基于酰胺的胰高血糖素超家族肽前药的制作方法
专利名称：基于酰胺的胰高血糖素超家族肽前药的制作方法
基于酰胺的胰高血糖素超家族肽前药相关申请的交叉引用本申请要求保护以下专利申请的优选权2008年12月19日提交的美国临时专利申请号61/139，210,2009年1月13日提交的美国临时专利申请号61/144，271和2009年 6月16日提交的美国临时专利申请号61/187，556。各申请的公开内容均通过引用以其整体明确结合到本文中。背景发明基于肽的药物是十分有效的药物，其作用持续时间相对较短，治疗指数可变。本公开内容涉及基于肽的前药，其中对前药衍生物进行设计以延迟起效并延长药物半寿期。起效延迟是有利的，因为允许前药在其活化前进行全身分布。因此，给予前药排除了在给药时由峰值活性引起的并发症，并提高母体药物的治疗指数。肽和蛋白质激动剂的受体识别和后续加工是许多基于肽和蛋白质的药物降解的主要途径。因此肽药物与其受体结合将引起生物刺激，但同时也将通过肽或蛋白质的酶促降解，引起肽/蛋白质诱导的药理作用的随后钝化。按照本公开内容，可根据抑制前药被相应受体识别的策略来制备延长肽或蛋白质的生物学半寿期的前药。本文公开的前药最终将以化学方法转化成可被受体识别的结构，其中这种化学转变的速度将决定起效时间和体内生物作用的持续时间。在本申请中公开的分子设计取决于分子内的化学反应，该反应不依赖其它的化学添加剂或酶。前胰高血糖素原是158个氨基酸的前体多肽，其在不同组织中加工形成许多不同的胰高血糖素原衍生的肽，包括参与包括葡萄糖稳态、胰岛素分泌、胃排空和肠生长以及食物摄取的调节在内的各种生理功能的胰高血糖素(SEQ ID N0:701)、胰高血糖素样肽-1(GLP-1 ；如SEQ ID NO 703和SEQ ID NO :704提供的氨基酸7_36)、胰高血糖素样肽-2(GLP-2 ；SEQ ID NO 708)和泌酸调节肽(0ΧΜ ；SEQ ID NO 706)。胰高血糖素是29个氨基酸的肽，其相当于前胰高血糖素原的氨基酸33-61，而产生的GLP-I为37个氨基酸肽，相当于前胰高血糖素原的氨基酸72-108。GLP-I (7_36)酰胺 (SEQ ID NO 704 ；C端为精氨酸酰胺)或GLP_1(7_37)酸(SEQ ID NO 703 ；C端为甘氨酸) 是GLP-I的生物学上的有效形式，在GLP-I受体上具有基本相等的活性。胰高血糖素是用于重度低血糖症急性治疗的救生药物。据报告，泌酸调节肽具有抑制食欲和减轻体重的药理能力。用GLP-I受体激动剂或稳定的GLP-I类似物的临床研究证实，肽的这个家族为II型糖尿病的有效治疗物。另外，从本质上讲，它可能比胰岛素疗法更安全，因为它的葡萄糖依赖作用从而排除了低血糖症的可能性。结构_活性关系研究显示，这三种肽(胰高血糖素、GLP-I和泌酸调节肽)每一种的N端组氨酸对于完整作用尤其重要，而且N端延伸形式严重削弱生物学效价。已知在结构上类似于胰高血糖素和GLP-I并具有相似活性的其它肽。例如，毒蜥外泌肽-4是存在于希拉毒蜥(Gila monster)唾液中的肽，其在结构上像GLP-1，并与胰高血糖素和GLP-I —样，增加胰岛素释放。另外，肠抑胃肽(GIP)亦称葡萄糖依赖性促胰岛素肽，是激素的促胰液素家族的成员。GIP来源于由GIP基因编码的153个氨基酸的前蛋白，并作为有生物活性的42个氨基酸肽(SEQ ID N0:707)循环。GIP基因在小肠以及唾液腺中表达，并且是胃酸分泌的弱抑制剂。除其在胃中的抑制作用以外，在葡萄糖存在下，当以生理剂量给予时，GIP通过胰岛β细胞增加胰岛素释放。一般认为，GIP作为刺激胰腺胰岛素释放的肠因子起作用，可在保持葡萄糖稳态中发挥生理作用。骨钙蛋白(SEQ ID NO 709)是存在于骨和牙质中的非胶原蛋白。它由成骨细胞分泌，并被认为在矿化和钙离子稳态中起一定作用。据报告，骨钙蛋白在机体内起激素作用， 引起胰腺中的β细胞释放更多的胰岛素，同时指导脂肪细胞释放激素脂连蛋白，这增加了对胰岛素的敏感性。与诸如骨钙蛋白、GIP、胰高血糖素、GLP-I和泌酸调节肽等生物活性肽的治疗应用有关的一个缺点是其在血浆中的半寿期极短(胰高血糖素和GLP-I为约2分钟)。因此， 为了获得适当的血糖控制，需要长时间地连续给予天然胰高血糖素相关肽。胰高血糖素和 GLP-I相关肽短的半寿期是被二肽基肽酶IV(DPP-IV)快速降解所引起的，该酶在第二和第三氨基酸之间切割。这种切割不仅仅使天然肽失活，而且在胰高血糖素和GLP-I的情况下， 在其相应的受体方面，缩短形式可能是功能性拮抗剂。因此，存在对疗效较久的GIP、胰高血糖素、GLP-I和泌酸调节肽以及相关肽的变体的需要，以实现这些药物作用机制的全部治疗潜力。发明概述按照一些实施方案，提供选自以下的生物活性多肽的前药衍生物胰高血糖素、 毒蜥外泌肽-4、GLP-U GLP-2、GIP、血管活性肠肽(VIP)、垂体腺苷酸环化酶激活多肽 27(PACAP-27)、组氨酸甲硫氨酸肽(PHM)、泌酸调节肽、促胰液素、骨钙蛋白、生长激素释放激素以及前述活性多肽的类似物、衍生物和缀合物。前药衍生物包含通过酰胺键与生物活性多肽的活性部位共价连接的二肽前药元件。在一些实施方案中，二肽在干扰生物活性多肽与其相应的受体或辅因子相互作用的能力的位置上与生物活性多肽共价结合。在一些实施方案中，二肽前药元件与生物活性肽的氨基端连接。随后在生理条件下和在缺乏酶活性时除去二肽，恢复多肽的全部活性。在一些实施方案中，提供具有A-B-Q通用结构的前药。在这个实施方案中，Q为选自胰高血糖素超家族肽的生物活性肽，包括胰高血糖素相关肽、骨钙蛋白以及上述生物活性肽的类似物、衍生物和缀合物；A-B表示通过酰胺键与生物活性肽连接的二肽前药。更具体地讲，在一些实施方案中，A为氨基酸或羟酸，B为N-烷基化氨基酸，其通过在(A-B中的) B的羧基和Q的胺之间形成酰胺键与Q连接。此外，在一些实施方案中，A、B或A-B与之连接的Q的氨基酸是非编码氨基酸，且在生理条件下，在PBS中，A-B自Q的化学裂解在约1小时-约720小时内完成至少约90%。在另一个实施方案中，在生理条件下，在PBS中，A-B 自Q的化学裂解在约1小时或约1周之内完成至少约50%。在一些实施方案中，选择A和B以抑制A-B 二肽从Q上被哺乳动物血清中存在的酶的酶促切割。在一些实施方案中，选择A和/或B使得在生理条件下在PBS中，A-B自Q 的裂解半寿期不超过在包含DPP-IV蛋白酶的溶液中A-B自Q的裂解半寿期的2倍(即与在酶不存在的相同条件相比，在存在DPP-IV蛋白酶和生理条件下，A-B自Q的裂解发生的速度不大于2倍)。在一些实施方案中，A和/或B为D立体异构体构型的氨基酸。在一些示例性的实施方案中，A为D立体异构体构型的氨基酸，而B为L立体异构体构型的氨基酸。 在一些示例性的实施方案中，A为L立体异构体构型的氨基酸，而B为D立体异构体构型的氨基酸。在一些示例性的实施方案中，A为D立体异构体构型的氨基酸，B为D立体异构体构型的氨基酸。在一些实施方案中，二肽前药元件(A-B)包含具有下式I通用结构的化合物
权利要求
1.一种前药，所述前药包含以下结构 A-B-Q ；其中Q为胰高血糖素超家族肽； A为氨基酸或羟酸；B为通过A-B与Q的胺之间的酰胺键与Q连接的N-烷基化氨基酸； 其中A、B或A-B与之连接的Q的氨基酸为非编码氨基酸，另外其中在生理条件下，在 PBS中，A-B自Q的化学裂解半寿期(t1/2)为至少约1小时-约1周。
2.权利要求1的前药，其中在生理条件下，在PBS中A-B自Q的裂解半寿期不超过在包含DPP-IV蛋白酶的溶液中A-B自Q的裂解半寿期的2倍。
3.权利要求2的前药，其中包含DPP-IV蛋白酶的溶液是血清。
4.权利要求1-3中任一项的前药，其中A-B包含以下结构
5.权利要求1-3中任一项的前药，其中A-B包含以下结构
6.权利要求4或5的前药，其中所述胰高血糖素超家族肽是胰高血糖素相关肽。
7.权利要求4或6的前药，其中 R1和R8独立地为H或C1-C8烷基；R2 和 R4 独立选自 H、C1-C8 烷基、C2-C8 烯基、(C1-C4 烷基)OH、(C1-C4 烷基)SH、(C2-C3 烷基)SCH3、(C1-C4 烷基)CONH2、(C1-C4 烷基)C00H、(C1-C4 烷基)NH2、(C1-C4 烷基)NHC (NH2+) NH2、(C0-C4 烷基)(C3-C6 环烷基)、(C0-C4 烷基)(C2-C5 杂环基)、(C0-C4 烷基)(C6-Cltl 芳基) R7和CH2 (C3-C9杂芳基)，或者R1和R2与它们所连接的原子一起形成C3-C12环烷基或芳基； R5 为 NHR6 ；和 R6为!1或C1-C8烷基。
8.权利要求5或6的前药，其中 R1和R8独立地为H或C1-C8烷基；R2 和 R4 独立选自 H、C1-C8 烷基、C2-C8 烯基、(C1-C4 烷基)OH、(C1-C4 烷基)SH、(C2-C3 烷基)SCH3、(C1-C4 烷基)CONH2、(C1-C4 烷基)C00H、(C1-C4 烷基)NH2、(C1-C4 烷基)NHC (NH2+) NH2、(C0-C4 烷基)(C3-C6 环烷基)、(C0-C4 烷基)(C2-C5 杂环基)、(C0-C4 烷基)(C6-Cltl 芳基) R7和CH2 (C3-C9杂芳基)，或者R1和R2与它们所连接的原子一起形成C3-C12环烷基； R3为C1-C18烧基； R5 为 NHR6 ；R6为H或C1-C8烷基；和R7 选自 S、C「C18 烷基、C2-C18 烯基、(Ctl-C4 烷基)CONH2、(C0-C4 烷基)C00H、(C0-C4 烷基) NH2、(Ctl-C4烷基)OH和卤素。
9.权利要求1-8中任一项的前药，其中所述伯胺为Q的N端氨基酸的α氨基。
10.权利要求9的前药，其中在生理条件下，在PBS中，A-B-Q的t1/2为约1小时。
11.权利要求10的前药，其中A-B包含以下结构
12.权利要求10的前药，其中A-B包含以下结构
13.权利要求9的前药，其中在生理条件下，在PBS中，A-B-Q的t1/2介于约6-约24小时之间。
14.权利要求13的前药，其中A-B包含以下结构
15.权利要求9的前药，其中在生理条件下，在PBS中，A-B-Q的t1/2为约12-约72小时。
16.权利要求15的前药，其中在生理条件下，在PBS中，A-B-Q的t1/2为约12-约24小时。
17.权利要求15或16中任一项的前药，其中A-B包含以下结构
18.权利要求17的前药，其中A-B包含以下结构
19.权利要求18的前药，其中A-B包含以下结构
20.权利要求17的前药，其中A-B包含以下结构
21.权利要求9的前药，其中在生理条件下，在PBS中，A-B-Q的t1/2为约72-约168小时。
22.权利要求21的前药，其中A-B包含以下结构
23.权利要求21的前药，其中A-B包含以下结构其中R1选自氢、C1-C8烷基和(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7 ； R3为C1-C18烧基； R4和R8各自为氢； R5 为 NHR6 或 OH ；R6为H、C1-C8烷基，或者R6和R1与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；和 R7 选自 S、C「C18 烷基、C2-C18 烯基、(Ctl-C4 烷基)CONH2、(C0-C4 烷基)C00H、(C0-C4 烷基) NH2、(C0-C4烷基)OH和卤素；前提条件是如果R1为烷基或(Ctl-C4烷基)(C6-Cltl芳基)R7,则R1和R5与它们所连接的原子一起形成4-11元杂环。
24.权利要求1-8中任一项的前药，其中所述伯胺为Q的内部氨基酸的侧链氨基，所述内部氨基酸包含下式V结构
25.权利要求24的前药，其中在生理条件下，在PBS中，A-B-Q的t1/2为约1小时。
26.权利要求25的前药，其中A-B包含以下结构
27.权利要求25的前药，其中A-B包含以下结构
28.权利要求24的前药，其中在生理条件下，在PBS中，A-B-Q的t1/2介于约6-约24 小时之间。
29.权利要求28的前药，其中A-B包含以下结构
30.权利要求28的前药，其中A-B包含以下结构
31.权利要求24的前药，其中在生理条件下，在PBS中，A-B-Q的t1/2为约72-约168 小时。
32.权利要求31的前药，其中A-B包含以下结构
33.权利要求31的前药，其中A-B包含以下结构
34.权利要求24-33中任一项的前药，其中式V氨基酸位于Q相当于天然胰高血糖素 (SEQ ID NO 701)的 12、16、17、18、20、28 或 29 位的位置上。
35.权利要求1-8中任一项的前药，其中所述伯胺为Q的芳族氨基酸的芳基上的取代基。
36.权利要求35的前药，其中所述芳族氨基酸为Q的内部氨基酸。
37.权利要求35或36的前药，其中所述芳族氨基酸选自氨基-Phe、氨基-萘基丙氨酸、 氨基色氨酸、氨基_苯基-甘氨酸、氨基_高苯丙氨酸和氨基酪氨酸。
38.权利要求35或36的前药，其中所述芳族氨基酸包含下式III的结构
39.权利要求35-38中任一项的前药，其中在生理条件下，在PBS中，A-B-Q的t1/2为约 1小时。
40.权利要求39的前药，其中A-B包含以下结构
41.权利要求39的前药，其中A-B包含以下结构
42.权利要求35-38的前药，其中在生理条件下，在PBS中，A-B-Q的t1/2介于约6-约 24小时之间。
43.权利要求42的前药，其中A-B包含以下结构
44.权利要求42的前药，其中A-B包含以下结构
45.权利要求35-38的前药，其中在生理条件下，在PBS中，A-B-Q的t1/2为约72-约 168小时。
46.权利要求45的前药，其中A-B包含以下结构
47.权利要求45的前药，其中A-B包含以下结构
48.权利要求35-47中任一项的前药，其中所述氨基取代的芳族氨基酸位于Q相当于天然胰高血糖素(SEQ ID NO 701)的10、13、22或25位的位置上。
49.前述权利要求中任一项的前药，其还包含与所述前药共价连接的亲水部分。
50.权利要求49的前药，其中所述亲水部分是聚乙二醇。
51.权利要求50的前药，其中所述聚乙二醇与A-B共价连接。
52.权利要求50的前药，其中所述聚乙二醇在Q相当于天然胰高血糖素(SEQID NO 701)的16、17、20、21、24或29位的位置上或C端氨基酸上与Q共价连接。
53.前述权利要求中任一项的前药，还包含与氨基酸侧链共价连接的酰基或烷基。
54.权利要求53的前药，其中所述酰基或烷基与A-B共价连接。
55.权利要求53的前药，其中所述酰基或烷基共价连接至Q相当于天然胰高血糖素 (SEQ ID NO :701)10 位的位置。
56.权利要求1-55中任一项的前药，其中Q包含与天然胰高血糖素(SEQID NO 701) 有至少50%同一性的氨基酸序列，其保持相当于SEQ ID NO :701氨基酸12-29的氨基酸的 α螺旋构象。
57.权利要求1-56中任一项的前药，其中Q包含以下氨基酸序列具有 1-3 个氨基酸修饰的 Xl-X2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-L eu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Z(SEQ ID NO 839),其中Xl和/或Χ2为降低胰高血糖素肽被二肽基肽酶IV(DPP-IV)切割的敏感性的非天然(与SEQ ID NO 701相比)氨基酸，其中 Z 选自-C00H、-Asn-COOH, Asn-Thr-COOH 和 Y-C00H，其中 Y 为 1-2 氨基酸，禾口其中(1)内酰胺桥连接i位上的氨基酸和i+4位上的氨基酸的侧链，其中i为12、16、 20或24，或(2)胰高血糖素肽16、20、21和24位上的1、2、3个或所有氨基酸被α，α-二取代氨基酸取代；和其中Q具有胰高血糖素激动剂活性。
58.权利要求1-56之一的前药，其中Q包含SEQID NO 701的氨基酸序列，且包含 至少一种选自以下的氨基酸修饰28位上的Asn被带电荷的氨基酸取代；28位上的Asn被选自以下的带电荷的氨基酸取代Lys、Arg、His、Asp、Glu、半胱磺酸和高半胱磺酸；在28位上被Asn、Asp或Glu取代； 在28位上被Asp取代； 在28位上被Glu取代； 29位上的Thr被带电荷的氨基酸取代；29位上的Thr被被选自以下的带电荷的氨基酸取代Lys、Arg、His、Asp、Glu、半胱磺酸和高半胱磺酸；在29位上被Asp、Glu或Lys取代；在29位上被Glu取代；在29位后插入1-3个带电荷的氨基酸；在29位后插入Glu或Lys ；在29位后插入Gly-Lys或Lys-Lys ；或其组合；和至少一种选自以下的氨基酸修饰A组或B组，或其组合；其中A组为选自以下的氨基酸修饰15位上的Asp被Glu取代和16位上的Ser被Thr 或AIB取代；和其中B组为选自以下的氨基酸修饰1位上的His被降低胰高血糖素肽对被二肽基肽酶IV (DPP-IV)切割的敏感性的非天然氨基酸取代，2位上的Ser被降低胰高血糖素肽对被二肽基肽酶IV(DPP-IV)切割的敏感性的非天然氨基酸降取代，10位上的Tyr被Phe或Val取代；12位上的Lys被Arg取代；20位上的Gln被Ala或AIB取代；21位上的Asp被Glu取代；24位上的Gln被Ala或AIB取代；27位的Met被Leu或Nle取代；27-29位上的氨基酸缺失；28-29位上的氨基酸缺失；29位上的氨基酸缺失；或其组合；且其中Q具有胰高血糖素激动剂活性。
59.权利要求1-56中任一项的前药，其中Q包含具有以下修饰的SEQID NO 701的胰高血糖素相关肽(a)赋予GIP激动剂活性的1位上的氨基酸修饰，(b)(1)在i和i+4位上的氨基酸侧链之间或在j和j+3位上的氨基酸侧链之间的内酰胺桥，其中i为12、13、16、17、20或24，其中j为17，或(2)类似物的16、20、21和24位上的1、2、3个或所有氨基酸被α，α - 二取代氨基酸取代，(c)在27、28和29位中的1、2个或全部上的氨基酸修饰，和(d)1-6个其它氨基酸修饰，其中类似物对GIP受体活化的EC50为约IOnM以下。
60.权利要求1-56中任一项的前药，其中Q包含SEQID NO 55的序列或SEQ ID NO 55的类似物，其中所述类似物因选自1、2、3、5、7、10、11、13、14、17、18、19、21、24、27、28和 29位的1-3个氨基酸修饰而不同于SEQ ID NO :55，其中所述胰高血糖素肽具有天然GLP-I 对GLP-I受体的活性的至少20%。
61.权利要求1-56中任一项的前药，其中Q包含因不超过10个氨基酸修饰而不同于 SEQ ID NO 701的氨基酸，所述修饰包括被AIB在16、20、21和/或24位上的一个或多个氨基酸取代，以及使被二肽基肽酶IV切割的敏感性得到降低的1和/或2位上的氨基酸修饰，其中所述胰高血糖素肽具有天然GLP-I对GLP-I受体的活性的至少20%。
62.权利要求1-56中任一项的前药，其中Q包含SEQID NO 1342的序列或其氧基衍生物，且其中Q具有胰高血糖素拮抗剂活性。
63.权利要求1-56中任一项的前药，其中Q包含如下修饰的天然胰高血糖素的氨基酸序列通过缺失SEQ ID NO :701N端的2-5个氨基酸残基，和用谷氨酸、高谷氨酸、β-高谷氨酸、半胱氨酸的磺酸衍生物或具有以下结构的半胱氨酸的烷基羧酸衍生物取代SEQ ID NO 701的9位上的天冬氨酸残基
64.权利要求1-56中任一项的前药，其中Q包含A-B-C的通用结构，其中A选自 ⑴苯基乳酸(PLA)；(ii)PLA的氧基衍生物；(iii)2-6个氨基酸的肽，其中该肽的2个连续氨基酸通过酯键或醚键连接；B表示SEQ ID N0:701的氨基酸i-26，其中i为3、4、5、6或7，任选包含一种或多种选自以下的氨基酸修饰(iv)9位(按照SEQID NO 701的氨基酸编号)上的Asp被Glu、Cys的磺酸衍生物、 高谷氨酸、β“高谷氨酸或具有以下结构的半胱氨酸的烷基羧酸衍生物取代
65.权利要求1-56中任一项的前药，其中Q包含SEQID NO 1451的序列或氧基衍生物，其中SEQ ID NO :1451的4和7位、7和11位、11和15位、15和19位或19和23位上的氨基酸通过内酰胺桥连接，且其中Q具有胰高血糖素拮抗剂活性和GLP-I激动剂活性。
66.权利要求1-56中任一项的前药，其中Q包含以下肽，其含有⑴分子内桥、或α， α - 二取代氨基酸、或16位(按照SEQ ID NO 701的编号)上的酸性氨基酸或其组合，(2) 替换C端羧酸的C端酰胺或酯，和(3)A-B-C的通用结构，其中A选自 ⑴ PLA ；(ii)PLA的氧基衍生物；和(iii)2-6个氨基酸的肽，其中该肽的2个连续氨基酸通过酯键或醚键连接；其中B表示SEQ ID N0:701的氨基酸p-26，其中ρ为3、4、5、6或7，任选包含一种或多种选自以下的氨基酸修饰(iv)9位(按照SEQID NO 701的氨基酸编号)上的Asp被Glu、Cys的磺酸衍生物、高谷氨酸、β-高谷氨酸或具有以下结构的半胱氨酸的烷基羧酸衍生物取代
67.前述权利要求中任一项的前药，其中A为呈D-立体化学构型的氨基酸。
68.权利要求1-55中任一项的前药，其中Q选自SEQID NO 1_564、566-570、573_575、 577、579-580、585-612、616、618-632、634-642、647、657-684、701-732、801-878、883-919、 1001-1262、1301-1371、1401-1518、1701-1708、1710、1711、1731-1734、1738、1740、1741、 1745 和 1747-1776。
69.一种无菌药物组合物，其包含权利要求1-68中任一项的前药和药学上可接受的载体。
70.一种治疗高血糖症或糖尿病的方法，所述方法包括给予有效量的权利要求69的药物组合物。
71.—种抑制食欲、减少体重增加或引起体重减轻的方法，所述方法包括给予有效量的权利要求69的药物组合物。
72.—种在有需要的患者中引起肠道暂时麻痹的方法，所述方法包括给予有效量的权利要求69的药物组合物。
73.一种治疗或预防有需要的患者的低血糖症的方法，所述方法包括给予有效量的权利要求69的药物组合物。
74.权利要求70-73中任一项的方法，所述方法还包括给予第二治疗剂。
75.权利要求74的方法，其中所述第二治疗剂是胰高血糖素相关肽或第二前药。
全文摘要
本发明提供胰高血糖素超家族肽的前药制剂，其中通过使二肽经由酰胺键与胰高血糖素超家族连接来修饰胰高血糖素超家族肽。本文公开的前药具有延长的半寿期，并且在生理条件下通过由化学不稳定性驱动的非酶促反应转化为活性形式。
文档编号A61K38/28GK102325539SQ200980157317
公开日2012年1月18日 申请日期2009年12月18日 优先权日2008年12月19日
发明者R·D·迪马基, 寇宾宾 申请人:印第安纳大学研究及科技有限公司
基于酰胺的胰高血糖素超家族肽前药相关申请的交叉引用本申请要求保护以下专利申请的优选权2008年12月19日提交的美国临时专利申请号61/139，210,2009年1月13日提交的美国临时专利申请号61/144，271和2009年 6月16日提交的美国临时专利申请号61/187，556。各申请的公开内容均通过引用以其整体明确结合到本文中。背景发明基于肽的药物是十分有效的药物，其作用持续时间相对较短，治疗指数可变。本公开内容涉及基于肽的前药，其中对前药衍生物进行设计以延迟起效并延长药物半寿期。起效延迟是有利的，因为允许前药在其活化前进行全身分布。因此，给予前药排除了在给药时由峰值活性引起的并发症，并提高母体药物的治疗指数。肽和蛋白质激动剂的受体识别和后续加工是许多基于肽和蛋白质的药物降解的主要途径。因此肽药物与其受体结合将引起生物刺激，但同时也将通过肽或蛋白质的酶促降解，引起肽/蛋白质诱导的药理作用的随后钝化。按照本公开内容，可根据抑制前药被相应受体识别的策略来制备延长肽或蛋白质的生物学半寿期的前药。本文公开的前药最终将以化学方法转化成可被受体识别的结构，其中这种化学转变的速度将决定起效时间和体内生物作用的持续时间。在本申请中公开的分子设计取决于分子内的化学反应，该反应不依赖其它的化学添加剂或酶。前胰高血糖素原是158个氨基酸的前体多肽，其在不同组织中加工形成许多不同的胰高血糖素原衍生的肽，包括参与包括葡萄糖稳态、胰岛素分泌、胃排空和肠生长以及食物摄取的调节在内的各种生理功能的胰高血糖素(SEQ ID N0:701)、胰高血糖素样肽-1(GLP-1 ；如SEQ ID NO 703和SEQ ID NO :704提供的氨基酸7_36)、胰高血糖素样肽-2(GLP-2 ；SEQ ID NO 708)和泌酸调节肽(0ΧΜ ；SEQ ID NO 706)。胰高血糖素是29个氨基酸的肽，其相当于前胰高血糖素原的氨基酸33-61，而产生的GLP-I为37个氨基酸肽，相当于前胰高血糖素原的氨基酸72-108。GLP-I (7_36)酰胺 (SEQ ID NO 704 ；C端为精氨酸酰胺)或GLP_1(7_37)酸(SEQ ID NO 703 ；C端为甘氨酸) 是GLP-I的生物学上的有效形式，在GLP-I受体上具有基本相等的活性。胰高血糖素是用于重度低血糖症急性治疗的救生药物。据报告，泌酸调节肽具有抑制食欲和减轻体重的药理能力。用GLP-I受体激动剂或稳定的GLP-I类似物的临床研究证实，肽的这个家族为II型糖尿病的有效治疗物。另外，从本质上讲，它可能比胰岛素疗法更安全，因为它的葡萄糖依赖作用从而排除了低血糖症的可能性。结构_活性关系研究显示，这三种肽(胰高血糖素、GLP-I和泌酸调节肽)每一种的N端组氨酸对于完整作用尤其重要，而且N端延伸形式严重削弱生物学效价。已知在结构上类似于胰高血糖素和GLP-I并具有相似活性的其它肽。例如，毒蜥外泌肽-4是存在于希拉毒蜥(Gila monster)唾液中的肽，其在结构上像GLP-1，并与胰高血糖素和GLP-I —样，增加胰岛素释放。另外，肠抑胃肽(GIP)亦称葡萄糖依赖性促胰岛素肽，是激素的促胰液素家族的成员。GIP来源于由GIP基因编码的153个氨基酸的前蛋白，并作为有生物活性的42个氨基酸肽(SEQ ID N0:707)循环。GIP基因在小肠以及唾液腺中表达，并且是胃酸分泌的弱抑制剂。除其在胃中的抑制作用以外，在葡萄糖存在下，当以生理剂量给予时，GIP通过胰岛β细胞增加胰岛素释放。一般认为，GIP作为刺激胰腺胰岛素释放的肠因子起作用，可在保持葡萄糖稳态中发挥生理作用。骨钙蛋白(SEQ ID NO 709)是存在于骨和牙质中的非胶原蛋白。它由成骨细胞分泌，并被认为在矿化和钙离子稳态中起一定作用。据报告，骨钙蛋白在机体内起激素作用， 引起胰腺中的β细胞释放更多的胰岛素，同时指导脂肪细胞释放激素脂连蛋白，这增加了对胰岛素的敏感性。与诸如骨钙蛋白、GIP、胰高血糖素、GLP-I和泌酸调节肽等生物活性肽的治疗应用有关的一个缺点是其在血浆中的半寿期极短(胰高血糖素和GLP-I为约2分钟)。因此， 为了获得适当的血糖控制，需要长时间地连续给予天然胰高血糖素相关肽。胰高血糖素和 GLP-I相关肽短的半寿期是被二肽基肽酶IV(DPP-IV)快速降解所引起的，该酶在第二和第三氨基酸之间切割。这种切割不仅仅使天然肽失活，而且在胰高血糖素和GLP-I的情况下， 在其相应的受体方面，缩短形式可能是功能性拮抗剂。因此，存在对疗效较久的GIP、胰高血糖素、GLP-I和泌酸调节肽以及相关肽的变体的需要，以实现这些药物作用机制的全部治疗潜力。发明概述按照一些实施方案，提供选自以下的生物活性多肽的前药衍生物胰高血糖素、 毒蜥外泌肽-4、GLP-U GLP-2、GIP、血管活性肠肽(VIP)、垂体腺苷酸环化酶激活多肽 27(PACAP-27)、组氨酸甲硫氨酸肽(PHM)、泌酸调节肽、促胰液素、骨钙蛋白、生长激素释放激素以及前述活性多肽的类似物、衍生物和缀合物。前药衍生物包含通过酰胺键与生物活性多肽的活性部位共价连接的二肽前药元件。在一些实施方案中，二肽在干扰生物活性多肽与其相应的受体或辅因子相互作用的能力的位置上与生物活性多肽共价结合。在一些实施方案中，二肽前药元件与生物活性肽的氨基端连接。随后在生理条件下和在缺乏酶活性时除去二肽，恢复多肽的全部活性。在一些实施方案中，提供具有A-B-Q通用结构的前药。在这个实施方案中，Q为选自胰高血糖素超家族肽的生物活性肽，包括胰高血糖素相关肽、骨钙蛋白以及上述生物活性肽的类似物、衍生物和缀合物；A-B表示通过酰胺键与生物活性肽连接的二肽前药。更具体地讲，在一些实施方案中，A为氨基酸或羟酸，B为N-烷基化氨基酸，其通过在(A-B中的) B的羧基和Q的胺之间形成酰胺键与Q连接。此外，在一些实施方案中，A、B或A-B与之连接的Q的氨基酸是非编码氨基酸，且在生理条件下，在PBS中，A-B自Q的化学裂解在约1小时-约720小时内完成至少约90%。在另一个实施方案中，在生理条件下，在PBS中，A-B 自Q的化学裂解在约1小时或约1周之内完成至少约50%。在一些实施方案中，选择A和B以抑制A-B 二肽从Q上被哺乳动物血清中存在的酶的酶促切割。在一些实施方案中，选择A和/或B使得在生理条件下在PBS中，A-B自Q 的裂解半寿期不超过在包含DPP-IV蛋白酶的溶液中A-B自Q的裂解半寿期的2倍(即与在酶不存在的相同条件相比，在存在DPP-IV蛋白酶和生理条件下，A-B自Q的裂解发生的速度不大于2倍)。在一些实施方案中，A和/或B为D立体异构体构型的氨基酸。在一些示例性的实施方案中，A为D立体异构体构型的氨基酸，而B为L立体异构体构型的氨基酸。 在一些示例性的实施方案中，A为L立体异构体构型的氨基酸，而B为D立体异构体构型的氨基酸。在一些示例性的实施方案中，A为D立体异构体构型的氨基酸，B为D立体异构体构型的氨基酸。在一些实施方案中，二肽前药元件(A-B)包含具有下式I通用结构的化合物
权利要求
1.一种前药，所述前药包含以下结构 A-B-Q ；其中Q为胰高血糖素超家族肽； A为氨基酸或羟酸；B为通过A-B与Q的胺之间的酰胺键与Q连接的N-烷基化氨基酸； 其中A、B或A-B与之连接的Q的氨基酸为非编码氨基酸，另外其中在生理条件下，在 PBS中，A-B自Q的化学裂解半寿期(t1/2)为至少约1小时-约1周。
2.权利要求1的前药，其中在生理条件下，在PBS中A-B自Q的裂解半寿期不超过在包含DPP-IV蛋白酶的溶液中A-B自Q的裂解半寿期的2倍。
3.权利要求2的前药，其中包含DPP-IV蛋白酶的溶液是血清。
4.权利要求1-3中任一项的前药，其中A-B包含以下结构
5.权利要求1-3中任一项的前药，其中A-B包含以下结构
6.权利要求4或5的前药，其中所述胰高血糖素超家族肽是胰高血糖素相关肽。
7.权利要求4或6的前药，其中 R1和R8独立地为H或C1-C8烷基；R2 和 R4 独立选自 H、C1-C8 烷基、C2-C8 烯基、(C1-C4 烷基)OH、(C1-C4 烷基)SH、(C2-C3 烷基)SCH3、(C1-C4 烷基)CONH2、(C1-C4 烷基)C00H、(C1-C4 烷基)NH2、(C1-C4 烷基)NHC (NH2+) NH2、(C0-C4 烷基)(C3-C6 环烷基)、(C0-C4 烷基)(C2-C5 杂环基)、(C0-C4 烷基)(C6-Cltl 芳基) R7和CH2 (C3-C9杂芳基)，或者R1和R2与它们所连接的原子一起形成C3-C12环烷基或芳基； R5 为 NHR6 ；和 R6为!1或C1-C8烷基。
8.权利要求5或6的前药，其中 R1和R8独立地为H或C1-C8烷基；R2 和 R4 独立选自 H、C1-C8 烷基、C2-C8 烯基、(C1-C4 烷基)OH、(C1-C4 烷基)SH、(C2-C3 烷基)SCH3、(C1-C4 烷基)CONH2、(C1-C4 烷基)C00H、(C1-C4 烷基)NH2、(C1-C4 烷基)NHC (NH2+) NH2、(C0-C4 烷基)(C3-C6 环烷基)、(C0-C4 烷基)(C2-C5 杂环基)、(C0-C4 烷基)(C6-Cltl 芳基) R7和CH2 (C3-C9杂芳基)，或者R1和R2与它们所连接的原子一起形成C3-C12环烷基； R3为C1-C18烧基； R5 为 NHR6 ；R6为H或C1-C8烷基；和R7 选自 S、C「C18 烷基、C2-C18 烯基、(Ctl-C4 烷基)CONH2、(C0-C4 烷基)C00H、(C0-C4 烷基) NH2、(Ctl-C4烷基)OH和卤素。
9.权利要求1-8中任一项的前药，其中所述伯胺为Q的N端氨基酸的α氨基。
10.权利要求9的前药，其中在生理条件下，在PBS中，A-B-Q的t1/2为约1小时。
11.权利要求10的前药，其中A-B包含以下结构
12.权利要求10的前药，其中A-B包含以下结构
13.权利要求9的前药，其中在生理条件下，在PBS中，A-B-Q的t1/2介于约6-约24小时之间。
14.权利要求13的前药，其中A-B包含以下结构
15.权利要求9的前药，其中在生理条件下，在PBS中，A-B-Q的t1/2为约12-约72小时。
16.权利要求15的前药，其中在生理条件下，在PBS中，A-B-Q的t1/2为约12-约24小时。
17.权利要求15或16中任一项的前药，其中A-B包含以下结构
18.权利要求17的前药，其中A-B包含以下结构
19.权利要求18的前药，其中A-B包含以下结构
20.权利要求17的前药，其中A-B包含以下结构
21.权利要求9的前药，其中在生理条件下，在PBS中，A-B-Q的t1/2为约72-约168小时。
22.权利要求21的前药，其中A-B包含以下结构
23.权利要求21的前药，其中A-B包含以下结构其中R1选自氢、C1-C8烷基和(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7 ； R3为C1-C18烧基； R4和R8各自为氢； R5 为 NHR6 或 OH ；R6为H、C1-C8烷基，或者R6和R1与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；和 R7 选自 S、C「C18 烷基、C2-C18 烯基、(Ctl-C4 烷基)CONH2、(C0-C4 烷基)C00H、(C0-C4 烷基) NH2、(C0-C4烷基)OH和卤素；前提条件是如果R1为烷基或(Ctl-C4烷基)(C6-Cltl芳基)R7,则R1和R5与它们所连接的原子一起形成4-11元杂环。
24.权利要求1-8中任一项的前药，其中所述伯胺为Q的内部氨基酸的侧链氨基，所述内部氨基酸包含下式V结构
25.权利要求24的前药，其中在生理条件下，在PBS中，A-B-Q的t1/2为约1小时。
26.权利要求25的前药，其中A-B包含以下结构
27.权利要求25的前药，其中A-B包含以下结构
28.权利要求24的前药，其中在生理条件下，在PBS中，A-B-Q的t1/2介于约6-约24 小时之间。
29.权利要求28的前药，其中A-B包含以下结构
30.权利要求28的前药，其中A-B包含以下结构
31.权利要求24的前药，其中在生理条件下，在PBS中，A-B-Q的t1/2为约72-约168 小时。
32.权利要求31的前药，其中A-B包含以下结构
33.权利要求31的前药，其中A-B包含以下结构
34.权利要求24-33中任一项的前药，其中式V氨基酸位于Q相当于天然胰高血糖素 (SEQ ID NO 701)的 12、16、17、18、20、28 或 29 位的位置上。
35.权利要求1-8中任一项的前药，其中所述伯胺为Q的芳族氨基酸的芳基上的取代基。
36.权利要求35的前药，其中所述芳族氨基酸为Q的内部氨基酸。
37.权利要求35或36的前药，其中所述芳族氨基酸选自氨基-Phe、氨基-萘基丙氨酸、 氨基色氨酸、氨基_苯基-甘氨酸、氨基_高苯丙氨酸和氨基酪氨酸。
38.权利要求35或36的前药，其中所述芳族氨基酸包含下式III的结构
39.权利要求35-38中任一项的前药，其中在生理条件下，在PBS中，A-B-Q的t1/2为约 1小时。
40.权利要求39的前药，其中A-B包含以下结构
41.权利要求39的前药，其中A-B包含以下结构
42.权利要求35-38的前药，其中在生理条件下，在PBS中，A-B-Q的t1/2介于约6-约 24小时之间。
43.权利要求42的前药，其中A-B包含以下结构
44.权利要求42的前药，其中A-B包含以下结构
45.权利要求35-38的前药，其中在生理条件下，在PBS中，A-B-Q的t1/2为约72-约 168小时。
46.权利要求45的前药，其中A-B包含以下结构
47.权利要求45的前药，其中A-B包含以下结构
48.权利要求35-47中任一项的前药，其中所述氨基取代的芳族氨基酸位于Q相当于天然胰高血糖素(SEQ ID NO 701)的10、13、22或25位的位置上。
49.前述权利要求中任一项的前药，其还包含与所述前药共价连接的亲水部分。
50.权利要求49的前药，其中所述亲水部分是聚乙二醇。
51.权利要求50的前药，其中所述聚乙二醇与A-B共价连接。
52.权利要求50的前药，其中所述聚乙二醇在Q相当于天然胰高血糖素(SEQID NO 701)的16、17、20、21、24或29位的位置上或C端氨基酸上与Q共价连接。
53.前述权利要求中任一项的前药，还包含与氨基酸侧链共价连接的酰基或烷基。
54.权利要求53的前药，其中所述酰基或烷基与A-B共价连接。
55.权利要求53的前药，其中所述酰基或烷基共价连接至Q相当于天然胰高血糖素 (SEQ ID NO :701)10 位的位置。
56.权利要求1-55中任一项的前药，其中Q包含与天然胰高血糖素(SEQID NO 701) 有至少50%同一性的氨基酸序列，其保持相当于SEQ ID NO :701氨基酸12-29的氨基酸的 α螺旋构象。
57.权利要求1-56中任一项的前药，其中Q包含以下氨基酸序列具有 1-3 个氨基酸修饰的 Xl-X2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-L eu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Z(SEQ ID NO 839),其中Xl和/或Χ2为降低胰高血糖素肽被二肽基肽酶IV(DPP-IV)切割的敏感性的非天然(与SEQ ID NO 701相比)氨基酸，其中 Z 选自-C00H、-Asn-COOH, Asn-Thr-COOH 和 Y-C00H，其中 Y 为 1-2 氨基酸，禾口其中(1)内酰胺桥连接i位上的氨基酸和i+4位上的氨基酸的侧链，其中i为12、16、 20或24，或(2)胰高血糖素肽16、20、21和24位上的1、2、3个或所有氨基酸被α，α-二取代氨基酸取代；和其中Q具有胰高血糖素激动剂活性。
58.权利要求1-56之一的前药，其中Q包含SEQID NO 701的氨基酸序列，且包含 至少一种选自以下的氨基酸修饰28位上的Asn被带电荷的氨基酸取代；28位上的Asn被选自以下的带电荷的氨基酸取代Lys、Arg、His、Asp、Glu、半胱磺酸和高半胱磺酸；在28位上被Asn、Asp或Glu取代； 在28位上被Asp取代； 在28位上被Glu取代； 29位上的Thr被带电荷的氨基酸取代；29位上的Thr被被选自以下的带电荷的氨基酸取代Lys、Arg、His、Asp、Glu、半胱磺酸和高半胱磺酸；在29位上被Asp、Glu或Lys取代；在29位上被Glu取代；在29位后插入1-3个带电荷的氨基酸；在29位后插入Glu或Lys ；在29位后插入Gly-Lys或Lys-Lys ；或其组合；和至少一种选自以下的氨基酸修饰A组或B组，或其组合；其中A组为选自以下的氨基酸修饰15位上的Asp被Glu取代和16位上的Ser被Thr 或AIB取代；和其中B组为选自以下的氨基酸修饰1位上的His被降低胰高血糖素肽对被二肽基肽酶IV (DPP-IV)切割的敏感性的非天然氨基酸取代，2位上的Ser被降低胰高血糖素肽对被二肽基肽酶IV(DPP-IV)切割的敏感性的非天然氨基酸降取代，10位上的Tyr被Phe或Val取代；12位上的Lys被Arg取代；20位上的Gln被Ala或AIB取代；21位上的Asp被Glu取代；24位上的Gln被Ala或AIB取代；27位的Met被Leu或Nle取代；27-29位上的氨基酸缺失；28-29位上的氨基酸缺失；29位上的氨基酸缺失；或其组合；且其中Q具有胰高血糖素激动剂活性。
59.权利要求1-56中任一项的前药，其中Q包含具有以下修饰的SEQID NO 701的胰高血糖素相关肽(a)赋予GIP激动剂活性的1位上的氨基酸修饰，(b)(1)在i和i+4位上的氨基酸侧链之间或在j和j+3位上的氨基酸侧链之间的内酰胺桥，其中i为12、13、16、17、20或24，其中j为17，或(2)类似物的16、20、21和24位上的1、2、3个或所有氨基酸被α，α - 二取代氨基酸取代，(c)在27、28和29位中的1、2个或全部上的氨基酸修饰，和(d)1-6个其它氨基酸修饰，其中类似物对GIP受体活化的EC50为约IOnM以下。
60.权利要求1-56中任一项的前药，其中Q包含SEQID NO 55的序列或SEQ ID NO 55的类似物，其中所述类似物因选自1、2、3、5、7、10、11、13、14、17、18、19、21、24、27、28和 29位的1-3个氨基酸修饰而不同于SEQ ID NO :55，其中所述胰高血糖素肽具有天然GLP-I 对GLP-I受体的活性的至少20%。
61.权利要求1-56中任一项的前药，其中Q包含因不超过10个氨基酸修饰而不同于 SEQ ID NO 701的氨基酸，所述修饰包括被AIB在16、20、21和/或24位上的一个或多个氨基酸取代，以及使被二肽基肽酶IV切割的敏感性得到降低的1和/或2位上的氨基酸修饰，其中所述胰高血糖素肽具有天然GLP-I对GLP-I受体的活性的至少20%。
62.权利要求1-56中任一项的前药，其中Q包含SEQID NO 1342的序列或其氧基衍生物，且其中Q具有胰高血糖素拮抗剂活性。
63.权利要求1-56中任一项的前药，其中Q包含如下修饰的天然胰高血糖素的氨基酸序列通过缺失SEQ ID NO :701N端的2-5个氨基酸残基，和用谷氨酸、高谷氨酸、β-高谷氨酸、半胱氨酸的磺酸衍生物或具有以下结构的半胱氨酸的烷基羧酸衍生物取代SEQ ID NO 701的9位上的天冬氨酸残基
64.权利要求1-56中任一项的前药，其中Q包含A-B-C的通用结构，其中A选自 ⑴苯基乳酸(PLA)；(ii)PLA的氧基衍生物；(iii)2-6个氨基酸的肽，其中该肽的2个连续氨基酸通过酯键或醚键连接；B表示SEQ ID N0:701的氨基酸i-26，其中i为3、4、5、6或7，任选包含一种或多种选自以下的氨基酸修饰(iv)9位(按照SEQID NO 701的氨基酸编号)上的Asp被Glu、Cys的磺酸衍生物、 高谷氨酸、β“高谷氨酸或具有以下结构的半胱氨酸的烷基羧酸衍生物取代
65.权利要求1-56中任一项的前药，其中Q包含SEQID NO 1451的序列或氧基衍生物，其中SEQ ID NO :1451的4和7位、7和11位、11和15位、15和19位或19和23位上的氨基酸通过内酰胺桥连接，且其中Q具有胰高血糖素拮抗剂活性和GLP-I激动剂活性。
66.权利要求1-56中任一项的前药，其中Q包含以下肽，其含有⑴分子内桥、或α， α - 二取代氨基酸、或16位(按照SEQ ID NO 701的编号)上的酸性氨基酸或其组合，(2) 替换C端羧酸的C端酰胺或酯，和(3)A-B-C的通用结构，其中A选自 ⑴ PLA ；(ii)PLA的氧基衍生物；和(iii)2-6个氨基酸的肽，其中该肽的2个连续氨基酸通过酯键或醚键连接；其中B表示SEQ ID N0:701的氨基酸p-26，其中ρ为3、4、5、6或7，任选包含一种或多种选自以下的氨基酸修饰(iv)9位(按照SEQID NO 701的氨基酸编号)上的Asp被Glu、Cys的磺酸衍生物、高谷氨酸、β-高谷氨酸或具有以下结构的半胱氨酸的烷基羧酸衍生物取代
67.前述权利要求中任一项的前药，其中A为呈D-立体化学构型的氨基酸。
68.权利要求1-55中任一项的前药，其中Q选自SEQID NO 1_564、566-570、573_575、 577、579-580、585-612、616、618-632、634-642、647、657-684、701-732、801-878、883-919、 1001-1262、1301-1371、1401-1518、1701-1708、1710、1711、1731-1734、1738、1740、1741、 1745 和 1747-1776。
69.一种无菌药物组合物，其包含权利要求1-68中任一项的前药和药学上可接受的载体。
70.一种治疗高血糖症或糖尿病的方法，所述方法包括给予有效量的权利要求69的药物组合物。
71.—种抑制食欲、减少体重增加或引起体重减轻的方法，所述方法包括给予有效量的权利要求69的药物组合物。
72.—种在有需要的患者中引起肠道暂时麻痹的方法，所述方法包括给予有效量的权利要求69的药物组合物。
73.一种治疗或预防有需要的患者的低血糖症的方法，所述方法包括给予有效量的权利要求69的药物组合物。
74.权利要求70-73中任一项的方法，所述方法还包括给予第二治疗剂。
75.权利要求74的方法，其中所述第二治疗剂是胰高血糖素相关肽或第二前药。
全文摘要
本发明提供胰高血糖素超家族肽的前药制剂，其中通过使二肽经由酰胺键与胰高血糖素超家族连接来修饰胰高血糖素超家族肽。本文公开的前药具有延长的半寿期，并且在生理条件下通过由化学不稳定性驱动的非酶促反应转化为活性形式。
文档编号A61K38/28GK102325539SQ200980157317
公开日2012年1月18日 申请日期2009年12月18日 优先权日2008年12月19日
发明者R·D·迪马基, 寇宾宾 申请人:印第安纳大学研究及科技有限公司
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