一种拉米夫定孪药的制备方法及其应用的制作方法
专利名称：一种拉米夫定孪药的制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于制药领域，涉及一种拉米夫定孪药的制备方法，以及该孪药作为肝炎
治疗药物的应用。
背景技术：
全球有近20亿人被乙型肝炎病毒(HBV)感染，其中约有3. 5亿人为HBV慢性感染 者，我国的慢性无症状HBV携带者可能超过1. 2亿人。由于乙型肝炎对人类的危害极大，每 年约有120万HBV感染患者死于HBV相关疾病。我国每年直接用于病毒性肝炎的医疗费用 高达300-500亿元，因此研发对HBV感染者安全有效的治疗药物在全世界特别是在我国显 得尤为迫切。 临床上抗HBV采用的主要是药物治疗和基因治疗，药物治疗是临床应用的重点， 主要分为生物类药物、化学类药物和中草药及有效成分三类。但真正在世界范围内广泛应 用的只有干扰素和拉米夫定为代表的核苷类抗病毒药物。目前临床应用较多的是拉米夫 定，它治疗乙肝的疗效以得到全球性的认可，是抗病毒治疗的一线主要药物。
拉米夫定(LAM， II)通过竞争性抑制乙型肝炎病毒DNA多聚酶，抑制乙型肝炎病毒 DNA的合成，能够持续抑制乙肝病毒的复制，使慢性乙型肝炎患者肝组织学明显改善。由于 拉米夫定不能杀灭乙型肝炎病毒，停药后病情容易反跳。在连续用药过程中，乙型肝炎病毒 对拉米夫定易耐药。临床资料显示，单用拉米夫定治疗慢性乙型肝炎肝功能恢复缓慢，从开 始用药到转氨酶恢复正常，其间有一段较长的炎症期。因为只有当病毒数量降低到一定程 度，炎症才能停止，这个过程至少需要2-3个月。研究证实，肝功能恢复延迟会给肝脏造成 一定程度的慢性损害。拉米夫定不能溶解肝间质中的纤维细胞，只能间接延缓肝纤维化进 程，因而它不能有效地减轻患者的肝纤维化，在拉米夫定治疗慢性乙型肝炎时，必须加强抗 纤维化的治疗。 熊果酸(UA， III)属非极性的五环三萜类化合物，是在自然界广为分布的一种天 然活性药物，具有广泛的生理活性。熊果酸临床表现有显著而迅速降低谷丙转氨酶、血清转 氨酶、消退黄疽、增进食欲、抗纤维化和恢复肝功能的作用，具有见效快、疗程短、效果稳定 的特点。印度学者Saraswat等发现熊果酸(5 20mg/kg)对CC14引起的大鼠肝毒性有保 护作用。用熊果酸作预处理可明显提高大鼠肝细胞的成活率，并在实验中观察到熊果酸具 有抗胆汁淤积的作用，胆汁流量及其内容物均有增加。由CC14的作用机制推测熊果酸对损 伤肝细胞的治疗作用机制可能与其同分异构体齐墩果酸相似，在于保护和稳定肝细胞膜及 细胞器的生物膜系统，使其变动通透及主动运输功能恢复正常，细胞内外离子和水的移动 及分布亦随之复原，再生能力相继恢复，促进肝小叶中央区坏死肝细胞修复。李开泉等研究 发现熊果酸在制备治疗病毒性肝炎药物中不论单独使用，还是与其他药物配合使用，均具 有显著治疗病毒性肝炎的作用，效果优于齐墩果酸对照组的疗效。临床试验证明，熊果酸能 够显著而迅速降低谷丙转氨酶，消退黄疸，恢复肝功能，对乙型肝炎也有一定治疗作用。
齐墩果酸(OA， IV)是一种齐墩果烷型五环三萜类化合物，广泛分布于自然界中大
3约60个科190种植物中。齐墩果酸具有消炎、增强免疫、抑制血小板降集、降糖、抗氧化和 利尿作用等多方面的临床药理作用，还具有护肝、抗高血脂、抗动脉粥样硬化及抗肿瘤等生 物活性。齐墩果酸是治疗急性黄胆型肝炎和慢性病毒性肝炎比较理想的药物，且毒性低， 不良反应少。20世纪70年代人们便已开始了对齐墩果酸保肝作用的研究，发现经齐墩果 酸治疗后的四氯化碳中毒大鼠血清中谷丙转氨酶明显下降，肝内三酰甘油蓄积明显减少， 组织学及组织化学显示肝细胞变性，坏死明显减轻，而且糖原蓄积增加，胞浆内RNA颗粒恢 复，电镜下观察线粒体肿胀，粗面内质网囊泡化基本恢复正常。表明齐墩果酸能对CCl4引 起的急慢性肝炎损伤有明显保护作用，能防止实验性肝硬化的发生。其机制可能在于齐墩 果酸保护和稳定了肝细胞膜及细胞器的生物膜系统，使其变动通透及主动运输功能恢复正 常，细胞内、外离子和水的移动及分布亦随之复原，于是胞质疏松及气球样变的肝细胞转化 为正常，再生能力相继恢复，促进肝小叶中央区坏死肝细胞修复。20世纪80年代人们又通 过组织病理学的检查进一步证实了齐墩果酸的肝保护作用。研究报道齐墩果酸作用下残留 的肝脏其核分裂数目明显增多。齐墩果酸对肝脏的保护作用主要归因于它的抗氧化、抗炎 作用以及对药物代谢酶的影响。韩德伟在实验研究中发现，齐墩果酸可促进肝细胞再生，使 坏死区迅速修复，使变性坏死的肝组织恢复正常来减轻丙氨酸的活力下降，使肝组织炎症 反应减弱，血中丙种球蛋白下降，从而抑制发胶原纤维增生，使肝硬化难以形成。其药理作 用与剂量有关，低剂量的齐墩果酸具有保肝作用。
结构式为
(n) (m) (iv)
发明内容
技术问题 本发明提出了针对拉米夫定治疗慢性乙型肝炎过程中会给肝脏造成一定程度的 慢性损害，并且不能溶解肝间质中的纤维细胞，只能间接延缓肝纤维化进程，不能有效地减 轻患者的肝纤维化等不足之处，提供一种拉米夫定_熊果酸或拉米夫定_齐墩果酸孪药及 其制备方法，该孪药在具有抗病毒作用的同时又具有较强的抗炎、保护肝细胞膜、改善肝功 能及抗纤维化作用，弥补了拉米夫定临床治疗的不足，是抗病毒疗法与护肝治疗的有机结 合。 技术方案 本发明提出了一种具有抗病毒和肝保护双重疗效的孪药，其结构通式(I)为
C I )其中= H或CH3， R2 = H或CH3， R3 = H或CH3， n = 1，2。 该类化合物降解后释放出原药拉米夫定和熊果酸或齐墩果酸。其连接基团水解后 是羟基乙酸或羟基丙酸，羟基乙酸或羟基丙酸是体内三羧酸循环的中间代谢物，其吸收和 代谢机理已经明确，具有可靠的生物安全性。
有益效果 为了弥补拉米夫定治疗慢性乙型肝炎过程中会给肝脏造成一定程度的慢性损害， 以及不能溶解肝间质中的纤维细胞，只能间接延缓肝纤维化进程，不能有效地减轻患者的 肝纤维化等不足之处，提出了拉米夫定_熊果酸或拉米夫定_齐墩果酸孪药的设想，在抗乙 肝药物拉米夫定的分子上连接具有抗纤维化和肝保护活性的熊果酸或齐墩果酸制成孪药， 进入体内后释放出原药拉米夫定和熊果酸或齐墩果酸，在具有抗病毒作用的同时又具有较
强的抗炎、保护肝细胞膜、改善肝功能及抗纤维化作用。该设计弥补了拉米夫定临床治疗的 不足，是抗病毒疗法与护肝治疗的有机结合。 本发明的孪药是以氯(溴)乙酸乙酯或氯(溴)丙酸乙酯为连接基团将拉米夫定 和熊果酸或齐墩果酸以共价键拼合入一个分子，使孪药的结构不太复杂，易于制备和质量 控制，易于应用。 本发明的孪药中原药以酯键和酰胺键的形式连接，有利于孪药在体内的水解。
具体实施例方式
下面的实施例可使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本 发明。 本发明的合成路线(以氯(溴)乙酸乙酯作为为连接基团的拉米夫定-熊果酸孪
药为例)
5
实施例1 2-熊果酰氧基乙酸 将熊果酸5g溶于DMF125ml中，加入氯乙酸乙酯1. 17ml (或等mol的溴乙酸乙酯)、 K2C03 4. 5g，室温搅拌反应5小时。过滤除去不溶固体，滤液减压浓縮，甲苯30mlX3带尽 DMF，得淡黄色清油状液体即为酯化产物，不经纯化，直接用于下一步反应。
将上述油状液中加入4N NaOH aq 30ml、甲醇50ml、THF 75ml，搅拌得淡黄色清液， 室温搅拌反应18小时。减压浓縮，得淡粉色固体，加入水90ml，用4N NaOH aq调pH = 3， 固体变白，且更稠厚，加入三氯甲烷75ml，搅拌至固体溶解，分液，用三氯甲烷70ml萃取水
6层，合并三氯甲烷层，浓縮至干，得类白色固体即为水解产物，5. 35g，两步总收率94.9X。 MS-ESI(-) :513. 3[M-H]—，MS-ESI(+) :515. 3[M+H] + 。 实施例2以氯(溴)乙酸乙酯为连接基团的拉米夫定_熊果酸孪药(LMX)
将上述水解产物3g加入DMF 30ml中，搅拌溶解，控外温_15°C _20"，加入三乙 胺0. 8lml ，缓慢滴加氯甲酸异丁酯1. 2g，滴加完毕，保温搅拌反应20min，有白色固体析出，
不经处理直接用于下一步。 配制拉米夫定1.337g、三乙胺1.2ml在DMF 15ml中的溶液，在外温-15。C _20°C 的条件下缓慢滴加到上述反应液中。滴加完毕，保温搅拌反应1小时，后升至室温，继续搅 拌l小时。滤去不溶物，滤液减压浓縮，甲苯30mlX4带尽DMF，得白色糊状物即为粗产物。向 上述粗产物中加入三氯甲烷75ml，在6(TC水浴中振荡5min，滤除不溶物，滤液用1%HC1 aq 75mlX2洗涤，分液，三氯甲烷层减压浓縮得淡棕黄色油状液，经硅胶柱层析(洗脱剂乙酸 乙酯/石油醚(60-90°C) =2 : 1)纯化得白色固体1.3g，两步总收率30. 7%。MS-ESI(_): 724.3[M-H]—， MS-ESI(+) :726. 4 [M+H]+。丄H NMR(d， ppm， CDC13) :0. 709—2. 277 (m， 45H)，
3. 190-3. 242 (m， 2H) ， 3. 628—3. 687 (dd， 1H) ， 3. 956—4. 007 (dd， 1H) ， 4. 089—4. 161 (m， 1H)，
4. 172-4. 215 (m， 1H) ， 4. 564—4. 619 (m， 2H) ， 4. 741—4. 794 (m， 1H) ， 5. 375 (s， 2H) ， 6. 340 (s， 1H) ， 7. 393 (d， 1H) ， 8. 555-8. 567 (d， 1H)。 实施例3以2-氯(溴)丙酸乙酯为连接基团的拉米夫定_熊果酸孪药(LMX-2)
操作同实施例1、2 ; 实施例4以3-氯(溴)丙酸乙酯为连接基团的拉米夫定_熊果酸孪药(LMX-3)
操作同实施例1、2 ; 实施例5以氯(溴)乙酸乙酯为连接基团的拉米夫定_齐墩果酸孪药(LMX-4)
操作同实施例1、2 ; 实施例6以2-氯(溴)丙酸乙酯为连接基团的拉米夫定-齐墩果酸孪药(LMX-5)
操作同实施例1、2 ; 实施例7以3-氯(溴)丙酸乙酯为连接基团的拉米夫定-齐墩果酸孪药(LMX-6) 操作同实施例1、2 ; 实施例8抗鸭乙型肝炎病毒作用实验 雄性一 日龄麻鸭，常规饲养，饲养环境温度24°C 26°C ，相对湿度60 80 % ，定 时通风换气，每日约12小时光照。实验时体重约70克/只，于第5天经胫静脉取血，分离 血清后，用PCR的方法检测DHBV，选出先天感染的鸭子进行实验。 用0. 5%羧甲基纤维素钠按250mg/kg/d、100mg/kg/d和50mg/kg/d剂量配制受试 药物LMX。按每只实验鸭70g，每次给药lml计算，每只实验鸭称重，按实际重量确定给药体 积。如此类推，实验鸭体重P < 0. 05增加后，按比例调整浓度。 样品分大、中和小剂量组(分别为250mg/kg/d ;100mg/kg/d ;50mg/kg/d)，给药量 均为lml/只/天；另设病毒对照(DHBV)，以0. 5%羧甲基纤维素钠代替药物；阳性药用拉米 夫定(3TC) lml/只/天。以上药物均灌胃给药，10天一疗程。在用药前(T。)、用药第5天 (T5)、第10天(T1Q)及停药后第5天(P5)，自鸭胫静脉取血，分离血清，_701:冻存待检。其 中，大和小剂量组鸭血清用定量PCR法测定DHBV-DNA，中剂量组鸭血清用斑点杂交法测定 DHBV-DNA。
结果显示实验病毒对照组动物血清DHBV-DNA水平稳定，受试药物LMX 250mg/ kg/d、 100mg/kg/d和50mg/kg/d 10天疗程各时点动物血清DHBV-DNA显著小于阳性药物拉 米夫定组(P < 0. 05)，受试药物LMX抗病毒活性强于阳性药物拉米夫定。
本文中DMF是指N， N_ 二甲基甲酰胺，K2C03是指碳酸钾，NaOH是指氢氧化钠，THF 是指四氢呋喃，HC1是指盐酸。
权利要求
一种具有抗病毒作用的同时又具有肝保护作用的孪药，其特征在于拉米夫定和肝保护药物拼合而成，该化合物通式如(I)所述其中，R1＝CH3，R2＝H，R3＝H或甲基；R1＝H，R2＝CH3，R3＝H或甲基；n＝1，2。F2010100182285C00011.tif
2. 权利要求l中所述的拉米夫定孪药，其特征在于肝保护药物包括熊果酸和齐墩果酸。
3. 权利要求l中所述的拉米夫定孪药的制备方法，其特征在于拉米夫定和熊果酸或齐 墩果酸以氯(溴)乙酸乙酯或氯(溴)丙酸乙酯为连接基团，先在低温条件下制备混合酸 酐，再与拉米夫定縮合成拉米夫定_熊果酸或拉米夫定_齐墩果酸孪药。
4. 根据权利要求3中所述的制备方法，其特征在于其连接基团为氯乙酸乙酯、溴乙酸 乙酯、2-氯丙酸乙酯、2-溴丙酸乙酯、3-氯丙酸乙酯、3-溴丙酸乙酯或它们的其它烷基酯类 衍生物；优选氯乙酸乙酯。
5. 根据权利要求3所述的的制备方法，其特征在于低温条件指0°C _78°C。
6. 根据权利要求3所述的的制备方法，其特征在于混合酸酐是指熊果酸或齐墩果酸与 其相应的连接基团连接后与氯甲酸异丙酯、氯甲酸异丁酯或其它氯甲酸烷基酯衍生物制备 的混合酸酐；优选氯甲酸异丁酯。
7. 根据权利要求3所述的的制备方法，其特征在于縮合采用的脱酸剂为三乙胺或吡 啶；优选三乙胺。
8. 根据权利要求3所述的的制备方法，其特征在于所选溶剂为氯仿、N， N- 二甲基甲酰 胺、二氯甲烷。
9. 根据权利要求l中所述的拉米夫定孪药，在临床肝炎治疗中的应用。
全文摘要
本发明提供一种拉米夫定孪药的制备方法及其应用，将拉米夫定和熊果酸或齐墩果酸以氯(溴)乙酸乙酯或氯(溴)丙酸乙酯为连接基团，在低温条件下缩合成拉米夫定-熊果酸或拉米夫定-齐墩果酸孪药。该孪药可能具有双重作用机制，在具有抗病毒作用的同时又具有较强的抗炎、保护肝细胞膜、改善肝功能及抗纤维化作用，是抗病毒疗法与护肝治疗的有机结合，为肝炎治疗药物的研发提供新的思路。
文档编号A61K31/513GK101766632SQ201010018228
公开日2010年7月7日 申请日期2010年1月20日 优先权日2010年1月20日
发明者仲琰, 周建平, 霍美蓉 申请人:中国药科大学
技术领域：
本发明属于制药领域，涉及一种拉米夫定孪药的制备方法，以及该孪药作为肝炎
治疗药物的应用。
背景技术：
全球有近20亿人被乙型肝炎病毒(HBV)感染，其中约有3. 5亿人为HBV慢性感染 者，我国的慢性无症状HBV携带者可能超过1. 2亿人。由于乙型肝炎对人类的危害极大，每 年约有120万HBV感染患者死于HBV相关疾病。我国每年直接用于病毒性肝炎的医疗费用 高达300-500亿元，因此研发对HBV感染者安全有效的治疗药物在全世界特别是在我国显 得尤为迫切。 临床上抗HBV采用的主要是药物治疗和基因治疗，药物治疗是临床应用的重点， 主要分为生物类药物、化学类药物和中草药及有效成分三类。但真正在世界范围内广泛应 用的只有干扰素和拉米夫定为代表的核苷类抗病毒药物。目前临床应用较多的是拉米夫 定，它治疗乙肝的疗效以得到全球性的认可，是抗病毒治疗的一线主要药物。
拉米夫定(LAM， II)通过竞争性抑制乙型肝炎病毒DNA多聚酶，抑制乙型肝炎病毒 DNA的合成，能够持续抑制乙肝病毒的复制，使慢性乙型肝炎患者肝组织学明显改善。由于 拉米夫定不能杀灭乙型肝炎病毒，停药后病情容易反跳。在连续用药过程中，乙型肝炎病毒 对拉米夫定易耐药。临床资料显示，单用拉米夫定治疗慢性乙型肝炎肝功能恢复缓慢，从开 始用药到转氨酶恢复正常，其间有一段较长的炎症期。因为只有当病毒数量降低到一定程 度，炎症才能停止，这个过程至少需要2-3个月。研究证实，肝功能恢复延迟会给肝脏造成 一定程度的慢性损害。拉米夫定不能溶解肝间质中的纤维细胞，只能间接延缓肝纤维化进 程，因而它不能有效地减轻患者的肝纤维化，在拉米夫定治疗慢性乙型肝炎时，必须加强抗 纤维化的治疗。 熊果酸(UA， III)属非极性的五环三萜类化合物，是在自然界广为分布的一种天 然活性药物，具有广泛的生理活性。熊果酸临床表现有显著而迅速降低谷丙转氨酶、血清转 氨酶、消退黄疽、增进食欲、抗纤维化和恢复肝功能的作用，具有见效快、疗程短、效果稳定 的特点。印度学者Saraswat等发现熊果酸(5 20mg/kg)对CC14引起的大鼠肝毒性有保 护作用。用熊果酸作预处理可明显提高大鼠肝细胞的成活率，并在实验中观察到熊果酸具 有抗胆汁淤积的作用，胆汁流量及其内容物均有增加。由CC14的作用机制推测熊果酸对损 伤肝细胞的治疗作用机制可能与其同分异构体齐墩果酸相似，在于保护和稳定肝细胞膜及 细胞器的生物膜系统，使其变动通透及主动运输功能恢复正常，细胞内外离子和水的移动 及分布亦随之复原，再生能力相继恢复，促进肝小叶中央区坏死肝细胞修复。李开泉等研究 发现熊果酸在制备治疗病毒性肝炎药物中不论单独使用，还是与其他药物配合使用，均具 有显著治疗病毒性肝炎的作用，效果优于齐墩果酸对照组的疗效。临床试验证明，熊果酸能 够显著而迅速降低谷丙转氨酶，消退黄疸，恢复肝功能，对乙型肝炎也有一定治疗作用。
齐墩果酸(OA， IV)是一种齐墩果烷型五环三萜类化合物，广泛分布于自然界中大
3约60个科190种植物中。齐墩果酸具有消炎、增强免疫、抑制血小板降集、降糖、抗氧化和 利尿作用等多方面的临床药理作用，还具有护肝、抗高血脂、抗动脉粥样硬化及抗肿瘤等生 物活性。齐墩果酸是治疗急性黄胆型肝炎和慢性病毒性肝炎比较理想的药物，且毒性低， 不良反应少。20世纪70年代人们便已开始了对齐墩果酸保肝作用的研究，发现经齐墩果 酸治疗后的四氯化碳中毒大鼠血清中谷丙转氨酶明显下降，肝内三酰甘油蓄积明显减少， 组织学及组织化学显示肝细胞变性，坏死明显减轻，而且糖原蓄积增加，胞浆内RNA颗粒恢 复，电镜下观察线粒体肿胀，粗面内质网囊泡化基本恢复正常。表明齐墩果酸能对CCl4引 起的急慢性肝炎损伤有明显保护作用，能防止实验性肝硬化的发生。其机制可能在于齐墩 果酸保护和稳定了肝细胞膜及细胞器的生物膜系统，使其变动通透及主动运输功能恢复正 常，细胞内、外离子和水的移动及分布亦随之复原，于是胞质疏松及气球样变的肝细胞转化 为正常，再生能力相继恢复，促进肝小叶中央区坏死肝细胞修复。20世纪80年代人们又通 过组织病理学的检查进一步证实了齐墩果酸的肝保护作用。研究报道齐墩果酸作用下残留 的肝脏其核分裂数目明显增多。齐墩果酸对肝脏的保护作用主要归因于它的抗氧化、抗炎 作用以及对药物代谢酶的影响。韩德伟在实验研究中发现，齐墩果酸可促进肝细胞再生，使 坏死区迅速修复，使变性坏死的肝组织恢复正常来减轻丙氨酸的活力下降，使肝组织炎症 反应减弱，血中丙种球蛋白下降，从而抑制发胶原纤维增生，使肝硬化难以形成。其药理作 用与剂量有关，低剂量的齐墩果酸具有保肝作用。
结构式为
(n) (m) (iv)
发明内容
技术问题 本发明提出了针对拉米夫定治疗慢性乙型肝炎过程中会给肝脏造成一定程度的 慢性损害，并且不能溶解肝间质中的纤维细胞，只能间接延缓肝纤维化进程，不能有效地减 轻患者的肝纤维化等不足之处，提供一种拉米夫定_熊果酸或拉米夫定_齐墩果酸孪药及 其制备方法，该孪药在具有抗病毒作用的同时又具有较强的抗炎、保护肝细胞膜、改善肝功 能及抗纤维化作用，弥补了拉米夫定临床治疗的不足，是抗病毒疗法与护肝治疗的有机结 合。 技术方案 本发明提出了一种具有抗病毒和肝保护双重疗效的孪药，其结构通式(I)为
C I )其中= H或CH3， R2 = H或CH3， R3 = H或CH3， n = 1，2。 该类化合物降解后释放出原药拉米夫定和熊果酸或齐墩果酸。其连接基团水解后 是羟基乙酸或羟基丙酸，羟基乙酸或羟基丙酸是体内三羧酸循环的中间代谢物，其吸收和 代谢机理已经明确，具有可靠的生物安全性。
有益效果 为了弥补拉米夫定治疗慢性乙型肝炎过程中会给肝脏造成一定程度的慢性损害， 以及不能溶解肝间质中的纤维细胞，只能间接延缓肝纤维化进程，不能有效地减轻患者的 肝纤维化等不足之处，提出了拉米夫定_熊果酸或拉米夫定_齐墩果酸孪药的设想，在抗乙 肝药物拉米夫定的分子上连接具有抗纤维化和肝保护活性的熊果酸或齐墩果酸制成孪药， 进入体内后释放出原药拉米夫定和熊果酸或齐墩果酸，在具有抗病毒作用的同时又具有较
强的抗炎、保护肝细胞膜、改善肝功能及抗纤维化作用。该设计弥补了拉米夫定临床治疗的 不足，是抗病毒疗法与护肝治疗的有机结合。 本发明的孪药是以氯(溴)乙酸乙酯或氯(溴)丙酸乙酯为连接基团将拉米夫定 和熊果酸或齐墩果酸以共价键拼合入一个分子，使孪药的结构不太复杂，易于制备和质量 控制，易于应用。 本发明的孪药中原药以酯键和酰胺键的形式连接，有利于孪药在体内的水解。
具体实施例方式
下面的实施例可使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本 发明。 本发明的合成路线(以氯(溴)乙酸乙酯作为为连接基团的拉米夫定-熊果酸孪
药为例)
5
实施例1 2-熊果酰氧基乙酸 将熊果酸5g溶于DMF125ml中，加入氯乙酸乙酯1. 17ml (或等mol的溴乙酸乙酯)、 K2C03 4. 5g，室温搅拌反应5小时。过滤除去不溶固体，滤液减压浓縮，甲苯30mlX3带尽 DMF，得淡黄色清油状液体即为酯化产物，不经纯化，直接用于下一步反应。
将上述油状液中加入4N NaOH aq 30ml、甲醇50ml、THF 75ml，搅拌得淡黄色清液， 室温搅拌反应18小时。减压浓縮，得淡粉色固体，加入水90ml，用4N NaOH aq调pH = 3， 固体变白，且更稠厚，加入三氯甲烷75ml，搅拌至固体溶解，分液，用三氯甲烷70ml萃取水
6层，合并三氯甲烷层，浓縮至干，得类白色固体即为水解产物，5. 35g，两步总收率94.9X。 MS-ESI(-) :513. 3[M-H]—，MS-ESI(+) :515. 3[M+H] + 。 实施例2以氯(溴)乙酸乙酯为连接基团的拉米夫定_熊果酸孪药(LMX)
将上述水解产物3g加入DMF 30ml中，搅拌溶解，控外温_15°C _20"，加入三乙 胺0. 8lml ，缓慢滴加氯甲酸异丁酯1. 2g，滴加完毕，保温搅拌反应20min，有白色固体析出，
不经处理直接用于下一步。 配制拉米夫定1.337g、三乙胺1.2ml在DMF 15ml中的溶液，在外温-15。C _20°C 的条件下缓慢滴加到上述反应液中。滴加完毕，保温搅拌反应1小时，后升至室温，继续搅 拌l小时。滤去不溶物，滤液减压浓縮，甲苯30mlX4带尽DMF，得白色糊状物即为粗产物。向 上述粗产物中加入三氯甲烷75ml，在6(TC水浴中振荡5min，滤除不溶物，滤液用1%HC1 aq 75mlX2洗涤，分液，三氯甲烷层减压浓縮得淡棕黄色油状液，经硅胶柱层析(洗脱剂乙酸 乙酯/石油醚(60-90°C) =2 : 1)纯化得白色固体1.3g，两步总收率30. 7%。MS-ESI(_): 724.3[M-H]—， MS-ESI(+) :726. 4 [M+H]+。丄H NMR(d， ppm， CDC13) :0. 709—2. 277 (m， 45H)，
3. 190-3. 242 (m， 2H) ， 3. 628—3. 687 (dd， 1H) ， 3. 956—4. 007 (dd， 1H) ， 4. 089—4. 161 (m， 1H)，
4. 172-4. 215 (m， 1H) ， 4. 564—4. 619 (m， 2H) ， 4. 741—4. 794 (m， 1H) ， 5. 375 (s， 2H) ， 6. 340 (s， 1H) ， 7. 393 (d， 1H) ， 8. 555-8. 567 (d， 1H)。 实施例3以2-氯(溴)丙酸乙酯为连接基团的拉米夫定_熊果酸孪药(LMX-2)
操作同实施例1、2 ; 实施例4以3-氯(溴)丙酸乙酯为连接基团的拉米夫定_熊果酸孪药(LMX-3)
操作同实施例1、2 ; 实施例5以氯(溴)乙酸乙酯为连接基团的拉米夫定_齐墩果酸孪药(LMX-4)
操作同实施例1、2 ; 实施例6以2-氯(溴)丙酸乙酯为连接基团的拉米夫定-齐墩果酸孪药(LMX-5)
操作同实施例1、2 ; 实施例7以3-氯(溴)丙酸乙酯为连接基团的拉米夫定-齐墩果酸孪药(LMX-6) 操作同实施例1、2 ; 实施例8抗鸭乙型肝炎病毒作用实验 雄性一 日龄麻鸭，常规饲养，饲养环境温度24°C 26°C ，相对湿度60 80 % ，定 时通风换气，每日约12小时光照。实验时体重约70克/只，于第5天经胫静脉取血，分离 血清后，用PCR的方法检测DHBV，选出先天感染的鸭子进行实验。 用0. 5%羧甲基纤维素钠按250mg/kg/d、100mg/kg/d和50mg/kg/d剂量配制受试 药物LMX。按每只实验鸭70g，每次给药lml计算，每只实验鸭称重，按实际重量确定给药体 积。如此类推，实验鸭体重P < 0. 05增加后，按比例调整浓度。 样品分大、中和小剂量组(分别为250mg/kg/d ;100mg/kg/d ;50mg/kg/d)，给药量 均为lml/只/天；另设病毒对照(DHBV)，以0. 5%羧甲基纤维素钠代替药物；阳性药用拉米 夫定(3TC) lml/只/天。以上药物均灌胃给药，10天一疗程。在用药前(T。)、用药第5天 (T5)、第10天(T1Q)及停药后第5天(P5)，自鸭胫静脉取血，分离血清，_701:冻存待检。其 中，大和小剂量组鸭血清用定量PCR法测定DHBV-DNA，中剂量组鸭血清用斑点杂交法测定 DHBV-DNA。
结果显示实验病毒对照组动物血清DHBV-DNA水平稳定，受试药物LMX 250mg/ kg/d、 100mg/kg/d和50mg/kg/d 10天疗程各时点动物血清DHBV-DNA显著小于阳性药物拉 米夫定组(P < 0. 05)，受试药物LMX抗病毒活性强于阳性药物拉米夫定。
本文中DMF是指N， N_ 二甲基甲酰胺，K2C03是指碳酸钾，NaOH是指氢氧化钠，THF 是指四氢呋喃，HC1是指盐酸。
权利要求
一种具有抗病毒作用的同时又具有肝保护作用的孪药，其特征在于拉米夫定和肝保护药物拼合而成，该化合物通式如(I)所述其中，R1＝CH3，R2＝H，R3＝H或甲基；R1＝H，R2＝CH3，R3＝H或甲基；n＝1，2。F2010100182285C00011.tif
2. 权利要求l中所述的拉米夫定孪药，其特征在于肝保护药物包括熊果酸和齐墩果酸。
3. 权利要求l中所述的拉米夫定孪药的制备方法，其特征在于拉米夫定和熊果酸或齐 墩果酸以氯(溴)乙酸乙酯或氯(溴)丙酸乙酯为连接基团，先在低温条件下制备混合酸 酐，再与拉米夫定縮合成拉米夫定_熊果酸或拉米夫定_齐墩果酸孪药。
4. 根据权利要求3中所述的制备方法，其特征在于其连接基团为氯乙酸乙酯、溴乙酸 乙酯、2-氯丙酸乙酯、2-溴丙酸乙酯、3-氯丙酸乙酯、3-溴丙酸乙酯或它们的其它烷基酯类 衍生物；优选氯乙酸乙酯。
5. 根据权利要求3所述的的制备方法，其特征在于低温条件指0°C _78°C。
6. 根据权利要求3所述的的制备方法，其特征在于混合酸酐是指熊果酸或齐墩果酸与 其相应的连接基团连接后与氯甲酸异丙酯、氯甲酸异丁酯或其它氯甲酸烷基酯衍生物制备 的混合酸酐；优选氯甲酸异丁酯。
7. 根据权利要求3所述的的制备方法，其特征在于縮合采用的脱酸剂为三乙胺或吡 啶；优选三乙胺。
8. 根据权利要求3所述的的制备方法，其特征在于所选溶剂为氯仿、N， N- 二甲基甲酰 胺、二氯甲烷。
9. 根据权利要求l中所述的拉米夫定孪药，在临床肝炎治疗中的应用。
全文摘要
本发明提供一种拉米夫定孪药的制备方法及其应用，将拉米夫定和熊果酸或齐墩果酸以氯(溴)乙酸乙酯或氯(溴)丙酸乙酯为连接基团，在低温条件下缩合成拉米夫定-熊果酸或拉米夫定-齐墩果酸孪药。该孪药可能具有双重作用机制，在具有抗病毒作用的同时又具有较强的抗炎、保护肝细胞膜、改善肝功能及抗纤维化作用，是抗病毒疗法与护肝治疗的有机结合，为肝炎治疗药物的研发提供新的思路。
文档编号A61K31/513GK101766632SQ201010018228
公开日2010年7月7日 申请日期2010年1月20日 优先权日2010年1月20日
发明者仲琰, 周建平, 霍美蓉 申请人:中国药科大学
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