降压肽的血管紧张素转化酶抑制活性的检测方法

专利名称：降压肽的血管紧张素转化酶抑制活性的检测方法
技术领域：
本发明涉及一种降压肽的血管紧张素转化酶(ACE)抑制活性的检测方法，属于生物技术领域。
背景技术：
高血压严重威胁着人类的健康，我国高血压患者达I. 8亿人，每年因高血压死亡的人数超过100万人。人体的升压系统体肾素-血管紧张素系统和降压系统激肽释放酶-激肽系统在血压调节及心血管功能方面扮演着重要角色。ACE (血管紧张素转化酶)通过对上述两个系统的调控达到升高血压的作用。降压肽通过抑制ACE的活性，起到降压作用。
降压肽具有高安全性、无副作用、效果明显等特点成为降压药物、保健品的研究重点，具有巨大的市场前景。因此，高效、灵敏、可靠的ACE抑制活性检测方法的建立是非常必要的。Cushman等建立了紫外分光光度法，ACE在37°C，pH8. 3的条件下催化分解血管紧张素I的模拟物马尿酸一组氨酸一亮氨酸(Hip-His-Leu，HHL)产生血管紧张素II的模拟物马尿酸(Hip)，该物质在紫外228nm处具有特征吸收峰，当加入ACE抑制肽时，ACE对HHL的催化分解作用受到抑制，Hip的生成量减少。通过测定加入抑制肽前后所生成Hip紫外吸收峰的差别确定抑制活性。在该方法中，反应所生成的Hip和HHL不能有效分离，而且均在 228nm处有吸收，易产生实验误差。在此基础上，许多学者建立高效液相色谱法，利用高效液相色谱分离Hip，通过测定加入抑制肽前后所生成Hip峰面积的差别确定样品的抑制活性。 高效液相色谱法利用Hip色谱峰与杂质峰具有不同的保留时间，定量分析Hip，准确度高于紫外分光光度法。但有些样品在紫外检测中出现弱吸收峰或无吸收峰，高效液相色谱法无法检测这些样品的ACE抑制活性。

发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种简便、快捷、精密度、准确性高的降压肽 ACE抑制活性检测方法，为降压药物、保健品的研发提供技术支持。为解决上述技术问题，本发明的技术解决方案是
一种降压肽的血管紧张素转化酶(ACE)抑制活性的检测方法，包括如下步骤
(1)降压肽的抑制ACE活性实验
将一定量的降压肽溶于PH8. 3,0. lmol/L的硼酸缓冲液中，吸取25 μ L的降压肽，加 Λ 75 μ L60mU · πιΓ1的ACE于37°C保温5min，随后加入112 μ L5. OmmoI/L的马尿酸一组氨酸一亮氨酸；空白对照组则用相同体积的硼酸缓冲液代替降压肽，在37°C，恒温水浴中保温60min,然后加入25 μ L0. 1%三氟乙酸中止反应,在ACE的作用下,马尿酸一组氨酸一亮氨酸生成马尿酸即Hip ；
(2)利用高效液相色谱一质谱联用LC-MS技术检测分析反应产物
LC-MS检测分析反应组和空白对照组的反应产物，液相色谱条件为反相色谱柱，流动相为乙腈超纯水为20 :80，含体积比为O. 1%三氟乙酸，流速I. OmL/min，检测波长228nm，进样量10 μ L ;质谱条件为电喷雾离子源(ESI )，电离电压3. 5KV，一级锥孔电压35V，二级锥孔电压3. 0V,六级杆透镜电压O. IV，源温度120°C，脱溶剂温度350°C，脱溶剂氮气流速 500L/h,锥孔氮气流速50L/h，离子能量O. 5 ;利用反应产物的总离子流色谱图和紫外检测色谱图检测反应产物，确保Hip纯度；定量分析SIM模型下 Λ180的提取离子图的Hip峰面积，计算Hip的峰面积；
(3)降压活性的计算
通过上述方法得到反应组和空白对照组反应产物Hip的峰面积，降压肽的ACE抑制活性IP为(Ac-As) X 100/AC，其中IP为样品对ACE的抑制率；AC为空白对照组中Hip的峰面积；AS为反应组中Hip的峰面积。所述步骤(2)所用反相色谱柱为Ugl20_C18分析柱。所述步骤(2)所用电喷雾离子源(ESI)为电喷雾电离正离子模式。所述步骤(2)所述反应组反应产物重复测三次，峰面积的相对偏差(RSD)为
O.1-0. 4%。所述步骤(3)所述的空白对照组以不加降压肽时ACE与HHL反应生成Hip在LC-MS 中的峰面积来表示；反应组以加降压肽时ACE与HHL反应生成Hip在LC-MS中的峰面积来表不。采用上述方案后，本发明利用LC-MS检测反应产物，通过检测SM模型下》Λ180 的提取离子图的马尿酸(Hip)峰面积变化表征降压肽的降压活性。在高效液相色谱紫外检测器和电喷雾离子源(ESI)质谱的监测下，利用总离子流色谱图和紫外检测色谱图，判断 Hip的分离度，确保降压肽检测方法的准确性。本发明将LC-MS技术应用于降压肽的活性筛选，和以往的分光光度法、色谱法相比，具有以下优点
I、本发明利用液质联用技术(LC-MS)检测降压肽的ACE抑制活性，通过检测SM模型下《Λ180的提取离子图的马尿酸(Hip)峰面积的变化表征降压肽的降压活性。利用高效液相紫外色谱协同质谱总离子流色谱图，确定Hip的纯度，避免传统液相色谱法在检测具紫外弱吸收峰或无吸收峰样品的ACE抑制活性时，出现准确率低的现象，提高ACE抑制活性检测方法的准确性。2、本发明利用液质联用技术(LC-MS)检测降压肽的ACE抑制活性，在高效液相分离的同时利用质谱检测反应产物的纯度、峰面积，可以节约一半的检测时间。


图I是实施例一 LC-MS检测空白对照组的色谱图，其中1-1为SM模型下》Λ180 的提取离子图，1-2为总离子流色谱图，1-3为紫外色谱图2是实施例一 LC-MS检测反应组的色谱图，其中2-1为SM模型下 Λ180的提取离子图，2-2为总离子流色谱图，2-3为紫外色谱图3是实施例二 LC-MS检测反应组的色谱图，其中3-1为SM模型下》Λ180的提取离子图，3-2为总离子流色谱图，3-3为紫外色谱图4是实施例三LC-MS检测反应组的色谱图，其中4-1为SM模型下》Λ180的提取离子图，4-2为总离子流色谱图，4-3为紫外色谱图。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详述。实例一
I、将一定量的鱼鳞降压肽溶于PH8. 3,0. lmol/L的硼酸缓冲液中，配置浓度为lmg/ml 的样品溶液，吸取25 μ L的降压肽，加入75 μ L 60mU -πιΓ1的ACE于37°C保温5min，随后加 Λ 112μ L5. Ommo I/L的HHL，空白对照组则用相同体积的硼酸缓冲液代替降压肽的体积，在 37°C恒温水浴中保温60min，然后加入25 μ L0. 1%TFA中止反应。2、LC-MS检测检测分析反应产物，高效液相色谱条件为Ugl20_C18反相色谱柱、 流动相为乙腈超纯水=20:80 (含O. 1%TFA,为体积比)、流速I. OmLmin'检测波长228nm、 进样量10 μ L0质谱条件为电喷雾电离正离子模式，电离电压3. 5KV，一级锥孔电压35V， 二级锥孔电压3. 0V,六级杆透镜电压O. IV，源温度120°C，脱溶剂温度350°C，脱溶剂氮气流速500L/h，锥孔氮气流速50L/h，离子能量O. 5。3、利用反应产物的总离子流色谱图(图1-2、图2-2)和紫外色谱图(图1_3、图2_3) 确定反应产物中Hip不含其它杂质，此时Hip的出峰时间为5. 02min。利用软件计算对SIM 模型下》/^180的提取离子图(图1-1、图2-1)的Hip峰面积进行定量分析。反应组反应产物中Hip的峰面积为15134. 13，空白对照组中Hip的峰面积为118954. 55，鱼鳞降压肽的 ACE的抑制率为87. 28%。反应组中Hip的峰面积重复测定3次，其RSD为O. 4%。该方法精密度高、重复性好。实例二
I、将一定量的花生降压肽溶于PH8. 3,0. lmol/L的硼酸缓冲液中，配置浓度为lmg/ml 的样品溶液，吸取25 μ L的降压肽，加入75 μ L60mU · ml-1的ACE于37°C保温5min,随后加 Λ 112μ L5. Ommo I/L的HHL，空白对照组则用相同体积的硼酸缓冲液代替降压肽的体积，在 37°C恒温水浴中保温60min，然后加入25 μ L0. 1%TFA中止反应。2、LC-MS检测检测分析反应产物，高效液相色谱条件为Ugl20_C18反相色谱柱、 流动相为乙腈超纯水=20:80 (含O. 1%TFA)(体积比)、流速I. OmLmin'检测波长228nm、 进样量10 μ L0质谱条件为电喷雾电离正离子模式，电离电压3. 5KV，一级锥孔电压35V， 二级锥孔电压3. 0V,六级杆透镜电压O. IV，源温度120°C，脱溶剂温度350°C，脱溶剂氮气流速500L/h，锥孔氮气流速50L/h，离子能量O. 5。3、利用反应产物的总离子流色谱图(图1-2、图3-2)和紫外色谱图(图1_3、图3_3) 确定反应产物中Hip不含其它杂质，此时Hip的出峰时间为5. 02min。利用软件计算对SIM 模型下》/^180的提取离子图(图1-1、图3-1)的Hip峰面积进行定量分析。反应组反应产物中Hip的峰面积为15691. 29，空白对照组中Hip的峰面积为118954. 55，故花生降压肽 ACE的抑制率为86. 81 %。反应组反应产物Hip的峰面积重复测定3次，其RSD为O. 1%。该方法精密度高、重复性好。实例三
I、将一定量的甘氨酸一苯丙氨酸(Gly-Phe)溶于pH8. 3,0. lmol/L的硼酸缓冲液中，配置浓度为lmg/ml的样品溶液，吸取25 μ L的降压肽，加入75 μ L60mU · πιΓ1的ACE于37°C 保温5min，随后加入225 μ L5. OmmoI/L的HHL，空白对照组则用相同体积的硼酸缓冲液代替降压肽的体积，在37°C恒温水浴中保温60min，然后加入25 μ L0. 1%TFA中止反应。 2、LC-MS检测检测分析反应产物，高效液相色谱条件为Ugl20_C18反相色谱柱、 流动相为乙腈超纯水=20:80 (含O. 1%TFA)(体积比)、流速I. OmLmin'检测波长228nm、 进样量10 μ L0质谱条件为电喷雾电离正离子模式，电离电压3. 5KV，一级锥孔电压35V， 二级锥孔电压3. 0V,六级杆透镜电压O. IV，源温度120°C，脱溶剂温度350°C，脱溶剂氮气流速500L/h，锥孔氮气流速50L/h，离子能量O. 5，
3、利用反应产物的总离子流色谱图(图1-2、图4-2)和紫外色谱图(图1-3、图4-3)确定反应产物中Hip不含其它杂质，此时Hip的出峰时间为5. 02min。利用软件计算对SIM模型下》/zl80的提取离子图(图1-1、图4-1)的Hip峰面积进行定量分析。反应组反应产物中Hip的峰面积为19668. 16，空白对照组中Hip的峰面积为118954. 55，故Gly-Phe降压肽的ACE的抑制率为83. 47%,反应组Hip的峰面积重复测定3次，其RSD为O. 3%。该方法精密度高、重复性好。
权利要求
1.一种降压肽的血管紧张素转化酶抑制活性的检测方法，血管紧张素转化酶缩写为 ACE，其特征在于包括如下步骤(1)降压肽的抑制ACE活性实验将一定量的降压肽溶于PH8. 3,0. lmol/L的硼酸缓冲液中，吸取25 μ L的降压肽，加 Λ 75 μ L60mU · πιΓ1的ACE于37°C保温5min，随后加入112 μ L5. OmmoI/L的马尿酸一组氨酸一亮氨酸；空白对照组则用相同体积的硼酸缓冲液代替降压肽，在37°C，恒温水浴中保温60min,然后加入25 μ L0. 1%三氟乙酸中止反应,在ACE的作用下,马尿酸一组氨酸一亮氨酸生成马尿酸即Hip ；(2)利用高效液相色谱一质谱联用LC-MS技术检测分析反应产物LC-MS检测分析反应组和空白对照组的反应产物，液相色谱条件为反相色谱柱，流动相为乙腈超纯水为20 :80，含体积比为O. 1%三氟乙酸，流速I. OmL/min，检测波长228nm， 进样量10 μ L ;质谱条件为电喷雾离子源，电离电压3. 5KV，一级锥孔电压35V，二级锥孔电压3. 0V,六级杆透镜电压O. IV，源温度120°C，脱溶剂温度350°C，脱溶剂氮气流速500L/h， 锥孔氮气流速50L/h，离子能量O. 5 ;利用反应产物的总离子流色谱图和紫外检测色谱图检测反应产物，确保Hip纯度；定量分析SIM模型下》/zl80的提取离子图的Hip峰面积,计算 Hip的峰面积；(3)降压活性的计算通过上述方法得到反应组和空白对照组反应产物Hip的峰面积，降压肽的ACE抑制活性IP为(Ae-As) X 100/A。，其中IP为样品对ACE的抑制率;A。为空白对照组中Hip的峰面积；AS为反应组中Hip的峰面积。
2.根据权利要求I所述的降压肽的血管紧张素转化酶抑制活性的检测方法，其特征在于所述步骤(2)所用反相色谱柱为Ugl20-C18分析柱。
3.根据权利要求I所述的降压肽的血管紧张素转化酶抑制活性的检测方法，其特征在于所述步骤(2 )所用电喷雾离子源为电喷雾电离正离子模式。
4.根据权利要求I所述的降压肽的血管紧张素转化酶抑制活性的检测方法，其特征在于所述步骤(2)所述反应组反应产物重复测三次，峰面积的相对偏差为O. 1-0. 4%。
5.根据权利要求I所述的降压肽的血管紧张素转化酶抑制活性的检测方法，其特征在于所述步骤(3)所述的空白对照组以不加降压肽时ACE与HHL反应生成Hip在LC-MS中的峰面积来表示；反应组以加降压肽时ACE与HHL反应生成Hip在LC-MS中的峰面积来表
全文摘要
一种降压肽的血管紧张素转化酶(ACE)抑制活性的检测方法，包括如下步骤(1)配置硼酸缓冲液，进行降压肽的ACE活性抑制实验。(2)利用LC-MS检测分析反应产物，通过检测马尿酸(Hip)峰面积的变化表征降压肽的降压活性。在高效液相色谱紫外检测器和电喷雾离子源质谱的监测下，利用总离子流色谱图和紫外检测色谱图，保证Hip的纯度，定量分析SIM模型下m/z180的提取离子图的Hip峰面积，计算Hip的峰面积。(3)通过上述方法得到反应组和空白对照组反应产物Hip的峰面积，以此可得样品对ACE的抑制率。本发明将LC-MS技术应用于降压肽的活性筛选，可以减少杂质对活性检测的影响，具有精确性高、重复性好、灵敏度高的特点。
文档编号G01N30/02GK102608234SQ20121008990
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月30日 优先权日2012年3月30日
发明者余琳, 刘颖, 孙继鹏, 张怡评, 徐建, 易瑞灶, 朱伟翔, 许诺华, 谢全灵, 郑美华, 陈俊德, 陈思谨, 陈晖 申请人:国家海洋局第三海洋研究所