成骨蛋白复合物的新型施用形式的制作方法
专利名称：成骨蛋白复合物的新型施用形式的制作方法
成骨蛋白复合物的新型施用形式本发明涉及成骨制剂领域，更具体地涉及属于骨形态发生蛋白(BMP)家族的成骨蛋白的制剂。骨形态发生蛋白(BMP)是参与骨诱导机制的生长因子。也称为成骨蛋白(OP)的 BMP 最初于 1965 年由 Urist 进行了表征(Urist MR. Science 1965 ；150,893) 这些从骨密质分离出的蛋白质具有在许多动物中诱导骨形成的能力⑴rist MR. Science 1965 ；150, 893)。BMP以前肽的形式进行表达，后者在翻译后成熟之后，具有104至139个残基的长度。它们彼此之间具有很大的序列同源性并且具有类似的三维结构。特别地，它们具有6个在形成“半胱氨酸结(cysteine knot) ”的分子内二硫键中所牵涉的半胱氨酸残基 (Scheufler C. 2004 J. Mol. Biol. 1999 ；287,103 ；Schlunegger MP,J. Mol. Biol. 1993 ；231, 445)。它们中的某些具有还在导致二聚体形成的分子间二硫键中所牵涉的第7个半胱氨酸 (Scheufler C. 2004 J. Mol. Biol. 1999 ；287 :103)。在其活性形式下，BMP装配成同二聚体，甚至异二聚体，如Israel等人所描述的那样(Israel DI，Growth Factors. 1996 ； 13 (3-4)，291)。二聚体 BMP 与 BMPR 类型的跨膜受体相互作用(Mundy等人，Growth Factors, 2004, 22 (4), 233) 该识别引发尤其牵涉Smad 蛋白的细胞内信号传导级联，如此导致靶基因的激活或抑制。BMP (除了 BMP 1和3夕卜)对于间充质细胞的分化起着直接或间接的作用，导致它们分化为成骨细胞(Cheng H.，J. Bone and Joint Surgery, 2003,85A 1544-1552)。此外， 它们还具有趋化性并且诱导增殖、分化和血管生成。某些重组人BMP，尤其是rhBMP-2和rhBMP_7，清楚地显示出在人中于体内诱导骨形成的能力并且已被批准用于某些医学应用。因此，将重组人BMP-2 (根据国际通用命名为代勃特明-α)配制在以hFUSE 的名称(在美国)和以hductOs 的名称(在欧洲)进行销售的产品中。该产品被指定用于腰椎的融合和胫骨的骨再生(对于称为骨不连合的骨折)。在用于腰椎融合的hFUSE 的情况下，外科手术首先在于用rhBMP-2的溶液浸透胶原海绵，然后将海绵放置入预先植入到椎骨之间的空心支架(LT支架)中。重组人BMP_7(根据国际通用命名为依托特明- α )具有与BMP-2相同的治疗适应症并且构成了两种产品的基础用于胫骨的开放性骨折的0Ρ-1 Implant和用于腰椎融合的0P-1 Putty。0P-1 Implant由待接纳在0.9%盐水溶液中的包含rhBMP-7和胶原的粉末组成。然后，将所获得的糊状物在外科手术期间应用在骨折处。0P-1 Putty以两种粉末的形式存在一种包含rhBMP-7和胶原，另一种包含羧甲基纤维素(CMC)。在外科手术过程中，CMC用0. 9%盐水溶液来重构并与rhBMP-7和胶原相混合。将如此获得的糊状物应用在待处理的部位上。由于其不稳定性以及为了获得包含最小量的成骨蛋白的成骨制剂而出现的需要， 成骨蛋白的施用是一个重要的问题。这是为了避免由这些蛋白质的高浓度而产生的副作用，并且也由于这些蛋白质的价格。已开发和正在开发许多制剂，例如在Seeherman的综述(Seeherman，H.等人，Spine 2002,27(16 Suppl 1)，S16_S23)中提及的那些，在该综述中强调了递送系统的性质
的重要性。所使用的递送系统应当使得能够增加在施用部位处所述蛋白质的停留时间，获得所使用的蛋白质量的完全释放，和避免可以引起扩散至施用部位之外的过于急剧的释放。所使用的递送系统还应当可以用作在待处理的部位处骨生长的基质，而同时使得能够将该骨生长限制在待处理的部位处。目前，在递送系统中采用四种类型的材料天然聚合物、合成聚合物、无机材料以及这些材料的混合物。然而，没有一个所开发的系统使得能够显著地减少BMP的剂量。这尤其要么与制剂中该蛋白质的不稳定性相关，要么与由于支持物的结构而引起的该蛋白质的差的生物利用率相关。关于天然聚合物，使用胶原、乙酰透明质酸、纤维蛋白、壳聚糖、藻酸盐和其他天然多糖。尽管基于重组胶原的海绵使得能够消除该天然聚合物的大部分已知缺点，但在海绵中引入成骨蛋白至今仍不令人满意。以水凝胶形式的其他天然多糖基本上具有过快被吸除的不足之处，除非预先以凝胶的形式进行交联，这导致与前面对于胶原海绵而描述的那些相同的缺点。关于合成聚合物，最经常使用的是聚(α-羟基酸)的聚合物，例如聚交酯(PLA)、 聚乙醇酸交酯(PLG)以及其共聚物(PLGA)。这些聚合物的主要缺点是由于其降解而引起的ρΗ下降以及它们可能诱导的炎症反应。关于无机材料，开发了将磷酸钙与骨诱导蛋白相组合的递送系统。其中，提及基于磷酸钙的陶瓷，例如羟基磷灰石(HAP)和磷酸三钙(TCP)，以及“非陶瓷”磷酸钙类，例如基于磷酸钙的骨水泥(CPC)。自从20世纪70年代以来已知，磷酸钙陶瓷对于骨重构可以具有益处，如在 M. Bohner (Bohner, Μ. , Injury 2000,31 Suppl. 4，37-47)的综述中所提及的那样。但是，承认了，有效的BMP-2剂量在陶瓷中比在胶原海绵中更高。一项在人中的后外侧融合术的临床研究(Boden，S.D.等人，Spine 2002,27(23),2662-2673)报告，在与BCP 颗粒(60% HAP和40% TCP)(由MEDTRONIC S0FAM0R公司开发的产品)一起时BMP-2的剂量GOmg)比在不含磷酸钙的胶原海绵中(iaiig)更高。为了掩盖该缺点，已经基于非陶瓷磷酸钙开发了非常大量的系统，其中包括磷酸钙骨水泥。骨水泥是由Brown和Chow在20世纪80年代发现的，并且符合下述定义“磷酸钙骨水泥由水溶液和一种或多种磷酸钙类构成。当进行混合时，磷酸钙类溶解并且以溶解度更低的磷酸钙的盐而沉淀出来。在沉淀过程中，磷酸钙晶体增大并相互交错，这导致骨水泥的机械刚性”(Bohner，M.，hjury 2000,31 Suppl 4，37-47)。Kim 的文章(Kim，H.D.等人，Methods Mol Biol 2004，238，49-64)描述了由 Etex 公司开发的骨水泥0 3511与81^-2—起进行使用。该新产品很好地导致了基质的骨诱导活性。然而，引入该基质中的BMP-2丧失了其活性的重大部分，这导致必须增加所装入的BMP-2的量。因此，在大鼠中在异位骨形成模型中使用40yg BMP-2的剂量，而在胶原海绵中使用20 μ g BMP-2。这是因为，骨水泥具有两个缺点。首先，作为其前体的磷酸钙类必须预先在与所述蛋白质不相容的条件下合成。因此，在专利US 5650176中描述了对于制备作为α-BSM的化合物之一的无定形磷酸钙而言必需的反应条件。这些条件与所述蛋白质不相容，因为使用了非常大量的氢氧化钠。此外，这些产物需要加强的纯化，因为使用了毒性化合物例如硝酸钙。骨水泥的其他实例，例如由Graftys公司在专利ΕΡ1891984Α1中所描述的那些，是在与所述蛋白质不相容的条件下获得的，因为在合成磷酸钙的过程中使用了二氯甲烷。由 Lisopharm公司在专利US2009/0155320中所描述的骨水泥是在氢氧化钙存在下获得的，这也是与所述蛋白质不相容的。此外，通常地，骨水泥的形成通过使可溶性磷酸钙盐与在大于400 0C下进行处理以使其具有反应性的固体磷酸钙盐进行反应来获得。这两种化合物之间的反应是不受控制的，往往是放热的，并且导致产生具有将该蛋白质隔离在其团块中的整块结构的骨水泥。在专利US563461中提及在固体中存在有“反应性空隙”，而不知道这是否这对于 ΒΜΡ-2的化学稳定性有害。为了减小在所形成的固体的团块中蛋白质的损失，在专利US5650176中描述了， 向反应混合物中添加能够减少骨水泥的“整块”特性的起泡化合物是有利的。尽管有这些改进，但是必须看到，对于在异位大鼠模型中获得骨形成而言必需的蛋白质量仍是很大的。关于混合系统，它们目前还不允许解决上面提及的问题。总之，涉及使用合成聚合物、天然聚合物或者无机材料(例如磷酸钙陶瓷或磷酸钙骨水泥)的在现有技术中所描述的系统，不允许完全符合为骨修复的应用所规定的技术规格。本申请人的功劳是开发出了一种独创的方法，其在于使成骨蛋白与可溶性钙盐和可溶性磷酸盐相接触，这使得能够符合为骨修复的应用所规定的技术规格。该独创的方法使得能够，一方面使该蛋白质沉淀，同时避免在与所存在的反应物接触时的任何化学降解，和另一方面使该蛋白质与不溶性钙盐，优选地磷酸钙共沉淀，所述共沉淀物以分开的形式存在，这非常明显地限制了例如用骨水泥时所观察到的在固体的团块中的损失。因此，本申请人研发出了新的由共沉淀物组成的成骨组合物，所述共沉淀物包含至少一种不溶性钙盐和至少一种在成骨蛋白与多糖之间的复合物，所述共沉淀物以分开的形式存在。这两件事情的结合使得能够获得包含低得多的蛋白质量的非常成骨的制剂。这些新的组合物因此具有包含更低的蛋白质量(这是主要的目标)这样的优点， 这为了减少在患者中在施用后的副作用。此外，它们使得能够通过减少蛋白质的量来降低治疗的成本，因为这些蛋白质是
非常贵的。已知以本申请人名义的临时申请61/129023和61/1四617，其全部内容通过提及而合并入本文中，它们描述和要求保护了包含至少一种成骨蛋白、二价阳离子的可溶性盐和基质的成骨组合物。已知以本申请人名义的临时申请61/129011和61/1四618，其全部内容通过提及而合并入本文中，它们描述和要求保护了包含至少一种成骨蛋白、至少一种血管生成蛋白、 二价阳离子的可溶性盐、任选地阴离子多糖和任选地基质的成骨组合物。已知以本申请人名义的临时申请61/129616和61/1四012，其全部内容通过提及而合并入本文中，它们描述和要求保护了包含至少一种成骨蛋白/阴离子多糖复合物、至少二价的阳离子的可溶性盐和基质的成骨组合物。已知以本申请人名义的临时申请US61/193216，其全部内容通过提及而合并入本文中，它描述和要求保护了包含至少一种成骨蛋白/阴离子多糖复合物、至少二价的阳离子的可溶性盐和形成水凝胶的聚合物的成骨组合物。已知以本申请人名义的于2008年11月6日提交的临时申请US61/193217，其全部内容通过提及而合并入本文中，它描述和要求保护了包含至少一种成骨蛋白、至少二价的阳离子的可溶性盐和形成水凝胶的聚合物的成骨组合物。关于本发明，本申请人还研发出了制备以分开的形式存在的共沉淀物的方法，所述共沉淀物包含至少一种不溶性钙盐和至少一种在成骨蛋白与多糖之间的复合物。本发明还涉及包含所述共沉淀物的制剂、药物产品和医学装置。使得能够实施该方法和获得该共沉淀物的组合物和试剂盒也是下面所描述的发明。所述共沉淀通过下述方式来获得-通过添加钙离子的盐的溶液而沉淀出在阴离子聚合物与成骨蛋白之间的复合物，-通过添加组合物而沉淀出钙离子，该所添加的组合物包含至少一种能够在确定的PH下形成不溶性钙盐的阴离子的可溶性盐。 在一个实施方案中，所述共沉淀物由同时沉淀而得到。在一个实施方案中，所述共沉淀物由顺次沉淀而得到。所述在阴离子聚合物与成骨蛋白之间的复合物通过向成骨蛋白的溶液中添加阴离子多糖的溶液来获得。在一个实施方案中，通过添加可溶性磷酸盐的溶液，以磷酸钙的形式来实施钙盐的沉淀。共沉淀物的性质和形式可以随所接触的溶液的pH而变化，因为磷酸钙盐随pH和随构成该复合物的阴离子多糖和蛋白质而具有不同的固相。本发明涉及由至少一种在成骨蛋白与以其不溶解化形式存在的多糖之间的复合物和至少一种不溶性钙盐构成的共沉淀物，所述共沉淀物以分开的形式存在。在一个实施方案中，所述共沉淀物另外还包含至少一种具有化学吸引和血管生成能力的生长因子。在一个实施方案中，所述不溶性钙盐选自正磷酸钙，其以无水或水合的形式，单独地或作为混合物地。在一个实施方案中，所述共沉淀物另外还包含至少一种选自下列的不溶性钙盐草酸钙、抗坏血酸钙、碳酸钙或硫酸钙。所述不溶性钙盐可以为在阳离子性钙离子与阴离子性离子之间形成的混合盐，所述阴离子性离子例如为单、二或三碱价的磷酸根类，多糖的羧酸根，碳酸根，氢氧化物，和可能的由碱所携带的阴离子。正磷酸钙是由用钙盐中和各种不同酸度的磷酸而得到的盐，并且根据文献，在 25°C下，pKa 从 2. 12 至 12. 67 变化。主要的不溶性正磷酸钙为磷酸二钙(DCP，无水的或二水合的)、磷酸八钙(OCP)、 磷酸三钙(TCP)、磷酸钙型羟基磷灰石(HAP或PCA)和磷酸四钙(TTCP)。所述“阴离子聚合物/成骨蛋白”复合物由在以本申请人名义的申请PCT/ EP2008/059832中所描述的复合物构成。通过添加可溶性钙盐(如在申请FR 08 54621和61/U9616中所描述的)来使它们不溶解化。根据所寻求的效应，任选地在碱存在下来施行该共沉淀，所述碱使得能够将PH调节至预定的值。该共沉淀使得能够获得处于分开状态的固体化学组合物，其尤其使得能够控制包含在该组合物中的成骨蛋白的递送。该处于分开状态的固体化学组合物在环境温度条件下自发地获得，并且其分开状态在体外在生理条件下是稳定的。在一个实施方案中，本发明涉及用于制备成骨植入物的试剂盒，其至少包括a_包含至少一种成骨蛋白的组合物，b_包含至少一种多糖的组合物，C-包含至少一种可溶性钙盐的组合物，d-包含至少一种能够形成不溶性钙盐的阴离子的可溶性盐的组合物。在一个实施方案中，所述试剂盒另外还包含额外的组合物，所述额外的组合物包含至少一种碱。在一个实施方案中，可以将第二种碱添加至组合物b、c或d。这些组合物中的某些可以在共沉淀物形成之前合并，以减少小瓶的数目。在一个实施方案中，该包含成骨蛋白的组合物还可以包含用于形成复合物的多糖。该包含成骨蛋白的组合物或该包含复合物的组合物还可以包含能够形成不溶性钙盐的阴离子的可溶性盐，和/或碱。在一个实施方案中，该包含多糖的组合物还可以包含能够形成不溶性钙盐的阴离子的可溶性盐，和/或碱在一个实施方案中，该包含可溶性钙盐的组合物还可以包含碱。在一个实施方案中，所述试剂盒包括a_包含至少一种成骨蛋白的组合物，b_包含至少一种阴离子多糖和至少一种能够形成不溶性钙盐的阴离子的可溶性盐的组合物，C-包含至少一种可溶性钙盐的组合物，
d-包含至少一种碱的组合物。在该实施方案中，可以将与组合物d的碱相同或不同的第二种碱添加至组合物b 和C。在一个实施方案中，所述试剂盒包括a_包含至少一种成骨蛋白的组合物，b_包含至少一种阴离子多糖的组合物，C-包含至少一种可溶性钙盐和至少一种碱的组合物，d-包含至少一种能够形成不溶性钙盐的阴离子的可溶性盐的组合物。在该实施方案中，可以将与组合物c的碱相同或不同的第二种碱添加至组合物b 和d。在一个实施方案中，所述试剂盒包括a-包含至少一种成骨蛋白的组合物，b-包含至少一种阴离子多糖和至少一种碱的组合物，C-包含至少一种可溶性钙盐的组合物，d-包含至少一种能够形成不溶性钙盐的阴离子的可溶性盐的组合物。在该实施方案中，可以将与组合物b的碱相同或不同的第二种碱添加至组合物c 和d。在一个实施方案中，所述试剂盒包括a_包含至少一种成骨蛋白和至少一种能够形成不溶性钙盐的阴离子的可溶性盐的组合物，b-包含至少一种阴离子多糖的组合物，C-包含至少一种可溶性钙盐的组合物，d-包含至少一种碱的组合物。在该实施方案中，可以将与组合物d的碱相同或不同的第二种碱添加至组合物b 和C。在一个实施方案中，所述试剂盒包括a_包含至少一种成骨蛋白的组合物，b_包含至少一种阴离子多糖的组合物，C-包含至少一种可溶性钙盐的组合物，d-包含至少一种能够形成不溶性钙盐的阴离子的可溶性盐和至少一种碱的组合物。在该实施方案中，可以将与组合物d的碱相同或不同的第二种碱添加至组合物b 和C。在一个实施方案中，所述试剂盒包括a_包含至少一种成骨蛋白的组合物，b_包含至少一种阴离子多糖和至少一种能够形成不溶性钙盐的阴离子的可溶性盐的组合物，C-包含至少一种可溶性钙盐的组合物，d-包含至少一种碱的组合物。
在该实施方案中，可以将与组合物d的碱相同或不同的第二种碱添加至组合物b 和C。在一个实施方案中，所述试剂盒包括a_包含至少一种成骨蛋白的组合物，b_包含至少一种阴离子多糖、至少一种碱和至少一种能够形成不溶性钙盐的阴离子的可溶性盐的组合物，C-包含至少一种可溶性钙盐的组合物。在一个实施方案中，所述试剂盒包括a_包含至少一种“成骨蛋白/阴离子多糖”复合物和至少一种能够形成不溶性钙盐的阴离子的可溶性盐的组合物，b-包含至少一种可溶性钙盐的组合物，C-包含至少一种碱的组合物。在该实施方案中，可以将与组合物c的碱相同或不同的第二种碱添加至其他组合物。在一个实施方案中，所述试剂盒包括a_包含至少一种成骨蛋白的组合物，b_包含至少一种阴离子多糖和至少一种能够形成不溶性钙盐的阴离子的可溶性盐的组合物，C-包含至少一种可溶性钙盐和至少一种碱的组合物。在该实施方案中，可以将与组合物c的碱相同或不同的第二种碱添加至组合物b。在一个实施方案中，所述试剂盒包括a_包含至少一种成骨蛋白的组合物，b_包含至少一种阴离子多糖和至少一种能够形成不溶性钙盐的阴离子的可溶性盐的组合物，C-包含至少一种可溶性钙盐的组合物。在一个实施方案中，所述试剂盒包括a_包含至少一种“成骨蛋白/阴离子多糖”复合物的组合物，b-包含至少一种可溶性钙盐和至少一种碱的组合物，C-包含至少一种能够形成不溶性钙盐的阴离子的可溶性盐的组合物。在该实施方案中，可以将与组合物b的碱相同或不同的第二种碱添加至其他组合物。
在一个实施方案中，所述试剂盒包括a-包含至少一种“成骨蛋白/阴离子多糖”复合物的组合物，b-包含至少一种可溶性钙盐的组合物，C-包含至少一种能够形成不溶性钙盐的阴离子的可溶性盐的组合物。在一个实施方案中，所述试剂盒包括a-包含至少一种“成骨蛋白/阴离子多糖”复合物的组合物，b-包含至少一种可溶性钙盐的组合物，C-包含至少一种能够形成不溶性钙盐的阴离子的可溶性盐和至少一种碱的组合物。在该实施方案中，可以将与組合物c的碱相同或不同的第二种碱添加至其他組合 物。在一个实施方案中，所述试剂盒包括a-包含至少ー种“成骨蛋白/阴离子多糖”复合物和至少ー种能够形成不溶性钙 盐的阴离子的可溶性盐的组合物，b-包含至少ー种可溶性钙盐的组合物。在一个实施方案中，所述试剂盒包括a-包含至少ー种“成骨蛋白/阴离子多糖”复合物和至少ー种能够形成不溶性钙 盐的阴离子的可溶性盐的组合物，b-包含至少ー种可溶性钙盐和至少ー种碱的组合物。在一个实施方案中，所述试剂盒包括a-包含至少ー种“成骨蛋白/阴离子多糖”复合物和至少ー种能够形成不溶性钙 盐的阴离子的可溶性盐和至少ー种碱的组合物，b-包含至少ー种可溶性钙盐的组合物。在一个实施方案中，所述试剂盒包括a-包含至少ー种“成骨蛋白/阴离子多糖”复合物和至少ー种能够形成不溶性钙 盐的阴离子的可溶性盐和至少ー种碱的组合物，b-包含至少ー种可溶性钙盐和至少ー种碱的组合物。在一个实施方案中，该包含至少ー种成骨蛋白的組合物另外还包含至少ー种具有 化学吸引和血管生成能力的生长因子。在一个实施方案中，所述试剂盒另外还包含至少ー种有机基质或无机基质或混合在一个实施方案中，构成该试剂盒的組合物为水溶液。在一个实施方案中，构成该试剂盒的組合物为冻干物。在一个实施方案中，构成该试剂盒的組合物中的某些为冻干物。在该实施方案中，在反应之前，用水或用以溶液形式的其他組合物之一来使所述 冻干物再水化。因此，例如，以冻干物形式的该包含成骨蛋白的組合物可以用该包含阴离子多糖 的溶液，或者用该包含阴离子多糖和能够形成不溶性钙盐的阴离子的可溶性盐和/或碱的 溶液来进行再水化。在一个实施方案中，包含所述沉淀物的制剂、医学装置和药物产品为水性悬浮液。在一个实施方案中，包含所述沉淀物的制剂和药物产品为冻干物。在该实施方案中，在使用之前，用生理盐水或血液来使所述冻干物再水化。“成骨蛋白”是指成骨生长因子或BMP，単独地或与选自具有治疗活性的BMPs (骨 形态发生蛋白)的BMP相組合地。更特别地，所述成骨蛋白选自BMP-2 (代勃特明-a )、BMP_4、BMP-7 (依托特 明-a )、BMP-14和⑶F-5，单独地或相组合地。所使用的BMP为重组人BMP，其根据本领域技术人员已知的技术来获得，或者购自供应商例如 Research Diagnostic Inc. (USA)公司。“具有化学吸引和血管生成能力的生长因子”是指这样的蛋白质，例如PDGF，尤其是 PDGF-BB、VEGF 或 FGF，尤其是 FGF-2。在一个实施方案中，所述成骨蛋白选自BMP-2 (代勃特明-α )、BMP_4、BMP_7 (依托特明-α )、ΒΜΡ_14和⑶F-5，单独地或相组合地；并且所述至少一种具有化学吸引和血管生成能力的生长因子为PDGF。在一个实施方案中，该组合物至少包含ΒΜΡ-2和PDGF-BB。在一个实施方案中，该组合物至少包含ΒΜΡ-7和PDGF-BB。在一个实施方案中，该组合物至少包含⑶F-5和PDGF-BB。在一个实施方案中，所述成骨蛋白选自BMP-2 (代勃特明-α )、BMP_4、BMP_7 (依托特明-α )、ΒΜΡ_14和⑶F-5，单独地或相组合地；并且所述至少一种具有化学吸引和血管生成能力的生长因子为VEGF。在一个实施方案中，所述成骨蛋白选自BMP-2 (代勃特明-α )、BMP_4、BMP_7 (依托特明-α )、ΒΜΡ_14和⑶F-5，单独地或相组合地；并且所述至少一种具有化学吸引和血管生成能力的生长因子为FGF。所述可溶性钙盐为其阴离子选自负氯离子、D-葡糖酸根、甲酸根、D-糖二酸根、乙酸根、L-乳酸根、谷氨酸根或天冬氨酸根的钙盐。 在一个实施方案中，所述可溶性钙盐为氯化钙。“能够与钙离子形成沉淀物的阴离子的可溶性盐”是指这样的可溶性盐，该可溶性盐的阴离子选自包括磷酸根离子Ρ0/-、磷酸氢根离子HPO42-和磷酸二氢根离子H2PO4-的磷酸根类阴离子。在一个实施方案中，另外将选自草酸根阴离子、抗坏血酸根阴离子、碳酸根阴离子或硫酸根阴离子的第二种阴离子添加至该包含磷酸根阴离子的组合物。所述能够与钙离子形成沉淀物的阴离子的可溶性盐选自磷酸钠、草酸钠、抗坏血酸钠、碳酸钠、硫酸钠和碳酸氢钠。“阴离子多糖”是指这样的多糖，其选自通过疏水性衍生物进行官能化的多糖。在一个实施方案中，所述多糖选自多糖衍生物，所述多糖衍生物占多数地包含(1， 4)和/或(1，；3)和/或(1, 类型的糖苷键，通过至少一个色氨酸衍生物进行官能化，如在申请FR08/55567中所描述的。这些多糖占多数地由(1，4)和/或(1，3)和/或(1，2)类型的糖苷键构成。它们可以是中性的，即不携带酸官能团，或者是阴离子的且携带酸官能团。它们通过标注为Trp的至少一个色氨酸衍生物进行官能化所述色氨酸衍生物通过与酸官能团的偶联而嫁接或连接至所述多糖，所述酸官能团可以是阴离子多糖的酸官能团和/或由连接臂R所携带的酸官能团，所述连接臂R通过官能团F而与该多糖相连接，所述官能团F由于连接臂R和该中性或阴离子多糖的-OH官能团之间的偶联而产生，-F为酯官能团、硫酯官能团、酰胺官能团、碳酸酯官能团、氨基甲酸酯官能团、醚官能团、硫醚官能团或胺官能团，-R为包含1-18个碳的链，其任选地是支化的和/或不饱和的，包含一个或多个杂原子，例如0、N和/或S，并且具有至少一个酸官能团，Trp为L-或D-色氨酸衍生物的残基，其从该色氨酸的胺和由基团R所携带的所述至少一个酸和/或由该阴离子多糖所携带的酸之间的偶联而产生。根据本发明，占多数地包含(1，4)、(1,3)和/或(1，2)类型的糖苷键并通过至少一个色氨酸衍生物进行官能化的多糖可以符合下述通式I
权利要求
1.由至少一种在成骨蛋白与以其不溶解化形式存在的阴离子多糖之间的复合物和至少一种不溶性钙盐构成的共沉淀物，所述共沉淀物以分开的形式存在。
2.根据权利要求1的共沉淀物，其特征在于，所述不溶性钙盐选自正磷酸钙，其以无水或水合的形式，单独地或作为混合物地。
3.根据前述权利要求中任一项的共沉淀物，其特征在于，所述共沉淀物另外还包含至少一种选自下列的不溶性钙盐草酸钙、抗坏血酸钙、碳酸钙或硫酸钙。
4.根据权利要求1的共沉淀物，其特征在于，所述不溶性钙盐选自在阳离子性钙离子与阴离子性离子之间形成的混合盐，所述阴离子性离子例如为单、二或三碱价的磷酸根类， 多糖的羧酸根，碳酸根，氢氧化物，和可能的由碱所携带的阴离子。
5.根据前述权利要求中任一项的共沉淀物，其特征在于，所述共沉淀物另外还包含至少一种具有化学吸引和血管生成能力的生长因子。
6.根据前述权利要求中任一项的共沉淀物，其特征在于，所述阴离子多糖选自通过疏水性衍生物进行官能化的多糖。
7.根据前述权利要求中任一项的共沉淀物，其特征在于，所述阴离子多糖选自通式IX 的包含部分地被疏水性醇取代的羧基官能团的多糖
8.根据前述权利要求中任一项的共沉淀物，其特征在于，所述包含羧基官能团的多糖为通式X的合成多糖，其从天然地包含羧基官能团的多糖获得或者从在其上嫁接有至少15个羧基官能团/100个糖单元的中性多糖获得
9.根据权利要求1至6中任一项的共沉淀物，其特征在于，所述阴离子多糖选自这样的阴离子多糖，其占多数地包含(1，4)、(1，；3)和/或(1, 类型的糖苷键，通过至少一个色氨酸衍生物进行官能化，并且符合下述通式I
10.根据权利要求1至6中任一项的共沉淀物，其特征在于，所述阴离子多糖选自下述通式III的经官能化的阴离子多糖
11.根据前述权利要求中任一项的共沉淀物，其特征在于，所述成骨蛋白选自 BMP-2 (代勃特明-α )、BMP-4、BMP-7 (依托特明-α ) ,BMP-14和⑶F_5，单独地或相组合地。
12.根据权利要求5至11中任一项的共沉淀物，其特征在于，所述至少一种具有化学吸引和血管生成能力的生长因子为PDGF。
13.根据权利要求6至12中任一项的共沉淀物，其特征在于，所述共沉淀物至少包含 BMP-2 和 PDGF-BB。
14.根据权利要求6至12中任一项的共沉淀物，其特征在于，所述共沉淀物至少包含 BMP-7 和 PDGF-BB。
15.根据权利要求6至12中任一项的共沉淀物，其特征在于，所述共沉淀物至少包含 ⑶F-5 和 PDGF-BB。
16.根据权利要求6至12中任一项的共沉淀物，其特征在于，所述成骨蛋白选自 BMP-2 (代勃特明-α )、BMP-4、BMP-7 (依托特明-α ) ,BMP-14和⑶F_5，单独地或相组合地；并且所述至少一种具有化学吸引和血管生成能力的生长因子为VEGF。
17.用于制备成骨植入物的试剂盒，其至少包括a-包含至少一种成骨蛋白的组合物，b-包含至少一种多糖的组合物，C"包含至少一种可溶性钙盐的组合物，d-包含至少一种能够形成不溶性钙盐的阴离子的可溶性盐的组合物。
18.根据前一项权利要求的试剂盒，其另外还包含额外的组合物，所述额外的组合物包含至少一种碱。
19.根据前一项权利要求的试剂盒，其另外还包含可以被添加至组合物b、c或d的第二种碱。
20.根据权利要求17至19中任一项的试剂盒，其特征在于，该包含成骨蛋白的组合物还可以包含用于形成复合物的多糖。
21.根据权利要求17至19中任一项的试剂盒，其特征在于，该包含复合物的组合物还可以包含能够形成不溶性钙盐的阴离子的可溶性盐，和/或碱。
22.根据权利要求17至19中任一项的试剂盒，其特征在于，该包含多糖的组合物还可以包含能够形成不溶性钙盐的阴离子的可溶性盐，和/或碱。
23.根据权利要求17至19中任一项的试剂盒，其特征在于，该包含可溶性钙盐的组合物还可以包含碱。
24.试剂盒，其包括a-包含至少一种成骨蛋白的组合物，b_包含至少一种阴离子多糖、至少一种碱和至少一种能够形成不溶性钙盐的阴离子的可溶性盐的组合物，C"包含至少一种可溶性钙盐的组合物。
25.试剂盒，其包括a-包含至少一种成骨蛋白的组合物，b-包含至少一种阴离子多糖和至少一种能够形成不溶性钙盐的阴离子的可溶性盐的组合物，C"包含至少一种可溶性钙盐和至少一种碱的组合物。
26.根据权利要求17至25中任一项的试剂盒，其特征在于，所述阴离子多糖选自通过疏水性衍生物进行官能化的多糖。
27.根据权利要求沈的试剂盒，其特征在于，所述阴离子多糖选自通式IX的包含部分地被疏水性醇取代的羧基官能团的多糖多糖+羧基
28.根据权利要求沈的试剂盒，其特征在于，所述包含羧基官能团的多糖为通式X的合成多糖，其从天然地包含羧基官能团的多糖获得或者从在其上嫁接有至少15个羧基官能团/100个糖单元的中性多糖获得
29.根据权利要求沈的试剂盒，其特征在于，所述阴离子多糖选自这样的阴离子多糖， 其占多数地包含(1，4)、(1,3)和/或(1，2)类型的糖苷键，通过至少一个色氨酸衍生物进行官能化，并且符合下述通式I
30.根据权利要求沈的试剂盒，其特征在于，所述阴离子多糖选自下述通式III的经官能化的阴离子多糖
31.根据权利要求17至30中任一项的试剂盒，其特征在于，所述成骨蛋白选自 BMP-2 (代勃特明-α )、BMP-4、BMP-7 (依托特明-α ) ,BMP-14和⑶F_5，单独地或相组合地。
32.根据权利要求17至30中任一项的试剂盒，其特征在于，所述至少一种具有化学吸引和血管生成能力的生长因子为PDGF。
33.根据权利要求17至30中任一项的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒至少包含 BMP-2 和 PDGF-BB。
34.根据权利要求17至30中任一项的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒至少包含 BMP-7 和 PDGF-BB。
35.根据权利要求17至30中任一项的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒至少包含 GDF-5 和 PDGF-BB。
36.根据权利要求17至30中任一项的试剂盒，其特征在于，所述成骨蛋白选自 BMP-2 (代勃特明-α )、BMP-4、BMP-7 (依托特明-α ) ,BMP-14和⑶F_5，单独地或相组合地； 并且所述至少一种具有化学吸引和血管生成能力的生长因子为VEGF。
37.根据权利要求17至36中任一项的试剂盒，其特征在于，所述可溶性钙盐选自氯化钙、D-葡糖酸钙、甲酸钙、D-糖二酸钙、乙酸钙、L-乳酸钙、谷氨酸钙或天冬氨酸钙。
38.根据权利要求17至36中任一项的试剂盒，其特征在于，所述可溶性钙盐为氯化钙。
39.根据权利要求17至38中任一项的试剂盒，其特征在于，所述能够与钙离子形成沉淀物的阴离子的可溶性盐为这样的可溶性盐，该可溶性盐的阴离子选自包括磷酸根离子 P043_、磷酸氢根离子hpo42_和磷酸二氢根离子H2PO4_的磷酸根类阴离子。
40.根据权利要求17至38中任一项的试剂盒，其特征在于，所述碱选自无机碱或有机碱。
41.根据权利要求40的试剂盒，其特征在于，所述无机碱选自氢氧化钠、碳酸氢钠或碳酸钠。
42.根据权利要求40的试剂盒，其特征在于，所述有机碱选自胺和脱质子化的氨基酸。
43.根据权利要求40的试剂盒，其特征在于，所述有机碱选自咪唑及其衍生物，尤其是组氨酸、脯氨酸、乙醇胺或丝氨酸。
44.根据权利要求17至43中任一项的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒另外还包含至少一种有机基质或无机基质或混合基质。
45.根据权利要求44的试剂盒，其特征在于，所述基质为选自水凝胶和/或基于交联聚合物的基质的有机基质。
46.根据权利要求45的试剂盒，其特征在于，所述水凝胶为通过聚合物链的化学或物理交联而获得的水凝胶。
47.根据权利要求45的试剂盒，其特征在于，所述交联聚合物为经纯化的、经灭菌的且交联的天然胶原。
48.根据权利要求46的试剂盒，其特征在于，所述水凝胶选自合成聚合物的组，其中包括乙二醇和乳酸的共聚物、乙二醇和乙醇酸的共聚物、聚(N-乙烯吡咯烷酮)、聚乙烯酸、以及聚丙烯酰胺和聚丙烯酸。
49.根据权利要求45的试剂盒，其特征在于，所述水凝胶选自天然聚合物的组，其中包括透明质酸、角质素、出芽短梗霉聚糖、果胶、右旋糖酐、纤维素和纤维素衍生物、藻酸、黄原胶、角叉菜聚糖、壳聚糖、软骨素、胶原、明胶、聚赖氨酸、纤维蛋白以及它们的在生物学上可接受的盐。
50.根据权利要求17至50中任一项的试剂盒，其特征在于，构成该试剂盒的组合物为水溶液。
51.根据权利要求17至50中任一项的试剂盒，其特征在于，构成该试剂盒的组合物为冻干物。
52.制备在权利要求1至16中任一项之中所定义的共沉淀物的方法，其包括通过下述方式来获得共沉淀的步骤-通过添加钙离子的盐的溶液而沉淀出在阴离子聚合物与成骨蛋白之间的复合物，-通过添加组合物而沉淀出钙离子，该所添加的组合物包含至少一种能够在确定的PH 下形成不溶性钙盐的阴离子的可溶性盐，所述在阴离子聚合物与成骨蛋白之间的复合物通过向成骨蛋白的溶液中添加阴离子多糖的溶液来获得。
53.根据权利要求52的方法，其特征在于，通过添加可溶性磷酸盐的溶液，以磷酸钙的形式来实施钙盐的沉淀。
全文摘要
本发明涉及由包含至少一种不溶性钙盐和至少一种在成骨蛋白与多糖之间的复合物的共沉淀物组成的成骨组合物，所述共沉淀物以分开的形式存在。本发明还涉及使得能够实施本发明的试剂盒。本发明还涉及制备以分开的形式存在的共沉淀物的方法，所述共沉淀物包含至少一种不溶性钙盐和至少一种在成骨蛋白与多糖之间的复合物。本发明还涉及包含所述共沉淀物的制剂、药物产品和医学装置。
文档编号A61K9/14GK102281868SQ200980154601
公开日2011年12月14日 申请日期2009年11月19日 优先权日2008年11月19日
发明者G·索拉, O·索拉, R·索拉 申请人:阿道恰公司
成骨蛋白复合物的新型施用形式本发明涉及成骨制剂领域，更具体地涉及属于骨形态发生蛋白(BMP)家族的成骨蛋白的制剂。骨形态发生蛋白(BMP)是参与骨诱导机制的生长因子。也称为成骨蛋白(OP)的 BMP 最初于 1965 年由 Urist 进行了表征(Urist MR. Science 1965 ；150,893) 这些从骨密质分离出的蛋白质具有在许多动物中诱导骨形成的能力⑴rist MR. Science 1965 ；150, 893)。BMP以前肽的形式进行表达，后者在翻译后成熟之后，具有104至139个残基的长度。它们彼此之间具有很大的序列同源性并且具有类似的三维结构。特别地，它们具有6个在形成“半胱氨酸结(cysteine knot) ”的分子内二硫键中所牵涉的半胱氨酸残基 (Scheufler C. 2004 J. Mol. Biol. 1999 ；287,103 ；Schlunegger MP,J. Mol. Biol. 1993 ；231, 445)。它们中的某些具有还在导致二聚体形成的分子间二硫键中所牵涉的第7个半胱氨酸 (Scheufler C. 2004 J. Mol. Biol. 1999 ；287 :103)。在其活性形式下，BMP装配成同二聚体，甚至异二聚体，如Israel等人所描述的那样(Israel DI，Growth Factors. 1996 ； 13 (3-4)，291)。二聚体 BMP 与 BMPR 类型的跨膜受体相互作用(Mundy等人，Growth Factors, 2004, 22 (4), 233) 该识别引发尤其牵涉Smad 蛋白的细胞内信号传导级联，如此导致靶基因的激活或抑制。BMP (除了 BMP 1和3夕卜)对于间充质细胞的分化起着直接或间接的作用，导致它们分化为成骨细胞(Cheng H.，J. Bone and Joint Surgery, 2003,85A 1544-1552)。此外， 它们还具有趋化性并且诱导增殖、分化和血管生成。某些重组人BMP，尤其是rhBMP-2和rhBMP_7，清楚地显示出在人中于体内诱导骨形成的能力并且已被批准用于某些医学应用。因此，将重组人BMP-2 (根据国际通用命名为代勃特明-α)配制在以hFUSE 的名称(在美国)和以hductOs 的名称(在欧洲)进行销售的产品中。该产品被指定用于腰椎的融合和胫骨的骨再生(对于称为骨不连合的骨折)。在用于腰椎融合的hFUSE 的情况下，外科手术首先在于用rhBMP-2的溶液浸透胶原海绵，然后将海绵放置入预先植入到椎骨之间的空心支架(LT支架)中。重组人BMP_7(根据国际通用命名为依托特明- α )具有与BMP-2相同的治疗适应症并且构成了两种产品的基础用于胫骨的开放性骨折的0Ρ-1 Implant和用于腰椎融合的0P-1 Putty。0P-1 Implant由待接纳在0.9%盐水溶液中的包含rhBMP-7和胶原的粉末组成。然后，将所获得的糊状物在外科手术期间应用在骨折处。0P-1 Putty以两种粉末的形式存在一种包含rhBMP-7和胶原，另一种包含羧甲基纤维素(CMC)。在外科手术过程中，CMC用0. 9%盐水溶液来重构并与rhBMP-7和胶原相混合。将如此获得的糊状物应用在待处理的部位上。由于其不稳定性以及为了获得包含最小量的成骨蛋白的成骨制剂而出现的需要， 成骨蛋白的施用是一个重要的问题。这是为了避免由这些蛋白质的高浓度而产生的副作用，并且也由于这些蛋白质的价格。已开发和正在开发许多制剂，例如在Seeherman的综述(Seeherman，H.等人，Spine 2002,27(16 Suppl 1)，S16_S23)中提及的那些，在该综述中强调了递送系统的性质
的重要性。所使用的递送系统应当使得能够增加在施用部位处所述蛋白质的停留时间，获得所使用的蛋白质量的完全释放，和避免可以引起扩散至施用部位之外的过于急剧的释放。所使用的递送系统还应当可以用作在待处理的部位处骨生长的基质，而同时使得能够将该骨生长限制在待处理的部位处。目前，在递送系统中采用四种类型的材料天然聚合物、合成聚合物、无机材料以及这些材料的混合物。然而，没有一个所开发的系统使得能够显著地减少BMP的剂量。这尤其要么与制剂中该蛋白质的不稳定性相关，要么与由于支持物的结构而引起的该蛋白质的差的生物利用率相关。关于天然聚合物，使用胶原、乙酰透明质酸、纤维蛋白、壳聚糖、藻酸盐和其他天然多糖。尽管基于重组胶原的海绵使得能够消除该天然聚合物的大部分已知缺点，但在海绵中引入成骨蛋白至今仍不令人满意。以水凝胶形式的其他天然多糖基本上具有过快被吸除的不足之处，除非预先以凝胶的形式进行交联，这导致与前面对于胶原海绵而描述的那些相同的缺点。关于合成聚合物，最经常使用的是聚(α-羟基酸)的聚合物，例如聚交酯(PLA)、 聚乙醇酸交酯(PLG)以及其共聚物(PLGA)。这些聚合物的主要缺点是由于其降解而引起的ρΗ下降以及它们可能诱导的炎症反应。关于无机材料，开发了将磷酸钙与骨诱导蛋白相组合的递送系统。其中，提及基于磷酸钙的陶瓷，例如羟基磷灰石(HAP)和磷酸三钙(TCP)，以及“非陶瓷”磷酸钙类，例如基于磷酸钙的骨水泥(CPC)。自从20世纪70年代以来已知，磷酸钙陶瓷对于骨重构可以具有益处，如在 M. Bohner (Bohner, Μ. , Injury 2000,31 Suppl. 4，37-47)的综述中所提及的那样。但是，承认了，有效的BMP-2剂量在陶瓷中比在胶原海绵中更高。一项在人中的后外侧融合术的临床研究(Boden，S.D.等人，Spine 2002,27(23),2662-2673)报告，在与BCP 颗粒(60% HAP和40% TCP)(由MEDTRONIC S0FAM0R公司开发的产品)一起时BMP-2的剂量GOmg)比在不含磷酸钙的胶原海绵中(iaiig)更高。为了掩盖该缺点，已经基于非陶瓷磷酸钙开发了非常大量的系统，其中包括磷酸钙骨水泥。骨水泥是由Brown和Chow在20世纪80年代发现的，并且符合下述定义“磷酸钙骨水泥由水溶液和一种或多种磷酸钙类构成。当进行混合时，磷酸钙类溶解并且以溶解度更低的磷酸钙的盐而沉淀出来。在沉淀过程中，磷酸钙晶体增大并相互交错，这导致骨水泥的机械刚性”(Bohner，M.，hjury 2000,31 Suppl 4，37-47)。Kim 的文章(Kim，H.D.等人，Methods Mol Biol 2004，238，49-64)描述了由 Etex 公司开发的骨水泥0 3511与81^-2—起进行使用。该新产品很好地导致了基质的骨诱导活性。然而，引入该基质中的BMP-2丧失了其活性的重大部分，这导致必须增加所装入的BMP-2的量。因此，在大鼠中在异位骨形成模型中使用40yg BMP-2的剂量，而在胶原海绵中使用20 μ g BMP-2。这是因为，骨水泥具有两个缺点。首先，作为其前体的磷酸钙类必须预先在与所述蛋白质不相容的条件下合成。因此，在专利US 5650176中描述了对于制备作为α-BSM的化合物之一的无定形磷酸钙而言必需的反应条件。这些条件与所述蛋白质不相容，因为使用了非常大量的氢氧化钠。此外，这些产物需要加强的纯化，因为使用了毒性化合物例如硝酸钙。骨水泥的其他实例，例如由Graftys公司在专利ΕΡ1891984Α1中所描述的那些，是在与所述蛋白质不相容的条件下获得的，因为在合成磷酸钙的过程中使用了二氯甲烷。由 Lisopharm公司在专利US2009/0155320中所描述的骨水泥是在氢氧化钙存在下获得的，这也是与所述蛋白质不相容的。此外，通常地，骨水泥的形成通过使可溶性磷酸钙盐与在大于400 0C下进行处理以使其具有反应性的固体磷酸钙盐进行反应来获得。这两种化合物之间的反应是不受控制的，往往是放热的，并且导致产生具有将该蛋白质隔离在其团块中的整块结构的骨水泥。在专利US563461中提及在固体中存在有“反应性空隙”，而不知道这是否这对于 ΒΜΡ-2的化学稳定性有害。为了减小在所形成的固体的团块中蛋白质的损失，在专利US5650176中描述了， 向反应混合物中添加能够减少骨水泥的“整块”特性的起泡化合物是有利的。尽管有这些改进，但是必须看到，对于在异位大鼠模型中获得骨形成而言必需的蛋白质量仍是很大的。关于混合系统，它们目前还不允许解决上面提及的问题。总之，涉及使用合成聚合物、天然聚合物或者无机材料(例如磷酸钙陶瓷或磷酸钙骨水泥)的在现有技术中所描述的系统，不允许完全符合为骨修复的应用所规定的技术规格。本申请人的功劳是开发出了一种独创的方法，其在于使成骨蛋白与可溶性钙盐和可溶性磷酸盐相接触，这使得能够符合为骨修复的应用所规定的技术规格。该独创的方法使得能够，一方面使该蛋白质沉淀，同时避免在与所存在的反应物接触时的任何化学降解，和另一方面使该蛋白质与不溶性钙盐，优选地磷酸钙共沉淀，所述共沉淀物以分开的形式存在，这非常明显地限制了例如用骨水泥时所观察到的在固体的团块中的损失。因此，本申请人研发出了新的由共沉淀物组成的成骨组合物，所述共沉淀物包含至少一种不溶性钙盐和至少一种在成骨蛋白与多糖之间的复合物，所述共沉淀物以分开的形式存在。这两件事情的结合使得能够获得包含低得多的蛋白质量的非常成骨的制剂。这些新的组合物因此具有包含更低的蛋白质量(这是主要的目标)这样的优点， 这为了减少在患者中在施用后的副作用。此外，它们使得能够通过减少蛋白质的量来降低治疗的成本，因为这些蛋白质是
非常贵的。已知以本申请人名义的临时申请61/129023和61/1四617，其全部内容通过提及而合并入本文中，它们描述和要求保护了包含至少一种成骨蛋白、二价阳离子的可溶性盐和基质的成骨组合物。已知以本申请人名义的临时申请61/129011和61/1四618，其全部内容通过提及而合并入本文中，它们描述和要求保护了包含至少一种成骨蛋白、至少一种血管生成蛋白、 二价阳离子的可溶性盐、任选地阴离子多糖和任选地基质的成骨组合物。已知以本申请人名义的临时申请61/129616和61/1四012，其全部内容通过提及而合并入本文中，它们描述和要求保护了包含至少一种成骨蛋白/阴离子多糖复合物、至少二价的阳离子的可溶性盐和基质的成骨组合物。已知以本申请人名义的临时申请US61/193216，其全部内容通过提及而合并入本文中，它描述和要求保护了包含至少一种成骨蛋白/阴离子多糖复合物、至少二价的阳离子的可溶性盐和形成水凝胶的聚合物的成骨组合物。已知以本申请人名义的于2008年11月6日提交的临时申请US61/193217，其全部内容通过提及而合并入本文中，它描述和要求保护了包含至少一种成骨蛋白、至少二价的阳离子的可溶性盐和形成水凝胶的聚合物的成骨组合物。关于本发明，本申请人还研发出了制备以分开的形式存在的共沉淀物的方法，所述共沉淀物包含至少一种不溶性钙盐和至少一种在成骨蛋白与多糖之间的复合物。本发明还涉及包含所述共沉淀物的制剂、药物产品和医学装置。使得能够实施该方法和获得该共沉淀物的组合物和试剂盒也是下面所描述的发明。所述共沉淀通过下述方式来获得-通过添加钙离子的盐的溶液而沉淀出在阴离子聚合物与成骨蛋白之间的复合物，-通过添加组合物而沉淀出钙离子，该所添加的组合物包含至少一种能够在确定的PH下形成不溶性钙盐的阴离子的可溶性盐。 在一个实施方案中，所述共沉淀物由同时沉淀而得到。在一个实施方案中，所述共沉淀物由顺次沉淀而得到。所述在阴离子聚合物与成骨蛋白之间的复合物通过向成骨蛋白的溶液中添加阴离子多糖的溶液来获得。在一个实施方案中，通过添加可溶性磷酸盐的溶液，以磷酸钙的形式来实施钙盐的沉淀。共沉淀物的性质和形式可以随所接触的溶液的pH而变化，因为磷酸钙盐随pH和随构成该复合物的阴离子多糖和蛋白质而具有不同的固相。本发明涉及由至少一种在成骨蛋白与以其不溶解化形式存在的多糖之间的复合物和至少一种不溶性钙盐构成的共沉淀物，所述共沉淀物以分开的形式存在。在一个实施方案中，所述共沉淀物另外还包含至少一种具有化学吸引和血管生成能力的生长因子。在一个实施方案中，所述不溶性钙盐选自正磷酸钙，其以无水或水合的形式，单独地或作为混合物地。在一个实施方案中，所述共沉淀物另外还包含至少一种选自下列的不溶性钙盐草酸钙、抗坏血酸钙、碳酸钙或硫酸钙。所述不溶性钙盐可以为在阳离子性钙离子与阴离子性离子之间形成的混合盐，所述阴离子性离子例如为单、二或三碱价的磷酸根类，多糖的羧酸根，碳酸根，氢氧化物，和可能的由碱所携带的阴离子。正磷酸钙是由用钙盐中和各种不同酸度的磷酸而得到的盐，并且根据文献，在 25°C下，pKa 从 2. 12 至 12. 67 变化。主要的不溶性正磷酸钙为磷酸二钙(DCP，无水的或二水合的)、磷酸八钙(OCP)、 磷酸三钙(TCP)、磷酸钙型羟基磷灰石(HAP或PCA)和磷酸四钙(TTCP)。所述“阴离子聚合物/成骨蛋白”复合物由在以本申请人名义的申请PCT/ EP2008/059832中所描述的复合物构成。通过添加可溶性钙盐(如在申请FR 08 54621和61/U9616中所描述的)来使它们不溶解化。根据所寻求的效应，任选地在碱存在下来施行该共沉淀，所述碱使得能够将PH调节至预定的值。该共沉淀使得能够获得处于分开状态的固体化学组合物，其尤其使得能够控制包含在该组合物中的成骨蛋白的递送。该处于分开状态的固体化学组合物在环境温度条件下自发地获得，并且其分开状态在体外在生理条件下是稳定的。在一个实施方案中，本发明涉及用于制备成骨植入物的试剂盒，其至少包括a_包含至少一种成骨蛋白的组合物，b_包含至少一种多糖的组合物，C-包含至少一种可溶性钙盐的组合物，d-包含至少一种能够形成不溶性钙盐的阴离子的可溶性盐的组合物。在一个实施方案中，所述试剂盒另外还包含额外的组合物，所述额外的组合物包含至少一种碱。在一个实施方案中，可以将第二种碱添加至组合物b、c或d。这些组合物中的某些可以在共沉淀物形成之前合并，以减少小瓶的数目。在一个实施方案中，该包含成骨蛋白的组合物还可以包含用于形成复合物的多糖。该包含成骨蛋白的组合物或该包含复合物的组合物还可以包含能够形成不溶性钙盐的阴离子的可溶性盐，和/或碱。在一个实施方案中，该包含多糖的组合物还可以包含能够形成不溶性钙盐的阴离子的可溶性盐，和/或碱在一个实施方案中，该包含可溶性钙盐的组合物还可以包含碱。在一个实施方案中，所述试剂盒包括a_包含至少一种成骨蛋白的组合物，b_包含至少一种阴离子多糖和至少一种能够形成不溶性钙盐的阴离子的可溶性盐的组合物，C-包含至少一种可溶性钙盐的组合物，
d-包含至少一种碱的组合物。在该实施方案中，可以将与组合物d的碱相同或不同的第二种碱添加至组合物b 和C。在一个实施方案中，所述试剂盒包括a_包含至少一种成骨蛋白的组合物，b_包含至少一种阴离子多糖的组合物，C-包含至少一种可溶性钙盐和至少一种碱的组合物，d-包含至少一种能够形成不溶性钙盐的阴离子的可溶性盐的组合物。在该实施方案中，可以将与组合物c的碱相同或不同的第二种碱添加至组合物b 和d。在一个实施方案中，所述试剂盒包括a-包含至少一种成骨蛋白的组合物，b-包含至少一种阴离子多糖和至少一种碱的组合物，C-包含至少一种可溶性钙盐的组合物，d-包含至少一种能够形成不溶性钙盐的阴离子的可溶性盐的组合物。在该实施方案中，可以将与组合物b的碱相同或不同的第二种碱添加至组合物c 和d。在一个实施方案中，所述试剂盒包括a_包含至少一种成骨蛋白和至少一种能够形成不溶性钙盐的阴离子的可溶性盐的组合物，b-包含至少一种阴离子多糖的组合物，C-包含至少一种可溶性钙盐的组合物，d-包含至少一种碱的组合物。在该实施方案中，可以将与组合物d的碱相同或不同的第二种碱添加至组合物b 和C。在一个实施方案中，所述试剂盒包括a_包含至少一种成骨蛋白的组合物，b_包含至少一种阴离子多糖的组合物，C-包含至少一种可溶性钙盐的组合物，d-包含至少一种能够形成不溶性钙盐的阴离子的可溶性盐和至少一种碱的组合物。在该实施方案中，可以将与组合物d的碱相同或不同的第二种碱添加至组合物b 和C。在一个实施方案中，所述试剂盒包括a_包含至少一种成骨蛋白的组合物，b_包含至少一种阴离子多糖和至少一种能够形成不溶性钙盐的阴离子的可溶性盐的组合物，C-包含至少一种可溶性钙盐的组合物，d-包含至少一种碱的组合物。
在该实施方案中，可以将与组合物d的碱相同或不同的第二种碱添加至组合物b 和C。在一个实施方案中，所述试剂盒包括a_包含至少一种成骨蛋白的组合物，b_包含至少一种阴离子多糖、至少一种碱和至少一种能够形成不溶性钙盐的阴离子的可溶性盐的组合物，C-包含至少一种可溶性钙盐的组合物。在一个实施方案中，所述试剂盒包括a_包含至少一种“成骨蛋白/阴离子多糖”复合物和至少一种能够形成不溶性钙盐的阴离子的可溶性盐的组合物，b-包含至少一种可溶性钙盐的组合物，C-包含至少一种碱的组合物。在该实施方案中，可以将与组合物c的碱相同或不同的第二种碱添加至其他组合物。在一个实施方案中，所述试剂盒包括a_包含至少一种成骨蛋白的组合物，b_包含至少一种阴离子多糖和至少一种能够形成不溶性钙盐的阴离子的可溶性盐的组合物，C-包含至少一种可溶性钙盐和至少一种碱的组合物。在该实施方案中，可以将与组合物c的碱相同或不同的第二种碱添加至组合物b。在一个实施方案中，所述试剂盒包括a_包含至少一种成骨蛋白的组合物，b_包含至少一种阴离子多糖和至少一种能够形成不溶性钙盐的阴离子的可溶性盐的组合物，C-包含至少一种可溶性钙盐的组合物。在一个实施方案中，所述试剂盒包括a_包含至少一种“成骨蛋白/阴离子多糖”复合物的组合物，b-包含至少一种可溶性钙盐和至少一种碱的组合物，C-包含至少一种能够形成不溶性钙盐的阴离子的可溶性盐的组合物。在该实施方案中，可以将与组合物b的碱相同或不同的第二种碱添加至其他组合物。
在一个实施方案中，所述试剂盒包括a-包含至少一种“成骨蛋白/阴离子多糖”复合物的组合物，b-包含至少一种可溶性钙盐的组合物，C-包含至少一种能够形成不溶性钙盐的阴离子的可溶性盐的组合物。在一个实施方案中，所述试剂盒包括a-包含至少一种“成骨蛋白/阴离子多糖”复合物的组合物，b-包含至少一种可溶性钙盐的组合物，C-包含至少一种能够形成不溶性钙盐的阴离子的可溶性盐和至少一种碱的组合物。在该实施方案中，可以将与組合物c的碱相同或不同的第二种碱添加至其他組合 物。在一个实施方案中，所述试剂盒包括a-包含至少ー种“成骨蛋白/阴离子多糖”复合物和至少ー种能够形成不溶性钙 盐的阴离子的可溶性盐的组合物，b-包含至少ー种可溶性钙盐的组合物。在一个实施方案中，所述试剂盒包括a-包含至少ー种“成骨蛋白/阴离子多糖”复合物和至少ー种能够形成不溶性钙 盐的阴离子的可溶性盐的组合物，b-包含至少ー种可溶性钙盐和至少ー种碱的组合物。在一个实施方案中，所述试剂盒包括a-包含至少ー种“成骨蛋白/阴离子多糖”复合物和至少ー种能够形成不溶性钙 盐的阴离子的可溶性盐和至少ー种碱的组合物，b-包含至少ー种可溶性钙盐的组合物。在一个实施方案中，所述试剂盒包括a-包含至少ー种“成骨蛋白/阴离子多糖”复合物和至少ー种能够形成不溶性钙 盐的阴离子的可溶性盐和至少ー种碱的组合物，b-包含至少ー种可溶性钙盐和至少ー种碱的组合物。在一个实施方案中，该包含至少ー种成骨蛋白的組合物另外还包含至少ー种具有 化学吸引和血管生成能力的生长因子。在一个实施方案中，所述试剂盒另外还包含至少ー种有机基质或无机基质或混合在一个实施方案中，构成该试剂盒的組合物为水溶液。在一个实施方案中，构成该试剂盒的組合物为冻干物。在一个实施方案中，构成该试剂盒的組合物中的某些为冻干物。在该实施方案中，在反应之前，用水或用以溶液形式的其他組合物之一来使所述 冻干物再水化。因此，例如，以冻干物形式的该包含成骨蛋白的組合物可以用该包含阴离子多糖 的溶液，或者用该包含阴离子多糖和能够形成不溶性钙盐的阴离子的可溶性盐和/或碱的 溶液来进行再水化。在一个实施方案中，包含所述沉淀物的制剂、医学装置和药物产品为水性悬浮液。在一个实施方案中，包含所述沉淀物的制剂和药物产品为冻干物。在该实施方案中，在使用之前，用生理盐水或血液来使所述冻干物再水化。“成骨蛋白”是指成骨生长因子或BMP，単独地或与选自具有治疗活性的BMPs (骨 形态发生蛋白)的BMP相組合地。更特别地，所述成骨蛋白选自BMP-2 (代勃特明-a )、BMP_4、BMP-7 (依托特 明-a )、BMP-14和⑶F-5，单独地或相组合地。所使用的BMP为重组人BMP，其根据本领域技术人员已知的技术来获得，或者购自供应商例如 Research Diagnostic Inc. (USA)公司。“具有化学吸引和血管生成能力的生长因子”是指这样的蛋白质，例如PDGF，尤其是 PDGF-BB、VEGF 或 FGF，尤其是 FGF-2。在一个实施方案中，所述成骨蛋白选自BMP-2 (代勃特明-α )、BMP_4、BMP_7 (依托特明-α )、ΒΜΡ_14和⑶F-5，单独地或相组合地；并且所述至少一种具有化学吸引和血管生成能力的生长因子为PDGF。在一个实施方案中，该组合物至少包含ΒΜΡ-2和PDGF-BB。在一个实施方案中，该组合物至少包含ΒΜΡ-7和PDGF-BB。在一个实施方案中，该组合物至少包含⑶F-5和PDGF-BB。在一个实施方案中，所述成骨蛋白选自BMP-2 (代勃特明-α )、BMP_4、BMP_7 (依托特明-α )、ΒΜΡ_14和⑶F-5，单独地或相组合地；并且所述至少一种具有化学吸引和血管生成能力的生长因子为VEGF。在一个实施方案中，所述成骨蛋白选自BMP-2 (代勃特明-α )、BMP_4、BMP_7 (依托特明-α )、ΒΜΡ_14和⑶F-5，单独地或相组合地；并且所述至少一种具有化学吸引和血管生成能力的生长因子为FGF。所述可溶性钙盐为其阴离子选自负氯离子、D-葡糖酸根、甲酸根、D-糖二酸根、乙酸根、L-乳酸根、谷氨酸根或天冬氨酸根的钙盐。 在一个实施方案中，所述可溶性钙盐为氯化钙。“能够与钙离子形成沉淀物的阴离子的可溶性盐”是指这样的可溶性盐，该可溶性盐的阴离子选自包括磷酸根离子Ρ0/-、磷酸氢根离子HPO42-和磷酸二氢根离子H2PO4-的磷酸根类阴离子。在一个实施方案中，另外将选自草酸根阴离子、抗坏血酸根阴离子、碳酸根阴离子或硫酸根阴离子的第二种阴离子添加至该包含磷酸根阴离子的组合物。所述能够与钙离子形成沉淀物的阴离子的可溶性盐选自磷酸钠、草酸钠、抗坏血酸钠、碳酸钠、硫酸钠和碳酸氢钠。“阴离子多糖”是指这样的多糖，其选自通过疏水性衍生物进行官能化的多糖。在一个实施方案中，所述多糖选自多糖衍生物，所述多糖衍生物占多数地包含(1， 4)和/或(1，；3)和/或(1, 类型的糖苷键，通过至少一个色氨酸衍生物进行官能化，如在申请FR08/55567中所描述的。这些多糖占多数地由(1，4)和/或(1，3)和/或(1，2)类型的糖苷键构成。它们可以是中性的，即不携带酸官能团，或者是阴离子的且携带酸官能团。它们通过标注为Trp的至少一个色氨酸衍生物进行官能化所述色氨酸衍生物通过与酸官能团的偶联而嫁接或连接至所述多糖，所述酸官能团可以是阴离子多糖的酸官能团和/或由连接臂R所携带的酸官能团，所述连接臂R通过官能团F而与该多糖相连接，所述官能团F由于连接臂R和该中性或阴离子多糖的-OH官能团之间的偶联而产生，-F为酯官能团、硫酯官能团、酰胺官能团、碳酸酯官能团、氨基甲酸酯官能团、醚官能团、硫醚官能团或胺官能团，-R为包含1-18个碳的链，其任选地是支化的和/或不饱和的，包含一个或多个杂原子，例如0、N和/或S，并且具有至少一个酸官能团，Trp为L-或D-色氨酸衍生物的残基，其从该色氨酸的胺和由基团R所携带的所述至少一个酸和/或由该阴离子多糖所携带的酸之间的偶联而产生。根据本发明，占多数地包含(1，4)、(1,3)和/或(1，2)类型的糖苷键并通过至少一个色氨酸衍生物进行官能化的多糖可以符合下述通式I
权利要求
1.由至少一种在成骨蛋白与以其不溶解化形式存在的阴离子多糖之间的复合物和至少一种不溶性钙盐构成的共沉淀物，所述共沉淀物以分开的形式存在。
2.根据权利要求1的共沉淀物，其特征在于，所述不溶性钙盐选自正磷酸钙，其以无水或水合的形式，单独地或作为混合物地。
3.根据前述权利要求中任一项的共沉淀物，其特征在于，所述共沉淀物另外还包含至少一种选自下列的不溶性钙盐草酸钙、抗坏血酸钙、碳酸钙或硫酸钙。
4.根据权利要求1的共沉淀物，其特征在于，所述不溶性钙盐选自在阳离子性钙离子与阴离子性离子之间形成的混合盐，所述阴离子性离子例如为单、二或三碱价的磷酸根类， 多糖的羧酸根，碳酸根，氢氧化物，和可能的由碱所携带的阴离子。
5.根据前述权利要求中任一项的共沉淀物，其特征在于，所述共沉淀物另外还包含至少一种具有化学吸引和血管生成能力的生长因子。
6.根据前述权利要求中任一项的共沉淀物，其特征在于，所述阴离子多糖选自通过疏水性衍生物进行官能化的多糖。
7.根据前述权利要求中任一项的共沉淀物，其特征在于，所述阴离子多糖选自通式IX 的包含部分地被疏水性醇取代的羧基官能团的多糖
8.根据前述权利要求中任一项的共沉淀物，其特征在于，所述包含羧基官能团的多糖为通式X的合成多糖，其从天然地包含羧基官能团的多糖获得或者从在其上嫁接有至少15个羧基官能团/100个糖单元的中性多糖获得
9.根据权利要求1至6中任一项的共沉淀物，其特征在于，所述阴离子多糖选自这样的阴离子多糖，其占多数地包含(1，4)、(1，；3)和/或(1, 类型的糖苷键，通过至少一个色氨酸衍生物进行官能化，并且符合下述通式I
10.根据权利要求1至6中任一项的共沉淀物，其特征在于，所述阴离子多糖选自下述通式III的经官能化的阴离子多糖
11.根据前述权利要求中任一项的共沉淀物，其特征在于，所述成骨蛋白选自 BMP-2 (代勃特明-α )、BMP-4、BMP-7 (依托特明-α ) ,BMP-14和⑶F_5，单独地或相组合地。
12.根据权利要求5至11中任一项的共沉淀物，其特征在于，所述至少一种具有化学吸引和血管生成能力的生长因子为PDGF。
13.根据权利要求6至12中任一项的共沉淀物，其特征在于，所述共沉淀物至少包含 BMP-2 和 PDGF-BB。
14.根据权利要求6至12中任一项的共沉淀物，其特征在于，所述共沉淀物至少包含 BMP-7 和 PDGF-BB。
15.根据权利要求6至12中任一项的共沉淀物，其特征在于，所述共沉淀物至少包含 ⑶F-5 和 PDGF-BB。
16.根据权利要求6至12中任一项的共沉淀物，其特征在于，所述成骨蛋白选自 BMP-2 (代勃特明-α )、BMP-4、BMP-7 (依托特明-α ) ,BMP-14和⑶F_5，单独地或相组合地；并且所述至少一种具有化学吸引和血管生成能力的生长因子为VEGF。
17.用于制备成骨植入物的试剂盒，其至少包括a-包含至少一种成骨蛋白的组合物，b-包含至少一种多糖的组合物，C"包含至少一种可溶性钙盐的组合物，d-包含至少一种能够形成不溶性钙盐的阴离子的可溶性盐的组合物。
18.根据前一项权利要求的试剂盒，其另外还包含额外的组合物，所述额外的组合物包含至少一种碱。
19.根据前一项权利要求的试剂盒，其另外还包含可以被添加至组合物b、c或d的第二种碱。
20.根据权利要求17至19中任一项的试剂盒，其特征在于，该包含成骨蛋白的组合物还可以包含用于形成复合物的多糖。
21.根据权利要求17至19中任一项的试剂盒，其特征在于，该包含复合物的组合物还可以包含能够形成不溶性钙盐的阴离子的可溶性盐，和/或碱。
22.根据权利要求17至19中任一项的试剂盒，其特征在于，该包含多糖的组合物还可以包含能够形成不溶性钙盐的阴离子的可溶性盐，和/或碱。
23.根据权利要求17至19中任一项的试剂盒，其特征在于，该包含可溶性钙盐的组合物还可以包含碱。
24.试剂盒，其包括a-包含至少一种成骨蛋白的组合物，b_包含至少一种阴离子多糖、至少一种碱和至少一种能够形成不溶性钙盐的阴离子的可溶性盐的组合物，C"包含至少一种可溶性钙盐的组合物。
25.试剂盒，其包括a-包含至少一种成骨蛋白的组合物，b-包含至少一种阴离子多糖和至少一种能够形成不溶性钙盐的阴离子的可溶性盐的组合物，C"包含至少一种可溶性钙盐和至少一种碱的组合物。
26.根据权利要求17至25中任一项的试剂盒，其特征在于，所述阴离子多糖选自通过疏水性衍生物进行官能化的多糖。
27.根据权利要求沈的试剂盒，其特征在于，所述阴离子多糖选自通式IX的包含部分地被疏水性醇取代的羧基官能团的多糖多糖+羧基
28.根据权利要求沈的试剂盒，其特征在于，所述包含羧基官能团的多糖为通式X的合成多糖，其从天然地包含羧基官能团的多糖获得或者从在其上嫁接有至少15个羧基官能团/100个糖单元的中性多糖获得
29.根据权利要求沈的试剂盒，其特征在于，所述阴离子多糖选自这样的阴离子多糖， 其占多数地包含(1，4)、(1,3)和/或(1，2)类型的糖苷键，通过至少一个色氨酸衍生物进行官能化，并且符合下述通式I
30.根据权利要求沈的试剂盒，其特征在于，所述阴离子多糖选自下述通式III的经官能化的阴离子多糖
31.根据权利要求17至30中任一项的试剂盒，其特征在于，所述成骨蛋白选自 BMP-2 (代勃特明-α )、BMP-4、BMP-7 (依托特明-α ) ,BMP-14和⑶F_5，单独地或相组合地。
32.根据权利要求17至30中任一项的试剂盒，其特征在于，所述至少一种具有化学吸引和血管生成能力的生长因子为PDGF。
33.根据权利要求17至30中任一项的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒至少包含 BMP-2 和 PDGF-BB。
34.根据权利要求17至30中任一项的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒至少包含 BMP-7 和 PDGF-BB。
35.根据权利要求17至30中任一项的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒至少包含 GDF-5 和 PDGF-BB。
36.根据权利要求17至30中任一项的试剂盒，其特征在于，所述成骨蛋白选自 BMP-2 (代勃特明-α )、BMP-4、BMP-7 (依托特明-α ) ,BMP-14和⑶F_5，单独地或相组合地； 并且所述至少一种具有化学吸引和血管生成能力的生长因子为VEGF。
37.根据权利要求17至36中任一项的试剂盒，其特征在于，所述可溶性钙盐选自氯化钙、D-葡糖酸钙、甲酸钙、D-糖二酸钙、乙酸钙、L-乳酸钙、谷氨酸钙或天冬氨酸钙。
38.根据权利要求17至36中任一项的试剂盒，其特征在于，所述可溶性钙盐为氯化钙。
39.根据权利要求17至38中任一项的试剂盒，其特征在于，所述能够与钙离子形成沉淀物的阴离子的可溶性盐为这样的可溶性盐，该可溶性盐的阴离子选自包括磷酸根离子 P043_、磷酸氢根离子hpo42_和磷酸二氢根离子H2PO4_的磷酸根类阴离子。
40.根据权利要求17至38中任一项的试剂盒，其特征在于，所述碱选自无机碱或有机碱。
41.根据权利要求40的试剂盒，其特征在于，所述无机碱选自氢氧化钠、碳酸氢钠或碳酸钠。
42.根据权利要求40的试剂盒，其特征在于，所述有机碱选自胺和脱质子化的氨基酸。
43.根据权利要求40的试剂盒，其特征在于，所述有机碱选自咪唑及其衍生物，尤其是组氨酸、脯氨酸、乙醇胺或丝氨酸。
44.根据权利要求17至43中任一项的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒另外还包含至少一种有机基质或无机基质或混合基质。
45.根据权利要求44的试剂盒，其特征在于，所述基质为选自水凝胶和/或基于交联聚合物的基质的有机基质。
46.根据权利要求45的试剂盒，其特征在于，所述水凝胶为通过聚合物链的化学或物理交联而获得的水凝胶。
47.根据权利要求45的试剂盒，其特征在于，所述交联聚合物为经纯化的、经灭菌的且交联的天然胶原。
48.根据权利要求46的试剂盒，其特征在于，所述水凝胶选自合成聚合物的组，其中包括乙二醇和乳酸的共聚物、乙二醇和乙醇酸的共聚物、聚(N-乙烯吡咯烷酮)、聚乙烯酸、以及聚丙烯酰胺和聚丙烯酸。
49.根据权利要求45的试剂盒，其特征在于，所述水凝胶选自天然聚合物的组，其中包括透明质酸、角质素、出芽短梗霉聚糖、果胶、右旋糖酐、纤维素和纤维素衍生物、藻酸、黄原胶、角叉菜聚糖、壳聚糖、软骨素、胶原、明胶、聚赖氨酸、纤维蛋白以及它们的在生物学上可接受的盐。
50.根据权利要求17至50中任一项的试剂盒，其特征在于，构成该试剂盒的组合物为水溶液。
51.根据权利要求17至50中任一项的试剂盒，其特征在于，构成该试剂盒的组合物为冻干物。
52.制备在权利要求1至16中任一项之中所定义的共沉淀物的方法，其包括通过下述方式来获得共沉淀的步骤-通过添加钙离子的盐的溶液而沉淀出在阴离子聚合物与成骨蛋白之间的复合物，-通过添加组合物而沉淀出钙离子，该所添加的组合物包含至少一种能够在确定的PH 下形成不溶性钙盐的阴离子的可溶性盐，所述在阴离子聚合物与成骨蛋白之间的复合物通过向成骨蛋白的溶液中添加阴离子多糖的溶液来获得。
53.根据权利要求52的方法，其特征在于，通过添加可溶性磷酸盐的溶液，以磷酸钙的形式来实施钙盐的沉淀。
全文摘要
本发明涉及由包含至少一种不溶性钙盐和至少一种在成骨蛋白与多糖之间的复合物的共沉淀物组成的成骨组合物，所述共沉淀物以分开的形式存在。本发明还涉及使得能够实施本发明的试剂盒。本发明还涉及制备以分开的形式存在的共沉淀物的方法，所述共沉淀物包含至少一种不溶性钙盐和至少一种在成骨蛋白与多糖之间的复合物。本发明还涉及包含所述共沉淀物的制剂、药物产品和医学装置。
文档编号A61K9/14GK102281868SQ200980154601
公开日2011年12月14日 申请日期2009年11月19日 优先权日2008年11月19日
发明者G·索拉, O·索拉, R·索拉 申请人:阿道恰公司
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