免疫测定的校准品的制作方法

xiaoxiao2020-7-23  13

专利名称:免疫测定的校准品的制作方法
技术领域
本发明一般地涉及免疫测定领域。更具体而言,本发明涉及校准物质用于校准自 身抗体之免疫测定的用途。
背景技术
日间差异是任何免疫测定中所固有的。此差异可由许多不同因素引起,包括环境 条件、测量仪器或试剂的老化、试剂批次改变和生物变异。在长期研究中,当需要将一天的 测试结果与不同天测量的另一结果相比较时,必需能根据此差异进行调整。对所述测定的 校准使之成为可能并且还能够提醒操作者注意与仪器的输出或日间漂移有关的问题。一般地,校准被设计用于测量血清中抗原的免疫测定是相对直接的,因为重组或 合成形式的抗原通常可制备并且容易定量。因此,可利用高度表征并明确定义的校准物质。就被设计用于测量患者试样中人自身抗体水平的测定而言,鉴别合适的校准物质 受到所测量抗体之不同特异性和反应之多克隆性(polyclonality)的阻碍。本发明人已 经研究了小鼠单克隆抗体用作自身抗体测定的校准品的用途。然而,这需要不同的报告系 统用于检测人自身抗体,因此决不能保证所检测的差异是自身抗体测定中固有差异的真实 代表。另外,所述单克隆抗体具有非常明确的特异性并且缺乏人多克隆反应所表现出的混 杂性(promiscuity)。这意味着可能不能检测出在捕获抗原结构中导致测定差异的微小改 变。如果对人源化抗体进行改造以用作校准物质,这将采用与自身抗体测定相同的报告系 统,但是将仍然表现出与其鼠单克隆抗体相同的单克隆性问题。因此,本发明人必须寻找能提供具有充足量并且还能被长期贮存的长期校准源的 新校准物质源。

发明内容
在第一个方面中,本发明涉及包含哺乳动物(尤其是人)体液的校准物质用于校 准检测自身抗体之免疫测定的用途。在一个实施方案中,所述校准物质包含人体液。在一个实施方案中,所述校准物质不包含选自血清、全血和血浆的任何血液产品。在一个实施方案中,所述校准物质包含引流液、流出物(exudate)或渗出物 (transudate)。这种物质优选不包含选自血清、全血和血浆的任何血液产品。在一个实施方案中,所述校准物质包含从一名或多名癌症对象收集的体液。在另一个实施方案中,所述校准物质包含从其中存在肿瘤或曾经存在肿瘤或者与 肿瘤相关或曾经与肿瘤相关的体腔或间隙收集的体液。在一个实施方案中,所述校准物质包含从其中存在肿瘤或曾经存在肿瘤或者与肿 瘤相关或曾经与肿瘤相关的体腔或间隙收集的哺乳动物(尤其是人)体液。在某些非限定性实施方案中,所述校准物质可包含从一名或多名人癌症患者收集 的胸水(pleural fluid)或腹水(ascites fluid)。
在一个实施方案中,所述校准物质包含对肿瘤标志物蛋白具有免疫特异性的天然 人自身抗体,并且待校准的免疫测定是用于检测对肿瘤标志物蛋白具有免疫特异性的天然 人自身抗体的免疫测定。在第二个方面中,本发明提供校准检测自身抗体之免疫测定的方法,其包括(a)使包含哺乳动物体液的多个不同稀释度的校准物质中每一个与对免疫测定中 待检测自身抗体具有特异性的抗原接触,其中已知所述体液包含对所述抗原具有免疫特异 性的自身抗体;(b)检测所述抗原与存在于所述校准物质中的自身抗体之间特异性结合的量;以 及(c)针对步骤(a)中所用校准物质的每一个稀释度,绘制或计算所述特异性结合 的量对所述校准物质之稀释度的曲线,从而校准使用所述抗原检测所述自身抗体的免疫测定。在一个实施方案中,所述校准物质包含人体液。在一个实施方案中,所述校准物质不包含选自血清、全血和血浆的任何血液产品。在一个实施方案中,所述校准物质包含引流液、流出物或渗出物。这种物质优选不 包含选自血清、全血和血浆的任何血液产品。在一个实施方案中,所述校准物质包含从一名或多名癌症对象收集的体液。在另一个实施方案中,所述校准物质包含从其中存在肿瘤或曾经存在肿瘤或者与 肿瘤相关或曾经与肿瘤相关的体腔或间隙收集的体液。在一个实施方案中,所述校准物质包含从其中存在肿瘤或曾经存在肿瘤或者与肿 瘤相关或曾经与肿瘤相关的体腔或间隙收集的哺乳动物(尤其是人)体液。在某些非限定性实施方案中,所述校准物质可包含从一名或多名人癌症患者收集 的胸水或腹水。在一个实施方案中,所述校准物质包含肿瘤标志物蛋白免疫特异性的天然人自身 抗体,并且待校准的免疫测定是用于检测肿瘤标志物蛋白免疫特异性的天然人自身抗体的 免疫测定。因此,在一个具体的非限定性实施方案中,本发明提供校准检测抗肿瘤标志物自 身抗体之免疫测定的方法,其包括(a)使包含从一名或多名癌症患者分离的胸水或腹水的多个不同稀释度的校准物 质中每一个与对抗肿瘤标志物自身抗体具有特异性的肿瘤标志物抗原接触,其中已知所述 胸水或腹水包含对所述抗原具有免疫特异性的自身抗体;(b)检测所述抗原与存在于所述校准物质中的自身抗体之间特异性结合的量;以 及(c)针对步骤(a)中所用校准物质的每一个稀释度,绘制或计算所述特异性结合 的量对所述校准物质之稀释度的曲线,从而校准使用所述抗原检测所述自身抗体的免疫测定。在第三个方面中,本发明提供了用于校准检测自身抗体之免疫测定的校准标准品 组合,其中所述组合中的各校准标准品包含不同稀释度的哺乳动物体液,已知所述哺乳动 物体液包含天然人自身抗体。
如权利要求22中所要求保护的校准标准品组合,其中所述哺乳动物体液为人体液。在一个实施方案中,所述哺乳动物体液不包含选自血清、全血和血浆的任何血液产品。在一个实施方案中,所述哺乳动物体液是引流液、流出物或渗出物。在一个实施方案中,所述哺乳动物体液是从一名或多名癌症患者收集的体液。在另一个实施方案中,所述哺乳动物体液是从其中存在肿瘤或曾经存在肿瘤或者 与肿瘤相关或曾经与肿瘤相关的体腔或间隙收集的体液。在一个实施方案中,所述哺乳动物体液包含从一名或多名癌症对象(比如人癌症 患者)收集的胸水。在一个实施方案中,所述哺乳动物体液包含从一名或多名癌症对象(比如人癌症 患者)收集的腹水。本发明进一步提供用于检测自身抗体的免疫测定试剂盒,所述试剂盒包含根据本 发明第三个方面的校准标准品组合以及含有对所述自身抗体具有免疫特异性的抗原的免 疫测定试剂。


图1 来自晚期乳腺癌患者的胸水中人自身抗体的抗原特异性抑制作用。图2 通过Western印迹证明的胸水对重组癌症相关抗原的特异性。(a)p53特异 性的流体B3280,(b)NY-ES0-1特异性的流体B1564,(c)对B⑶4_5和膜联蛋白1具有特异 性的流体PL-061,(d)对p53、CAGE和NY-ES0-1具有特异性的流体B3084。泳道1 =分子量 标志物,泳道2 = VOL,泳道3 = p53,泳道4 = c-myc,泳道5 = CAGE,泳道6 = NY-ES0-1, 泳道7 = GBU4-5,泳道8 = IKBKE,泳道9 =膜联蛋白1,泳道10 =膜联蛋白2。图3 通过Western印迹证明的血清与重组蛋白中污染细菌蛋白的结合,(a)、(b)。 泳道1 =分子量标志物,泳道2 =膜联蛋白XIa,泳道3 = BRCA2,泳道4 = c-myc,泳道5 = ECD6,泳道 6 = IKBKE,泳道 7 = NY-ES0-1,泳道 8 = p53,泳道 9 = PSA,泳道 10 = VOL。图4 该图描述患者流体稀释度对包被在板上的NYESO的滴定浓度(nM)的图。图5 利用引流液生成的校准曲线的重现性。所述曲线表示10次运行的平均值 与以误差线表示的标准偏差所代表的测定间差异。显示了对p53 (a)、c-myc (b)、E⑶6 (C)、 NYESO(d)、BRCA2(e)、PSA(f)和膜联蛋白 Xla(g)的反应性。图6 :5次运行中患者胸水合并液C3/C4 (a)和患者胸水合并液B3255/B3258 (b)对 160nM NYESO的反应性,其中以流体稀释度的对数对OD对数进行绘图。通过减去与阴性对 照抗原VOL之结合而获得的信号来校正非特异性结合的数据。图7 :5次运行中患者胸水合并液B3255/B3258 (a)和患者胸水合并液C3/C4 (b)对 160nM p53的反应性,其中以流体稀释度的对数对光密度的对数进行绘图。通过减去与阴性 对照抗原VOL之结合而获得的信号来校正非特异性结合的数据。图8 :5次运行中患者胸水合并液B3255/B3258 (a)和患者胸水合并液C3/C4 (b)对 160nM BRCA2的反应性,其中以流体稀释度的对数对OD对数进行绘图。通过减去与阴性对 照抗原VOL之结合而获得的信号来校正非特异性结合的数据。
图9 :5次运行中患者胸水合并液B3255/B3258 (a)和患者胸水合并液C3/C4 (b)对 160nM c-myc的反应性,其中以流体稀释度的对数对OD对数进行绘图。通过减去与阴性对 照抗原VOL之结合而获得的信号来校正非特异性结合的数据。图10 :5次运行中患者胸水合并液B3255/B3258(a)和患者胸水合并液C3/C4(b) 对160nM PSA的反应性,其中以流体稀释度的对数对OD对数进行绘图。通过减去与阴性对 照抗原VOL之结合而获得的信号来校正非特异性结合的数据。图11 :5次运行中患者胸水合并液B3258/B3255(a)和患者胸水合并液C3/C4(b) 对160nM ECD6的反应性,其中以流体稀释度的对数对OD对数进行绘图。通过减去与阴性 对照抗原VOL之结合而获得的信号来校正非特异性结合的数据。图12 5次运行中患者胸水合并液B3255/B3258(a)和患者胸水合并液C3/C4(b) 对160nM膜联蛋白XIa的反应性,其中以流体稀释度的对数对OD对数进行绘图。通过减去 与阴性对照抗原VOL之结合而获得的信号来校正非特异性结合的数据。图13 校准对对照样品之重现性的影响。在5次单独的运行中测量8个对照血清 中针对P53的自身抗体。原始OD值显示在(a)中。同时运行校准曲线并将此用于外推对 照样品的值(b)。图14 校准对对照样品之重现性的影响。在5次单独的运行中测量8个对照血清 中针对c-myc的自身抗体。原始OD值显示在(a)中。同时运行校准曲线并将此用于外推 对照样品的值(b)。图15 校准对对照样品之重现性的影响。在5次单独的运行中测量8个对照血清 中针对ECD6的自身抗体。原始OD值显示在(a)中。同时运行校准曲线并将此用于外推对 照样品的值(b)。图16 校准对对照样品之重现性的影响。在5次单独的运行中测量8个对照血清 中针对NYESO的自身抗体。原始OD值显示在(a)中。同时运行校准曲线并将此用于外推 对照样品的值(b)。图17 校准对对照样品之重现性的影响。在5次单独的运行中测量8个对照血清 中针对BRCA2的自身抗体。原始OD值显示在(a)中。同时运行校准曲线并将此用于外推 对照样品的值(b)。图18 校准对对照样品之重现性的影响。在5次单独的运行中测量8个对照血清 中针对PSA的自身抗体。原始OD值显示在(a)中。同时运行校准曲线并将此用于外推对 照样品的值(b)。图19 校准对对照样品之重现性的影响。在5次单独的运行中测量8个对照血清 中针对膜联蛋白XIa的自身抗体。原始OD值显示在(a)中。同时运行校准曲线并将此用 于外推对照样品的值(b)。图20 血清和引流液用作自身抗体测定的潜在校准物质的比较。将胸水C3(a)与 来自同一患者的血清样品18176(b)相比较。图21 血清和引流液用作自身抗体测定的潜在校准物质的比较。将胸水C7(a)与 来自同一患者的血清样品11828(b)相比较。图22 具有最小化残差平方和的四参数对数校准品曲线。所述4pl图以光密度 对校准品稀释度的对数构建。运行1-12的平均值以灰色实线表示,运行13和14的平均值以黑色虚线表示。误差线代表平均值的标准偏差。针对p53(a)、c-myc(b)、CAGE(c)、 NY-ES0-1 (d)、GBU4-5(e)、膜联蛋白1(f)和膜联蛋白2(g)的抗原特异性自身抗体测定。图23 校准对不同测定运行中进行的自身抗体测量值差异的影响。利用针对该运 行的抗原特异性校准曲线来校正血清样品的结果。空心三角形=未校准的测量值,实心点 =通过校准修正的测量值,虚线=校准值的平均值加上或减去3个标准偏差。图24 冷冻的校准品系列等份试样与新鲜稀释的校准品稀释系列的比较。使校准 品胸水C3与NYESO抗原反应。每对新鲜和冷冻系列运行10次(a)。平均值的对数/对数 曲线示于(b)中,其中误差线表示标准偏差。图25 冷冻校准品系列等份试样与新鲜稀释的校准品稀释系列的比较。使校准品 胸水C7与c-myc抗原反应。每对新鲜和冷冻系列运行10次(a)。平均值的对数/对数曲 线示于(b)中,其中误差线表示标准偏差。图26 冷冻的校准品系列等份试样与新鲜稀释的校准品稀释系列的比较。使校准 品胸水B3258与p53抗原反应。每对新鲜和冷冻系列运行10次(a)。平均值的对数/对数 曲线示于(b)中,其中误差线表示标准偏差。图27 冷冻的校准品系列等份试样与新鲜稀释的校准品稀释系列的比较。使校准 品胸水B3258与PSA抗原反应。每对新鲜和冷冻系列运行10次(a)。平均值的对数/对数 曲线示于(b)中,其中误差线表示标准偏差。图28 冷冻的校准品系列等份试样与新鲜稀释的校准品稀释系列的比较。使校准 品胸水B3258与膜联蛋白抗原反应。每对新鲜和冷冻系列运行10次(a)。平均值的对数/ 对数曲线示于(b)中,其中误差线表示标准偏差。图29 冷冻的校准品系列等份试样与新鲜稀释的校准品稀释系列的比较。使校准 品胸水B3255与BRCA2抗原反应。每对新鲜和冷冻系列运行10次(a)。平均值的对数/对 数曲线示于(b)中,其中误差线表示标准偏差。图30 冷冻的校准品系列等份试样与新鲜稀释的校准品稀释系列的比较。使校准 品胸水C3与ECD6抗原反应。每对新鲜和冷冻系列运行10次(a)。平均值的对数/对数曲 线示于(b)中,其中误差线表示标准偏差。图31 来自患有不同类型癌症之患者的流体中自身抗体与肿瘤相关抗原的反应 性。图32 来自胰腺癌患者的胸水的系列稀释液与160nM(a)和50nM(b)阴性对照蛋 白VOL的反应性。在不同的5天重复所述实验5次。图33 腹水B2993针对160nM C-myc的4次运行的结果,图a和b中均带有标准 偏差误差线(图a描述该实验中所用对照血清的OD值)。图34 腹水B3259针对160nM E⑶6的4次运行的结果,图a和b中均带有标准偏 差误差线(图a描述该实验中所用对照血清的OD值)。图35 腹水B2993针对160nM E⑶6的4次运行的结果,图a和b中均带有标准偏 差误差线(图a描述该实验中所用对照血清的OD值)。发明详述本发明涉及包含哺乳动物(尤其是人)体液的校准物质用于校准检测自身抗体 (尤其是人自身抗体)之免疫测定的用途。
在一个实施方案中,本文所用的校准物质可包含人体液用作“天然人自身抗体”的 来源,意指已经在人宿主中产生的自身抗体作为自然免疫过程的结果。为避免疑问,此校准 物质不包含非人抗体或通过实验室技术外源性产生的任何人抗体或人源化抗体,例如来自 培养的免疫细胞的单克隆抗体。所述校准物质可包含已知含有具有合适免疫特异性的自身抗体的任何人体液或 其它哺乳动物体液,即所述校准品必须包含已知对免疫测定中待检测自身抗体呈阳性的哺 乳动物(例如人)体液。在此方面,应当预先知道所述校准品流体含有这样的自身抗体,其 表现出与期望利用免疫测定来检测的自身抗体可比较的免疫特异性。本发明的校准物质的 优点在于其包含与在人血清中所发现的天然人自身抗体的免疫特异性基本上相同的天然 人自身抗体,所述免疫特异性是针对在旨在校准的免疫测定中作为试剂使用的抗原的结合 而言的。如所附实施例中所举例说明的,可通过实施利用测试抗原的试验性测定预先确定 给定的人体液样品中是否含有具有合适免疫特异性的自身抗体。在一个实施方案中,所述 试验性测定可使用与旨在用在合适的免疫测定中使用的相同的抗原和检测方法。已表明含 有对这种试验性测定中的测试抗原具有免疫特异性的自身抗体的体液适于用作所述随后 的免疫测定使用相同测试抗原来检测自身抗体状态未知的患者测试样品中的相应自身抗 体。在上下文中,“测试样品”可定义为来自待测试自身抗体存在的对象的样品,其中在测试 样品之前,所述患者的所述自身抗体状态是未知的。通常不需要在使用之前测定校准物质中存在的自身抗体之量的准确滴度,尤其是 当使用本发明的校准方法时,其利用多个稀释度的校准物质来提供校准标准品组合。不需 要准确测定校准标准品组合中存在的自身抗体的绝对量,前提是所述校准标准品组涵盖了 当在合适的免疫测定中测试抗体状态未知之患者测试样品时所预期会遇到的抗体滴度的 正常范围。这可通过测试与典型的患者测试样品平行比较的稀释校准样品的范围来凭经验 确定。所述校准物质可简单地由从人体分离得到之形式的人体液(例如“纯”胸水或腹 水)组成,或者可在使用之前使所述体液与其它成分混合或用其它成分稀释来形成校准物 质。典型地,在合适的缓冲液中配制一系列稀释度的流体来提供校准标准品组合。用于配 制所述较准标准品的合适的稀释缓冲液包括例如PBS+0. 5M NaCl+0. 酪蛋白+0. 吐温 20的高盐缓冲液(在实施例中称为HSBT)或者含有BSA的PBS。因此,本发明涉及由 本文所述类型的哺乳动物(例如人)体液与这些稀释缓冲液之一混合组成的校准物质的用 途。特别有用的校准品由可从一名或多名人癌症患者获得的人胸水或人腹水与HSBT的混 合物组成。或者,正常血清可用作校准品稀释液。还包括浓缩所述体液或(半)纯化所述 抗体以及然后稀释此物质以提供校准标准品。可将其它成分加入到所述校准标准品中,例 如以提高长期贮存的稳定性。在使用之前,可将在合适稀释缓冲液中稀释的校准物质以等份试样分装并贮存。 方便地,可将待稀释的校准物质等份试样冻存在_20°C或-80°C下并在使用前解冻。本发明 人已表明胸水和腹水适于贮存在-20°C并可长期冻存而不损失自身抗体的反应性。在长期 冻存之前预先稀释校准标准品并分成等份试样是方便的并且避免了重现性误差和多个冻 融循环。
在用于检测抗原的免疫测定领域中,将已知的阳性样品用作免疫测定的校准品是 相当常规的做法。然而,当所述测定的靶标是抗体而不是抗原时,难于提供含有具有合适特 异性之抗体的已知阳性样品的合适校准物质。本发明通过使用校准物质来解决此问题,所 述校准物质含有预先已知包含具有合适特异性的抗体的体液。通常,优选不使用是“血液产品”(例如全血、血浆或血清)或含有“血液产品”的 体液作为校准物质的基础。但是,所述校准物质可含有作为引流液、流出物或渗出物的体 液,并且包括在疾病过程中产生的或者作为疾病结果的这些物质。在非限定性实施方案中, 所述体液可选自胸水、腹水、水系腔液(hydrocoele)、伤口引流液、炎性或非炎性滑膜液、积 液、乳头抽吸液、心包积液、胆汁、胰腺分泌物等。所述流体可从人对象或非人哺乳动物对象 (包括例如狗和非人灵长类)获得。在某些实施方案中,所述校准物质可包含从其中存在肿瘤或曾经存在肿瘤或者与 肿瘤相关或曾经与肿瘤相关的体腔或间隙分离出的体液。在此方面,术语“体腔或间隙”包 括任何体腔或间隙,不论是天然腔或间隙或者作为疾病或医疗介入的结果而导致的间隙或 腔(包括塌陷的(collapsed)或前腔(former cavity))。所述流体来源于其中存在肿瘤或 曾经存在肿瘤或者与肿瘤相关或曾经与肿瘤相关的腔或间隙。优选地,所述“来源于体腔的 体液”将是肿瘤诱导的体液,意指在疾病过程中例如响应于或作为肿瘤细胞存在的结果而 产生的体液。在此方面,示例性“体腔”流体是腹水、胸水、积液、水系腔液和伤口引流液。为避免疑问,“来源于体腔或间隙的体液”不包括来源于体循环的血液产品,例如 全血、血清或血浆。根据本发明,胸水和腹水是用于根据本发明用途的特别有用的校准物质来源,因 为它们通常是大量获得的并且是作为治疗策略的一部分从患者中取出的。此流体(或者将 会被丢弃)是有价值的校准物质来源。如上所述,本发明人已经证明了人“体腔”流体(例 如胸水和腹水)是用于检测人血清中自身抗体的免疫测定的合适校准物质,因为这些流体 含有可与人血清中存在的那些相比较的自身抗体,就与抗原结合的免疫特异性以及抗体同 型两个方面而言。后者是重要的,因为其能将相同的检测系统用于所述校准物质中的自身 抗体和患者血清测试样品中存在的具有相同抗原结合特异性的自身抗体。所述校准物质可包含从一名或多名癌症患者收集的体液,更具体是“体腔”流体, 例如胸水或腹水。在上下文中,术语“癌症患者”包括之前诊断为患有癌症的个体,所述癌 症包括但不限于结肠癌、卵巢癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、食道癌、胃癌、肾癌、膀胱癌、子宫内膜 癌、淋巴瘤和白血病或乳腺癌。所述流体可取自单个患者或者可将得自两名或更多名患者 的流体合并在一起。可以是将两名或更多名患有相同类型或不同类型癌症、处于相同阶段 或不同阶段的患者的流体样品合并一起。还包括将来自一名或更多名癌症患者的不同类型 的体液合并在一起。由取自于患有特定类型癌症之癌症患者的体液所制得的校准物质可用于辅助诊 断其它个体中相同类型癌症或不同类型癌症。如所附实施例中所举例说明的,肿瘤标志物 蛋白特异性的天然人自身抗体存在于从结肠癌、卵巢癌、肺癌、肝癌、胰腺癌和乳腺癌患者 取得的胸水中。一旦利用试验性测定确定存在具有所需免疫特异性的自身抗体,这些流体 便可用于校准免疫测定以测试来自患有其它类型癌症之患者的测试样品中具有相同免疫 学特异性的自身抗体,例如可用包含来自于患有结肠癌、卵巢癌、肺癌、肝癌或胰腺癌的患者胸水(以及其它体腔液)的校准物质来校准乳腺癌血清中自身抗体的免疫测定。
在一个实施方案中,从已诊断为癌症的患者制得的校准物质储备液可用于校准在 晚些时候进行的免疫测定,以评价同一患者或不同患者的免疫状态,例如监测疾病进展和/ 或评价所述患者中抗癌治疗过程的功效。 在使用中,本发明的校准物质可用于校准根据已知方法实施的检测自身抗体的免 疫测定。典型地,所述免疫测定可采用直接、夹心或竞争性ELISA的形式,但是其它测定方 法也在本发明的范围内。用于检测人抗肿瘤标志物自身抗体的免疫测定的一般特征描述于 WO 99/58978和W02006/126008中,其全部内容在此通过参考并入本文。本发明提供的校准 物质可用于校准WO 99/58978和WO 2006/126008中所述的测定。本文所述的校准物质以及包含此校准物质的校准标准品组可用于校准任何类型 的自身抗体的免疫测定,所述自身抗体起到疾病状态标志物或疾病易感性标志物的作用, 其中所述疾病具有产生/诱导本文所述类型的体液(包括具有与作为疾病标志物的自身抗 体可比较的免疫特异性的自身抗体)形成的可能。典型地与含有自身抗体的体液的产生相关的疾病的实例包括本文所列举的癌症 类型。如上所述,从癌症患者获得的体液(尤其是“体腔液”例如胸水、腹水、水系腔水、积 液、伤口引流液等)提供了含有肿瘤标志物特异性的自身抗体之阳性校准物质的有用来 源。因此,所述校准物质可用于校准用于检测测试患者样品(例如自身抗体状态未知的患 者血清样品)中癌症或早期肿瘤疾病的免疫测定。这样的测定(用于检测患者测试样品中 抗肿瘤标志物自身抗体)可利用WO 99/58978和WO 2006/126008中所述的方法或其改进 方法来实施。然而,应当理解的是,本发明不限于使用癌症来源的流体,实际上也不限于检测肿 瘤标志物的自身抗体,尽管这是一个重要的实施方案。另一类与含有疾病特征性自身抗体 的体液(除血清、全血或血浆之外)的产生相关的疾病为良性自身免疫疾病。因此,本发明 涉及从患有良性自身免疫疾病的哺乳动物(例如人)对象获得的体液用作校准物质用于检 测作为所述自身免疫疾病标志物的自身抗体的用途。这些自身免疫疾病的实例包括类风湿 关节炎、系统红斑狼疮(SLE)、原发性胆汁性肝硬化(PBC)、自身免疫性甲状腺炎(如桥本甲 状腺炎)、自身免疫性胃炎(如恶性贫血)、自身免疫性肾上腺炎(如阿狄森氏病)、自身免 疫性甲状旁腺功能减低症、自身免疫性糖尿病(如1型糖尿病)或重症肌无力。在类风湿性关节炎的情形下,所述校准物质可包含与疾病进程相关的流出物或由 与疾病进程相关的流出物组成,所述流出物典型地是关节积液,例如从RA患者的膝盖中分 离出的炎性滑膜液。在系统红斑狼疮(SLE)的情形下,所述校准物质可包含从SLE患者获得的腹水或 由从 SLE 患者获得的腹水组成(参见 Lacconi 等· InternetJournal of Radiology, ISSN 1528-8404)。在此方面,应当指出的是,不是所有的腹水(或实际上其它体腔液例如胸水) 都与肿瘤存在相关。在胆汁性肝硬化的情形下,所述校准物质可包含从胆汁性肝硬化患者获得的腹水 或由从胆汁性肝硬化患者获得的腹水组成。免疫测定(例如ELISA、放射性免疫测定等)的一般特征是本领域中技术人员众 所周知的(参见 Immunoassay, Ε. Diamandis 禾口 Τ· Christopoulus,Academic Press, Inc.,San Diego,CA,1996,其内容在此通过参考并入本文)。用于检测具有特定免疫特异性的自 身抗体的免疫测定(例如与给定抗原具有免疫反应性的自身抗体,比如肿瘤标志物蛋白) 通常需要使用这样的试剂,其含有在测试下表现出与所述抗体具有特异性免疫反应性的抗 原。取决于所述测定的形式,所述试剂可被固定在固体载体上。使待测试抗体之存在的测 试样品与所述试剂接触,并且如果具有所需的免疫特异性的抗体存在于所述测试样品中, 则它们将与所述试剂发生免疫反应以形成自身抗体-试剂复合物,然后可检测或定量测量 所述自身抗体-试剂复合物。典型地,这些免疫测定通过使用用于检测所述测试样品中(自 身)抗体的相同试剂进行平行测定来校准,但是用一个或多个校准标准品替换所述测试样 品,所述校准标准品是已知含有具有合适免疫特异性的(自身)抗体的校准物质的样品。使用本发明校准物质的优选校准方法使用校准标准品组合,通常是本发明校准物 质的系列稀释液,是针对一个或多个已知浓度的抗原进行测试的。在典型的“夹心”ELISA 中,对在测试下所述自身抗体具有特异性的抗原被固定到固体表面(例如标准微滴定测定 板的孔或微殊表面)上,并且使校准品样品(或待测试自身抗体之存在的测试样品)与所 述固定抗原接触。存在于所述校准物质中具有所期望特异性的自身抗体将与所述固定抗原 结合。然后可使用任何合适的方法来检测所结合的自身抗体/抗原复合物。因此,本发明提供校准检测自身抗体之免疫测定的方法,其包括(a)使包含人或其它哺乳动物体液的多个不同稀释度的校准物质中每一个与对自 身抗体具有(免疫)特异性的抗原接触,其中已知所述人体液包含对所述抗原具有免疫特 异性的自身抗体;(b)检测所述抗原与存在于所述校准物质中的自身抗体之间(免疫)特异性结合 的量;以及(c)针对步骤(a)中所用校准物质的每一个稀释度,绘制或计算所述特异性结合 的量对所述校准物质之稀释度的曲线,从而校准使用所述抗原检测所述自身抗体的免疫测定。用于检测步骤(b)中的特异性结合的准确方法并不限于本发明。在一个实施方案 中,标记的抗人免疫球蛋白第二抗体特异性识别一类或多类人免疫球蛋白所共有的表位, 被用于检测自身抗体/抗原复合物。典型地,所述第二抗体是抗IgG或抗IgM。所述第二抗 体通常用可检测的标志物(典型地是酶标志物)例如过氧化物酶或碱性磷酸酶来标记,通 过添加所述酶的底物以产生可检测的产物来进行定量检测,所述可检测的产物例如为有色 产物、化学发光产物或荧光产物。可使用具有等同效果的本领域公知的其它类型的可检测 标记物。就步骤(b)中获得的结合测量值而言,对步骤(a)中所用的抗原浓度进行选择以 得到宽的动态范围,以提供用于宽范围的自身抗体测量的校准。这是一个尤其重要的关于 用于检测抗肿瘤标志物自身抗体的免疫测定的考虑,所述自身抗体定义为多克隆的,并且 在抗原/自身抗体结合强度以及所存在的自身抗体的绝对量方面表现出患者间的差异。所 用抗原的浓度典型地大于20nM,更尤其是在20Nm-180nM之间,或者在50nM_160nM之间。可能需要测试许多稀释度的校准物质来构建(C)部分中宽泛的校准曲线。典型 地,在所用的每个抗原浓度下,将测试至少6个单一稀释度的校准物质,但是此数字不旨在 限于此。
本文所述的校准物质的优选用途是用作检测对人肿瘤标志物具有免疫特异性的 天然人自身抗体之免疫测定的校准品,这些自身抗体典型地与癌症相关。发现患者中癌症的形成和发展通常与患者体液中标志物的存在相关,这些“肿瘤 标志物”反映了癌症生物学的不同方面(参见Fateh-Maghadam,A. & Steilber,P. (1993) Sensible use of tumour markers.由 Verlag GMBH 出片反,ISBN 3-926725-07-9 ;Harris 等,J Clin Oncol. ,25 :5287_5312, 2007 ;Voorzanger-Rousselot 禾口 Garnero, Cancer Treatment Reviews, 31 :230_283,2007)。发现肿瘤标志物常常是由“正常”细胞表达的野 生型蛋白质的改变形式,在此情形下,这种改变可以是原始氨基酸序列的改变,二级、三级 或四级结构的改变或翻译后修饰的改变,例如异常糖基化。此外,在肿瘤细胞中被上调或过 度表达(可能是基因扩增或异常转录调节的结果)的野生型蛋白也可以是肿瘤标志物。在一些情形下,由“正常”细胞表达的野生型蛋白和相应的肿瘤标志物蛋白之间的 差异可导致所述肿瘤标志物蛋白被个体的免疫系统识别为“异己”并因此在所述个体中诱 发免疫反应。这可以是体液(即B细胞介导的)免疫反应,导致产生对所述肿瘤标志物蛋白 具有免疫特异性的自身抗体。自身抗体是针对被个体的免疫系统识别为外源物之抗原(甚 至在抗原实际上来源于所述个体的情形下也是如此)的天然抗体。它们可作为循环的游离 自身抗体或以循环的免疫复合物形式存在于循环中,所述免疫复合物由与其靶标肿瘤标志 物蛋白结合的自身抗体组成。术语“癌症相关”抗肿瘤标志物自身抗体指这样的自身抗体,其是癌症疾病状态的 特征并且针对存在于优先在癌症疾病状态下表达的肿瘤标志物蛋白形式上的表位。典型地,用于检测抗肿瘤标志物自身抗体的肿瘤标志物抗原包含重组肿瘤标志物 蛋白(在细菌、昆虫、酵母或哺乳动物细胞中表达)或者化学合成的肿瘤标志物抗原,其可 基本上包含全部的肿瘤标志物蛋白或其片段,例如短肽抗原。用作检测抗肿瘤自身抗体的 免疫测定试剂的基础的肿瘤相关蛋白的其它可能来源包括培养的肿瘤细胞(以及供其生 长所用的耗尽培养基(spent media))、肿瘤组织以及来自肿瘤个体的血清,或来自一名或 多名癌症患者的其它体液(如W/02004/044590中所述)。本文所述的校准物质可用于校准用于检测针对不同肿瘤标志物的许多抗肿瘤标 志物自身抗体的免疫测定,而不管这些测定中所用的抗原的性质如何。用于本发明中的校 准物质(尤其是包含来自一名或多名癌症患者的胸水或腹水的校准物质)的一个关键特征 在于它包含在抗原结合特异性方面非常类似于存在于癌症患者测试样品(例如癌症患者 血清)中的自身抗体。所述校准物质可以与重组肿瘤标志物抗原、合成的肽肿瘤标志物抗 原或纯化的肿瘤标志物天然抗原一起使用。本发明不旨在限于有关免疫测定的靶标方面,即不陷于旨在检测的靶标自身抗体 的特异性方面。本文所述的校准物质可用于校准存在于所述校准物质本身中的任何自身 抗体的免疫测定。单一的校准物质可含有大量的具有不同免疫特异性的不同自身抗体,因 此相同的物质可用于校准大量的不同测定。例如,在现有的实施例中已经表明人胸水样 品包含针对大量肿瘤标志物的自身抗体,包括p53、c-myc、E⑶-6 (HER2/neu胞外片段)、 NY-ESOU BRCA2, PSA 以及膜联蛋白 X1-A。在最后一个方面,本发明提供这样的校准物质,其可用于将结合到固体表面(例 如微滴定板的孔)上的标签蛋白的量进行定量,因为所述校准物质中存在对所述“标签”蛋白的多肽标签成分(例如组氨酸标签或生物素标签)具有免疫特异性的天然自身抗体。本 发明人观察到从癌症患者分离的某些胸水样品包含对连接到重组肿瘤标志物抗原上的组 氨酸标签和/或生物素标签具有免疫特异性的抗体。因此,这些胸水可用于提供用于具有 组氨酸标签和/或生物素标签之重组蛋白的通用定量ELISA,其利用对所述标签具有特异 性的天然人抗体以及标记的抗人第二抗体。该方法具有某些优点,在抗肿瘤标志物自身抗 体的免疫测定的情形下优于使用鼠单克隆抗体来定量与固体载体结合的标签抗原,因为它 使用与测量对所述肿瘤标志物抗原本身具有特异性的天然人自身抗体所用的报告系统相 同的报告系统。因此,可使用含有针对所述抗原的组氨酸标签或生物素标签部分的天然自 身抗体的校准物质,在一个测定板中运行测定以定量结合到所述板上的重组肿瘤标志物抗 原,并且平行运行用于相同标签重组抗原与天然抗肿瘤标志物自身抗体之结合的校准标准 品组合,并且就两个测定而言使用相同的报告系统。因此,在又一个方面中,本发明提供定量与固体表面结合的蛋白质之量的方法,其 中所述蛋白质包含标签,所述方法包括使所述待检测所述蛋白质之存在的固体表面与含 有人体液的试剂物质接触,其中已知所述流体包含对所述标签具有免疫特异性的天然人抗 体,以及测量所述天然人抗体与所述标签之间的特异性结合的量,从而对所述表面上存在 的所述蛋白质进行定量。在上下文中,术语“标签”指蛋白质上的化学部分,其连接到不存在于任何天然表 达形式的蛋白质中。所述标签可以是多肽,在这种情况下,所述标签由不与任何天然表达形 式的蛋白质的氨基酸序列连接的氨基酸序列组成。固体表面上待定量的蛋白质典型地是重组表达蛋白。通常连接到重组表达蛋白上 的标签的实例包括生物素标签和组氨酸标签。如所附实施例中所举例说明的,大约10%的 人群含有对生物素具有免疫特异性的天然人抗体。也可在正常人群中鉴定出含有对组氨酸 标签具有特异性的天然抗体的人个体。应当理解的是,对根据本发明获得的校准曲线数据的统计分析和数学分析可包括 但不限于四参数对数图。参照下述实验实施例进一步理解本发明。本文具体参考的所有科技出版物和专利公开物的全部内容在此通过引用并入本文。材料和方法校准物质的配制利用标准方法在知情同意情形下从癌症患者收集胸水和腹水。典型地,在局部麻 醉下向胸腔或腹腔插入引流管来收集流体。所述引流管可以插有或不插有影像引导控制 (image-guided control)(例如超声),这取决于当地政策和临床治疗医师的实践。i)应当以标准的胸水(pleural effusion)引流方式将胸水收集到无菌胸腔引流 容器中。ii)应当以标准的腹水(ascite)引流方式通过腹腔引流管将腹水收集到无菌引 流袋中。不需要向所述袋/容器内添加化学品而将所述流体引流至所述袋/容器内。应当在所述袋/容器被装满时收集它们或以日为基础收集,以较快者为准。
在II级Hood中,使用25ml吸液管将1升流体转移至20支50毫升无菌管中并在 400g离心5分钟。将上清倒入2支500毫升无菌组织培养瓶中并加入叠氮化钠至0. 01% (1 μ 110% 储备液加至Iml上清中)。加入抑肽酶(蛋白酶抑制剂)至lyg/ml(lyl在PBS中的 10mg/ml抑肽酶储备液加至IOml上清中)。然后将上清倒入非无菌的50毫升管中并贮存 在-20"C。试剂清单叠氮化钠储备液,贮存在室温下,抑肽酶=Calbiochem616370抑肽酶储备液,以50μ 1等份试样贮存在-20°C,PBS=磷酸盐缓冲液。自身抗体的标准免疫测定本文使用重组肿瘤标志物抗原举例说明一般的免疫测定法,但是,应当认识到相 同的测定方案也可适用于其它(自身)抗原。以类似于W099/58978中所述的方法通过重组表达来制备肿瘤标志物抗原样品。简而言之,将编码目的标志物抗原的cDNA克隆到pET21载体(Invitrogen)中,所 述载体已被修饰来编码生物素标签和6x组氨酸标签以有助于所表达蛋白的纯化。将所得 克隆物在合适的细菌宿主细胞(包涵体)中培养,所述细菌裂解并变性,通过镍螯合物亲和 柱(Hi-trap,可从Amersham商购,按照生产商方法)重新获得所表达的抗原。通过在合适 的缓冲液中透析使所表达的抗原复性,通过SDS-PAGEJestern印迹和ELISA来评价所表达 蛋白的产率,并在贮存前定量。阴性对照VOL为空载体(即未克隆的cDNA),其仍然包含所述组氨酸标签序列和生 物素标签序列。多种标志物cDNA的GenBank登记号如下P53 :B003596c-myc :V00568ECD6(HER2)细胞外结构域M11730NY-ESO :NM_001327BRCA2 :U43746BRCAl δ 9-10 :NM_007302膜联蛋白Xl-A :NM_145868PSA :NM_001648CAGE :NM_182699XM_291343GBU4-5 :NM_001110822 XM_001713629 XM_001713630XM_001713631膜联蛋白1 :NM_000700膜联蛋白2 :NM_0040391.将抗原和VOL(阴性对照)在0. IM碳酸盐缓冲液中稀释至合适浓度。利用多通 道电子移液器根据板布置将抗原稀释液以50μ 1/孔分散在Falcon微滴定板的数列中,覆 盖板并在4°C下贮存48小时。
2.利用板自动清洗机在PBS+0. 1% Tween 20中清洗板1次,然后用纸巾吸干。3.用高盐孵育缓冲液(HSBT,PBS+0. 5M NaCl+0. 酪蛋白 +0. 1% Tween 20)以 200 μ 1/孔封闭板1小时或直到使用(在4°C覆盖贮存)。4.适当时,在室温下于HSBT中稀释患者体液和校准物质的测试样品。5.将板倒空并在纸巾上吸干。利用多通道电子移液器将每个稀释的测试样品(或 校准物质)以50 μ 1/孔分散在微滴定板的所有孔中。覆盖板并在室温下孵育1.5小时,同 时摇动。6.清洗步骤利用板自动清洗机在PBS+0. 1 % Tween 20中清洗板3次,然后用纸 巾吸干。7.将缀合至兔抗人化6和化11(扭01^011,1/10000,在把811中)或兔抗人186(0&1 ), 1/5000,在HSBT中)上的辣根过氧化物酶以50 μ 1/孔分散在微滴定板的所有孔中。HRP-缀 合的兔抗小鼠Ig(1/1000,在HSBT中)用于利用小鼠单克隆抗体的测定。然后在室温下孵 育板1小时,同时摇动。8.如步骤6所示清洗板。9.以50 μ 1/孔添加预先配制的TMB底物,并在bench上孵育板1分钟。轻轻敲击 板以进行混合。10.利用标准读板法于650nm处测定孔的光密度。实施例1 (对比)单克隆抗体用作校准品研究了单克隆抗体用作自身抗体测定中的可能的校准物质(数据未显示)。尽管 可产生可重现的稀释反应,但是这些反应不可用作校准品曲线。认为这是无效的校准系统, 因为所述单克隆抗体是鼠源的,因此需要使用不同的第二抗体报告系统来检测血清中的人 自身抗体。因此,利用此方法,利用两种不同的测量系统才有效,并且不能通过所述小鼠单 克隆系统来检测或校准由于所述第二抗系统引起的日间差异。此外,所述单克隆反应特异 性如此之高以至于其不能有效模拟人自身抗体所表现出的多克隆反应。这可解释为什么单 克隆抗体不能用作良性自身免疫疾病(比如系统红斑狼疮和类风湿性关节炎)中的校准物 质。由于已经看低了单克隆抗体用作校准物质的可能性,出于上述原因,本发明人选 择研究人胸水和腹水用作可能的校准物质来源。在标准自身抗体测定中以1 100稀释度(在HSBT中)对患者流体进行筛选以 确定含有针对所选抗原的自身抗体的那些流体(表1)。图Ia和Ib显示对两种不同胸水中 自身抗体与两种不同抗原之结合的抑制作用的实施例,是通过将所述胸水与所述抗原在溶 液中一起预孵育来实施的。因此,本发明人表明所选的抗原能测量对特定肿瘤相关抗原具 有特异性的自身抗体。作为胸水中自身抗体的肿瘤相关抗原特异性的另一证实,对用作自身抗体测定中 捕获剂的重组抗原进行Western印迹。这些Western印迹是根据文献中所述的标准方法进 行的,并用被选择用作校准品的胸水进行检测。结果可见于图2,其中每一流体的特定抗原 特异性是通过对应于抗原抗体结合的校正大小(correct size)的强条带所表明的,所述抗 原很少或不具有与污染物质条带结合的迹象。在图3中,使用血清来检测相似的Western印
表1 对胸水中针对7种不同肿瘤相关抗原的自身抗体的筛选。将所测量的自身 抗体的水平任意指定为低、中或高。在良性自身免疫疾病中,就每种特定的疾病而言,自身抗原通常更有限得多。在此 方面,本发明人所报道的有关癌症患者中体液的数据是不同的。不同癌症患者中不同自身 抗体的存在使得开发针对多个自身抗体测试的全面校准系统远更具有挑战性并且复杂得 多。对这些流体进行筛选之后,进一步研究了最可能用作测定之校准品的对抗原呈阳性的 那些流体。实施例3 抗原和VOL滴定以及流体滴定最初利用双滴定系统研究了患者流体用作校准系统的可能性,其中利用抗原滴定 液和VOL滴定液包被测定板(参见表2a)。使抗原和VOL吸附到板上最少48小时,此后,清 洗所述板并用含有酪蛋白(0. 1% w/v)、NaCl (0. 5M)和Tween20 (0. 1% w/v)的PBS将板封 闭。在封闭孵育过程中,在管中配制一系列患者流体校准品滴定液(在HSBT中)。除去所 述封闭缓冲液之后,将这些滴定液添加到空板中(如表2b所示)并孵育90分钟。如材料 和方法中所述进行其余的测定。
权利要求
包含哺乳动物体液的校准物质用于校准检测自身抗体之免疫测定的用途。
2.权利要求1的用途,其中所述校准物质包含人体液。
3.权利要求1或2的用途,其中所述校准物质不包含选自血清、全血和血浆的任何血液女口广 PFt ο
4.权利要求1-3中任一项的用途,其中所述校准物质包含引流液、流出物或渗出物。
5.权利要求1-4中任一项的用途,其中所述校准物质包含从其中存在肿瘤或曾经存在 肿瘤或者与肿瘤相关或曾经与肿瘤相关的体腔或间隙收集的体液。
6.权利要求5的用途,其中所述校准物质包含从一名或多名癌症对象收集的胸水。
7.权利要求5的用途,其中所述校准物质包含从一名或多名癌症对象收集的腹水。
8.权利要求1-7中任一项的用途,其中所述免疫测定用于检测针对癌症的自身抗体。
9.权利要求1-7中任一项的用途,其中所述免疫测定用于检测针对早期肿瘤变化的自 身抗体。
10.校准用于检测自身抗体之免疫测定的方法,其包括(a)使包含哺乳动物体液的多个不同稀释度的校准物质中每一个与自身抗体特异性的 抗原接触,其中已知所述哺乳动物体液包含对所述抗原具有免疫特异性的自身抗体;(b)检测所述抗原与存在于所述校准物质中的自身抗体之间特异性结合的量;以及(c)针对步骤(a)中所用校准物质的每一个稀释度,绘制或计算所述特异性结合的量 对所述校准物质之稀释度的曲线,从而校准使用所述抗原检测所述自身抗体的免疫测定。
11.权利要求10的方法,其中所述校准物质包含人体液。
12.权利要求10或11的方法,其中所述校准物质不包含选自血清、全血和血浆的任何血液产品。
13.权利要求10-12中任一项的方法,其中所述校准物质包含引流液、流出物或渗出物。
14.权利要求10-13中任一项的方法,其中所述校准物质包含从一名或多名癌症对象 收集的体液。
15.权利要求10-14中任一项的方法,其中所述校准物质包含从其中存在肿瘤或曾经 存在肿瘤或者与肿瘤相关或曾经与肿瘤相关的体腔或间隙收集的体液。
16.权利要求15的方法,其中所述校准物质包含从一名或多名癌症对象收集的胸水。
17.权利要求4的方法,其中所述校准物质包含从一名或多名癌症对象收集的腹水。
18.权利要求11-17中任一项的方法,其中所述校准物质包含人体液,其中已知所述人 体液含有对肿瘤标志物蛋白具有免疫特异性的天然人自身抗体。
19.权利要求10-18中任一项的方法,其中(a)部分中抗原的使用浓度大于20nM。
20.权利要求19的方法,其中(a)部分中抗原的使用浓度范围为20nM至180nM。
21.权利要求19的方法,其中(a)部分中抗原的使用浓度范围为50nM至160nM。
22.用于校准检测自身抗体之免疫测定的校准标准品组合,其中所述组合中的每个校 准标准品包含不同稀释度的哺乳动物体液,已知所述哺乳动物体液包含天然人自身抗体。
23.权利要求22中所要求保护的校准标准品组合,其中所述哺乳动物体液为人体液。
24.权利要求22或23中所要求保护的校准标准品组合,其中所述哺乳动物体液不包含 选自血清、全血和血浆的任何血液产品。
25.权利要求22-24中任一项所要求保护的校准标准品组合,其中所述哺乳动物体液 是引流液、流出物或渗出物。
26.权利要求22-25中任一项所要求保护的校准标准品组合,其中所述哺乳动物体液 是从一名或多名癌症对象收集的体液。
27.权利要求22-26中任一项所要求保护的校准标准品组合,其中所述哺乳动物体液 是从其中存在肿瘤或曾经存在肿瘤或者与肿瘤相关或曾经与肿瘤相关的体腔或间隙收集 的体液。
28.权利要求27中所要求保护的校准标准品组合,其中所述哺乳动物体液包含从一名 或多名癌症对象收集的胸水。
29.权利要求27中所要求保护的校准标准品组合,其中所述哺乳动物体液包含从一名 或多名癌症对象收集的腹水。
30.权利要求22-29中任一项所要求保护的校准标准品组合,其中所述所述哺乳动物 体液是人体液,其中已知所述人体液含有对肿瘤标志物蛋白具有免疫特异性的天然人自身 抗体。
31.用于检测自身抗体的免疫测定试剂盒,所述试剂盒包含权利要求22至30中任一项 的校准标准品组合以及含有对所述自身抗体具有免疫特异性之抗原的免疫测定试剂。
32.定量结合到固体表面上的蛋白质之量的方法,其中所述蛋白质包含标签,所述方法 包括使待测试所述蛋白质存在性的固体表面与含有人体液的试剂物质接触,其中已知所述 体液包含对所述标签具有免疫特异性的天然人抗体,以及测量所述天然人抗体与所述标签 之间特异性结合的量,从而定量存在于所述表面上的所述蛋白质的量。
33.权利要求32的方法,其中所述蛋白质是重组表达的蛋白质。
34.权利要求32或33的方法,其中所述标签是生物素。
35.权利要求33的方法,其中所述标签是组氨酸标签。
36.权利要求1至4中任一项的用途,其中所述免疫测定用于检测针对良性自身免疫疾 病的自身抗体。
全文摘要
包含哺乳动物体液的校准物质用于校准检测自身抗体之免疫测定的用途。
文档编号G01N33/564GK101952723SQ200880122385
公开日2011年1月19日 申请日期2008年12月23日 优先权日2007年12月24日
发明者卡罗琳·查普曼, 安东尼·巴恩斯, 安德烈亚·默里, 约翰·福赛思·鲁塞尔·罗伯特森 申请人:昂西免疫有限公司

最新回复(0)