免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗及其制备方法
专利名称：免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种乙肝疫苗，具体是指一种免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗，同时本发明也涉及这种疫苗的制备方法。
本发明的另一目的是提供一种免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗的制备方法。
为达上述目的本发明采用的技术方案是，将脂质体作为载体和佐剂，与乙肝表面抗原结合在一起制备成的一种免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗，这种疫苗既能激发机体体液免疫反应，产生保护性抗体，清除血循环中的病毒，又能激发CTL的活性，产生很强的细胞免疫反应，消灭肝细胞内的病毒，从而达到彻底清除病毒，治疗慢性乙肝和乙肝病毒携带者。
该疫苗可以加免疫调节剂，如胸腺肽、白细胞介素-2、LAK细胞、免疫核糖核酸、特异性转移因子、肝炎灵、猪苓多糖、香菇菌多糖、云苓、辅酶Q10、左旋咪唑、脂质A、MPL、QuilA、BCG等。也可以不加免疫增强剂。
本发明的特征是所述的免疫脂质体治疗性乙肝疫苗中可以加入维生素E等抗氧化剂，加入负电荷磷脂，防止脂质体凝聚、融合，改变剂型，制备冻干剂，避免渗漏，延长脂质体保存时间。
本发明所述的乙肝表面抗原包括S，S+前S1，前S1+前S2，S+前S2，S+前S1+前S2中的任一种。
本发明优选的乙肝表面抗原包括S+前S2、S+前S1+前S2，本发明最佳的乙肝表面抗原是S+前S1+前S2。
本发明免疫脂质体治疗性乙肝疫苗单位剂量中含乙肝表面抗原的量是1-80微克。
本发明免疫脂质体治疗性乙肝疫苗单位剂量中含乙肝表面抗原的优选量是20-30微克。
本发明所涉及的脂质体是由磷脂、非磷脂、固醇类及它们的衍生物和膜材组成。目前用于制备脂质体的有卵磷脂、豆磷脂，磷脂酰乙醇胺、胆固醇、脑磷脂、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇乙酰脂质体、B-谷甾醇、牛胆酸钠、蛋磷脂酰胆碱、二棕榈酰-DL-a磷脂酰胆碱、磷脂酰丝胺酸、磷脂酰肌醇、神经鞘磷脂、鞘髓磷脂、二鲸蜡磷酸酯、二肉豆蔻卵磷脂、硬脂酰胺、二氧乙烯十六烷基醚和四氧乙烯十二烷基醚等均可用于本发明。
本发明所涉及的膜材包括但不限于胆固醇、十八胺、磷脂酸等。胆固醇可以调节双分子层流动性、通透性等，十八胺、磷脂酸可以改变脂质体表面电荷性质。
本发明优选的脂质体球径为20～5000nm，本发明较优选的脂质体球径是100～200nm和950-1050nm。
本发明免疫脂质体治疗性乙肝疫苗单位剂量中含脂质体量0.3-1.5ml。
本发明免疫脂质体治疗性乙肝疫苗单位剂量中含脂质体优选的量是0.5-1.0ml。
脂质体的制备工艺是本领域的技术人员所熟知的，其基本原理都是将油性材料与水性防料经过适当处理后形成油包水的制剂，但包裹物质的性质可能具有较大的差别，如化学合成物质，有机物质；生物物质如蛋白、多肽及核酸等。后者在处理过程中较易受到制备条件的影响，如温度、时间、振荡及酸碱度等因素的影响。治疗性乙肝疫苗属于生物制剂中的多肽。常规的脂质体制备方法，象薄膜法、逆相蒸发法、加压挤出法、熔融法及冻干水化法或改进均可用于本发明制备免疫脂质体治疗性乙肝疫苗。
本发明免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗的优选的制备工艺是逆相蒸发法、冻干水化法。本发明最优选的脂质体的制备工艺是冻干水化法。
本发明免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗的冻干水化法制备工艺包括如下步骤(1)将脂质体、膜材及附加剂或免疫调节分子以摩尔比1∶1∶1溶于溶媒中，置于旋转蒸发器中，除去有机溶媒，旋转蒸发形成磷脂膜；(2)加入磷酸缓冲液，40-60℃，超声3-8分钟，形成脂质体悬液；(3)将脂质体悬液与乙肝抗原溶液以摩尔比3∶1混合，加入冷冻保护剂，进行冷冻干燥；(4)采用湿热法或钴照射等方法灭菌，得到冻干粉剂；(5)加无菌水、震荡、再水化融合；(6)得到免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗。
本发明免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗的逆相蒸发法制备工艺包括如下步骤(1)将脂质体、膜材和附加剂或免疫调节分子以摩尔比1∶1∶1溶于溶媒中，加入乙肝抗原溶液，40-60℃，短时超声3-8分钟，得到稳定的油包水乳液；(2)40-60℃，减压蒸发，得到胶态物质；(3)加入磷酸缓冲液，40-60℃旋转蒸发，减压蒸发10-20分钟，除去微量有机溶媒，得到脂质体水性混悬液，放置20-40分钟，透析20-30小时，除去游离的未包入脂质体的乙肝抗原；(4)采用湿热法或钴照射等方法灭菌；(5)得到免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗。
本发明的优点是本发明的免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗，它既能对HBV起到良好的预防作用，又能对HBV感染引起的乙型肝炎发挥有效的治疗作用。这种疫苗既能激发机体体液免疫反应，产生保护性抗体，清除血循环中的病毒，又能激发CTL的活性，产生很强的细胞免疫反应，消灭肝细胞内的病毒，从而达到彻底清除病毒，治疗慢性乙肝和乙肝病毒携带者。
本发明制备的免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗可以采用皮下或静脉注射给药。
为了更好地理解本发明的技术方案和有益效果，下面结合具体的实验及实验结果对本发明做进一步阐述。
实验一免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗的制备工艺对疫苗诱导能力的影响实验结果见表2。
表2 脂质体球径与免疫诱导能力
实验证明，球径在1000±200nm左右的脂质体和150+50nm左右最易被巨噬细胞吞噬，并引发强烈的免疫反应，较佳的球径是1000±200nm和150+50nm，最优的球径是950-1050nm。实验3免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗的保存时间对乙肝疫苗诱导能力的影响脂质体类制剂由于其本身为油与水的结合物，在保存过程中必然纯在内容物的渗漏现象，如何延缓、减少包封物的渗漏和脂质体的解离，是决定制剂质量的重要技术指标。通过本发明方法制备的免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗，由于抗氧化剂及制备工艺及剂型的改进，大大延长了保存时间。我们用不同保存时间的本发明的免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗免疫小鼠0.5ml，10天后再接种同样浓度的疫苗1ml，第二次接种4天，取其脾细胞体外培养，并加入特异性表面抗原。根据其淋巴细胞增殖程度可以判定疫苗免疫效果。淋巴细胞增殖采用同位素氚标记的胸腺嘧啶的渗入率为指标。
实验动物Balb/c小鼠，由吉林大学基础医学院动物中心提供。
试剂乙肝病毒表面抗原购自军事医学科学院5所实验结果如下表3 免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗的保存时间对其免疫效果的影响
实验结果表明，本发明的方法制备的免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗有较好疗效的保存时间可以达到30天，即使60天也有一定的免疫效果。实验4乙肝疫苗中所含的不同抗原成分对小鼠免疫反应的影响乙肝疫苗中所含的抗原成分可以包括白蛋白，S蛋白、前S2及前S1蛋白。将球径在1000±200nm左右的脂质体分别与各种组合的乙肝抗原结合，给小鼠接种，观察抗体滴度及淋巴细胞增殖率。结果如表4。
表4 不同的乙肝抗原与脂质体结合对免疫效果的影响
实验结果表明，1-5组间抗体滴度无显著差异；淋巴增殖率1、2、3组与4、5组比较有显著差异，1、2、3组间淋巴增殖率无显著差异，4和5组间淋巴增殖率无显著差异，1-5组与第6组比较都有显著性差异。
1-5组的淋巴增殖率及抗体滴度与6组比较均有显著差异。其中淋巴细胞增殖率及抗体滴度较高的是S+前S2、S+前S1+前S2，本发明最佳的乙肝表面抗原是S+前S1+前S2。实验5单位剂量的免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗中不同乙肝抗原含量和脂质体含量引起的免疫诱导反应。
我们在实验中设计了以下的实验组合，通过实验4所述的免疫学常规技术淋巴细胞增殖率确定单位剂量免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗引起免疫反应的不同组分组合的用量范围和最佳的用量范围。实验结果如表5
表5引起免疫反应的免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗不同组分组合的用量范围和最佳的用量范围
实验结果表明本发明免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗可以引起有效免疫反应单位剂量中乙肝抗原的优选的含量范围是1-80ug，最优选的含量范围是20-30ug，脂质体的优选的含量范围是0.3ml-1.5ml最优选的含量范围是0.5ml-1.0ml。本发明的免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗单位剂量中乙肝表面抗原的体积其相对脂质体可以不计。实验6治疗性乙肝疫苗的临床试用结果为了验证治疗性乙肝疫苗的临床效果，我们与国内具有完备检验条件和技术力量的防疫站、医院进行合作，对其效果进行观察。
我们随机选择乙肝病毒携带患者，并且其体内乙肝病毒处于复制期，标准为血清检测表面抗原阳性，e抗原阳性，核心抗原阳性(又称“大三阳”)，病程2年以上，无急性发作征象，肝功正常。所有患者均进行定量PCR检测。对照组为裸疫苗接种。为保证观测结果的客观性，采用双份血清检测，即患者治疗前的血清与治疗后血清在相同条件下同时检测，以排除试剂、季节及操作人员的主观误差。实验结果如下表6免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗在乙肝病毒标记治疗前后比较(广东卫生防疫站)
*p＜0.05表7免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗在乙肝病毒标记治疗前后比较(临沂市人民医院)
*p＜0.05表8免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗在乙肝病毒标记治疗前后比较(邵东防疫站)
*p＜0.05为了更好地理解本发明的实质，下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细的说明。
本发明所涉及的脂质体及乙肝表面抗原或免疫调节分子均可用实施例1-4所述的方法制备。
权利要求
1.一种免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗，它是包含有乙肝病毒表面抗原的脂质体。
2.根据权利要求1所述的一种免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗，其特征在于它包含有免疫调节分子。
3.根据权利要求1或2所述的一种免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗，其中所述的乙肝病毒表面抗原是选自S，S+前S1，前S1+前S2，S+前S2及S+前S1+前S2。
4.根据权利要求3所述的一种免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗，其中优选的乙肝病毒表面抗原是选自S+前S2及S+前S1+前S2。
5.根据权利要求4所述的一种免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗，其中最优选的乙肝病毒表面抗原是S+前S1+前S2。
6.根据权利要求1或2所述的一种免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗，其中单位剂量的疫苗中含有的乙肝病毒表面抗原1-80ug。
7.根据权利要求6所述的一种免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗，其中单位剂量的疫苗中含有的乙肝病毒表面抗原优选量是20-30ug。
8.根据权利要求1或2所述的一种免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗，其中所述的脂质体是磷脂、非磷脂、固醇类及它们的衍生物和膜材组成。
9.根据权利要求8所述的一种免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗，其中所述的脂质体选自大豆卵磷脂，豆磷脂，磷脂酰乙醇胺、胆固醇、脑磷脂、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇乙酰脂质体、B-谷甾醇、牛胆酸钠、蛋磷脂酰胆碱、二棕榈酰-DL-a磷脂酰胆碱、磷脂酰丝胺酸、磷脂酰肌醇、神经鞘磷脂、鞘髓磷脂、二鲸蜡磷酸酯、二肉豆蔻卵磷脂、硬脂酰胺、二氧乙烯十六烷基醚和四氧乙烯十二烷基醚等。
10.根据权利要求8所述的一种免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗，其中所述的脂质体的球径是20～5000nm。
11.根据权利要求10所述的一种免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗，其中所述的脂质体优选的球径是100～200nm或950-1050nm。
12.根据权利要求1或2所述的一种免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗，其中单位剂量的疫苗中含有的脂质体量是0.3-1.5ml。
13.根据权利要求12所述的一种免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗，其中单位剂量的疫苗中含有的脂质体优选量是0.5-1.0ml。的疫苗中含有的脂质体优选量是0.5-1.0ml。
14.根据权利要求2所述的一种免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗，其中含有的免疫调节分子选自胸腺肽、白细胞介素-2、LAK细胞、免疫核糖核酸、特异性转移因子、肝炎灵、猪苓多糖、香菇菌多糖、云苓、辅酶Q10、左旋咪唑、脂质A、MPL、QuilA、BCG等。
15.一种制备免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗的方法，包括如下步骤(1)将脂质体、膜材或免疫调节分子以摩尔比1∶1∶1溶于溶媒中，置于旋转蒸发器中，除去有机溶媒，旋转蒸发形成磷脂膜；(2)加入磷酸缓冲液，40-60℃，超声3-8分钟，形成脂质体悬液；(3)将脂质体悬液与乙肝抗原溶液以摩尔比3∶1混合，加入冷冻保护剂，进行冷冻干燥；(4)采用湿热法或钴照射等方法灭菌，得到冻干粉剂；(5)加无菌水、震荡、再水化融合；(6)得到免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗。
16.一种制备免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗的方法，包括如下步骤(1)将脂质体、膜材或免疫调节分子以摩尔比1∶1∶1溶于溶媒中，加入乙肝抗原溶液，40-60℃，短时超声3-8分钟，得到稳定的油包水乳液；(2)40-60℃，减压蒸发，得到胶态物质；(3)加入磷酸缓冲液，40-60℃旋转蒸发，减压蒸发10-20分钟，除去微量有机溶媒，得到脂质体水性混悬液，放置20-40分钟，透析20-30小时，除去游离的未包入脂质体的乙肝抗原；(4)采用湿热法或钴照射等方法灭菌；(5)得到免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗。
全文摘要
本发明公开了一种免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗,它是包含乙肝表面抗原的脂质体,它也可以包括或不包括免疫调节分子,它能有效地治疗HBV感染引起的慢性乙型肝炎及HBV病毒携带者,又能对HBV再感染起到良好的预防作用。本发明也提供了制备这种疫苗的逆相蒸发法、冻干水化法方法的工艺流程。
文档编号A61K39/29GK1364644SQ0210048
公开日2002年8月21日 申请日期2002年2月5日 优先权日2002年2月5日
发明者李求是 申请人:北京多米诺医药研究所
技术领域：
本发明涉及一种乙肝疫苗，具体是指一种免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗，同时本发明也涉及这种疫苗的制备方法。
本发明的另一目的是提供一种免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗的制备方法。
为达上述目的本发明采用的技术方案是，将脂质体作为载体和佐剂，与乙肝表面抗原结合在一起制备成的一种免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗，这种疫苗既能激发机体体液免疫反应，产生保护性抗体，清除血循环中的病毒，又能激发CTL的活性，产生很强的细胞免疫反应，消灭肝细胞内的病毒，从而达到彻底清除病毒，治疗慢性乙肝和乙肝病毒携带者。
该疫苗可以加免疫调节剂，如胸腺肽、白细胞介素-2、LAK细胞、免疫核糖核酸、特异性转移因子、肝炎灵、猪苓多糖、香菇菌多糖、云苓、辅酶Q10、左旋咪唑、脂质A、MPL、QuilA、BCG等。也可以不加免疫增强剂。
本发明的特征是所述的免疫脂质体治疗性乙肝疫苗中可以加入维生素E等抗氧化剂，加入负电荷磷脂，防止脂质体凝聚、融合，改变剂型，制备冻干剂，避免渗漏，延长脂质体保存时间。
本发明所述的乙肝表面抗原包括S，S+前S1，前S1+前S2，S+前S2，S+前S1+前S2中的任一种。
本发明优选的乙肝表面抗原包括S+前S2、S+前S1+前S2，本发明最佳的乙肝表面抗原是S+前S1+前S2。
本发明免疫脂质体治疗性乙肝疫苗单位剂量中含乙肝表面抗原的量是1-80微克。
本发明免疫脂质体治疗性乙肝疫苗单位剂量中含乙肝表面抗原的优选量是20-30微克。
本发明所涉及的脂质体是由磷脂、非磷脂、固醇类及它们的衍生物和膜材组成。目前用于制备脂质体的有卵磷脂、豆磷脂，磷脂酰乙醇胺、胆固醇、脑磷脂、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇乙酰脂质体、B-谷甾醇、牛胆酸钠、蛋磷脂酰胆碱、二棕榈酰-DL-a磷脂酰胆碱、磷脂酰丝胺酸、磷脂酰肌醇、神经鞘磷脂、鞘髓磷脂、二鲸蜡磷酸酯、二肉豆蔻卵磷脂、硬脂酰胺、二氧乙烯十六烷基醚和四氧乙烯十二烷基醚等均可用于本发明。
本发明所涉及的膜材包括但不限于胆固醇、十八胺、磷脂酸等。胆固醇可以调节双分子层流动性、通透性等，十八胺、磷脂酸可以改变脂质体表面电荷性质。
本发明优选的脂质体球径为20～5000nm，本发明较优选的脂质体球径是100～200nm和950-1050nm。
本发明免疫脂质体治疗性乙肝疫苗单位剂量中含脂质体量0.3-1.5ml。
本发明免疫脂质体治疗性乙肝疫苗单位剂量中含脂质体优选的量是0.5-1.0ml。
脂质体的制备工艺是本领域的技术人员所熟知的，其基本原理都是将油性材料与水性防料经过适当处理后形成油包水的制剂，但包裹物质的性质可能具有较大的差别，如化学合成物质，有机物质；生物物质如蛋白、多肽及核酸等。后者在处理过程中较易受到制备条件的影响，如温度、时间、振荡及酸碱度等因素的影响。治疗性乙肝疫苗属于生物制剂中的多肽。常规的脂质体制备方法，象薄膜法、逆相蒸发法、加压挤出法、熔融法及冻干水化法或改进均可用于本发明制备免疫脂质体治疗性乙肝疫苗。
本发明免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗的优选的制备工艺是逆相蒸发法、冻干水化法。本发明最优选的脂质体的制备工艺是冻干水化法。
本发明免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗的冻干水化法制备工艺包括如下步骤(1)将脂质体、膜材及附加剂或免疫调节分子以摩尔比1∶1∶1溶于溶媒中，置于旋转蒸发器中，除去有机溶媒，旋转蒸发形成磷脂膜；(2)加入磷酸缓冲液，40-60℃，超声3-8分钟，形成脂质体悬液；(3)将脂质体悬液与乙肝抗原溶液以摩尔比3∶1混合，加入冷冻保护剂，进行冷冻干燥；(4)采用湿热法或钴照射等方法灭菌，得到冻干粉剂；(5)加无菌水、震荡、再水化融合；(6)得到免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗。
本发明免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗的逆相蒸发法制备工艺包括如下步骤(1)将脂质体、膜材和附加剂或免疫调节分子以摩尔比1∶1∶1溶于溶媒中，加入乙肝抗原溶液，40-60℃，短时超声3-8分钟，得到稳定的油包水乳液；(2)40-60℃，减压蒸发，得到胶态物质；(3)加入磷酸缓冲液，40-60℃旋转蒸发，减压蒸发10-20分钟，除去微量有机溶媒，得到脂质体水性混悬液，放置20-40分钟，透析20-30小时，除去游离的未包入脂质体的乙肝抗原；(4)采用湿热法或钴照射等方法灭菌；(5)得到免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗。
本发明的优点是本发明的免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗，它既能对HBV起到良好的预防作用，又能对HBV感染引起的乙型肝炎发挥有效的治疗作用。这种疫苗既能激发机体体液免疫反应，产生保护性抗体，清除血循环中的病毒，又能激发CTL的活性，产生很强的细胞免疫反应，消灭肝细胞内的病毒，从而达到彻底清除病毒，治疗慢性乙肝和乙肝病毒携带者。
本发明制备的免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗可以采用皮下或静脉注射给药。
为了更好地理解本发明的技术方案和有益效果，下面结合具体的实验及实验结果对本发明做进一步阐述。
实验一免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗的制备工艺对疫苗诱导能力的影响实验结果见表2。
表2 脂质体球径与免疫诱导能力
实验证明，球径在1000±200nm左右的脂质体和150+50nm左右最易被巨噬细胞吞噬，并引发强烈的免疫反应，较佳的球径是1000±200nm和150+50nm，最优的球径是950-1050nm。实验3免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗的保存时间对乙肝疫苗诱导能力的影响脂质体类制剂由于其本身为油与水的结合物，在保存过程中必然纯在内容物的渗漏现象，如何延缓、减少包封物的渗漏和脂质体的解离，是决定制剂质量的重要技术指标。通过本发明方法制备的免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗，由于抗氧化剂及制备工艺及剂型的改进，大大延长了保存时间。我们用不同保存时间的本发明的免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗免疫小鼠0.5ml，10天后再接种同样浓度的疫苗1ml，第二次接种4天，取其脾细胞体外培养，并加入特异性表面抗原。根据其淋巴细胞增殖程度可以判定疫苗免疫效果。淋巴细胞增殖采用同位素氚标记的胸腺嘧啶的渗入率为指标。
实验动物Balb/c小鼠，由吉林大学基础医学院动物中心提供。
试剂乙肝病毒表面抗原购自军事医学科学院5所实验结果如下表3 免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗的保存时间对其免疫效果的影响
实验结果表明，本发明的方法制备的免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗有较好疗效的保存时间可以达到30天，即使60天也有一定的免疫效果。实验4乙肝疫苗中所含的不同抗原成分对小鼠免疫反应的影响乙肝疫苗中所含的抗原成分可以包括白蛋白，S蛋白、前S2及前S1蛋白。将球径在1000±200nm左右的脂质体分别与各种组合的乙肝抗原结合，给小鼠接种，观察抗体滴度及淋巴细胞增殖率。结果如表4。
表4 不同的乙肝抗原与脂质体结合对免疫效果的影响
实验结果表明，1-5组间抗体滴度无显著差异；淋巴增殖率1、2、3组与4、5组比较有显著差异，1、2、3组间淋巴增殖率无显著差异，4和5组间淋巴增殖率无显著差异，1-5组与第6组比较都有显著性差异。
1-5组的淋巴增殖率及抗体滴度与6组比较均有显著差异。其中淋巴细胞增殖率及抗体滴度较高的是S+前S2、S+前S1+前S2，本发明最佳的乙肝表面抗原是S+前S1+前S2。实验5单位剂量的免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗中不同乙肝抗原含量和脂质体含量引起的免疫诱导反应。
我们在实验中设计了以下的实验组合，通过实验4所述的免疫学常规技术淋巴细胞增殖率确定单位剂量免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗引起免疫反应的不同组分组合的用量范围和最佳的用量范围。实验结果如表5
表5引起免疫反应的免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗不同组分组合的用量范围和最佳的用量范围
实验结果表明本发明免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗可以引起有效免疫反应单位剂量中乙肝抗原的优选的含量范围是1-80ug，最优选的含量范围是20-30ug，脂质体的优选的含量范围是0.3ml-1.5ml最优选的含量范围是0.5ml-1.0ml。本发明的免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗单位剂量中乙肝表面抗原的体积其相对脂质体可以不计。实验6治疗性乙肝疫苗的临床试用结果为了验证治疗性乙肝疫苗的临床效果，我们与国内具有完备检验条件和技术力量的防疫站、医院进行合作，对其效果进行观察。
我们随机选择乙肝病毒携带患者，并且其体内乙肝病毒处于复制期，标准为血清检测表面抗原阳性，e抗原阳性，核心抗原阳性(又称“大三阳”)，病程2年以上，无急性发作征象，肝功正常。所有患者均进行定量PCR检测。对照组为裸疫苗接种。为保证观测结果的客观性，采用双份血清检测，即患者治疗前的血清与治疗后血清在相同条件下同时检测，以排除试剂、季节及操作人员的主观误差。实验结果如下表6免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗在乙肝病毒标记治疗前后比较(广东卫生防疫站)
*p＜0.05表7免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗在乙肝病毒标记治疗前后比较(临沂市人民医院)
*p＜0.05表8免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗在乙肝病毒标记治疗前后比较(邵东防疫站)
*p＜0.05为了更好地理解本发明的实质，下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细的说明。
本发明所涉及的脂质体及乙肝表面抗原或免疫调节分子均可用实施例1-4所述的方法制备。
权利要求
1.一种免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗，它是包含有乙肝病毒表面抗原的脂质体。
2.根据权利要求1所述的一种免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗，其特征在于它包含有免疫调节分子。
3.根据权利要求1或2所述的一种免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗，其中所述的乙肝病毒表面抗原是选自S，S+前S1，前S1+前S2，S+前S2及S+前S1+前S2。
4.根据权利要求3所述的一种免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗，其中优选的乙肝病毒表面抗原是选自S+前S2及S+前S1+前S2。
5.根据权利要求4所述的一种免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗，其中最优选的乙肝病毒表面抗原是S+前S1+前S2。
6.根据权利要求1或2所述的一种免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗，其中单位剂量的疫苗中含有的乙肝病毒表面抗原1-80ug。
7.根据权利要求6所述的一种免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗，其中单位剂量的疫苗中含有的乙肝病毒表面抗原优选量是20-30ug。
8.根据权利要求1或2所述的一种免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗，其中所述的脂质体是磷脂、非磷脂、固醇类及它们的衍生物和膜材组成。
9.根据权利要求8所述的一种免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗，其中所述的脂质体选自大豆卵磷脂，豆磷脂，磷脂酰乙醇胺、胆固醇、脑磷脂、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇乙酰脂质体、B-谷甾醇、牛胆酸钠、蛋磷脂酰胆碱、二棕榈酰-DL-a磷脂酰胆碱、磷脂酰丝胺酸、磷脂酰肌醇、神经鞘磷脂、鞘髓磷脂、二鲸蜡磷酸酯、二肉豆蔻卵磷脂、硬脂酰胺、二氧乙烯十六烷基醚和四氧乙烯十二烷基醚等。
10.根据权利要求8所述的一种免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗，其中所述的脂质体的球径是20～5000nm。
11.根据权利要求10所述的一种免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗，其中所述的脂质体优选的球径是100～200nm或950-1050nm。
12.根据权利要求1或2所述的一种免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗，其中单位剂量的疫苗中含有的脂质体量是0.3-1.5ml。
13.根据权利要求12所述的一种免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗，其中单位剂量的疫苗中含有的脂质体优选量是0.5-1.0ml。的疫苗中含有的脂质体优选量是0.5-1.0ml。
14.根据权利要求2所述的一种免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗，其中含有的免疫调节分子选自胸腺肽、白细胞介素-2、LAK细胞、免疫核糖核酸、特异性转移因子、肝炎灵、猪苓多糖、香菇菌多糖、云苓、辅酶Q10、左旋咪唑、脂质A、MPL、QuilA、BCG等。
15.一种制备免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗的方法，包括如下步骤(1)将脂质体、膜材或免疫调节分子以摩尔比1∶1∶1溶于溶媒中，置于旋转蒸发器中，除去有机溶媒，旋转蒸发形成磷脂膜；(2)加入磷酸缓冲液，40-60℃，超声3-8分钟，形成脂质体悬液；(3)将脂质体悬液与乙肝抗原溶液以摩尔比3∶1混合，加入冷冻保护剂，进行冷冻干燥；(4)采用湿热法或钴照射等方法灭菌，得到冻干粉剂；(5)加无菌水、震荡、再水化融合；(6)得到免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗。
16.一种制备免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗的方法，包括如下步骤(1)将脂质体、膜材或免疫调节分子以摩尔比1∶1∶1溶于溶媒中，加入乙肝抗原溶液，40-60℃，短时超声3-8分钟，得到稳定的油包水乳液；(2)40-60℃，减压蒸发，得到胶态物质；(3)加入磷酸缓冲液，40-60℃旋转蒸发，减压蒸发10-20分钟，除去微量有机溶媒，得到脂质体水性混悬液，放置20-40分钟，透析20-30小时，除去游离的未包入脂质体的乙肝抗原；(4)采用湿热法或钴照射等方法灭菌；(5)得到免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗。
全文摘要
本发明公开了一种免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗,它是包含乙肝表面抗原的脂质体,它也可以包括或不包括免疫调节分子,它能有效地治疗HBV感染引起的慢性乙型肝炎及HBV病毒携带者,又能对HBV再感染起到良好的预防作用。本发明也提供了制备这种疫苗的逆相蒸发法、冻干水化法方法的工艺流程。
文档编号A61K39/29GK1364644SQ0210048
公开日2002年8月21日 申请日期2002年2月5日 优先权日2002年2月5日
发明者李求是 申请人:北京多米诺医药研究所
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