一种中药组合物及其在制备防治猪伪狂犬病药物中的应用的制作方法

专利名称：：一种中药组合物及其在制备防治猪伪狂犬病药物中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及兽药领域，具体涉及养猪业，尤其涉及一种中药组合物及其在制备防治猪伪狂犬病药物中的应用。
背景技术：
：猪伪狂犬病是一种由猪伪狂犬病毒(Psendorabiesvirus,PRV)引起的急性传染病，可引发妊娠母猪流产、死胎以及呼吸道症状。该病在猪群中具有传播快、死亡率高、流行范围广、传播途径多、病原体顽固等特点，每年给养猪业造成了巨大损失。病毒性疾病的治疗药物研发较迟缓，主要由于病毒有严格寄生性，与细胞关系密切，病毒感染细胞后，进入细胞内，在宿主细胞内利用细胞酶系统复制；有些病毒核酸整合于细胞染色体，难于清除。病毒严格寄生在细胞内，使得药物杀伤病毒的同时对机体细胞也有损害。现有的抗病毒化学药物即因为毒性太大或耐药性的产生，其临床难以取得令人满意的效果。传统中药的多靶点作用机制、低毒副作用、无耐药性等优点使它表现出诱人的应用前景，筛选高效低毒的抗病毒中药是当前抗病毒研究热点之一。猪的伪狂犬病目前主要采用疫苗进行预防，缺乏治疗和预防药物，一旦发病损失巨大，针对猪伪狂犬病毒设计相应的中药治疗药物，对猪伪狂犬病的治疗具有重大意义。目前，有关中药抗病毒的机制尚未完全研究清楚，但主要的作用包括直接抑制作用、增强免疫功能作用、修复组织损伤、防治并发症和继发感染、调节器整机体缓解症状、防止应激等等。其中，直接抑制作用包括侵入前阻止吸附、细胞内抑制增殖和抗表达再感染三方面。增强免疫功能包括促进体液免疫和细胞免疫、促进免疫器官发育、增强红细胞免疫功能、诱生干扰素和增强NK细胞活性，进而杀灭病原体。目前，国内研究和筛选抗病毒中药的有效成分或有效部位群(如水溶性或醇溶性或脂溶溶性的一类成分)的主要研究手段是体外细胞法。国外抗病毒的筛选研究主要是从天然生物中提取、分离有效成分，并采用多种分子生物学研究手段(尤其是与现代免疫学实验研究相关的方法)来研究其分子结构与抗病毒分子机理间的关系，从而寻找有效的抗病毒药物，这一点目前国内尚有欠缺。同时由于病毒种类繁多、结构简单、变异复杂，中药进入机体后药物代谢过程复杂，加上中药进入机体后对免疫系统的影响与抗病毒间的协同关系等诸多因素的存在，这就使得针对某一病毒设计合适的中药治疗药物是一项复杂且有难度的工作。
发明内容本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种可防治猪伪狂犬病的中药组合物。本发明的另一个目的在于提供上述中药组合物在制备防治猪伪狂犬病药物中的应用。本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的本发明人首先根据猪伪狂犬病毒选择黄芪、板蓝根、半支莲、千里光、金银花、大青叶、连翘、香薷、鱼腥草、地胆草、野菊花、贯众、蟾酥、冰片和黄芩这15种中药作为研究对象，通过15种单味中药体外抗伪狂犬病毒的药效观察，以及小鼠体内试验，研究各种复方制剂对小鼠免疫力及抗氧化能力的影响，从而筛选出一种中药组合物，该中药组合物由地胆草、紫锥菊、半枝莲、板蓝根、野菊花、千里光、连翘、鱼腥草和黄芪这9种中草药中的任意69种组成。上述中药组合物中，9种中草药的用量比为地胆草紫锥菊半枝莲板蓝根野菊花千里光连翘鱼腥草黄芪=30:18:26:20:18:26:20:30，所述用量比为重量比。本发明的中药组合物的使用方法为从地胆草、紫锥菊、半枝莲、板蓝根、野菊花、千里光、连翘、鱼腥草和黄芪这9种中草药中随意选择任意69种，按照前述的用量比称取后混合到一起，即可得到本发明所需的中药组合物。本发明的中药组合物中，连翘、野菊花、地胆草、鱼腥草、半枝莲和板蓝根均对PRV在细胞内的增殖具有很好的抑制作用，黄芪、板蓝根、地胆草、金银花、半枝莲、鱼腥草、野菊花和千里光都对PRV有抗吸咐作用，金银花、千里光、野菊花、鱼腥草、黄芪、板蓝根和连翘对PRV具有直接的杀灭作用；此外，本发明的中药组合物对脂多糖(LPS)诱导B淋巴细胞具有显著的促增值作用，对细胞因子IFN-Y的分泌也有明显的促进租用，还能维持血清中AST、ALT、TBIL、DBIL和CHOL这几项指标的正常水平，同时显著提高TP、GLB和P这三项生化指标，此外本发明的中药组合物还能提高小鼠血清超氧化物歧化酶SOD的活力，降低丙二醛MDA含量。综上所述，本发明的中药组合物可用于制备防治猪伪狂犬病的药物，应用于猪饲养中对猪伪狂犬病的预防和治疗。本发明的中药组合物在使用时可制成任意一种常用的剂型，如散剂、颗粒剂、注射剂或口服剂，在饲料或饮水中按O.5%1%口服使用，或制成注射液肌肉注射使用。本发明的中药组合物在制备成散剂时，其具体操作过程为将上述中药组合物中的69种中草药按比例称取混合，粉碎后过80100目筛，制成散剂。本发明的中药组合物在制备成颗粒剂时，其具体操作过程为将上述中药组合物中的69种中草药按比例称取混合，然后采用水煎浓縮的方法，制成颗粒剂。本发明的中药组合物在制备成注射剂时，其具体操作过程为将上述中药组合物中的69种中草药按比例称取混合，然后采用水煎浓縮过滤除菌的方法，制成浓度为lg生药/mL的注射液。本发明的中药组合物在制备成口服剂时，其具体操作过程为将上述中药组合物中的69种中草药按比例称取混合，然后采用水煎浓縮过滤除菌的方法，制成浓度为lg生药/mL的口服液。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果本发明在中医药基本理论的指导下，结合文献检索和临床经验，筛选出一种中药组合物，该组合物包含地胆草、紫锥菊、半枝莲、板蓝根、野菊花、千里光、连翘、鱼腥草和黄芪，这9种中草药分别对猪伪狂犬病毒的增值具有抑制作用，对猪伪狂犬病毒具有抗吸附作用和直接灭杀作用，而且这9种中草药的复方能够提高小鼠免疫力和抗氧化能力，因此4该中药组合物可用于猪伪狂犬病的防治，具有广阔的市场前景。具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明做进一步地描述，但具体实施例并不对本发明做任何限定。实施例l15种单味中药体外抗猪伪狂犬病毒的药效观察本实施例选择黄芪、板蓝根、半支莲、千里光、金银花、大青叶、连翘、香薷、鱼腥草、地胆草、野菊花、贯众、蟾酥、冰片和黄吝15种中药，对这15种单味中药进行体外抗猪伪狂犬病毒的药效观察。—、单味中药的研究1.15种单味中药的提取液制备贯众提取液贯众粗粉50g经80X酒精加热回流提取2次，每次10倍体积，40min，提取液趁热滤过后合并，减压旋转蒸发粗提液，定容到50m1(1:l，体积比)醇提液。蟾酥提取液蟾酥lg经80%酒精加热提取，醇体积为药材的200倍，减压旋转蒸发提取液，定容到lOOml(l:IOO，体积比)醇提液。冰片提取液冰片lg经80%酒精溶解提取，定容至100ml(1:100，体积比)醇提液。黄芩提取液黄芩粗粉50g水提，水煎两次，每次沸腾30min，合并两次煎液，常压真空抽滤及浓縮，调ra=7.2定容至50ml(1:1，体积比)水煎液。黄芪、板蓝根、半支莲、千里光、金银花、大青叶、连翘、香薷、鱼腥草、地胆草、野菊花提取液各药按传统的水煎煮方法进行粗提，上述药物均粉碎到20目，浸泡2h，水煎两次，每次煮沸30min，合并两次煎液，常压真空抽滤及浓縮，定容至50ml(1:1，体积比)水煎液，相当于lg生药/ml。2.中药对细胞半数毒性浓度的测定结果通过MTT法检测加入中药后的细胞存活情况，根据计算平均OD值间接判断中药的毒性大小，如表1、2和3所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>由表1可知，毒性按小到大排列为黄芪<香薷<板蓝根<千里光<连翘<半枝莲、地胆草<大青叶<鱼腥草<野菊花<黄芩<金银花<贯众<冰片<蟾酥。在实验过程中，观察到中药对PK细胞也有一定的毒性作用，其毒性作用主要表现为细胞折光性增加、变圆、粘连、破碎、脱落、死亡、吸光值明显下降。药液浓度的升高，对细胞毒性越大，存活细胞越少，MTT被活细胞线粒体脱氢酶还原成蓝色甲簪结晶越少，0D值越小，细胞存活率越低。3.PRV的TCID50测定结果MTT法测定不同稀释度猪伪狂犬病病毒PRV对PK细胞的生长抑制试验。由0D值计算得各稀释度下病毒对PK细胞的生长抑制率，结果如表4所示。根据Reed-Muench两氏法得PRV的TCID5。=10—416/0.1ml。根据下列公式计算距离比例=(高于50%的百分数_50)/(高于50%的百分数_低于50%的百分数)=(57.07-50)/(57.07-12.34)=0.16。LgTCID5。=距离比例X稀释度对数之间的差+高于50%细胞生长抑制率的对数=0.158X(-l)+(-4)=-4.16。TCID50=10—416/0.lml。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>4.中药对病毒复制的抑制作用由表5和表6可知，连翘抑制PRV内增殖的效果最好，其次是野菊花、地胆草、金银花、鱼腥草、香薷、半枝莲和板蓝根，冰片、黄芩和蟾酥较次之，贯众及黄芪抑制效果不明显，大青叶和千里光没有抑制作用。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>5.中药对病毒的抗吸附作用如表7和表8所示，黄芪、板蓝根、蟾酥、地胆草、金银花、半枝莲、鱼腥草、大青叶、野菊花、千里光和香薷都对PRV有抗吸咐作用，其中以黄芪效果最好，板蓝根、蟾酥、地胆草和金银花等次之，香薷效果最弱，冰片、连翘、黄芩和贯众没有抗吸附的作用。表7中药对PRV的预防作用抑制率％(^土S.E，n=4)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表7中，Cl、C2、C3、C4、C5表示从TC50开始倍比稀释的五个浓度。表8中药对PRV的预防作用治疗指数<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>6.中药对病毒的直接灭活作用由表9和10可知，对PRV病毒的直接灭活作用中蟾酥、金银花和贯众效果较好，其中以蟾酥效果最好，千里光、野菊花、香薷、鱼腥草、黄芪、板蓝根、大青叶和连翘也有直接杀灭作用，但效果不如蟾酥和金银花理想；冰片的直接杀灭作用最弱，几乎与黄芩和地胆草一样，对PRV没有直接杀灭的作用。表9中药对PRV的直接灭活作用抑制率(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>注Cl、C2、C3、C4、C5表示从TC,。开始倍比#释的五个浓度。CN101721533A眾s步14/ls〔0060u嫌10i邀进PRV苦w碟s筇^油s遂4端錄〔0061u<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>二、复方制剂对小鼠免疫力及抗氧化能力的影响根据前述15种单味中药的体外实验结果，进行小鼠体内试验，旨在研究中药抗病毒作用的机理。复方I的配方为金银花30克、黄芪18克、地胆草20克、野菊花12克、贯众20克、冰片1克；复方II的配方为黄芩30克、金银花28克、连翘30克、大青叶20克、鱼腥草16克、野菊花12克、贯众20克；复方III的配方为地胆草30克、紫锥菊30克、半枝莲18克、板蓝根26克、野菊花20克、千里光18克、连翘26克、鱼腥草20克和黄芪30克；复方IV的配方为大青叶20克、鱼腥草16克、野菊花12克、贯众20克。以生理盐水作为对照组。1.复方制剂对小鼠脾脏指数影响的结果由表11可知，与对照组相比，四种复方制剂对小鼠脾脏指数都有一定的影响，复方1、复方III和复方IV的脾脏指数均高于对照组，复方III和复方IV与其它组对比均差异显著(P<0.05)，尤其以复方III组差异突出。表ll复方制剂对小鼠脾脏指数的影响(f±S.E，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>上述表12中，脾脏指数处各数值的上标字母不同表示差异显著(P<0.05)。3.复方制剂对小鼠血清IFN-Y的影响由表13可知，与对照组相比，复方III、IV组小鼠血清IFN-Y的含量较高，而且差异显著(P<0.05)。与复方IV组比较，复方III组促进细胞因子IFN-Y分泌的作用更加明显，差异显著(P<0.05)。表13复方制剂对小鼠血清IFN-Y的影响(f土S.E，n=5)组别<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>上述表14中，各数值的上标字母不同表示差异显著(P<0.05)。5.抗氧化能力的测定结果5.1S0D的测定结果由表15可知，与其它组相比，复方III能提高小鼠血清SOD的活力，但差异不显著；其它组均比正常值要低，差异不显著。表15复方制剂对小鼠血清SOD的影响(f±S.E，n=5)<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>5.2MDA的测定结果由表16可知，与其它各组比较，复方IV能提高血清中MDA含量，且差异显著(P<0.05)，而其余三组与对照组的MDA含量接近，复方III还能降低MDA含量，但差异不显表16复方对小鼠血清MDA的影响(f士s.E，n=5)<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>上述表16中，MDA含量处各数值的上标字母不同表示差异显著(P<0.05)。通过对四个复方的研究，最终得出本发明的中药组合物配方，即由地胆草、紫锥菊、半枝莲、板蓝根、野菊花、千里光、连翘、鱼腥草或黄芪中的任意69种中草药组成，各中草药的重量比为地胆草紫锥菊半枝莲板蓝根野菊花千里光连翘鱼腥草黄甚=30:is:加20:is:加20:30。本实施例的各表中，蟾、板、金、冰、芪、连、野、大、芩、地、香、鱼、半、千、贯分别表示蟾酥、板蓝根、金银花、冰片、黄芪、连翘、野菊花、大青叶、黄芩、地胆草、香薷、鱼腥草、半枝莲、千里光、贯众。权利要求一种中药组合物，其特征在于该中药组合物由地胆草、紫锥菊、半枝莲、板蓝根、野菊花、千里光、连翘、鱼腥草或黄芪中的任意6～9种中草药组成，所述各中草药的重量比为地胆草∶紫锥菊∶半枝莲∶板蓝根∶野菊花∶千里光∶连翘∶鱼腥草∶黄芪＝30∶18∶26∶20∶18∶26∶20∶30。2.权利要求1所述中药组合物在制备防治猪伪狂犬病的药物中的应用。3.根据权利要求2所述应用，其特征在于所述防治猪伪狂犬病的药物为散剂、颗粒剂、注射剂或口服剂。4.根据权利要求3所述应用，其特征在于所述防治猪伪狂犬病的散剂药物是通过将权利要求1所述中药组合物按比例称取混合，粉碎后过80100目筛制备而得。5.根据权利要求3所述应用，其特征在于所述防治猪伪狂犬病的颗粒剂药物是通过将权利要求1所述中药组合物按比例称取混合，然后采用水煎浓縮的方法制备而得。6.根据权利要求3所述应用，其特征在于所述防治猪伪狂犬病的注射剂药物是通过将权利要求1所述中药组合物按比例称取混合，然后采用水煎浓縮过滤除菌的方法，从而制备得到浓度为lg生药/mL的注射液。7.根据权利要求3所述应用，其特征在于所述防治猪伪狂犬病的口服剂注射剂药物是通过将权利要求1所述中药组合物按比例称取混合，然后采用水煎浓縮过滤除菌的方法，制成浓度为lg生药/mL的口服液。全文摘要本发明公开一种中药组合物及其在制备防治猪伪狂犬病药物中的应用，该中药组合物由地胆草、紫锥菊、半枝莲、板蓝根、野菊花、千里光、连翘、鱼腥草或黄芪中的任意6～9种中草药组成，各中草药的重量比为地胆草∶紫锥菊∶半枝莲∶板蓝根∶野菊花∶千里光∶连翘∶鱼腥草∶黄芪＝30∶18∶26∶20∶18∶26∶20∶30。本发明在中医药基本理论的指导下，结合文献检索和临床经验，筛选出一种中药组合物，该组合物中的中草药分别对猪伪狂犬病毒的增殖具有抑制作用，对猪伪狂犬病毒具有抗吸附作用和直接灭杀作用，该组合物能够提高小鼠免疫力和抗氧化能力，因此该中药组合物可用于猪伪狂犬病的防治，具有广阔的市场前景。文档编号A61K9/14GK101721533SQ20101001934公开日2010年6月9日申请日期2010年1月12日优先权日2010年1月12日发明者仇微红,吴鸿,孔德胜,石达友,郭世宁,陈志虹,魏光伟申请人:华南农业大学