表观遗传调控的小分子调节剂和其治疗应用的制作方法
专利名称：表观遗传调控的小分子调节剂和其治疗应用的制作方法
技术领域：
本发明大体上涉及分子医学的领域。特别地，本发明涉及用于调节转录因子、特别是将表观遗传调控剂(组蛋白修饰酶)募集至特定的DNA启动子的转录因子的功能的方法和组合物。靶向的转录因子包括但不限于肌细胞增强因子(MEF2)、叉状头/翼状螺旋转录因子F0XP3和转录因子GATA3。更特别地，本发明涉及MEF2和其相关因子的小分子调节剂以及它们的治疗应用，所述相关因子包括但不限于组蛋白脱乙酰酶(HDAC)、p300/CBP和 Cabinl ο
背景技术：
本发明涉及用于调节与特定疾病相关的转录因子的功能的小分子的用途。转录因子是与特定DNA序列结合的蛋白，其直接调控基因表达或通过诸如辅激活子和辅阻遏子等相关蛋白调控基因表达，或者通过募集诸如组蛋白乙酰转移酶(HAT)和组蛋白脱乙酰酶 (HDAC)等组蛋白修饰酶而调控基因表达。转录因子通过确保合适的基因表达水平而在许多生物过程中起关键作用。如果它们调控转录的能力受到异常修饰，则它们还可以与特定的疾病状态相关。因此，可以选择性调节特定转录因子的功能的小分子的鉴定和开发，可以引起潜在的新治疗应用。本发明基于两个基本想法。一个想法是开发结合诸如MEF2、F0XP3 和GATA3等特定转录因子并且调节其与转录辅激活子和辅阻遏子的相互作用的小分子。另一个想法是开发阻断HAT (例如p300和CBP)和HDAC以及其它组蛋白修饰酶(诸如组蛋白甲基转移酶、和脱甲基酶、DNA甲基转移酶)的募集以及阻断向特定的染色质区域的染色质重塑机制的小分子。特别地，本发明涉及肌细胞增强因子-2 (MEF2)，其在肌肉系统、免疫系统和神经系统的发育和适应性响应中起关键作用(Flavell等，2006 ；Kim等，2008 ；Mao等，1999 ； McKinsey 等，2002 ；Pan 等，2004 ；Potthoff 和 Olson, 2007 ；Youn 和 Liu, 2000 ；Youn 等， 1999)。已经表明MEF2是心肌细胞中肥大性响应的关键调控子。由病理刺激诱导的心脏肥大可以在许多形式的心血管疾病中弓丨起心力衰竭。MEF2通常定义了具有4个成员的转录因子家族MEF2A、MEF2B、MEF2C和MEF2D。 通过使用鼠类和果蝇遗传学已经详细地证明了它们功能的重要性(Potthoff和Olson， 2007)。最初在骨骼肌中鉴定出的MEF2，与诸如MyoD等肌原性碱性螺旋-环-螺旋转录因子一起，促进和维持肌生成(Molkentin和Olson，1996)。MEF2家族的一个成员MEF2A最近已经被表述为“心脏病发作基因”，这是因为该蛋白的突变与冠心病(CAD)和心肌梗死(MI)有关(Wang等，200 。这些发现成为MEF2在人类心脏病中起关键作用的基础(Kim等，2008 ； Wei 等，2008 ；Zhang 等，2002)。现在已知MEF2在许多其它细胞类型中是通用的转录因子。例如，MEF2是用于在淋巴系统发育中介导钙信号传导的重要转录因子之一(Pan等，2004 ；Youn和Liu，2000 ；Youn 等，1999)。MEF2调控细胞因子表达和免疫响应。MEF2还调控作为神经元存活和突触重塑的基础的转录程序(Chen 和 C印ko，2009 ；Flavell 等，2006 ；Flavell 和 Greenberg, 2008 ； Flavell 等，2008;Mao 1999 ；Morrow 等，2008 ;Shalizi 等，2006 ;Shalizi 和 Bonni, 2005 ；Yang等，2009)。这些观察表明，调节MEF2功能的小分子可以在心脏肥大和心力衰竭、 自体免疫疾病和移植排斥、神经退行性疾病以及学习力和记忆力的病理性损伤中具有治疗效果(Fischer 等，2007 ；Stefanko 等，2009)。在细胞内部，MEF2的作用包括三个不同步骤(i)转录阻遏；(ii)钙依赖性去阻遏；和(iii)转录激活。MEF2的转录阻遏作用取决于其与各种转录辅阻遏子的相关性，所述转录辅阻遏子具有固有的或相关的组蛋白脱乙酰酶(HDAC)活性。在T细胞中，MEF2结合 Cabin I ,Cabin I 接着与诸如 HDAC1、HADC2 和 HDAC3 等 I 类 HDAC 相连(Youn 和 Liu，2000)。 在肌肉细胞中，MEF2与诸如HDAC4、HDAC5和HDAC9等II类HDAC直接结合，并抑制参与肌肉的发育和适应性响应的特定基因的表达(Chan等，2003 ；Gregoire等，2006 ；Gregoire和 Yang, 2005 ；McKinsey 等，2001，2002 ；Miska 等，1999 ；Sparrow 等，1999)。其 HDAC5 或 HDAC9 已经被敲除的小鼠显示出对肥大刺激的敏感性增加，表明了 II类HDAC在心脏肥大中的重要作用(Potthoff和Olson，2007)。这些数据和其它数据表明，MEF2和II类组蛋白脱乙酰酶(HDAC)、特别是HDAC5和HDAC9，在心肌细胞中是肥大信号的关键介导物。大量的数据表明，MEF2/II类HDAC途径是心脏肥大的潜在治疗靶标。响应于特定的钙信号，Cabinl和HDAC被从MEF2中除去(Potthoff和Olson，
2007)。然后MEF2募集诸如p300和CBP等辅激活子以通过与各种转录激活子和辅激活子结合而启动不同的程序(McKinsey等，2001 ；Sartorelli等，1997 ；Sl印ak等，2001 ；Wei等，
2008)。已经显示p300的少量增加对于诱导MEF2依赖性心脏肥大是充分必要的。MEF2具有由已被良好表征的MADS盒和MEF2特异性结构域组成的高度保守的N末端区(第2位 第93位残基)(Shore和Sharrocks, 1995)。MADS盒/MEF2结构域的功能非常丰富，介导 DNA结合、二聚化和与包括Cabinl、IIa类HDAC和p300/CBP在内的大量MEF2转录伴侣的蛋白-蛋白相互作用(McKinsey等，2001，2002)。已经显示MEF2中的MADS盒/MEF2结构域对于与在II类HDAC和Cabinl中保守的小基序结合是充分必要的。p300和CBP的CH3 结构域也据显示会结合MADS盒/MEF2结构域。虽然本领域可获得MEF2参与各种细胞过程的广泛知识，但是迄今为止由于缺乏合适的分子工具而无法利用该知识。特别地，如何通过小分子调节MEF2的活性一直是个长期存在的挑战。这是因为MEF2是相对较小的转录因子，没有任何明显的酶活性；其主要功能在于结合特定的DNA并且将诸如Cabinl、II类HDAC和p300/CBP等转录辅调控子 (co-regulator)募集至特异性启动子。通常认为该功能模式不具有可药性，或至少非常难以被小分子靶向。所述分子的发现或创造会促进该领域的进展，并且会产生用于MEF2相关疾病的基于机制或基于结构的新治疗应用，所述MEF2相关疾病包括炎症、自体免疫疾病、神经退行性疾病、癌和心血管疾病。本申请描述的发明还可扩展至调节诸如叉状头/翼状螺旋转录因子F0XP3等其它转录因子的活性(Bennett 等，2001 ；Fontenot 等，2003 ；Hori 等，2003 ；Wu 等，2006 ；Zheng 和RudenSky，2007)。F0XP3是对于调控性T细胞(Treg)的发育和功能而言至关重要的关键转录因子。Treg是抑制免疫系统的过度激活所需的特别的T细胞群。通过突变和其它机制造成F0XP3功能的丧失会引起诸如IPEX等致命性自体免疫疾病，而F0XP3或其活性的表达增强可以造成功能受到抑制。F0XP3功能增强在治疗自体免疫疾病和移植排斥时可能是有益的，而F0XP3活性的策略性下调可用于开发基于免疫的抗肿瘤治疗(Zuo等，2007a ； Zuo等，2007b)。因此，结合F0XP3并且调节其与辅阻遏子和辅激活子的相互作用的小分子可能在自体免疫疾病、移植排斥和癌治疗中具有治疗应用。与MEF2类似，F0XP3的功能受包括HAT (例如TIP60)和HDAC(包括I类和II类 HDAC)在内的转录辅调控子的严格调控(Li等，2007)。因此，可以通过本发明所述的方法开发结合F0XP3并且阻断其与辅调控子的相互作用的小分子，所述辅调控子包括诸如组蛋白修饰酶和染色质重塑机制等表观遗传调控子。类似地，靶向转录辅调控子还满足了其挑战的作用。在诸如MEF2等转录因子的转录辅调控子中，II类HDAC是研究最透彻的组。组蛋白脱乙酰酶(HDAC) (EC号3. 5. 1)是一类从位于组蛋白上的ε -N-乙酰基赖氨酸氨基酸除去乙酰基的酶。其作用与组蛋白乙酰转移酶(HAT)的作用相反。现在还将 HDAC蛋白称为赖氨酸脱乙酰酶(KDAC)，以更准确地描述其活性而不是其靶标，其靶标还包括许多非组蛋白。如其名称所表明，HDAC的主要功能之一是从组蛋白除去乙酰基。组蛋白是染色质的主要蛋白成分。它们充当DNA绕其缠绕的轴，并且在基因调控和DNA包装中起重要作用。 组蛋白具有由存在于其赖氨酸和精氨酸氨基酸上的氨基引起的正常带正电的尾部。这些正电荷帮助组蛋白尾部与位于DNA主链上的带负电的磷酸基相互作用并与其结合。DNA和组蛋白之间的连接在调控转录因子接近DNA的能力上充当至关重要的控制机制。DNA和组蛋白之间的强连接限制了被转录因子接近，因此抑制基因转录(Morrison 等，2007)。对组蛋白或DNA进行修饰改变了其连接强度，并进而调节转录活性(Morrison 等，2007)。已经显示共价添加甲基、磷酸基或乙酰基部分改变了核小体状态并由此影响转录。乙酰基向组蛋白上的保守性N-末端赖氨酸残基的ε-氨基的添加引起乙酰化。向组蛋白添加乙酰基减少了带正电的组蛋白和带负电的DNA磷酸主链之间的吸引力，产生更加松弛的和可接近的染色质结构。HAT促进了组蛋白乙酰化，因此据认为是转录激活子。反之，HDAC用于从组蛋白除去乙酰基，由此抑制转录。因此，正是HAT和HDAC活性之间的相互作用主要管理局部染色质结构和基因表达。HDAC通过染色质的脱乙酰化改变全局基因转录。应该注意，HDAC不直接结合DNA序列，而是需要额外的靶基因识别用因子(Morrison 等，2007)。基于功能和DNA序列相似性，存在4种已得到认识的HDAC蛋白亚型(I类 IV 类)。将前两种亚型称为“经典"HDAC，其活性受曲古抑菌素A(TSA)抑制。I类HDAC包括普遍表达的 HDACl、2、3 和 8 (Zhang 和 01 sen，2000)。II 类 HDAC 有两个亚类 IIa 和 IIb，IIa 包括4、5、7和9，而nb包括HDAC6和HDAC10。IIa类享有共同的结构组织，具有羧基端催化域和介导与转录因子的肌细胞增强因子2 (MEF2)家族成员的相互作用的氨基端延伸。HDAC 与通常在细胞核中发现的I类的不同之处还在于其亚细胞定位，nb类主要定位于细胞质中，而IIa类在细胞核和细胞质之间穿梭。与I类HDAC不同，IIa类HDAC是受组织限制的， 在心脏、骨骼肌和脑中具有特别高水平的表达(aiang等，200幻。III类是不受TSA影响的 NAD+依赖性蛋白家族，并且认为IV类是其自身的非典型类别。HDACll归类于V类。考虑到HDAC在细胞过程中所起的重要作用，HDAC抑制剂(HDACi)的医学应用是研究的活跃区域。但是，HDACi的许多用途是在不了解其基础机制时发现的。例如，在精神病学和神经学中，使用丙戊酸作为情绪稳定剂和抗癫痫药有很长的历史。当将丙戊酸用作许多其它作为抗惊厥药而被研究的化合物的载剂时，偶然发现了丙戊酸的抗惊厥性。不久以后将丙戊酸鉴定为HDACi。近年来，HDACi作为缓和剂或用于神经退行性疾病的治疗而被活跃地研究。还付出了大量精力来开发癌治疗用HDACi。例如，最近已经批准伏立诺他 (Vorinostat) (SAHA)用于治疗皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)。用于CTCL的处于临床评价的替代试剂是环状缩酚肽天然产物(Romidepsin)，其是I类HDAC的强效抑制剂。另外，临床实验正在研究丙戊酸对受感染人中的HIV潜伏库的影响。虽然对于HDACi的医学应用的兴趣不断增长，这些化合物工作的确切机制仍未被良好地理解。因此，这些努力很大程度上由猜测和试错实验指导。使用HDACi的一个特别的问题在于大多数已知的抑制HDAC活性的小分子被设计成通过靶向HDAC的催化活性而起作用。但是，由于该活性位点是大量不同的HDAC同种型共有的保守性特征，其天生难以鉴定具有同种型选择性的HDACi。因此，大多数HDACi具有较低的特异性，不能特异性靶向任何特定种类的HDAC。例如，曲古抑菌素A(TSA)是目前已知的最强效的可逆HDACi中的一种，其IC5tl在较低的纳摩尔范围内。具有羟肟酸基团和与苯基连接的五碳原子连接子的TSA具有可适配至HDAC的活性位点内的最佳构象(de Ruijter 等，2003 ；Somoza等，2004)。据认为所有HDAC对于受TSA的抑制具有大致相等的敏感性。因此，发现抑制HDAC的功能并由此调节相关转录因子的活性的小分子的主要障碍，在于目前的现有技术致力于发现和优化已经通过HDACi与HDAC酶的活性位点结合的能力而得到鉴定和评价的HDACi。通常，这些HDACi具有通用结构R-L-Z，其中R是经由较短的脂肪族连接子L连接至Zn2+螯合基团Z的蛋白表面识别基团，Z与活性位点锌原子结合。在已知HDACi中出现的最常见螯合基团(Z)是羟肟酸(TSA、伏立诺他、LAQ824, belinostat)、硫醇衍生物(Π(228、拉格唑拉(Iargazole))或亲电子性酮(trapoxin A)。此类与如Si2+等金属阳离子紧密结合的基团的潜在缺点在于它们对特定的蛋白可能缺乏足够的选择性，从而引起各种副作用。另一类已知的HDACi是特征在于邻氨基酰基苯胺(2-氨基酰基苯胺)部分的苯甲酰胺类，包括MS-725、MG⑶0103、庚二酰基苯胺邻氨基酰基苯胺(PAOA)和化合物 106 (N1- (2-氨基苯基)-N7-对甲苯基庚烷二酰胺)，化合物106经研究认为是包括弗里德赖希氏共济失调和亨廷顿病在内的神经退行性疾病的潜在治疗物(Chou等，2008 ；Herman等， 2006 ；Paris 等，2008 ；Rai 等，2008 ；Thomas 等，2008 ；Wong 等，2003)。虽然该类 HDACi 作用的详细分子机制尚未知，但是据推测这些分子涉及邻氨基酰基苯氨基与HDAC活性位点的锌原子的结合，但是缺乏所述结合基序的任何直接证据。另外，发现所述分子显示的生物活性涉及HDAC功能的抑制，尽管其它非选择性HDACi并未显示出类似的活性。例如，化合物106虽然具有较弱的HDAC抑制，但据显示其非常活跃地诱导frataxin，而诸如SAHA等紧密相关的HDACi不具有这类活性。因此，考虑到该类化合物作用的分子机制的缺乏，妨碍了对其治疗潜能进行优化。由各种HDAC同种型的良好调控生物作用所产生的数种其他因子，对于设计HDACi 的常规方法造成了进一步的挑战。实验显示，在存在HDACi时乙酰化组蛋白的量增加。但是，通过经DNA结合的转录因子进行的HAT和HDAC的募集引起多蛋白转录调控复合物的形成，该多蛋白转录调控复合物赋予细胞类型特异性和对从属基因(subordinate gene)阵列的信号依赖性调控。使用不加区别地抑制HDAC的HDACi类似于将猴子农场(monkey ranch) 掷入复杂且经过精巧平衡的机器中。这解释了在许多涉及HDACi的实验中所观察到的众多不期望的副作用。对HDACi的医学用途进行研究时遇到的问题也是研究表观遗传调控的研究中所共有的。表观遗传调控是不永久性地改变DNA序列而建立可遗传基因表达模式。其已经表现为调控细胞功能的关键机制。表观遗传调控的变化是许多疾病，特别是癌的标志。正在开发的作为治疗这些疾病的药物的小分子通常经由表型筛选发现，其通过调节细胞过程的表观遗传控制起作用。 同样，表观遗传调控的基础机制是令人极为关注的领域。同时，对小分子表观遗传调控剂的搜索正在成为非常有前景的药物发现领域。由于表观遗传调控很大程度上经由通过酶对染色质结构进行的化学修饰而实现， 所述酶作用于DNA(例如DNA胞嘧啶甲基转移酶)或蛋白(例如，HAT、HDAC、组蛋白甲基化酶和组蛋白脱甲基酶)，在该背景下，HDAC调控DNA转录的作用可以视为表观遗传调控的组成部分。与HDACi类似，表观遗传调控剂的大多数现有化学调节剂通过与酶的催化位点结合而抑制这些酶，所述催化位点经常是具有不同细胞作用的多种酶所共有的。虽然关于诸如MEF2等转录因子的作用取得最新进展，并且其涉及数种主要疾病， 但是无法鉴定能够调节MEF2的功能的小分子。所述分子会促进该领域的进展，并且会产生用于MEF2相关疾病的基于机制或基于结构的新型治疗应用，所述MEF2-相关疾病包括炎症、自体免疫疾病、神经退行性疾病、癌和心血管疾病。因此，该研究领域的通常问题是缺乏能够靶向特定的表观遗传调控酶或蛋白的小分子。另一问题还在于缺乏设计、评价和优化所述小分子的方法，其方式在于给予所需选择性而没有由横跨整个酶或蛋白类型的广谱活性引起的相关缺点。所述分子作为研究表观遗传调控的基础机制的分子工具以及作为用于靶向治疗干预的治疗剂会具有重要应用。
发明内容
通过深入的生化和结构研究(Guo等，2007 ；Han等，2005 ；Han等，2003)，本发明人意外地发现了使得可以使用小分子调节MEF2的活性的独特MEF2结构特征。该发现是本发明的核心，因为其违反了常规观点并且开放了各种可能性。基于该意外发现，发明人设计了一种通过经由界面抑制剂阻断转录因子与其辅因子之间的相互作用而调节细胞过程的通用策略。因此，本发明还提供了用于鉴定、筛选、检验和合成能够与位于所述因子-辅因子复合物的界面表面中的位点结合并由此干扰所述复合物的形成的小分子调节剂。因此，本发明已经解决了靶向诸如MEF2等迄今为止“不可药用(undrugable) ”的转录因子的长期存在的问题。关于HDACi所面临的特异性问题，本发明提供了开发具有HDAC功能的小分子调节剂的替代方法。本发明靶向HDAC与调节转录所需的相关转录因子的结合位点，而不是靶向特定HDAC的活性位点。由于不同的HDAC亚型会具有与不同转录因子结合的不同表面，通过靶向这些蛋白-蛋白相互作用的界面，由保守性活性位点造成的特异性问题得以解决。具体而言，本发明针对转录因子MEF2和IIa类HDAC之间的相互作用。MEF2的活性受IIa类HDAC控制，所述IIa类HDAC结合特定启动子上的MEF2，从而抑制靶基因表达(Potthoff和Olson，2007)。正在开发的用于治疗各种癌的HDAC的一些小分子抑制剂 (HDACi)，也在涉及MEF2和HDAC活性的失调的疾病中显示出治疗潜能，所述疾病包括心脏肥大、神经退行性疾病和免疫功能障碍(Morrison等，2007 ；Paris等，2008)。这些观察表明，阻断IIa类HDAC:MEF2相互作用的小分子可能作为成员特异性HDACi提供类似的治疗益处(Guo 等，2007 ；Han 等，2005 ；Han 等，2003)。IIa类HDAC在肌肉细胞、神经元细胞和T细胞中与MEF2密切地起作用。IIa类 HDAC不结合DNA，但依赖于其与经DNA结合的MEF2的相互作用以用于启动子靶向。该相互作用受较短的两亲性螺旋结构介导，该螺旋结构在IIa类HDAC而非其它HDAC中是保守的，且与MEF2的MADS盒/MEF2结构域上的疏水沟结合(Guo等，2007 ；Han等，2005 ；Han等， 2003)。所述配体/受体样结合机制表明，可以使用小分子来阻断IIa类HDAC向MEF2-特异性启动子的募集(Guo等，2007 ；Han等，2005 ；Han等，2003)。本发明基于以下系统结构和生化研究(Guo等，2007 ；Han等，2005 ；Han等，2003)， 该系统结构和生化研究表明与MEF2结合的小分子能够调节其在募集诸如Cabinl、IIa类 HDAC和p300/CBP等转录辅调控子方面的活性。大多数这些辅调控子具有修饰染色质的固有功能(例如HDAC、p300和CBP)或募集染色质修饰酶和机构的能力(例如结合Cabinl、 HPl、CtBP的mSin3A，结合IIa类HDAC的14-3- 。因此，结合MEF2并调节其与其它转录辅调控子的相互作用的小分子，可以充当其中MEF2起关键调控作用的组织中的表观遗传调节子。所以这些小分子可用于治疗其中MEF2依赖性基因表达的活性失调的疾病。失调可由以下引起MEF2和其相关因子的遗传突变、引起MEF2功能的激活不足或激活过度的信号减少或过量、结合并与MEF2相互作用的辅因子的异常表达不足或表达过量。MEF2结合性小分子的潜在临床应用包括但不限于肌肉系统、免疫系统和神经系统的疾病。肌肉系统中的疾病有由MEF2功能不平衡引起的心脏肥大、肌纤维类型重塑和其它肌肉相关疾病。免疫系统中的疾病有各种由MEF2依赖性基因表达过多或过少引起的自体免疫疾病或免疫缺陷。MEF2结合性小分子还可用于操作调控性T细胞的功能和总体免疫应答以避免移植排斥。由于MEF2依赖性基因表达与突触重塑和神经元存活密切相关，MEF2结合性小分子还可用于治疗由MEF2功能失调引起的各种神经退行性疾病(例如阿尔茨海默氏病和亨廷顿病等)、孤独症、精神病以及学习力和记忆力受损。因为本发明的小分子调节剂通过靶向位于转录因子和其辅因子的蛋白-蛋白相互作用界面处的结合位点起作用，本文还将它们称为界面抑制剂。已经解释了本发明的基本原理，现在总结本发明的各方面和实施方式如下在第一方面，本发明提供了用于筛选、鉴定或优化候选界面抑制剂的检验。本发明该方面的检验通常会包括使候选界面抑制剂与评价元件(evaluating element)接触的步骤，所述评价元件包括由蛋白-蛋白界面限定的分子表面，该分子表面包括各MEF2单体的β链S1、S2和S3以及螺旋H2，和来自Cabinl、HDAC4以及HDAC9的较短螺旋基序。在一些优选实施方式中，评价元件与提供关于候选抑制剂的信息的报道元件可操作地结合。在优选实施方式中，所述检验为基于细胞的荧光素酶检验，该荧光素酶检验允许对结合MEF2 并调节其与转录辅调控子结合的小分子进行快速且高通量的筛选和优化。该检验由发明人实验室基于对MEF2复合物进行的长达10年的结构和生化研究而开发。本发明声明，通过晶体学研究首次鉴定、并通过本发明中的结构指导的突变研究进一步证明的蛋白-蛋白界面，可充当对MEF2结合性小分子进行高度特异性和灵敏性筛选的分子基础。其它实施方式中，所述检验的评价元件可以与物理检验或任何体外结合检验和基于细胞荧光素酶报道子检验、基于通过本发明鉴定的蛋白-蛋白界面的转基因报道子检验一起实施，所述物理检验包括但不限于牵出、共免疫沉淀或荧光猝灭和各向异性。在第二方面，本发明还提供在各种哺乳动物组织中可用作MEF2依赖性转录的表观遗传调节剂的化合物，所述哺乳动物组织包括但不限于肌肉系统、免疫系统和神经系统。在一些优选实施方式中，本发明该方面的化合物可以包括但不限于之前公开的化合物 (Chou 等，2008 ；Herman 等，2006 ；Paris 等，2008 ；Rai 等，2008 ；Thomas 等，2008 ；Wong 等， 2003)，庚二酰基苯胺邻氨基酰基苯胺ΡΑ0Α，和市售同系物辛二酰基苯胺邻氨基酰基苯胺 (或BML-210)以及它们的结构相关衍生物。在第三方面，本发明还提供了由位于MEF2上的BML-210结合位点限定的分子框架，该分子框架源自由与MEF2结合的BML-210的晶体结构建立的结构框架，如表1中的晶体结构坐标所示。将BML-210与结合至DNA的MEF2A(1_78) 二聚体共结晶。晶体衍射分辨率为2.4A，并且所述结构通过使用MEF2A(l-78) :DNA复合物作为搜索模型的分子置换来解析(Santelli和Richmond，2000)。BML-210采取延伸构象来结合到MEF2的疏水口袋中 (图Id)。所述分子的一端(苯基酰胺基)被许多疏水残基围绕，所述疏水残基包括Leu66、 Leu67, Thr70, Leu66'(撇号表示来自其它单体的残基)和Thr70'。位于该末端的酰胺基还处在能够参与分别与Thr70和Thr70'的氢键相互作用的位置。在BML-210的另一端， 环-链(ring-link)电子密度处于被Asn73、Gln56 ‘、Asp61'和Asp63'围绕的较为亲水的环境中。该区域对应于邻氨基酰基苯氨基。此处邻氨基酰基苯氨基及其酰胺基与MEF2的残基形成密切的范德华力接触和可能的氢键相互作用(图Id)。辛二酰胺的亚甲基紧贴配合在两个MEF2分子的螺旋H2之间，形成与MEF2残基的主链和侧链的许多接触，所述MEF2 残基大多数具有疏水性(图Id)。基于与MEF2结合的BML-210的晶体结构，本发明人声明， 接触BML-210和PAOA或非常接近接触BML-210和PAOA的表面残基可用于通过基于实验和计算的方法指导MEF2小分子的设计和筛选。这些残基包括所有暴露的位于MEF2的Si、 S2和S3链和螺旋H2上的残基。该结构框，连同与本发明所述的高通量、特异性、灵敏性检验，使得能够快速设计和优化MEF2结合性小分子，所述MEF2结合性小分子包括BML210和 PAOA衍生物以及基于新型分子支架的分子。与本发明所述的MEF2结合的BML-210的晶体结构，除了限定本文所述的小分子MEF2结合位点之外，还首次披露了可能的对于邻氨基酰基苯胺部分的结合位点，所述邻氨基酰基苯胺部分存在于BML-210和其它含苯甲酰胺HDAC 抑制剂中。特别地，该结合位点不同于之前对于该类HDAC抑制剂假定的HDAC酶活性位点。在第四方面，本发明提供了用于与由以上第三方面中的分子框架限定的界面结合位点结合的MEF2结合性小分子。在一个实施方式中，所提供的分子是具有以下结构通式的 MEF2结合性小分子，所述结构通式源自从与MEF2结合的BML-210的晶体结构衍生的经鉴定的结合位点。将所提供的小分子设计成与所述结构折叠体结合，并且有可能会以较高的亲和性和选择性结合MEF2。本发明的该实施方式提供的化合物包括与MEF2结合位点结合的具有通式Ra-L-Rb的化合物，其中Ra是与MEF2结合位点的疏水区结合的识别基团，其选自包括以下基团的组低级烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、烷氧基、芳氧基；烷硫基、芳硫基、或= 0)-、 RcRdN(SO2)-,其中Rc和Rd独立地选自由氢、烷基、烯基、炔基、烷氧基、芳基、杂芳基、烷氨基、二烷基氨基、芳氨基或杂芳基氨基组成的组。L是由至多20个碳原子的链组成的连接子，条件是至多3个碳原子可以被氧、氮或硫原子置换，并且另一条件是其可以包括选自由以下基团组成的组的取代基烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、苯并基(benzo)、羟基、烷氧基、芳氧基、氧杂基 (oxa)、酮基、酰氨基、磺酰氨基或氟。Rb是与MEF2结合位点的亲水区结合的识别基团，其选自包括以下基团的组 低级烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、或ReRdNC ( = 0)-、 RcRdN(SO2)，其中Rc和Rd独立地选自由氢、烷基、烯基、炔基、烷氧基、芳基、杂芳基、烷氨基、二烷基氨基、芳氨基或杂芳基氨基组成的组。在优选的实施方式中，所提供的化合物具有通式结构Ar1-L1-L2-L3-Ar2,其中Ar1 和Ar2独立选自由以下芳香环组成的组的芳香环苯、萘、吡啶、嘧啶、吡嗪、喹啉、异喹啉、吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、批唑、嚅唑、噻唑、异嚅唑、喷哚、苯并咪唑、苯并噻唑、苯并嚅唑，条件是所述芳香环可以含有至多7个选自由以下基团组成的组的取代基氢、烷基、烯基、炔基、 烷氧基、芳基、杂芳基、氨基、烷氨基、二烷基氨基、芳氨基、杂芳基氨基、羟基或商素。所述取代基还能够连接在一起形成至多12个原子的环；L1和L3是独立选自由以下基团组成的组中的连接基团氨基、烷氨基、芳氨基、氧杂基、酮基、NHC( = 0)、NR(C = 0)、S( = 0)或 _S( = 0)2-；L2是选自由至多10个碳原子的链组成的组中的连接基团，条件是至多3个碳原子可以被氧、氮或硫原子置换，并且另一条件是这些原子可以含有选自由以下基团组成的组的取代基烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、苯并基、羟基、烷氧基、芳氧基、氧杂基、酮基、酰氨基、磺酰氨基或氟。在另一优选实施方式中，所提供的化合物具有通式
权利要求
1.一种调节细胞过程的方法，所述方法包括选择与待调节的细胞过程相关的靶转录因子或辅因子；使所述转录因子或辅因子与界面抑制剂接触，其中所述界面抑制剂能够与位于所述转录因子或辅因子和结合伴侣之间的界面上的结合位点选择性结合，由此，干扰所述转录因子或辅因子和所述结合伴侣之间的相互作用。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述转录辅因子是HDAC酶。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述HDAC酶是选自由I类和II类HDAC组成的组中的一种。
4.如权利要求2所述的方法，其中所述HDAC酶是选自由IIa类HDAC组成的组中的一种。
5.如权利要求2所述的方法，其中所述界面结合位点由所述HDAC酶和MEF2之间的界面限定。
6.如权利要求2所述的方法，其中所述界面结合位点由所述HDAC酶和将所述HDAC募集至靶染色质区的辅因子之间的界面限定。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述转录因子选自由MEF2、F0XP3组成的组。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞过程是与转录失调相关的一种细胞过程。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述界面活性剂是具有通式Ra-L-Rb且能够与MEF2 界面结合位点结合的化合物，并且其中Ra是与MEF2结合位点的疏水区结合的识别基团，其选自包括以下基团的组低级烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、或!TRdNC( = 0)-、 RcRdN(SO2)，其中Rc和Rd独立地选自由氢、烷基、烯基、炔基、烷氧基、芳基、杂芳基、烷氨基、二烷基氨基、 芳氨基或杂芳基氨基；L是由至多20个碳原子的链组成的连接子，条件是至多3个碳原子可以被氧、氮或硫原子置换，并且另一条件是L可以包括选自由以下基团组成的组中的取代基烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、苯并基、羟基、烷氧基、芳氧基、氧杂基、酮基、酰氨基、 磺酰氨基或氟；Rb是与MEF2结合位点的亲水区结合的识别基团，其选自包括以下基团的组低级烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、或!TRdNC( = 0)-、 RcRdN(SO2)-,其中Rc和Rd独立地选自由氢、烷基、烯基、炔基、烷氧基、芳基、杂芳基、烷氨基、二烷基氨基、 芳氨基或杂芳基氨基。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述界面活性剂是具有通式Ar1-L1-L2-L3-Ar2且能够与MEF2界面结合位点结合的化合物，并且其中Ar1和Ar2独立选自由以下基团组成的组的芳香环苯、萘、吡啶、嘧啶、吡嗪、喹啉、异喹啉、吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、批唑、嚅唑、噻唑、异嚅唑、喷哚、苯并咪唑、苯并噻唑、苯并嚅唑， 条件是所述芳香环可以含有至多7个选自由以下基团组成的组的取代基氢、烷基、烯基、 炔基、烷氧基、芳基、杂芳基、氨基、烷氨基、二烷基氨基、芳氨基、杂芳基氨基、羟基或卤素； 所述取代基还能够连接在一起形成至多12个原子的环；L1和L3是独立选自由以下基团组成的组的连接基团氨基、烷氨基、芳氨基、氧杂基、酮基、NHC( = 0)、NR(C = 0)、S( = 0)或 _S( = 0)2-；L2是选自由至多10个碳原子的链组成的组的连接基团，条件是至多3个碳原子可以被氧、氮或硫原子置换，并且另一条件是这些原子可以含有选自由以下基团组成的组的取代基烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、苯并基、羟基、烷氧基、芳氧基、氧杂基、酮基、酰氨基、 磺酰氨基或氟。
11.如权利要求1所述的方法，其中所述界面抑制剂是具有以下通式的化合物其中R1 Rki独立选自由以下基团组成的组L1和L3是独立选自由以下基团组成的组中的连接基团氨基、烷氨基、芳氨基、氧杂基、 酮基、NHC( = 0)、NR(C = 0)、S( = 0)或 _S( = 0)2-；L2是选自由至多10个碳原子的链组成的组的连接基团，条件是至多3个碳原子可以被氧、氮或硫原子置换，并且另一条件是这些原子可以含有选自由以下基团组成的组的取代基烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、苯并基、羟基、烷氧基、芳氧基、氧杂基、酮基、酰氨基、磺酰氨基或氟。
12.如权利要求1所述的方法，其中所述界面抑制剂是能够与MEF2界面结合位点结合的化合物，并且所述化合物具有选自由以下式组成的组的式
13.一种治疗罹患与转录因子依赖性失调相关的疾病的患者的方法，所述方法包括 对所述患者施用药理学有效量的界面抑制剂，其中所述界面抑制剂是能够与靶转录因子或其辅因子选择性结合的一种界面抑制剂，其中已知所述转录因子或辅因子与所述疾病过程相关。
14.如权利要求10所述的方法，其中所述疾病是选自移植排斥、炎症、自体免疫疾病、 神经退行性疾病、癌和心血管疾病的一种疾病。
15.如权利要求10所述的方法，其中所述转录因子是将HDAC募集至靶DNA区的一种转录因子。
16.如权利要求12所述的方法，其中所述转录因子选自MEF2、F0XP3或其组合。
17.如权利要求12所述的方法，其中所述转录辅因子是HDAC的成员。
18.如权利要求12所述的方法，其中所述转录辅因子选自由I类和II类HDAC组成的组的一种转录辅因子。
19.如权利要求12所述的方法，其中所述HDAC失调相关疾病是选自由癌、神经退行性疾病、心脏病或其组合组成的组的一种疾病。
20.一种鉴定和优化用于调节所选的转录因子或辅因子与其结合伴侣之间的相互作用的界面抑制剂的方法，所述方法包括a.获得代表所述转录因子或辅因子的晶体结构、或含有功能重要的界面的其部分的一组相对坐标，其中所述坐标代表在所述转录因子或辅因子与其结合伴侣或先导化合物处于复合状态时所述转录因子或辅因子所采取的构象；和b.基于代表所述界面的所述坐标的一部分来设计抑制剂。
21.如权利要求17所述的方法，其中所述转录因子是MEF2或F0XP3。
22.如权利要求17所述的方法，其中所述转录辅因子选自由I类和II类HDAC组成的组。
23.如权利要求17所述的方法，其中所述坐标包含表1中各MEF2单体的β链Si、S2 和S3以及螺旋Η2。
24.如权利要求17所述的方法，其中所述坐标是表1中的坐标。
25.一种用于筛选、鉴定或优化适于用作界面抑制剂的先导化合物的检验，所述检验包括提供评价元件，其中所述评价元件包含分子框架，所述分子框架具有代表转录因子或辅因子的界面结合位点的结构；使测试化合物与所述评价元件接触；和根据来自所述评价元件的预定响应将所述测试化合物鉴定为先导物。
26.如权利要求25所述的检验，其中所述评价元件是双杂交检验系统，所述双杂交检验系统具有与所选的转录因子或辅因子融合的结合域、与所述转录因子或辅因子的结合伴侣融合的激活域、以及报道基因，其中当所述报道信号低于预定水平时，将所述测试化合物鉴定为先导化合物。
27.如权利要求沈所述的检验，其中所述转录因子是MEF2D的成员，并且所述结合伴侣是HDAC的成员。
28.如权利要求沈所述的检验，其中所述转录因子是MEF2D并且所述结合伴侣是HDAC 或其相互作用部分，其中所述相互作用部分包含与MEF2D结合的HDAC4的区段。
29.如权利要求25所述的检验，其中所述转录因子是选自MEF2、F0XP3和其它将HDAC 募集至DNA的类似转录因子中的一种转录因子。
30.一种用于执行权利要求沈所述的检验的试剂盒，所述试剂盒包含编码所述融合的结合域和作用域的载体。
31.一种用于抑制所选HDAC和转录因子之间的结合的化合物，所述化合物具有的结构式选自从由以下结构组成的组中选择的任何结构
32.如权利要求31所述的化合物，其中将所述化合物用作NEF2界面抑制剂。
33.一种用作MEF2界面抑制剂的化合物，所述化合物具有通式Ra-L-Rb且能够与MEF2 界面结合位点结合，其中Ra是与所述MEF2结合位点的疏水区结合的识别基团，其选自包括以下基团的组 低级烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、或RfNW = 0)-、 ITRtlN (SO2)-,其中Rc和Rd独立地选自由氢、烷基、烯基、炔基、烷氧基、芳基、杂芳基、烷氨基、二烷基氨基、 芳氨基或杂芳基氨基；L是由至多20个碳原子的链组成的连接子，条件是至多3个碳原子可以被氧、氮或硫原子置换，并且另一条件是其可以包括选自由以下基团组成的组的取代基烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、苯并基、羟基、烷氧基、芳氧基、氧杂基、酮基、酰氨基、 磺酰氨基或氟；Rb是与所述MEF2结合位点的亲水区结合的识别基团，其选自包括以下基团的组 低级烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、或RfNW = 0)-、 ITRtlN (SO2)-,其中Rc和Rd独立地选自由氢、烷基、烯基、炔基、烷氧基、芳基、杂芳基、烷氨基、二烷基氨基、 芳氨基或杂芳基氨基。
34.一种用作MEF2界面抑制剂的化合物，所述化合物具有通式Ar1-L1-L2-L3-Ar2且能够与MEF2界面结合位点结合，其中Ar1和Ar2独立选自由以下芳香环组成的组的芳香环苯、萘、吡啶、嘧啶、吡嗪、喹啉、异喹啉、批咯、呋喃、噻吩、咪唑、批唑、嗝唑、噻唑、异喁唑、Π引哚、苯并咪唑、苯并噻唑、苯并嘴唑，条件是所述芳香环可以含有至多7个选自由以下基团组成的组的取代基氢、烷基、烯基、炔基、烷氧基、芳基、杂芳基、氨基、烷氨基、二烷基氨基、芳氨基、杂芳基氨基、羟基或卤素；所述取代基还能够连接在一起形成至多12个原子的环；L1和L3是独立选自由以下基团组成的组的连接基团氨基、烷氨基、芳氨基、氧杂基、酮基、NHC( = 0)、NR(C = 0)、S( = 0)或 _S( = 0)2-；L2是选自由至多10个碳原子的链组成的组的连接基团，条件是至多3个碳原子可以被氧、氮或硫原子置换，并且另一条件是这些原子可以含有选自由以下基团组成的组的取代基烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、苯并基、羟基、烷氧基、芳氧基、氧杂基、酮基、酰氨基、 磺酰氨基或氟。
35. 一种用作MEF2界面抑制剂的化合物，所述化合物具有以下通式
36. 一种用于调节HDAC和NEF2之间的相互作用的组合物，所述组合物包含如权利要求 31、33、34、35所述的化合物或其组合。
全文摘要
本发明公开了用于调节转录因子、特别是将表观遗传调控剂(组蛋白修饰酶)募集至特定的DNA启动子的转录因子的功能的方法和组合物。靶向的转录因子包括但不限于肌细胞增强因子(MEF2)、叉状头/翼状螺旋转录因子FOXP3和转录因子GATA3。本发明还公开了MEF2和其相关因子的小分子调节剂以及它们的治疗应用，所述相关因子包括但不限于组蛋白脱乙酰酶(HDAC)、p300/CBP和Cabin1。
文档编号A61P29/00GK102271668SQ200980153697
公开日2011年12月7日 申请日期2009年11月5日 优先权日2008年11月5日
发明者N·加压特拉卡, 尼科斯·A.·佩塔西斯, 陈林, 韩爱东 申请人:南加州大学
技术领域：
本发明大体上涉及分子医学的领域。特别地，本发明涉及用于调节转录因子、特别是将表观遗传调控剂(组蛋白修饰酶)募集至特定的DNA启动子的转录因子的功能的方法和组合物。靶向的转录因子包括但不限于肌细胞增强因子(MEF2)、叉状头/翼状螺旋转录因子F0XP3和转录因子GATA3。更特别地，本发明涉及MEF2和其相关因子的小分子调节剂以及它们的治疗应用，所述相关因子包括但不限于组蛋白脱乙酰酶(HDAC)、p300/CBP和 Cabinl ο
背景技术：
本发明涉及用于调节与特定疾病相关的转录因子的功能的小分子的用途。转录因子是与特定DNA序列结合的蛋白，其直接调控基因表达或通过诸如辅激活子和辅阻遏子等相关蛋白调控基因表达，或者通过募集诸如组蛋白乙酰转移酶(HAT)和组蛋白脱乙酰酶 (HDAC)等组蛋白修饰酶而调控基因表达。转录因子通过确保合适的基因表达水平而在许多生物过程中起关键作用。如果它们调控转录的能力受到异常修饰，则它们还可以与特定的疾病状态相关。因此，可以选择性调节特定转录因子的功能的小分子的鉴定和开发，可以引起潜在的新治疗应用。本发明基于两个基本想法。一个想法是开发结合诸如MEF2、F0XP3 和GATA3等特定转录因子并且调节其与转录辅激活子和辅阻遏子的相互作用的小分子。另一个想法是开发阻断HAT (例如p300和CBP)和HDAC以及其它组蛋白修饰酶(诸如组蛋白甲基转移酶、和脱甲基酶、DNA甲基转移酶)的募集以及阻断向特定的染色质区域的染色质重塑机制的小分子。特别地，本发明涉及肌细胞增强因子-2 (MEF2)，其在肌肉系统、免疫系统和神经系统的发育和适应性响应中起关键作用(Flavell等，2006 ；Kim等，2008 ；Mao等，1999 ； McKinsey 等，2002 ；Pan 等，2004 ；Potthoff 和 Olson, 2007 ；Youn 和 Liu, 2000 ；Youn 等， 1999)。已经表明MEF2是心肌细胞中肥大性响应的关键调控子。由病理刺激诱导的心脏肥大可以在许多形式的心血管疾病中弓丨起心力衰竭。MEF2通常定义了具有4个成员的转录因子家族MEF2A、MEF2B、MEF2C和MEF2D。 通过使用鼠类和果蝇遗传学已经详细地证明了它们功能的重要性(Potthoff和Olson， 2007)。最初在骨骼肌中鉴定出的MEF2，与诸如MyoD等肌原性碱性螺旋-环-螺旋转录因子一起，促进和维持肌生成(Molkentin和Olson，1996)。MEF2家族的一个成员MEF2A最近已经被表述为“心脏病发作基因”，这是因为该蛋白的突变与冠心病(CAD)和心肌梗死(MI)有关(Wang等，200 。这些发现成为MEF2在人类心脏病中起关键作用的基础(Kim等，2008 ； Wei 等，2008 ；Zhang 等，2002)。现在已知MEF2在许多其它细胞类型中是通用的转录因子。例如，MEF2是用于在淋巴系统发育中介导钙信号传导的重要转录因子之一(Pan等，2004 ；Youn和Liu，2000 ；Youn 等，1999)。MEF2调控细胞因子表达和免疫响应。MEF2还调控作为神经元存活和突触重塑的基础的转录程序(Chen 和 C印ko，2009 ；Flavell 等，2006 ；Flavell 和 Greenberg, 2008 ； Flavell 等，2008;Mao 1999 ；Morrow 等，2008 ;Shalizi 等，2006 ;Shalizi 和 Bonni, 2005 ；Yang等，2009)。这些观察表明，调节MEF2功能的小分子可以在心脏肥大和心力衰竭、 自体免疫疾病和移植排斥、神经退行性疾病以及学习力和记忆力的病理性损伤中具有治疗效果(Fischer 等，2007 ；Stefanko 等，2009)。在细胞内部，MEF2的作用包括三个不同步骤(i)转录阻遏；(ii)钙依赖性去阻遏；和(iii)转录激活。MEF2的转录阻遏作用取决于其与各种转录辅阻遏子的相关性，所述转录辅阻遏子具有固有的或相关的组蛋白脱乙酰酶(HDAC)活性。在T细胞中，MEF2结合 Cabin I ,Cabin I 接着与诸如 HDAC1、HADC2 和 HDAC3 等 I 类 HDAC 相连(Youn 和 Liu，2000)。 在肌肉细胞中，MEF2与诸如HDAC4、HDAC5和HDAC9等II类HDAC直接结合，并抑制参与肌肉的发育和适应性响应的特定基因的表达(Chan等，2003 ；Gregoire等，2006 ；Gregoire和 Yang, 2005 ；McKinsey 等，2001，2002 ；Miska 等，1999 ；Sparrow 等，1999)。其 HDAC5 或 HDAC9 已经被敲除的小鼠显示出对肥大刺激的敏感性增加，表明了 II类HDAC在心脏肥大中的重要作用(Potthoff和Olson，2007)。这些数据和其它数据表明，MEF2和II类组蛋白脱乙酰酶(HDAC)、特别是HDAC5和HDAC9，在心肌细胞中是肥大信号的关键介导物。大量的数据表明，MEF2/II类HDAC途径是心脏肥大的潜在治疗靶标。响应于特定的钙信号，Cabinl和HDAC被从MEF2中除去(Potthoff和Olson，
2007)。然后MEF2募集诸如p300和CBP等辅激活子以通过与各种转录激活子和辅激活子结合而启动不同的程序(McKinsey等，2001 ；Sartorelli等，1997 ；Sl印ak等，2001 ；Wei等，
2008)。已经显示p300的少量增加对于诱导MEF2依赖性心脏肥大是充分必要的。MEF2具有由已被良好表征的MADS盒和MEF2特异性结构域组成的高度保守的N末端区(第2位 第93位残基)(Shore和Sharrocks, 1995)。MADS盒/MEF2结构域的功能非常丰富，介导 DNA结合、二聚化和与包括Cabinl、IIa类HDAC和p300/CBP在内的大量MEF2转录伴侣的蛋白-蛋白相互作用(McKinsey等，2001，2002)。已经显示MEF2中的MADS盒/MEF2结构域对于与在II类HDAC和Cabinl中保守的小基序结合是充分必要的。p300和CBP的CH3 结构域也据显示会结合MADS盒/MEF2结构域。虽然本领域可获得MEF2参与各种细胞过程的广泛知识，但是迄今为止由于缺乏合适的分子工具而无法利用该知识。特别地，如何通过小分子调节MEF2的活性一直是个长期存在的挑战。这是因为MEF2是相对较小的转录因子，没有任何明显的酶活性；其主要功能在于结合特定的DNA并且将诸如Cabinl、II类HDAC和p300/CBP等转录辅调控子 (co-regulator)募集至特异性启动子。通常认为该功能模式不具有可药性，或至少非常难以被小分子靶向。所述分子的发现或创造会促进该领域的进展，并且会产生用于MEF2相关疾病的基于机制或基于结构的新治疗应用，所述MEF2相关疾病包括炎症、自体免疫疾病、神经退行性疾病、癌和心血管疾病。本申请描述的发明还可扩展至调节诸如叉状头/翼状螺旋转录因子F0XP3等其它转录因子的活性(Bennett 等，2001 ；Fontenot 等，2003 ；Hori 等，2003 ；Wu 等，2006 ；Zheng 和RudenSky，2007)。F0XP3是对于调控性T细胞(Treg)的发育和功能而言至关重要的关键转录因子。Treg是抑制免疫系统的过度激活所需的特别的T细胞群。通过突变和其它机制造成F0XP3功能的丧失会引起诸如IPEX等致命性自体免疫疾病，而F0XP3或其活性的表达增强可以造成功能受到抑制。F0XP3功能增强在治疗自体免疫疾病和移植排斥时可能是有益的，而F0XP3活性的策略性下调可用于开发基于免疫的抗肿瘤治疗(Zuo等，2007a ； Zuo等，2007b)。因此，结合F0XP3并且调节其与辅阻遏子和辅激活子的相互作用的小分子可能在自体免疫疾病、移植排斥和癌治疗中具有治疗应用。与MEF2类似，F0XP3的功能受包括HAT (例如TIP60)和HDAC(包括I类和II类 HDAC)在内的转录辅调控子的严格调控(Li等，2007)。因此，可以通过本发明所述的方法开发结合F0XP3并且阻断其与辅调控子的相互作用的小分子，所述辅调控子包括诸如组蛋白修饰酶和染色质重塑机制等表观遗传调控子。类似地，靶向转录辅调控子还满足了其挑战的作用。在诸如MEF2等转录因子的转录辅调控子中，II类HDAC是研究最透彻的组。组蛋白脱乙酰酶(HDAC) (EC号3. 5. 1)是一类从位于组蛋白上的ε -N-乙酰基赖氨酸氨基酸除去乙酰基的酶。其作用与组蛋白乙酰转移酶(HAT)的作用相反。现在还将 HDAC蛋白称为赖氨酸脱乙酰酶(KDAC)，以更准确地描述其活性而不是其靶标，其靶标还包括许多非组蛋白。如其名称所表明，HDAC的主要功能之一是从组蛋白除去乙酰基。组蛋白是染色质的主要蛋白成分。它们充当DNA绕其缠绕的轴，并且在基因调控和DNA包装中起重要作用。 组蛋白具有由存在于其赖氨酸和精氨酸氨基酸上的氨基引起的正常带正电的尾部。这些正电荷帮助组蛋白尾部与位于DNA主链上的带负电的磷酸基相互作用并与其结合。DNA和组蛋白之间的连接在调控转录因子接近DNA的能力上充当至关重要的控制机制。DNA和组蛋白之间的强连接限制了被转录因子接近，因此抑制基因转录(Morrison 等，2007)。对组蛋白或DNA进行修饰改变了其连接强度，并进而调节转录活性(Morrison 等，2007)。已经显示共价添加甲基、磷酸基或乙酰基部分改变了核小体状态并由此影响转录。乙酰基向组蛋白上的保守性N-末端赖氨酸残基的ε-氨基的添加引起乙酰化。向组蛋白添加乙酰基减少了带正电的组蛋白和带负电的DNA磷酸主链之间的吸引力，产生更加松弛的和可接近的染色质结构。HAT促进了组蛋白乙酰化，因此据认为是转录激活子。反之，HDAC用于从组蛋白除去乙酰基，由此抑制转录。因此，正是HAT和HDAC活性之间的相互作用主要管理局部染色质结构和基因表达。HDAC通过染色质的脱乙酰化改变全局基因转录。应该注意，HDAC不直接结合DNA序列，而是需要额外的靶基因识别用因子(Morrison 等，2007)。基于功能和DNA序列相似性，存在4种已得到认识的HDAC蛋白亚型(I类 IV 类)。将前两种亚型称为“经典"HDAC，其活性受曲古抑菌素A(TSA)抑制。I类HDAC包括普遍表达的 HDACl、2、3 和 8 (Zhang 和 01 sen，2000)。II 类 HDAC 有两个亚类 IIa 和 IIb，IIa 包括4、5、7和9，而nb包括HDAC6和HDAC10。IIa类享有共同的结构组织，具有羧基端催化域和介导与转录因子的肌细胞增强因子2 (MEF2)家族成员的相互作用的氨基端延伸。HDAC 与通常在细胞核中发现的I类的不同之处还在于其亚细胞定位，nb类主要定位于细胞质中，而IIa类在细胞核和细胞质之间穿梭。与I类HDAC不同，IIa类HDAC是受组织限制的， 在心脏、骨骼肌和脑中具有特别高水平的表达(aiang等，200幻。III类是不受TSA影响的 NAD+依赖性蛋白家族，并且认为IV类是其自身的非典型类别。HDACll归类于V类。考虑到HDAC在细胞过程中所起的重要作用，HDAC抑制剂(HDACi)的医学应用是研究的活跃区域。但是，HDACi的许多用途是在不了解其基础机制时发现的。例如，在精神病学和神经学中，使用丙戊酸作为情绪稳定剂和抗癫痫药有很长的历史。当将丙戊酸用作许多其它作为抗惊厥药而被研究的化合物的载剂时，偶然发现了丙戊酸的抗惊厥性。不久以后将丙戊酸鉴定为HDACi。近年来，HDACi作为缓和剂或用于神经退行性疾病的治疗而被活跃地研究。还付出了大量精力来开发癌治疗用HDACi。例如，最近已经批准伏立诺他 (Vorinostat) (SAHA)用于治疗皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)。用于CTCL的处于临床评价的替代试剂是环状缩酚肽天然产物(Romidepsin)，其是I类HDAC的强效抑制剂。另外，临床实验正在研究丙戊酸对受感染人中的HIV潜伏库的影响。虽然对于HDACi的医学应用的兴趣不断增长，这些化合物工作的确切机制仍未被良好地理解。因此，这些努力很大程度上由猜测和试错实验指导。使用HDACi的一个特别的问题在于大多数已知的抑制HDAC活性的小分子被设计成通过靶向HDAC的催化活性而起作用。但是，由于该活性位点是大量不同的HDAC同种型共有的保守性特征，其天生难以鉴定具有同种型选择性的HDACi。因此，大多数HDACi具有较低的特异性，不能特异性靶向任何特定种类的HDAC。例如，曲古抑菌素A(TSA)是目前已知的最强效的可逆HDACi中的一种，其IC5tl在较低的纳摩尔范围内。具有羟肟酸基团和与苯基连接的五碳原子连接子的TSA具有可适配至HDAC的活性位点内的最佳构象(de Ruijter 等，2003 ；Somoza等，2004)。据认为所有HDAC对于受TSA的抑制具有大致相等的敏感性。因此，发现抑制HDAC的功能并由此调节相关转录因子的活性的小分子的主要障碍，在于目前的现有技术致力于发现和优化已经通过HDACi与HDAC酶的活性位点结合的能力而得到鉴定和评价的HDACi。通常，这些HDACi具有通用结构R-L-Z，其中R是经由较短的脂肪族连接子L连接至Zn2+螯合基团Z的蛋白表面识别基团，Z与活性位点锌原子结合。在已知HDACi中出现的最常见螯合基团(Z)是羟肟酸(TSA、伏立诺他、LAQ824, belinostat)、硫醇衍生物(Π(228、拉格唑拉(Iargazole))或亲电子性酮(trapoxin A)。此类与如Si2+等金属阳离子紧密结合的基团的潜在缺点在于它们对特定的蛋白可能缺乏足够的选择性，从而引起各种副作用。另一类已知的HDACi是特征在于邻氨基酰基苯胺(2-氨基酰基苯胺)部分的苯甲酰胺类，包括MS-725、MG⑶0103、庚二酰基苯胺邻氨基酰基苯胺(PAOA)和化合物 106 (N1- (2-氨基苯基)-N7-对甲苯基庚烷二酰胺)，化合物106经研究认为是包括弗里德赖希氏共济失调和亨廷顿病在内的神经退行性疾病的潜在治疗物(Chou等，2008 ；Herman等， 2006 ；Paris 等，2008 ；Rai 等，2008 ；Thomas 等，2008 ；Wong 等，2003)。虽然该类 HDACi 作用的详细分子机制尚未知，但是据推测这些分子涉及邻氨基酰基苯氨基与HDAC活性位点的锌原子的结合，但是缺乏所述结合基序的任何直接证据。另外，发现所述分子显示的生物活性涉及HDAC功能的抑制，尽管其它非选择性HDACi并未显示出类似的活性。例如，化合物106虽然具有较弱的HDAC抑制，但据显示其非常活跃地诱导frataxin，而诸如SAHA等紧密相关的HDACi不具有这类活性。因此，考虑到该类化合物作用的分子机制的缺乏，妨碍了对其治疗潜能进行优化。由各种HDAC同种型的良好调控生物作用所产生的数种其他因子，对于设计HDACi 的常规方法造成了进一步的挑战。实验显示，在存在HDACi时乙酰化组蛋白的量增加。但是，通过经DNA结合的转录因子进行的HAT和HDAC的募集引起多蛋白转录调控复合物的形成，该多蛋白转录调控复合物赋予细胞类型特异性和对从属基因(subordinate gene)阵列的信号依赖性调控。使用不加区别地抑制HDAC的HDACi类似于将猴子农场(monkey ranch) 掷入复杂且经过精巧平衡的机器中。这解释了在许多涉及HDACi的实验中所观察到的众多不期望的副作用。对HDACi的医学用途进行研究时遇到的问题也是研究表观遗传调控的研究中所共有的。表观遗传调控是不永久性地改变DNA序列而建立可遗传基因表达模式。其已经表现为调控细胞功能的关键机制。表观遗传调控的变化是许多疾病，特别是癌的标志。正在开发的作为治疗这些疾病的药物的小分子通常经由表型筛选发现，其通过调节细胞过程的表观遗传控制起作用。 同样，表观遗传调控的基础机制是令人极为关注的领域。同时，对小分子表观遗传调控剂的搜索正在成为非常有前景的药物发现领域。由于表观遗传调控很大程度上经由通过酶对染色质结构进行的化学修饰而实现， 所述酶作用于DNA(例如DNA胞嘧啶甲基转移酶)或蛋白(例如，HAT、HDAC、组蛋白甲基化酶和组蛋白脱甲基酶)，在该背景下，HDAC调控DNA转录的作用可以视为表观遗传调控的组成部分。与HDACi类似，表观遗传调控剂的大多数现有化学调节剂通过与酶的催化位点结合而抑制这些酶，所述催化位点经常是具有不同细胞作用的多种酶所共有的。虽然关于诸如MEF2等转录因子的作用取得最新进展，并且其涉及数种主要疾病， 但是无法鉴定能够调节MEF2的功能的小分子。所述分子会促进该领域的进展，并且会产生用于MEF2相关疾病的基于机制或基于结构的新型治疗应用，所述MEF2-相关疾病包括炎症、自体免疫疾病、神经退行性疾病、癌和心血管疾病。因此，该研究领域的通常问题是缺乏能够靶向特定的表观遗传调控酶或蛋白的小分子。另一问题还在于缺乏设计、评价和优化所述小分子的方法，其方式在于给予所需选择性而没有由横跨整个酶或蛋白类型的广谱活性引起的相关缺点。所述分子作为研究表观遗传调控的基础机制的分子工具以及作为用于靶向治疗干预的治疗剂会具有重要应用。
发明内容
通过深入的生化和结构研究(Guo等，2007 ；Han等，2005 ；Han等，2003)，本发明人意外地发现了使得可以使用小分子调节MEF2的活性的独特MEF2结构特征。该发现是本发明的核心，因为其违反了常规观点并且开放了各种可能性。基于该意外发现，发明人设计了一种通过经由界面抑制剂阻断转录因子与其辅因子之间的相互作用而调节细胞过程的通用策略。因此，本发明还提供了用于鉴定、筛选、检验和合成能够与位于所述因子-辅因子复合物的界面表面中的位点结合并由此干扰所述复合物的形成的小分子调节剂。因此，本发明已经解决了靶向诸如MEF2等迄今为止“不可药用(undrugable) ”的转录因子的长期存在的问题。关于HDACi所面临的特异性问题，本发明提供了开发具有HDAC功能的小分子调节剂的替代方法。本发明靶向HDAC与调节转录所需的相关转录因子的结合位点，而不是靶向特定HDAC的活性位点。由于不同的HDAC亚型会具有与不同转录因子结合的不同表面，通过靶向这些蛋白-蛋白相互作用的界面，由保守性活性位点造成的特异性问题得以解决。具体而言，本发明针对转录因子MEF2和IIa类HDAC之间的相互作用。MEF2的活性受IIa类HDAC控制，所述IIa类HDAC结合特定启动子上的MEF2，从而抑制靶基因表达(Potthoff和Olson，2007)。正在开发的用于治疗各种癌的HDAC的一些小分子抑制剂 (HDACi)，也在涉及MEF2和HDAC活性的失调的疾病中显示出治疗潜能，所述疾病包括心脏肥大、神经退行性疾病和免疫功能障碍(Morrison等，2007 ；Paris等，2008)。这些观察表明，阻断IIa类HDAC:MEF2相互作用的小分子可能作为成员特异性HDACi提供类似的治疗益处(Guo 等，2007 ；Han 等，2005 ；Han 等，2003)。IIa类HDAC在肌肉细胞、神经元细胞和T细胞中与MEF2密切地起作用。IIa类 HDAC不结合DNA，但依赖于其与经DNA结合的MEF2的相互作用以用于启动子靶向。该相互作用受较短的两亲性螺旋结构介导，该螺旋结构在IIa类HDAC而非其它HDAC中是保守的，且与MEF2的MADS盒/MEF2结构域上的疏水沟结合(Guo等，2007 ；Han等，2005 ；Han等， 2003)。所述配体/受体样结合机制表明，可以使用小分子来阻断IIa类HDAC向MEF2-特异性启动子的募集(Guo等，2007 ；Han等，2005 ；Han等，2003)。本发明基于以下系统结构和生化研究(Guo等，2007 ；Han等，2005 ；Han等，2003)， 该系统结构和生化研究表明与MEF2结合的小分子能够调节其在募集诸如Cabinl、IIa类 HDAC和p300/CBP等转录辅调控子方面的活性。大多数这些辅调控子具有修饰染色质的固有功能(例如HDAC、p300和CBP)或募集染色质修饰酶和机构的能力(例如结合Cabinl、 HPl、CtBP的mSin3A，结合IIa类HDAC的14-3- 。因此，结合MEF2并调节其与其它转录辅调控子的相互作用的小分子，可以充当其中MEF2起关键调控作用的组织中的表观遗传调节子。所以这些小分子可用于治疗其中MEF2依赖性基因表达的活性失调的疾病。失调可由以下引起MEF2和其相关因子的遗传突变、引起MEF2功能的激活不足或激活过度的信号减少或过量、结合并与MEF2相互作用的辅因子的异常表达不足或表达过量。MEF2结合性小分子的潜在临床应用包括但不限于肌肉系统、免疫系统和神经系统的疾病。肌肉系统中的疾病有由MEF2功能不平衡引起的心脏肥大、肌纤维类型重塑和其它肌肉相关疾病。免疫系统中的疾病有各种由MEF2依赖性基因表达过多或过少引起的自体免疫疾病或免疫缺陷。MEF2结合性小分子还可用于操作调控性T细胞的功能和总体免疫应答以避免移植排斥。由于MEF2依赖性基因表达与突触重塑和神经元存活密切相关，MEF2结合性小分子还可用于治疗由MEF2功能失调引起的各种神经退行性疾病(例如阿尔茨海默氏病和亨廷顿病等)、孤独症、精神病以及学习力和记忆力受损。因为本发明的小分子调节剂通过靶向位于转录因子和其辅因子的蛋白-蛋白相互作用界面处的结合位点起作用，本文还将它们称为界面抑制剂。已经解释了本发明的基本原理，现在总结本发明的各方面和实施方式如下在第一方面，本发明提供了用于筛选、鉴定或优化候选界面抑制剂的检验。本发明该方面的检验通常会包括使候选界面抑制剂与评价元件(evaluating element)接触的步骤，所述评价元件包括由蛋白-蛋白界面限定的分子表面，该分子表面包括各MEF2单体的β链S1、S2和S3以及螺旋H2，和来自Cabinl、HDAC4以及HDAC9的较短螺旋基序。在一些优选实施方式中，评价元件与提供关于候选抑制剂的信息的报道元件可操作地结合。在优选实施方式中，所述检验为基于细胞的荧光素酶检验，该荧光素酶检验允许对结合MEF2 并调节其与转录辅调控子结合的小分子进行快速且高通量的筛选和优化。该检验由发明人实验室基于对MEF2复合物进行的长达10年的结构和生化研究而开发。本发明声明，通过晶体学研究首次鉴定、并通过本发明中的结构指导的突变研究进一步证明的蛋白-蛋白界面，可充当对MEF2结合性小分子进行高度特异性和灵敏性筛选的分子基础。其它实施方式中，所述检验的评价元件可以与物理检验或任何体外结合检验和基于细胞荧光素酶报道子检验、基于通过本发明鉴定的蛋白-蛋白界面的转基因报道子检验一起实施，所述物理检验包括但不限于牵出、共免疫沉淀或荧光猝灭和各向异性。在第二方面，本发明还提供在各种哺乳动物组织中可用作MEF2依赖性转录的表观遗传调节剂的化合物，所述哺乳动物组织包括但不限于肌肉系统、免疫系统和神经系统。在一些优选实施方式中，本发明该方面的化合物可以包括但不限于之前公开的化合物 (Chou 等，2008 ；Herman 等，2006 ；Paris 等，2008 ；Rai 等，2008 ；Thomas 等，2008 ；Wong 等， 2003)，庚二酰基苯胺邻氨基酰基苯胺ΡΑ0Α，和市售同系物辛二酰基苯胺邻氨基酰基苯胺 (或BML-210)以及它们的结构相关衍生物。在第三方面，本发明还提供了由位于MEF2上的BML-210结合位点限定的分子框架，该分子框架源自由与MEF2结合的BML-210的晶体结构建立的结构框架，如表1中的晶体结构坐标所示。将BML-210与结合至DNA的MEF2A(1_78) 二聚体共结晶。晶体衍射分辨率为2.4A，并且所述结构通过使用MEF2A(l-78) :DNA复合物作为搜索模型的分子置换来解析(Santelli和Richmond，2000)。BML-210采取延伸构象来结合到MEF2的疏水口袋中 (图Id)。所述分子的一端(苯基酰胺基)被许多疏水残基围绕，所述疏水残基包括Leu66、 Leu67, Thr70, Leu66'(撇号表示来自其它单体的残基)和Thr70'。位于该末端的酰胺基还处在能够参与分别与Thr70和Thr70'的氢键相互作用的位置。在BML-210的另一端， 环-链(ring-link)电子密度处于被Asn73、Gln56 ‘、Asp61'和Asp63'围绕的较为亲水的环境中。该区域对应于邻氨基酰基苯氨基。此处邻氨基酰基苯氨基及其酰胺基与MEF2的残基形成密切的范德华力接触和可能的氢键相互作用(图Id)。辛二酰胺的亚甲基紧贴配合在两个MEF2分子的螺旋H2之间，形成与MEF2残基的主链和侧链的许多接触，所述MEF2 残基大多数具有疏水性(图Id)。基于与MEF2结合的BML-210的晶体结构，本发明人声明， 接触BML-210和PAOA或非常接近接触BML-210和PAOA的表面残基可用于通过基于实验和计算的方法指导MEF2小分子的设计和筛选。这些残基包括所有暴露的位于MEF2的Si、 S2和S3链和螺旋H2上的残基。该结构框，连同与本发明所述的高通量、特异性、灵敏性检验，使得能够快速设计和优化MEF2结合性小分子，所述MEF2结合性小分子包括BML210和 PAOA衍生物以及基于新型分子支架的分子。与本发明所述的MEF2结合的BML-210的晶体结构，除了限定本文所述的小分子MEF2结合位点之外，还首次披露了可能的对于邻氨基酰基苯胺部分的结合位点，所述邻氨基酰基苯胺部分存在于BML-210和其它含苯甲酰胺HDAC 抑制剂中。特别地，该结合位点不同于之前对于该类HDAC抑制剂假定的HDAC酶活性位点。在第四方面，本发明提供了用于与由以上第三方面中的分子框架限定的界面结合位点结合的MEF2结合性小分子。在一个实施方式中，所提供的分子是具有以下结构通式的 MEF2结合性小分子，所述结构通式源自从与MEF2结合的BML-210的晶体结构衍生的经鉴定的结合位点。将所提供的小分子设计成与所述结构折叠体结合，并且有可能会以较高的亲和性和选择性结合MEF2。本发明的该实施方式提供的化合物包括与MEF2结合位点结合的具有通式Ra-L-Rb的化合物，其中Ra是与MEF2结合位点的疏水区结合的识别基团，其选自包括以下基团的组低级烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、烷氧基、芳氧基；烷硫基、芳硫基、或= 0)-、 RcRdN(SO2)-,其中Rc和Rd独立地选自由氢、烷基、烯基、炔基、烷氧基、芳基、杂芳基、烷氨基、二烷基氨基、芳氨基或杂芳基氨基组成的组。L是由至多20个碳原子的链组成的连接子，条件是至多3个碳原子可以被氧、氮或硫原子置换，并且另一条件是其可以包括选自由以下基团组成的组的取代基烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、苯并基(benzo)、羟基、烷氧基、芳氧基、氧杂基 (oxa)、酮基、酰氨基、磺酰氨基或氟。Rb是与MEF2结合位点的亲水区结合的识别基团，其选自包括以下基团的组 低级烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、或ReRdNC ( = 0)-、 RcRdN(SO2)，其中Rc和Rd独立地选自由氢、烷基、烯基、炔基、烷氧基、芳基、杂芳基、烷氨基、二烷基氨基、芳氨基或杂芳基氨基组成的组。在优选的实施方式中，所提供的化合物具有通式结构Ar1-L1-L2-L3-Ar2,其中Ar1 和Ar2独立选自由以下芳香环组成的组的芳香环苯、萘、吡啶、嘧啶、吡嗪、喹啉、异喹啉、吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、批唑、嚅唑、噻唑、异嚅唑、喷哚、苯并咪唑、苯并噻唑、苯并嚅唑，条件是所述芳香环可以含有至多7个选自由以下基团组成的组的取代基氢、烷基、烯基、炔基、 烷氧基、芳基、杂芳基、氨基、烷氨基、二烷基氨基、芳氨基、杂芳基氨基、羟基或商素。所述取代基还能够连接在一起形成至多12个原子的环；L1和L3是独立选自由以下基团组成的组中的连接基团氨基、烷氨基、芳氨基、氧杂基、酮基、NHC( = 0)、NR(C = 0)、S( = 0)或 _S( = 0)2-；L2是选自由至多10个碳原子的链组成的组中的连接基团，条件是至多3个碳原子可以被氧、氮或硫原子置换，并且另一条件是这些原子可以含有选自由以下基团组成的组的取代基烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、苯并基、羟基、烷氧基、芳氧基、氧杂基、酮基、酰氨基、磺酰氨基或氟。在另一优选实施方式中，所提供的化合物具有通式
权利要求
1.一种调节细胞过程的方法，所述方法包括选择与待调节的细胞过程相关的靶转录因子或辅因子；使所述转录因子或辅因子与界面抑制剂接触，其中所述界面抑制剂能够与位于所述转录因子或辅因子和结合伴侣之间的界面上的结合位点选择性结合，由此，干扰所述转录因子或辅因子和所述结合伴侣之间的相互作用。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述转录辅因子是HDAC酶。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述HDAC酶是选自由I类和II类HDAC组成的组中的一种。
4.如权利要求2所述的方法，其中所述HDAC酶是选自由IIa类HDAC组成的组中的一种。
5.如权利要求2所述的方法，其中所述界面结合位点由所述HDAC酶和MEF2之间的界面限定。
6.如权利要求2所述的方法，其中所述界面结合位点由所述HDAC酶和将所述HDAC募集至靶染色质区的辅因子之间的界面限定。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述转录因子选自由MEF2、F0XP3组成的组。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞过程是与转录失调相关的一种细胞过程。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述界面活性剂是具有通式Ra-L-Rb且能够与MEF2 界面结合位点结合的化合物，并且其中Ra是与MEF2结合位点的疏水区结合的识别基团，其选自包括以下基团的组低级烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、或!TRdNC( = 0)-、 RcRdN(SO2)，其中Rc和Rd独立地选自由氢、烷基、烯基、炔基、烷氧基、芳基、杂芳基、烷氨基、二烷基氨基、 芳氨基或杂芳基氨基；L是由至多20个碳原子的链组成的连接子，条件是至多3个碳原子可以被氧、氮或硫原子置换，并且另一条件是L可以包括选自由以下基团组成的组中的取代基烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、苯并基、羟基、烷氧基、芳氧基、氧杂基、酮基、酰氨基、 磺酰氨基或氟；Rb是与MEF2结合位点的亲水区结合的识别基团，其选自包括以下基团的组低级烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、或!TRdNC( = 0)-、 RcRdN(SO2)-,其中Rc和Rd独立地选自由氢、烷基、烯基、炔基、烷氧基、芳基、杂芳基、烷氨基、二烷基氨基、 芳氨基或杂芳基氨基。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述界面活性剂是具有通式Ar1-L1-L2-L3-Ar2且能够与MEF2界面结合位点结合的化合物，并且其中Ar1和Ar2独立选自由以下基团组成的组的芳香环苯、萘、吡啶、嘧啶、吡嗪、喹啉、异喹啉、吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、批唑、嚅唑、噻唑、异嚅唑、喷哚、苯并咪唑、苯并噻唑、苯并嚅唑， 条件是所述芳香环可以含有至多7个选自由以下基团组成的组的取代基氢、烷基、烯基、 炔基、烷氧基、芳基、杂芳基、氨基、烷氨基、二烷基氨基、芳氨基、杂芳基氨基、羟基或卤素； 所述取代基还能够连接在一起形成至多12个原子的环；L1和L3是独立选自由以下基团组成的组的连接基团氨基、烷氨基、芳氨基、氧杂基、酮基、NHC( = 0)、NR(C = 0)、S( = 0)或 _S( = 0)2-；L2是选自由至多10个碳原子的链组成的组的连接基团，条件是至多3个碳原子可以被氧、氮或硫原子置换，并且另一条件是这些原子可以含有选自由以下基团组成的组的取代基烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、苯并基、羟基、烷氧基、芳氧基、氧杂基、酮基、酰氨基、 磺酰氨基或氟。
11.如权利要求1所述的方法，其中所述界面抑制剂是具有以下通式的化合物其中R1 Rki独立选自由以下基团组成的组L1和L3是独立选自由以下基团组成的组中的连接基团氨基、烷氨基、芳氨基、氧杂基、 酮基、NHC( = 0)、NR(C = 0)、S( = 0)或 _S( = 0)2-；L2是选自由至多10个碳原子的链组成的组的连接基团，条件是至多3个碳原子可以被氧、氮或硫原子置换，并且另一条件是这些原子可以含有选自由以下基团组成的组的取代基烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、苯并基、羟基、烷氧基、芳氧基、氧杂基、酮基、酰氨基、磺酰氨基或氟。
12.如权利要求1所述的方法，其中所述界面抑制剂是能够与MEF2界面结合位点结合的化合物，并且所述化合物具有选自由以下式组成的组的式
13.一种治疗罹患与转录因子依赖性失调相关的疾病的患者的方法，所述方法包括 对所述患者施用药理学有效量的界面抑制剂，其中所述界面抑制剂是能够与靶转录因子或其辅因子选择性结合的一种界面抑制剂，其中已知所述转录因子或辅因子与所述疾病过程相关。
14.如权利要求10所述的方法，其中所述疾病是选自移植排斥、炎症、自体免疫疾病、 神经退行性疾病、癌和心血管疾病的一种疾病。
15.如权利要求10所述的方法，其中所述转录因子是将HDAC募集至靶DNA区的一种转录因子。
16.如权利要求12所述的方法，其中所述转录因子选自MEF2、F0XP3或其组合。
17.如权利要求12所述的方法，其中所述转录辅因子是HDAC的成员。
18.如权利要求12所述的方法，其中所述转录辅因子选自由I类和II类HDAC组成的组的一种转录辅因子。
19.如权利要求12所述的方法，其中所述HDAC失调相关疾病是选自由癌、神经退行性疾病、心脏病或其组合组成的组的一种疾病。
20.一种鉴定和优化用于调节所选的转录因子或辅因子与其结合伴侣之间的相互作用的界面抑制剂的方法，所述方法包括a.获得代表所述转录因子或辅因子的晶体结构、或含有功能重要的界面的其部分的一组相对坐标，其中所述坐标代表在所述转录因子或辅因子与其结合伴侣或先导化合物处于复合状态时所述转录因子或辅因子所采取的构象；和b.基于代表所述界面的所述坐标的一部分来设计抑制剂。
21.如权利要求17所述的方法，其中所述转录因子是MEF2或F0XP3。
22.如权利要求17所述的方法，其中所述转录辅因子选自由I类和II类HDAC组成的组。
23.如权利要求17所述的方法，其中所述坐标包含表1中各MEF2单体的β链Si、S2 和S3以及螺旋Η2。
24.如权利要求17所述的方法，其中所述坐标是表1中的坐标。
25.一种用于筛选、鉴定或优化适于用作界面抑制剂的先导化合物的检验，所述检验包括提供评价元件，其中所述评价元件包含分子框架，所述分子框架具有代表转录因子或辅因子的界面结合位点的结构；使测试化合物与所述评价元件接触；和根据来自所述评价元件的预定响应将所述测试化合物鉴定为先导物。
26.如权利要求25所述的检验，其中所述评价元件是双杂交检验系统，所述双杂交检验系统具有与所选的转录因子或辅因子融合的结合域、与所述转录因子或辅因子的结合伴侣融合的激活域、以及报道基因，其中当所述报道信号低于预定水平时，将所述测试化合物鉴定为先导化合物。
27.如权利要求沈所述的检验，其中所述转录因子是MEF2D的成员，并且所述结合伴侣是HDAC的成员。
28.如权利要求沈所述的检验，其中所述转录因子是MEF2D并且所述结合伴侣是HDAC 或其相互作用部分，其中所述相互作用部分包含与MEF2D结合的HDAC4的区段。
29.如权利要求25所述的检验，其中所述转录因子是选自MEF2、F0XP3和其它将HDAC 募集至DNA的类似转录因子中的一种转录因子。
30.一种用于执行权利要求沈所述的检验的试剂盒，所述试剂盒包含编码所述融合的结合域和作用域的载体。
31.一种用于抑制所选HDAC和转录因子之间的结合的化合物，所述化合物具有的结构式选自从由以下结构组成的组中选择的任何结构
32.如权利要求31所述的化合物，其中将所述化合物用作NEF2界面抑制剂。
33.一种用作MEF2界面抑制剂的化合物，所述化合物具有通式Ra-L-Rb且能够与MEF2 界面结合位点结合，其中Ra是与所述MEF2结合位点的疏水区结合的识别基团，其选自包括以下基团的组 低级烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、或RfNW = 0)-、 ITRtlN (SO2)-,其中Rc和Rd独立地选自由氢、烷基、烯基、炔基、烷氧基、芳基、杂芳基、烷氨基、二烷基氨基、 芳氨基或杂芳基氨基；L是由至多20个碳原子的链组成的连接子，条件是至多3个碳原子可以被氧、氮或硫原子置换，并且另一条件是其可以包括选自由以下基团组成的组的取代基烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、苯并基、羟基、烷氧基、芳氧基、氧杂基、酮基、酰氨基、 磺酰氨基或氟；Rb是与所述MEF2结合位点的亲水区结合的识别基团，其选自包括以下基团的组 低级烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、或RfNW = 0)-、 ITRtlN (SO2)-,其中Rc和Rd独立地选自由氢、烷基、烯基、炔基、烷氧基、芳基、杂芳基、烷氨基、二烷基氨基、 芳氨基或杂芳基氨基。
34.一种用作MEF2界面抑制剂的化合物，所述化合物具有通式Ar1-L1-L2-L3-Ar2且能够与MEF2界面结合位点结合，其中Ar1和Ar2独立选自由以下芳香环组成的组的芳香环苯、萘、吡啶、嘧啶、吡嗪、喹啉、异喹啉、批咯、呋喃、噻吩、咪唑、批唑、嗝唑、噻唑、异喁唑、Π引哚、苯并咪唑、苯并噻唑、苯并嘴唑，条件是所述芳香环可以含有至多7个选自由以下基团组成的组的取代基氢、烷基、烯基、炔基、烷氧基、芳基、杂芳基、氨基、烷氨基、二烷基氨基、芳氨基、杂芳基氨基、羟基或卤素；所述取代基还能够连接在一起形成至多12个原子的环；L1和L3是独立选自由以下基团组成的组的连接基团氨基、烷氨基、芳氨基、氧杂基、酮基、NHC( = 0)、NR(C = 0)、S( = 0)或 _S( = 0)2-；L2是选自由至多10个碳原子的链组成的组的连接基团，条件是至多3个碳原子可以被氧、氮或硫原子置换，并且另一条件是这些原子可以含有选自由以下基团组成的组的取代基烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、苯并基、羟基、烷氧基、芳氧基、氧杂基、酮基、酰氨基、 磺酰氨基或氟。
35. 一种用作MEF2界面抑制剂的化合物，所述化合物具有以下通式
36. 一种用于调节HDAC和NEF2之间的相互作用的组合物，所述组合物包含如权利要求 31、33、34、35所述的化合物或其组合。
全文摘要
本发明公开了用于调节转录因子、特别是将表观遗传调控剂(组蛋白修饰酶)募集至特定的DNA启动子的转录因子的功能的方法和组合物。靶向的转录因子包括但不限于肌细胞增强因子(MEF2)、叉状头/翼状螺旋转录因子FOXP3和转录因子GATA3。本发明还公开了MEF2和其相关因子的小分子调节剂以及它们的治疗应用，所述相关因子包括但不限于组蛋白脱乙酰酶(HDAC)、p300/CBP和Cabin1。
文档编号A61P29/00GK102271668SQ200980153697
公开日2011年12月7日 申请日期2009年11月5日 优先权日2008年11月5日
发明者N·加压特拉卡, 尼科斯·A.·佩塔西斯, 陈林, 韩爱东 申请人:南加州大学
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