真菌的防卫素可属于昆虫防卫素类。如SEQ ID NO 1所示的防卫素是来源于菌丝霉素的合成防卫素(参见WO 03/044049)，其属于昆虫防卫素类。菌丝霉素显示为SEQ ID NO :2。在一个实施方案中，根据本发明的防卫素的氨基酸序列包含4、5、6、7或8个半胱氨酸残基，优选4、5或6个半胱氨酸残基，更优选4或6个半胱氨酸残基，且最优选6个半胱氨酸残基。防卫素也可为享有任何防卫素类的特性特征的合成防卫素。这样的防卫素的实例包括(但不限于)α-防卫素ΗΝΡ-1(人嗜中性粒细胞肽)、ΗΝΡ-2 和 ΗΝΡ-3 ； β -防卫素-12、Drosomycin, Heliomicin, γ 1-嘌呤硫素 (Y Ι-purothionin)、昆虫防卫素 Α，和 PCT 申请 WO 99/53053,WO 02/06324,WO 02/085934、 WO 03/044049, WO 2006/131504、WO 2006/050737 和 W02006/053565 中所公开的防卫素。分离的多肽术语“分离的变体”或“分离的多肽”用于本文指自来源分离的变体或多肽。在一方面，该变体或多肽为至少纯的，优选至少5%纯的，更优选至少10%纯的， 更优选至少20%纯的，更优选至少40%纯的，更优选至少60%纯的，甚至更优选至少80% 纯的，且最优选至少90 %纯的，如通过SDS-PAGE所测定的。基本上纯的多肽术语“基本上纯的多肽”于本文代表一种多肽制备物，其含有以重量计至多10 %，优选至多8 %，更优选至多6 %，更优选至多5 %，更优选至多4 %，更优选至多3%，甚至更优选至多2%，最优选至多1%，且甚至最优选至多0. 5%的与其天然或重组结合的其它多肽物质。因此，优选所述基本上纯的多肽按该制备物中存在的总多肽物质的重量计为至少92%纯的，优选至少94%纯的，更优选至少95%纯的，更优选至少96% 纯的，更优选至少96 %纯的，更优选至少97 %纯的，更优选至少98 %纯的，甚至更优选至少 99%纯的，最优选至少99. 5%纯的，且甚至最优选100%纯的。本发明的多肽优选处于基本上纯的形式。这可以通过以公知的重组方法或以经典的纯化方法制备该多肽来完成。同一性两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性通过参数“同一性” 描述。就本发明而言，两个氨基酸序列之间的同一性程度使用如于EMBOSS包(EMBOSS 欧洲分子生物开放软件组(The European Molecular Biology Open Software Suite)， Rice 等，2000，Trends in Genetics 16 :276-277 ;http://emboss, org)的 Needle 程序，优选3. 0. 0或更新的版本中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970， J. Mol. Biol. 48 =443-453)来确定。所使用的任选参数为缺口产生罚分(gap open penalty) 为10，缺口延伸罚分为0. 5，和EBL0SUM62(BL0SUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。使用标记为“最长同一性”的Needle的输出(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性并如下计算(相同的残基X100)/(比对的长度-比对中缺口的总数)就本发明而言，两个脱氧核糖核苷酸序列之间的同一性程度使用如于EMBOSS 包(EMBOSS 欧洲分子生物开放软件组，Rice等，2000，如上；http //emboss, org)的 Needle程序，优选3. 0. 0或更晚版本中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和 mmsch，1970，如上)测定。所使用的任选参数为缺口产生罚分10，缺口延伸罚分0.5，和 EDNAFULL(NCBI NUC4. 4的EMBOSS版本)取代矩阵。使用标记为“最长同一性”的Needle 的输出(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性并如下计算(相同的脱氧核糖核苷酸X100)/(比对的长度-比对中缺口的总数)。等位变体术语“等位变体(allelic variant) ”在本文中表示占据相同染色体基因座的基因的任何两种或更多种可选形式。等位变异通过突变天然地发生，并且可导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。修饰术语“修饰”在本文的意思是，对由SEQ ID NO 1的氨基酸序列组成的多肽的任何化学修饰，以及对编码所述多肽的DNA的遗传操作。所述修饰可以是一处或多处一个或多个(数个)氨基酸的取代、缺失和/或插入，以及一处或多处一个或多个(数个)氨基酸侧链的置换；或在氨基酸序列中使用具有相似特征的非天然氨基酸。特别地，所述修饰可为酰胺化，例如C-端的酰胺化。具有抗细菌活性的多肽在第一方面，本发明涉及具有与SEQ ID NO :1 ( S卩，成熟多肽)有至少80%，优选至少85%，更优选至少90%，最优选至少95%，且特别地至少97%同一性程度的氨基酸序列的分离的多肽，其具有抗细菌活性(以下称“同源多肽”)。在一个优选的方面，所述同源多肽具有与SEQ ID NO :1的氨基酸序列相差至多六个氨基酸，优选至多五个氨基酸，更优选至多四个氨基酸，甚至更优选至多三个氨基酸，最优选至多两个氨基酸，且特别是一个氨基酸的氨基酸序列。本发明的多肽优选包含SEQ ID NO=I的氨基酸序列或其等位变体。在一个优选的方面，多肽包含SEQ ID NO :1的氨基酸序列。在另一个优选的方面，多肽由SEQ ID N0:1的氨基酸序列或其等位变体组成。在另一个优选的方面，多肽由SEQ ID NO :1的氨基酸序列组成。
优选地，氨基酸改变对性质是较不重要的(of a minor nature)，即不显著影响多肽的折叠和/或活性的保守的氨基酸取代或插入；单缺失；小的氨基-或羧基-末端延伸；多至大约20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或其它功能来促进纯化的小延伸，如多组氨酸标签(poly histidine tag)、抗原表位(antigenic印itope)或结合域 (binding domain)。保守取代的实例是在以下组之内碱性氨基酸组(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、 酸性氨基酸组(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸组(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸组(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸组(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不改变比活性(specific activity)的氨基酸取代是本领域已知的，并且由例如H. Neurath和R. L. Hill，1979，于The Proteins, Academic Press, New York 中描述。最普遍发生的交换是 Ala/^er、Val/Ile、 Asp/Glu、Thr/Ser,Ala/Gly,Ala/Thr,Ser/Asn,Ala/Val、Ser/Gly,Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/ Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu 禾口 Asp/Gly。除了 20个基本氨基酸，非基本氨基酸(如4-羟脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、2_氨基异丁酸、异缬氨酸和α-甲基丝氨酸)可以取代野生型多肽的氨基酸残基。有限数量的非保守氨基酸、不由遗传密码编码的氨基酸和非天然氨基酸可以取代氨基酸残基。“非天然氨基酸”在蛋白质合成后已经过修饰，和/或在它们的侧链具有不同于基本氨基酸的化学结构。非天然氨基酸能够以化学方法合成，并且优选是商业上能够获得的，且包括六氢吡啶羧酸(pipecolic acid)、噻唑烧羧酸(thiazolidine carboxylic acid)、脱氢脯氨酸、3-和 4-甲基脯氨酸，和3，3-二甲基脯氨酸。能够根据本领域已知的方法，例如定位诱变或丙氨酸分区诱变法(Cunningham和 Wells, 1989, Science 244 :1081-1085)来鉴定亲本多肽中的必需氨基酸。在后一技术中， 将单一丙氨酸突变引入到分子中的每个残基，并且测试所得突变分子的生物活性(即，抗细菌活性)以鉴定对于所述分子的活性关键的氨基酸残基。同样参见Hilton等，1996， J. Biol. Chem. 271 :4699_4708。生物相互作用也能够通过对结构的物理分析而测定，如通过以下这些技术如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记，连同推定的接触位点氨基酸的突变来测定。参见例如de Vos等，1992，Science 255 :306-312 ;Smith等，1992， J. Mol. Biol. 224 :899-904 ；Wlodaver 等，1992，FEBSLett. 309 :59_64。必需氨基酸的身份 (identity)也能够根据分析与多肽的同一性来推断，所述多肽与根据本发明的多肽相关。能够使用已知的诱变、重组和/或改组(shuffling)方法，然后是有关的筛选方法，例如那些由 Reidhaar-Olson 禾Π Sauer, 1988，Science 241 :53-57 ；Bowie 禾Π Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 :2152-2156 ；WO 95/17413;或 WO 95/22625 公开的那些方法来进行并测试单个或多个氨基酸取代。能够使用的其它方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，Lowman 等，1991，Biochem. 30 :10832-10837 ；美国专利 No. 5，223，409 ；WO 92/06204)和区域定向的诱变(Derbyshire 等，1986，Gene 46 :145 ；Ner 等，1988，DNA 7 127)。诱变/改组方法能够与高通量、自动化的筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性。能够从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并且使用本领域内标准方法快速测序。这些方法允许快速测定感兴趣的多肽中单个氨基酸残基的重要性，并且能够应用于未知结构的多肽。在一个优选实施方案中，本发明的多肽是防卫素多肽，优选昆虫或节肢动物防卫素多肽。N-端延伸本发明的多肽的N-端延伸可适当地由1至50个氨基酸，优选2-20个氨基酸，尤其是3-15个氨基酸组成。在一个实施方案中，N-端肽延伸不包含Arg(R)。在另一个实施方案中，N-端延伸包含kex2或kex2_样切割位点，如在下文进一步定义的。在一个优选的实施方案中，N-端延伸为肽，其包含至少两个Glu (E)和/或Asp (D)氨基酸残基，如包含以下序列之一的N-端延伸EAE、EE、DE和DD。Kex2 位点Kex2位点(参见，例如，Methods in Enzymology Vol 185，D. Goeddel编，Academic Press Inc. (1990), San Diego, CA, "Gene Expression Technology，，)禾口 kex2_ 样位点为在一些蛋白质的前肽编码区和成熟区之间存在的二元的(dibasic)识别位点(即，切割位
点)ο插入kex2位点或kex2_样位点已在某些情况中显示改进了于前肽切割位点处的正确内肽酶加工，导致蛋白质分泌水平增加。在本发明的上下文中，插入kex2或kex2_样位点导致在N-端延伸中某个位置处获得切割的可能性，造成抗细菌多肽与SEQ ID NO :1中所示的成熟多肽相比得到延长。融合的多肽本发明的多肽也包括融合的多肽或可切割的融合多肽，其中另一多肽融合于本发明的多肽或其片段的N-端或C-端。通过将编码另一多肽的核苷酸序列(或其部分)融合于本发明的核苷酸序列(或其部分)来产生融合的多肽。产生融合多肽的技术是本领域已知的，并包括连接编码所述多肽的编码序列以使它们在阅读框中，并且使融合的多肽的表达在相同启动子和终止子的控制下。方法和用途本发明涉及本发明多肽在吞噬性细胞优选巨噬细胞中处理胞内细菌感染的用途。 相应地，本发明多肽可用于制备兽用或人用治疗剂或预防剂以供在吞噬性细胞优选巨噬细胞中处理胞内细菌感染。胞内细菌感染意指造成感染的细菌存在(reside)于人或动物细胞内。在一个优选实施方案中，所述胞内细菌感染是胞内革兰氏阳性细菌感染；更优选地，所述胞内细菌感染是胞内葡萄球菌Staphylococcus)感染；更优选地，所述胞内细菌感染是胞内金黄色葡萄球菌感染。本发明的多肽可用于治疗慢性肉芽肿病(CGD)，其为其中免疫系统的细胞(吞噬性细胞)难以形成用于杀灭摄取的病原体如金黄色葡萄球菌的活性氧化合物(最重要地， 超氧自由基)的疾病。这导致在许多器官中形成肉芽肿。罹患CGD的患者由于其免疫系统对抗造成疾病的生物(其部分存在于胞内)的能力下降而屡次遭受感染发作。因为本发明多肽能够在胞内呈现针对由吞噬性细胞摄取的病原体的抗细菌活性，其可用于制备用于治疗慢性肉芽肿病的药物。本发明的多肽可以以足以杀灭存在于人或动物细胞内的葡萄球菌属菌种如金黄色葡萄球菌或抑制其生长的量使用。将本发明多肽的配制物施用于正遭受吞噬性细胞优选巨噬细胞中的胞内细菌感染或对其易感的宿主。在一个实施方案中，所述胞内细菌感染是由葡萄球菌属菌种如金黄色葡萄球菌的感染造成的。施用可为局部化的或全身性的。一般而言，本发明的抗细菌多肽的剂量足以减少微生物种群至少llog，且可杀灭2或更多个log。将本发明的多肽以减少微生物种群同时最小化任何副作用的剂量施用。考虑的是所述组合物可在医师的指导下获得并用于体内用途。可采用多种施用方法。所述多肽配制物可口服给予，或可血管内、肌肉内、皮下、腹膜注射、通过气溶胶、眼部(opthalmically)、膀胱内、局部等方式。治疗性配制物的剂量变化会很大，取决于待施用的具体抗细菌多肽、施用的频率、施用的方式、药剂自宿主的清除等。初始剂量可较大，然后为较小的维持剂量。优选初始剂量至少为17mg/kg。在许多情况中，口服施用会需要比静脉内施用更高的剂量。可对酰胺键以及氨基与羧基端进行修饰以在口服施用时具有较好的稳定性。例如，羧基端可以是酰胺化的。配制物本发明的多肽可掺入多种配制物中用于治疗性施用。更具体地，本发明的多肽可通过与适合的、药学上可接受的载体或稀释剂组合而配制成药物组合物，且可配制成固体、半固体、液体或气体形式的制备物，如片剂、胶囊、粉末、颗粒、软膏(ointment)、乳霜 (cream)、泡沫、溶液、栓剂、注射剂、吸入剂、凝胶、微球、洗剂(lotion)和气雾剂。如此，所述多肽的施用可以多种方式实现，其包括经口施用、含服施用、直肠施用、肠胃外施用、腹膜内施用、皮内施用、透皮施用、气管内施用等。本发明的抗细菌多肽可在施用后为全身性的或可为局部化的。本发明的多肽可单独施用、彼此组合施用或其可与其他已知化合物(例如，穿孔素(perforin)、抗炎剂、抗生素等)组合使用。在药物剂型中，所述多肽可以其药学上可接受的盐的形式施用。以下方法和赋形剂仅为示例性的而非以任何方式进行限制。对于口服制备物，所述多肽可单独使用或与适合的添加剂组合以制造片剂、粉末、 颗粒或胶囊，例如，与常规的添加剂，如乳糖、甘露醇、玉米淀粉或马铃薯淀粉组合；与粘合剂(binder)，如结晶纤维素、纤维素衍生物、阿拉伯树胶(acacia)、玉米淀粉或明胶组合； 与崩解剂，如玉米淀粉、马铃薯淀粉或羧甲基纤维素钠组合；与润滑剂，如滑石或硬脂酸镁组合；以及如果需要，与稀释剂、缓冲剂、湿润剂、防腐剂和调味剂结合。所述多肽可通过将其溶解、悬浮或乳化于水性或非水性溶剂例如植物油或其它类似的油、合成的脂肪酸甘油酯、高级脂肪酸的酯或丙二醇中，以及如果需要，与常规的添加剂例如增溶剂、等张剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂一起，而配制成用于注射的制备物。所述多肽可用于气溶胶配制物中以经由吸入施用。本发明的多肽可配制于加压的可接受推进剂如二氯二氟甲烷、丙烷、氮等中。此外，所述多肽可通过与多种基底(base)(例如乳化基底或水溶性基底)混合而制成栓剂。本发明的多肽可经由栓剂而直肠施用。栓剂可包括媒介物，例如可可脂、碳蜡 (carbowax)和聚乙二醇，其在体温融化，但在室温固化。
可提供用于口服或直肠施用的单位剂型，如糖浆、酏剂和悬浮剂，其中每个剂量单位(例如茶匙量、汤匙量、片剂或栓剂)包含预定量的组合物，所述组合物含有一种或多种本发明的多肽。类似地，用于注射或静脉内施用的单位剂型可包含在组合物中的本发明多肽，而所述组合物为无菌水、生理盐水或另一药学上可接受的载体中的溶液。用于持续释放配制物的移植物是本领域中公知的。移植物以生物可降解的或非生物可降解的聚合物配制成微球、厚片(slab)等。例如，乳酸和/或乙醇酸的聚合物形成可侵蚀性聚合物，其被宿主良好地耐受。包含本发明的抗细菌多肽的移植物置于接近感染的位点，使得活性剂的局部浓度相对于身体的其余部分增加。术语“单位剂型”用于本文意指物理上离散的单位，其适合作为用于人和动物受试者的单元剂量，每个单元包含预定量的本发明多肽，该量经计算为足够产生期望效果的量，所述多肽与药学上可接受的稀释剂、载体或媒介物组合。本发明的单位剂型的规格取决于所采用的具体多肽和待实现的效果、以及在宿主中与所述多肽相关的药效动力学 (pharmacodynamics)0药学上可接受的赋形剂，如媒介物、佐剂、载体或稀释剂，是公众容易获得的。此外，药学上可接受的辅助物质，如PH调整和缓冲剂、张度调节剂(tonicity adjusting agent)、稳定剂、润湿剂等，是公众容易获得的。用于全身性施用的典型剂量的范围为0. Ipg至100毫克每公斤受试者重量每次施用。典型剂量可为每天服用二到六次每次一片，或每天服用一次每次一颗延时-释放的 (time-release)胶囊或片剂，且包含成比例更高含量的活性成分。延时-释放效果可通过在不同PH值溶解的胶囊材料、通过由于渗透压缓慢释放的胶囊、或通过任何其它已知的控制释放方法而获得。本领域的技术人员容易理解的是剂量水平可作为具体多肽、症状的严重性和受试者对副作用的敏感性的函数而变化。一些特定多肽比其他更为有效。给定多肽的优选剂量可由本领域的技术人员通过多种手段容易地确定。一个优选的手段为测量给定多肽的生理潜力(physiological potency)。使用脂质体作为递送媒介物是一种受关注的方法。脂质体与目标位点的细胞融合并将内腔的内容物在细胞内递送。维持脂质体与细胞接触一段足够融合的时间，其使用多种方法以维持接触，如分离、结合剂等。在本发明的一个方面，脂质体经设计以气溶胶化用于肺部施用。脂质体可用介导膜融合的纯化蛋白质或肽(如，仙台病毒或流感病毒等)制备。脂质可为已知的脂质体形成性脂质的任何有用组合，包括阳离子脂质或两性离子脂质， 如磷脂酰胆碱。剩下的脂质通常会为中性或酸性脂质，如胆固醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油等。为了制备脂质体，可使用Kato等(1991) J. Biol. Chem. 266 :3361所描述的方法。 简言之，将脂质和包含肽的内腔组合物在适合的水性介质(方便地为盐水介质)中组合，其中总固体在大约1-10重量百分比的范围内。在短时间(大约5-60秒)激烈地搅动后，将管子置于温水浴(大约25-40°C )并重复此循环大约5-10次。然后对所述组合物进行声处理一段方便的时间(一般大约1-10秒)并可进一步通过漩涡震荡而搅动。然后通过加入水性介质扩增体积，一般使体积增加大约1-2倍，然后摇动并冷却。此方法允许将高分子量分子并入内腔中。
具有其它活性剂的配制物为了用于提述方法，本发明的抗细菌多肽可与其它药学活性剂(特别是其它抗微生物剂)一起配制。所关注的其它药剂包括广大范围的抗生素，如于技术领域中已知的。抗生素的类型包括青霉素类，例如青霉素G、青霉素V、甲氧西林(methicillin)、 苯唑西林(oxacillin)、羧节西林(carbenicillin)、萘夫西林(nafcillin)、氨节西林等；青霉素类与β-内酰胺酶抑制剂，头胞菌素类的组合，例如头孢克洛(cefaclor)、头孢唑林(cefazolin)、头孢呋辛(cefuroxime)、拉氧头孢(moxalactam)等；碳青霉烯类 (carbapenems)；单环内酰胺类(moncAactams)；氨基糖苷类；四环素类；大环内酯类；林可霉素类；多粘菌素类；磺胺类；喹诺酮类(quinolones)；氯霉素(cloramphenical)；甲硝唑 (metronidazole)；大观霉素；甲氧节唆(trimethoprim)；万古霉素等。抗霉菌剂(包括多烯类，例如两性霉素B (amphotericin B)、制霉菌素； 5-flucosyn ；和唑类，例如咪康唑(miconazol)、酮康唑(ketoconazol)、伊曲康唑(itraconazol)和氟康唑(fluconazol))也是有用的。抗结核药物包括异烟胼 (isoniazid)、乙胺丁醇(ethambutol)、链霉素和利福平(rifampin)。细胞因子(例如干扰素Y、肿瘤坏死因子α、白介素12等)也可包含于本发明的抗细菌多肽的配制物中。体外合成本发明的多肽可通过体外合成使用如本技术领域中已知的常规方法制备。多种商业合成设备是可获得的，例如Applied Biosystems Inc.，Beckman的自动化合成仪等。通过使用合成仪，可以用非天然氨基酸(特别是D-异构体(或D-型)，例如D-丙氨酸与D-异亮氨酸、非对映异构体、具有不同长度或官能团的侧链等)取代天然存在的氨基酸。制备的特定顺序和方式可通过方便性、经济性、所需纯度等确定。可将化学连接提供给多种肽或蛋白质，其包括方便的用于键合的官能团，如用于酰胺或取代的胺形成(例如还原性胺化)的氨基、用于硫醚或二硫键形成的硫醇基、用于酰胺形成的羧基等。如果需要，可在合成过程中或在表达过程中将多个基团(其允许连接至其它分子或表面)导入至肽中。因此，可使用半胱氨酸以制造硫醚、使用组氨酸以连接至金属离子复合物、使用羧基以形成酰胺或酯、使用氨基以形成酰胺等。所述多肽也可根据常规的重组合成方法分离和纯化。可制备表达宿主的裂解物， 而该裂解物使用HPLC、排阻层析、凝胶电泳、亲和层析、或其它纯化技术纯化。一般来说，所使用的组合物会包含按重量计至少20%的期望产物，更通常按重量计至少大约75%，优选按重量计至少大约95 %，以及为了治疗目的，通常按重量计至少大约99. 5 %，其系相对于与产物的制备及其纯化方法有关的污染物而言。通常，百分比会基于总蛋白质。通过以下实施例进一步描述本发明，且所述实施例不应被理解为限制本发明的范围。
实施例在下述实施例中，SEQ ID NO 1所示的防卫素多肽在下文中称作“防卫素2114”， 而SEQ ID NO :2所示的防卫素多肽在下文中称作“菌丝霉素”。实施例1
对干菌丝霍素和防下.素2114在THP-I巨卩策细胞,中胞内作用的体夕卜研究本实施例呈现在受感染的THP-I巨噬细胞中对菌丝霉素和防卫素2114的胞内抗细菌活性的体外研究。细菌菌株的制备对于菌丝霉素研究，使用了两种金黄色葡萄球菌菌株ATCC25923(MSSA)和 E33235(MSSA，axil，来自 Statens Serum Institute，Denmark 的临床分离株)。对于防卫素2114研究，使用了两种金黄色葡萄球菌菌株ATCC25923 (MSSA)、 MRSA(临床败血病分离株，Statens Serum Institute,引用号1-15479)和 VRSA2(Pennsylvania HIP 11983)。将细菌的过夜培养物用人血清(AB阳性，Lonza, USA)调理45分钟。之后将所述细菌使用分光光度计(CECIL 2040)滴定，并对THP-I巨噬细胞计数，然后用4个细菌/细胞进行感染。将THP-I细胞在补充有胎牛血清的RPMI1640培养基中培养。将细菌与细胞在37°C，0)25%培养1小时以允许吞噬作用。洗涤在1小时温育之后，将感染的细胞与庆大霉素(50μ g/mL)温育45分钟以消灭剩余的未经吞噬的细菌。为了在温育之后去除庆大霉素，将细胞用PBS洗涤3x。在第三次洗涤之后，将细胞重悬于RPMI 1640培养基(+10%胎牛血清)中，并将菌丝霉素或防卫素2114 以所需浓度添加(O-USxMIC)。将一个样品与庆大霉素以IxMIC温育以控制胞内生长。在防卫素2114研究中，将活性与万古霉素和达托霉素的活性相比较。将细胞在6孔板中在37°C，0)25%温育M小时。在温育之后，将细胞在PBS中洗涤，并随后在无菌水中重悬以释放胞内细菌。CFU量的确定将样品根据预计的CFU量稀释并涂布于TSA板上，并在35°C温育过夜。在M小时温育之后，对CFU进行计数。细胞蛋白测定可将样品在-20°C储藏长达一周。对样品进行声处理并如Lowry等所述滴定蛋白质，由此获得作为CFU/mg蛋白的结果。对所有样品进行三次重复测试。数据分析体外胞内剂量-应答研究对于剂量-效果关系的分析，采用Hill等式(斜率=1)计算最大相对效力(maximal relative efficacy)，^liax，静止浓度(static concentration, Cstatic)和拟合优度。这些参数使用非线性回归确定。Efflax定义为CFU计数在吞噬后接种物和M小时处理之间的log变化，而Cstatic为导致无明显细菌生长(CFU与起始接种物相同)的浓度(以MIC的倍数计)。结果24小时之后菌丝霉素针对金黄色葡萄球菌ATCC25923和E33235 表1.最大作用，^iax (以及置信区间，Cl)和静止剂量(static dose)，Cstati。，来自
菌丝霉素的体外胞内研究
权利要求
1.具有抗细菌活性的多肽在制备用于治疗性处理吞噬性细胞中胞内细菌感染的药物中的用途，所述多肽包含与SEQ ID NO :1的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列。
2.根据权利要求1的用途，其中所述吞噬性细胞是巨噬细胞。
3.根据权利要求1-2任一项的用途，其中所述细菌感染是金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)感染。
4.根据权利要求1-3任一项的用途，其中所述处理包括至少17mg/kg的所述多肽的第一剂量。
5.具有抗细菌活性的多肽用于处理吞噬性细胞中的胞内细菌感染，所述多肽包含与 SEQ ID NO :1的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列。
6.根据权利要求5使用的多肽，其中所述吞噬性细胞是巨噬细胞。
7.根据权利要求5-6任一项使用的多肽，其中所述细菌感染是金黄色葡萄球菌感染。
8.根据权利要求5-7任一项使用的多肽，其中所述处理包括至少17mg/kg的所述多肽的第一剂量。
9.具有抗细菌活性的多肽在制备用于治疗性处理慢性肉芽肿病的药物中的用途，所述多肽包含与SEQ ID NO 1的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列。
10.具有抗细菌活性的多肽用于处理慢性肉芽肿病，所述多肽包含与SEQID N0:1的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列。
11.处理吞噬性细胞中胞内细菌感染的方法，包括向需要此种处理的人或动物以用于处理吞噬性细胞中所述胞内细菌感染的有效量施用抗细菌多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO 1的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。
12.权利要求11的方法，其中所述吞噬性细胞是巨噬细胞。
13.权利要求11-12任一项的方法，其中所述细菌感染是金黄色葡萄球菌感染。
14.权利要求11-13任一项的方法，其中所述处理包括至少17mg/kg的所述多肽的第一剂量。
15.处理慢性肉芽肿病的方法，包括向需要此种处理的人或动物以用于处理慢性肉芽肿病的有效量施用抗细菌多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO :1的氨基酸序列具有至少90% 同一性的氨基酸序列。
全文摘要
本发明涉及用防卫素多肽治疗胞内细菌感染的方法。
文档编号A61P31/04GK102264383SQ200980152304
公开日2011年11月30日 申请日期2009年10月23日 优先权日2008年10月24日
发明者卡罗林.S.布林科 申请人:诺维信阿德宁生物技术公司
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