人肠道病毒71型的亚单位混合疫苗的制作方法
专利名称：人肠道病毒71型的亚单位混合疫苗的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医学领域，特别是涉及到研究人肠道病毒71型疫苗的方法。
背景技术：
人肠道病毒71型(EV71)于1969年首次被分离鉴定，是手足口病的病原体之一。 该病毒主要感染5岁以下儿童，主要导致手足口病及疱疹性咽峡炎，少数情况下的并发症 包括脑膜炎，肺水肿，出血等，严重病例可导致死亡。人肠道病毒71型曾引起世界范围内的 多次疾病暴发流行，上世纪80年代以来，人肠道病毒71型引发的手足口病在亚太地区肆 虐，引发了严重的婴幼儿死亡病例。我国自1981年在上海发现本病，以后各个省市均有报道。2009年3月全国通过传 染病网络直报系统报告的手足口病病例是54713例，死亡31例。从今年年初到4月7号， 网络直报显示，全国累计报告手足口病例115618例，其中重症773例，死亡50例。人肠道病毒71型多肽链全长2，193个氨基酸，在体内合成后切割成11个蛋白，包 括VP1，VP2, VP3, VP4，2A，2B，2C，3A，3B，3C，3D。目前该病的治疗尚无有效地药物，而研制安全而具有良好保护性能的疫苗，被认 为是防御EV71病毒感染的有效方法。目前报道的疫苗主要是使用灭活或减毒的全病毒，或 者全病毒的结构类似物，此类疫苗在小鼠模型中均能给与幼鼠良好的抗病毒保护作用。此 外，VPl蛋白被普遍认为集中了优势的抗原决定簇，该蛋白被用作亚单位疫苗时，也能在体 外表现出较好的保护效果，但是体内试验并不理想。但是，日本学者用减毒的全病毒疫苗免疫实验猴时，动物仍表现出一定的神经症 状，使人们对于全病毒疫苗的安全性提出了怀疑。此前，我们发现了 EV71病毒与人脑组织存在免疫交叉，并发现了引发这种免疫交 叉的区域，据此，我们进一步设计了剔除强交叉区域的混合亚单位疫苗。
发明内容
鉴于以上需要，本发明的主要目的在于提供一种无潜在毒副反应的人肠道病毒71 型(EV71)的亚单位混合疫苗。本发明提供的人肠道病毒71型(EV71)的亚单位混合疫苗，其包括下述属于人肠 道病毒71型多肽链的多肽中的一个或多个的任意组合，以及必要的佐剂，所述多肽分别为
ppppppppPPPP
r1-69‘ r70-159' r140-249' r324-443‘ r444-565' r566-665' r746-876‘ r1197-1338' r1441-1526' r1549-1668' r1649-1731 ' r 1732-1851 '
Pl952-2071 'P2072-2193' P1843-1951，所述下标数字代表所述多肽在EV7 1多肽链中的位置，从多肽链N 端起始。所述人肠道病毒71型可以是任何一种人肠道病毒71型毒株；以上述15个多肽中任何一个或者多个的组合为母版，可以添加或删除少于或等 于50个属于EV71多肽链的序列；以上述15个多肽中任何一个或者多个的组合为母版，可以添加或删除任何不属于EV71多肽链编码区的序列；所述多肽通过以下方法筛选a.人肠道病毒71型多肽链的分割和工程表达将人肠道病毒71型多肽链分割成由22 156个氨基酸组成的多肽，共22个，分 别在大肠杆菌中表达，使用6XHis tag标签进行纯化；b.人肠道病毒71型多肽链的分割多肽抗原性的确定将纯化的蛋白对实验动物进行免疫，获得的抗血清分别与健康成年人和胎儿的脑 组织进行免疫组化试验，鉴定能与正常脑组织发生交叉反应的抗血清，确定与人体存在强 交叉免疫原区域的人肠道病毒71型多肽；确定与人体存在弱交叉免疫原区域的人肠道病 毒71型多肽；确定与人体不存在交叉免疫原区域的人肠道病毒71型多肽。上述步骤a中，将EV71病毒的多肽链进行顺序分割，将2193个氨基酸从N端依次 分割成22 156个氨基酸构成的多肽，共22个，绝大多数多肽的分子量在IOkDa左右；上述步骤a中，相邻并且同属于一个蛋白的两个多肽之间存在4 19个氨基酸的 重叠，避免了抗原决定簇的筛选遗漏；上述步骤a中，多肽的N端与6XHis tag标签进行融合表达，因为6XHis tag蛋 白标签不会对多肽的抗原性产生明显影响，同时有利于多肽的纯化；上述步骤b中，P23Q_323，P646_755，P857_1Q12，P1329_144q4种多肽与人体抗原的交叉反应结 果为强阳性，下标数字表示在多肽在总病毒中多肽链上的位置，从N端起始，它们分别属于 人肠道病毒 71 型中的 VP2，VP1，2A，2C 蛋白 ，P324_443，P444_565，P566_665，P746_876，P1441_1526，
Pl549-1668，Pl732-1851， 1952"2071' ^2012-219^^ 种多肽与人体抗原的交叉反应结果为弱阳性，它们分
别属于人肠道病毒 71 型中的 VP4，VP3，VP1，3A，3C 以及 3D 蛋白；P7(1_159，P14ch249，P1197^1338, P1649-I73I' P1843-19515种多肽与人体抗原不存在交叉反应，它们分别属于人肠道病毒71型中的 VP2，2C，3C以及3D蛋白。将上述15个多肽中的一个或者多个的组合进行等量，组成亚单位混合疫苗，进行 效果验证疫苗对雌性小鼠进行免疫，测定了小鼠血清的抗体滴度，中和效价和与人脑组织 的交叉反应。免疫后的雌鼠进行交配，母源抗体可以通过胎盘屏障进入到幼鼠体内，对幼鼠 进行病毒攻击后，通过测定幼鼠组织中病毒数量变化和病理表现，证明该疫苗具有良好保 护性能。疫苗对雌性小鼠进行两次免疫后，病毒中和效价达到26以上。对免疫后雌鼠产下 的幼鼠攻毒后，母源抗体可以有效的清除幼鼠体内的病毒，7日后肌肉组织内病毒含量接近 于零，且在5日内可以有效的清除75%以上幼鼠组织内的病毒，7日内可以有效的清除全部 幼鼠组织内病毒，保护率接近100%。病理观察发现幼鼠的组织没有明显的病理变化。综上所述，本发明提供的所述人肠道病毒71型的亚单位混合疫苗，可以在体内外 起到抗病毒感染的保护作用，是具有潜在临床应用价值的备选疫苗。
具体实施例方式以下结合具体实施方案对本发明作进一步详细说明，但不作对其的限定实施例1
多肽的筛选步骤一人肠道病毒71型的分割和工程表达分割所采用的菌株名称为Fuyang-0805a，其NCBI中存储号为⑶350629。该菌株 的基因组CDS区共6582bp，编码2193个氨基酸，分割多肽的大小控制在100个氨基酸(aa) 左右，下限为22aa，上限为156aa，位于同一个蛋白内的相邻两个多肽间存在4 15aa的重 叠，如表1。表1人肠道病毒71型的分割方式多肽名称 所属蛋白多肽编码区在人肠道病毒
71型基因组编码区中的位
置
P1-69VP41-207P70-159VP2208-477P140-249VP2418-747P230-323VP2688-969P324-443VP3970-1329P444-565VP31330-1695P566-665VPl1696-1995P646-755VPl1936-2265P746-876VPl2236-2628P857-10122A2569-3036Pl013-llll2B3037-3333Plll2-12012C3334-3603Pll97-13382C3589-4014Pl329-14402C3985-4320Pl441-15263A4321-4578Pl527-15483B4579-4644Pl549-16683C4645-5004Pl649-17313C4945-5193Pl732-18513D5194-5553P]843-19513D5527-5853P1952-20713D5854-6213P2072-21933D6214-6582扩增多肽编码区的引物两端添加NdeI和SacI位点，表达载体使用改造过的 pET28a(+)表达载体，该载体经过修改后，所表达目的蛋白的N端除6XHis tag蛋白标签 外，不含有多余的氨基酸序列。构建成功的表达载体转入Escherichia coli BL21(DE3)中，用0. 5mM IPTG诱导 多肽表达。多肽表达用SDS-PAGE检测，结果显示除PKum^Pnf^mH^三个多肽表达 失败外，其余多肽皆成功表达。
6
步骤二分割多肽的纯化多肽以不可溶的包涵体形式表达，纯化的包涵体使用8M尿素溶解，随后使用 Novagen公司的Ni-HTA进行亲和层析纯化，纯化后多肽纯度达到95%以上。步骤三确定与人体抗原存在交叉免疫原的多肽纯化后的多肽对ICR小鼠免疫，获得的抗血清分别与健康成年人和胎儿的脑组织 进行免疫组化试验，确定人体抗原的交叉免疫原。抗血清稀释倍数为1 200，二抗为购自中山公司的HRP标记的山羊抗小鼠的二 抗，显色底物为DAB，随后用光学显微镜观察试验结果。结果表明，与人体抗原的交叉反应 为强阳性的包括EV71总病毒，以及P23tH323，P
646-755， 857-1012'卩1329-144C)4 f 巾· Ιλ。“
的交叉反应为弱阳性的包括P1
-69
P,
P,
P,
P,
Pl441-1526，P’
P1
1952-2071，
P2Q72-2193IO种多肽。与人体抗原的不存在交叉反应的为 fVo-159，Pl40-249，P
1197-1338'
P
P
1649—1731， r1843-1951
…种多肽<
实施例2 疫苗的检测
将上述所得的15种弱交叉反应或无交叉反应的多肽组成18种组合，如表2所述 表218种多肽的组合
权利要求
一种人肠道病毒71型的亚单位混合疫苗，其特征在于，包括下述属于人肠道病毒71型多肽链的多肽中的一个或多个的任意组合，以及必要的佐剂，所述多肽分别为P1 69，P70 159，P140 249，P324 443，P444 565，P566 665，P746 876，P1197 1338，P1441 1526，P1549 1668，P1649 1731，P1732 1851，P1843 1951，P1952 2071，P2072 2193，所述下标数字代表所述多肽在EV71多肽链中的位置，从多肽链N端起始。
2.根据权利要求1所述的人肠道病毒71型的亚单位混合疫苗，其特征在于，所述人肠 道病毒71型选自于任何一种人肠道病毒71型毒株。
3.根据权利要求1所述的人肠道病毒71型的亚单位混合疫苗，其特征在于，以上述15 个多肽中任何一个或者多个的组合为母版，再添加少于或等于50个属于EV71多肽链的序 列。
4.根据权利要求1所述的人肠道病毒71型的亚单位混合疫苗，其特征在于，以上述15 个多肽中任何一个或者多个的组合为母版，再删除少于或等于50个属于EV71多肽链的序 列。
5.根据权利要求1所述的人肠道病毒71型的亚单位混合疫苗，其特征在于，以上述15 个多肽中任何一个或者多个的组合为母版，再添加任何不属于EV71多肽链编码区的序列。
6.根据权利要求1所述的人肠道病毒71型的亚单位混合疫苗，其特征在于，优选包括P746-876，Pll97-1338，Pl843-1951，P2072-2193^ ^^$5^。
7.根据权利要求1所述的人肠道病毒71型的亚单位混合疫苗，其特征在于，优选包括卩70-159' Pl40-249' P324-443' Ρ746-87θ4 个多月太°
全文摘要
本发明属于生物医学领域，提供一种人肠道病毒71型的亚单位混合疫苗，包括下述属于人肠道病毒71型多肽链的多肽中的一个或多个的任意组合，以及必要的佐剂，所述多肽分别为P1-69，P70-159，P140-249，P324-443，P444-565，P566-665，P746-876，P1197-1338，P1441-1526，P1549-1668，P1649-1731，P1732-1851，P1952-2071，P2072-2193，P1843-1951，该疫苗无潜在毒副反应，可以在体内外起到抗病毒感染的保护作用，是具有潜在临床应用价值的备选疫苗。
文档编号A61K39/125GK101947316SQ201010105060
公开日2011年1月19日 申请日期2010年2月2日 优先权日2010年2月2日
发明者刘江宁, 张连峰, 王卫, 秦川 申请人:中国医学科学院实验动物研究所
技术领域：
本发明属于生物医学领域，特别是涉及到研究人肠道病毒71型疫苗的方法。
背景技术：
人肠道病毒71型(EV71)于1969年首次被分离鉴定，是手足口病的病原体之一。 该病毒主要感染5岁以下儿童，主要导致手足口病及疱疹性咽峡炎，少数情况下的并发症 包括脑膜炎，肺水肿，出血等，严重病例可导致死亡。人肠道病毒71型曾引起世界范围内的 多次疾病暴发流行，上世纪80年代以来，人肠道病毒71型引发的手足口病在亚太地区肆 虐，引发了严重的婴幼儿死亡病例。我国自1981年在上海发现本病，以后各个省市均有报道。2009年3月全国通过传 染病网络直报系统报告的手足口病病例是54713例，死亡31例。从今年年初到4月7号， 网络直报显示，全国累计报告手足口病例115618例，其中重症773例，死亡50例。人肠道病毒71型多肽链全长2，193个氨基酸，在体内合成后切割成11个蛋白，包 括VP1，VP2, VP3, VP4，2A，2B，2C，3A，3B，3C，3D。目前该病的治疗尚无有效地药物，而研制安全而具有良好保护性能的疫苗，被认 为是防御EV71病毒感染的有效方法。目前报道的疫苗主要是使用灭活或减毒的全病毒，或 者全病毒的结构类似物，此类疫苗在小鼠模型中均能给与幼鼠良好的抗病毒保护作用。此 外，VPl蛋白被普遍认为集中了优势的抗原决定簇，该蛋白被用作亚单位疫苗时，也能在体 外表现出较好的保护效果，但是体内试验并不理想。但是，日本学者用减毒的全病毒疫苗免疫实验猴时，动物仍表现出一定的神经症 状，使人们对于全病毒疫苗的安全性提出了怀疑。此前，我们发现了 EV71病毒与人脑组织存在免疫交叉，并发现了引发这种免疫交 叉的区域，据此，我们进一步设计了剔除强交叉区域的混合亚单位疫苗。
发明内容
鉴于以上需要，本发明的主要目的在于提供一种无潜在毒副反应的人肠道病毒71 型(EV71)的亚单位混合疫苗。本发明提供的人肠道病毒71型(EV71)的亚单位混合疫苗，其包括下述属于人肠 道病毒71型多肽链的多肽中的一个或多个的任意组合，以及必要的佐剂，所述多肽分别为
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r1-69‘ r70-159' r140-249' r324-443‘ r444-565' r566-665' r746-876‘ r1197-1338' r1441-1526' r1549-1668' r1649-1731 ' r 1732-1851 '
Pl952-2071 'P2072-2193' P1843-1951，所述下标数字代表所述多肽在EV7 1多肽链中的位置，从多肽链N 端起始。所述人肠道病毒71型可以是任何一种人肠道病毒71型毒株；以上述15个多肽中任何一个或者多个的组合为母版，可以添加或删除少于或等 于50个属于EV71多肽链的序列；以上述15个多肽中任何一个或者多个的组合为母版，可以添加或删除任何不属于EV71多肽链编码区的序列；所述多肽通过以下方法筛选a.人肠道病毒71型多肽链的分割和工程表达将人肠道病毒71型多肽链分割成由22 156个氨基酸组成的多肽，共22个，分 别在大肠杆菌中表达，使用6XHis tag标签进行纯化；b.人肠道病毒71型多肽链的分割多肽抗原性的确定将纯化的蛋白对实验动物进行免疫，获得的抗血清分别与健康成年人和胎儿的脑 组织进行免疫组化试验，鉴定能与正常脑组织发生交叉反应的抗血清，确定与人体存在强 交叉免疫原区域的人肠道病毒71型多肽；确定与人体存在弱交叉免疫原区域的人肠道病 毒71型多肽；确定与人体不存在交叉免疫原区域的人肠道病毒71型多肽。上述步骤a中，将EV71病毒的多肽链进行顺序分割，将2193个氨基酸从N端依次 分割成22 156个氨基酸构成的多肽，共22个，绝大多数多肽的分子量在IOkDa左右；上述步骤a中，相邻并且同属于一个蛋白的两个多肽之间存在4 19个氨基酸的 重叠，避免了抗原决定簇的筛选遗漏；上述步骤a中，多肽的N端与6XHis tag标签进行融合表达，因为6XHis tag蛋 白标签不会对多肽的抗原性产生明显影响，同时有利于多肽的纯化；上述步骤b中，P23Q_323，P646_755，P857_1Q12，P1329_144q4种多肽与人体抗原的交叉反应结 果为强阳性，下标数字表示在多肽在总病毒中多肽链上的位置，从N端起始，它们分别属于 人肠道病毒 71 型中的 VP2，VP1，2A，2C 蛋白 ，P324_443，P444_565，P566_665，P746_876，P1441_1526，
Pl549-1668，Pl732-1851， 1952"2071' ^2012-219^^ 种多肽与人体抗原的交叉反应结果为弱阳性，它们分
别属于人肠道病毒 71 型中的 VP4，VP3，VP1，3A，3C 以及 3D 蛋白；P7(1_159，P14ch249，P1197^1338, P1649-I73I' P1843-19515种多肽与人体抗原不存在交叉反应，它们分别属于人肠道病毒71型中的 VP2，2C，3C以及3D蛋白。将上述15个多肽中的一个或者多个的组合进行等量，组成亚单位混合疫苗，进行 效果验证疫苗对雌性小鼠进行免疫，测定了小鼠血清的抗体滴度，中和效价和与人脑组织 的交叉反应。免疫后的雌鼠进行交配，母源抗体可以通过胎盘屏障进入到幼鼠体内，对幼鼠 进行病毒攻击后，通过测定幼鼠组织中病毒数量变化和病理表现，证明该疫苗具有良好保 护性能。疫苗对雌性小鼠进行两次免疫后，病毒中和效价达到26以上。对免疫后雌鼠产下 的幼鼠攻毒后，母源抗体可以有效的清除幼鼠体内的病毒，7日后肌肉组织内病毒含量接近 于零，且在5日内可以有效的清除75%以上幼鼠组织内的病毒，7日内可以有效的清除全部 幼鼠组织内病毒，保护率接近100%。病理观察发现幼鼠的组织没有明显的病理变化。综上所述，本发明提供的所述人肠道病毒71型的亚单位混合疫苗，可以在体内外 起到抗病毒感染的保护作用，是具有潜在临床应用价值的备选疫苗。
具体实施例方式以下结合具体实施方案对本发明作进一步详细说明，但不作对其的限定实施例1
多肽的筛选步骤一人肠道病毒71型的分割和工程表达分割所采用的菌株名称为Fuyang-0805a，其NCBI中存储号为⑶350629。该菌株 的基因组CDS区共6582bp，编码2193个氨基酸，分割多肽的大小控制在100个氨基酸(aa) 左右，下限为22aa，上限为156aa，位于同一个蛋白内的相邻两个多肽间存在4 15aa的重 叠，如表1。表1人肠道病毒71型的分割方式多肽名称 所属蛋白多肽编码区在人肠道病毒
71型基因组编码区中的位
置
P1-69VP41-207P70-159VP2208-477P140-249VP2418-747P230-323VP2688-969P324-443VP3970-1329P444-565VP31330-1695P566-665VPl1696-1995P646-755VPl1936-2265P746-876VPl2236-2628P857-10122A2569-3036Pl013-llll2B3037-3333Plll2-12012C3334-3603Pll97-13382C3589-4014Pl329-14402C3985-4320Pl441-15263A4321-4578Pl527-15483B4579-4644Pl549-16683C4645-5004Pl649-17313C4945-5193Pl732-18513D5194-5553P]843-19513D5527-5853P1952-20713D5854-6213P2072-21933D6214-6582扩增多肽编码区的引物两端添加NdeI和SacI位点，表达载体使用改造过的 pET28a(+)表达载体，该载体经过修改后，所表达目的蛋白的N端除6XHis tag蛋白标签 外，不含有多余的氨基酸序列。构建成功的表达载体转入Escherichia coli BL21(DE3)中，用0. 5mM IPTG诱导 多肽表达。多肽表达用SDS-PAGE检测，结果显示除PKum^Pnf^mH^三个多肽表达 失败外，其余多肽皆成功表达。
6
步骤二分割多肽的纯化多肽以不可溶的包涵体形式表达，纯化的包涵体使用8M尿素溶解，随后使用 Novagen公司的Ni-HTA进行亲和层析纯化，纯化后多肽纯度达到95%以上。步骤三确定与人体抗原存在交叉免疫原的多肽纯化后的多肽对ICR小鼠免疫，获得的抗血清分别与健康成年人和胎儿的脑组织 进行免疫组化试验，确定人体抗原的交叉免疫原。抗血清稀释倍数为1 200，二抗为购自中山公司的HRP标记的山羊抗小鼠的二 抗，显色底物为DAB，随后用光学显微镜观察试验结果。结果表明，与人体抗原的交叉反应 为强阳性的包括EV71总病毒，以及P23tH323，P
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的交叉反应为弱阳性的包括P1
-69
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P,
P,
P,
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1952-2071，
P2Q72-2193IO种多肽。与人体抗原的不存在交叉反应的为 fVo-159，Pl40-249，P
1197-1338'
P
P
1649—1731， r1843-1951
…种多肽<
实施例2 疫苗的检测
将上述所得的15种弱交叉反应或无交叉反应的多肽组成18种组合，如表2所述 表218种多肽的组合
权利要求
一种人肠道病毒71型的亚单位混合疫苗，其特征在于，包括下述属于人肠道病毒71型多肽链的多肽中的一个或多个的任意组合，以及必要的佐剂，所述多肽分别为P1 69，P70 159，P140 249，P324 443，P444 565，P566 665，P746 876，P1197 1338，P1441 1526，P1549 1668，P1649 1731，P1732 1851，P1843 1951，P1952 2071，P2072 2193，所述下标数字代表所述多肽在EV71多肽链中的位置，从多肽链N端起始。
2.根据权利要求1所述的人肠道病毒71型的亚单位混合疫苗，其特征在于，所述人肠 道病毒71型选自于任何一种人肠道病毒71型毒株。
3.根据权利要求1所述的人肠道病毒71型的亚单位混合疫苗，其特征在于，以上述15 个多肽中任何一个或者多个的组合为母版，再添加少于或等于50个属于EV71多肽链的序 列。
4.根据权利要求1所述的人肠道病毒71型的亚单位混合疫苗，其特征在于，以上述15 个多肽中任何一个或者多个的组合为母版，再删除少于或等于50个属于EV71多肽链的序 列。
5.根据权利要求1所述的人肠道病毒71型的亚单位混合疫苗，其特征在于，以上述15 个多肽中任何一个或者多个的组合为母版，再添加任何不属于EV71多肽链编码区的序列。
6.根据权利要求1所述的人肠道病毒71型的亚单位混合疫苗，其特征在于，优选包括P746-876，Pll97-1338，Pl843-1951，P2072-2193^ ^^$5^。
7.根据权利要求1所述的人肠道病毒71型的亚单位混合疫苗，其特征在于，优选包括卩70-159' Pl40-249' P324-443' Ρ746-87θ4 个多月太°
全文摘要
本发明属于生物医学领域，提供一种人肠道病毒71型的亚单位混合疫苗，包括下述属于人肠道病毒71型多肽链的多肽中的一个或多个的任意组合，以及必要的佐剂，所述多肽分别为P1-69，P70-159，P140-249，P324-443，P444-565，P566-665，P746-876，P1197-1338，P1441-1526，P1549-1668，P1649-1731，P1732-1851，P1952-2071，P2072-2193，P1843-1951，该疫苗无潜在毒副反应，可以在体内外起到抗病毒感染的保护作用，是具有潜在临床应用价值的备选疫苗。
文档编号A61K39/125GK101947316SQ201010105060
公开日2011年1月19日 申请日期2010年2月2日 优先权日2010年2月2日
发明者刘江宁, 张连峰, 王卫, 秦川 申请人:中国医学科学院实验动物研究所
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