一种双佐剂用于生产灭活疫苗的制备方法
专利名称：一种双佐剂用于生产灭活疫苗的制备方法
技术领域：
本发明涉及生物制剂的制备，采用双佐剂复配用于生产灭活疫苗，达到增强灭活 疫苗免疫的技术效果。
背景技术：
佐剂(Adjuvant) —词来源于拉丁语，原为辅助之意。佐剂在免疫中的作用主要是 提升机体免疫系统(体液或细胞免疫系统)对抗原或免疫原的免疫应答反应，包括增强免 疫反应强度和反应的持久性。随着生物技术的发展，疫苗的更新换代越来越快；其中，选择 合适的佐剂的已成为提高疫苗质量的重要手段，受到了科技工作者的重视。文献检索披露 国家药典和生物制品书籍中灭活疫苗均使用单个佐剂，例如矿物油佐剂，206佐剂，氢氧化 铝胶佐剂，中药免疫佐剂，蜂胶佐剂等文献资料。例如①中国农业科学院兰州兽医研究所王 永录等人发明了 口蹄疫0、A、Asia-I型三价灭活疫苗(专利申请号200710018543)的佐剂 为蒙太得206佐剂一Montanide ISA 206佐剂。②中国农业大学康友敏进行了增强口蹄疫 疫苗免疫反应及其调节机制的研究，将左旋咪唑(LMS)作为口蹄疫灭活疫苗的佐剂，并进 行了效果研究。③南京联海化工有限公司陈锡武等人发明了一种灭活疫苗的油佐剂(专利 申请号200910028379)，由注射白油和甘露醇油酸脂按90 10 100 8的体积份混合 而成。④北京生泰尔生物科技有限公司江厚生等人发明了一种新型疫苗佐剂(专利申请号 200710165168)，其制备方法为将几种免疫增强剂和表面活性剂分别溶于水和油中，然后 进行乳化配制和纳米处理，制备得到一种新型纳米微粒佐剂。上述文献的佐剂均为左旋咪 唑，或注射白油和甘露醇油酸脂混合物，或纳米微粒佐剂，或206油佐剂。本发明在口蹄疫灭活疫苗常规使用的法国SEPPIC公司Montanide ISA206佐剂 206佐剂的基础上，设计了一种缓释作用更强的双佐剂生产疫苗，用于配制口蹄疫0型、亚 洲1型二价灭活疫苗、A型单价灭活疫苗与常规206佐剂配制的口蹄疫0型、亚洲1型二价 灭活疫苗、铝胶佐剂配制的A型单价灭活疫苗进行的免疫，达到了设计效果；也可用于其他 灭活疫苗。
发明内容
本发明的目的在于提供的缓释作用更强的双佐剂生产疫苗，能提高灭活疫苗质 量，增强免疫效力和延长免疫持续期等。本发明的目的是这样实现的一种双佐剂用于生产灭活疫苗的制备方法，包括对病 毒液的接种、纯化、浓缩、环化、灭活阻断的预处置，将提取的病毒液加入以百分比配制佐剂1 和佐剂2，佐剂1氢氧化铝胶的用量为1-50%;佐剂2Montanide ISA 206佐剂的用量为1-50% 或用氢氧化铝胶佐剂1_50%、白油1-50%、吐温-80为1-10%、司盘-20为1-10% 经复合， 将佐剂1充分搅拌、吸附静置沉淀，弃去上清液，再加入佐剂2乳化即可获取灭活疫苗。所述生产灭活疫苗的方法，采用双佐剂用于生产配制口蹄疫0型灭活疫苗、口蹄 疫0型、亚洲1型二价灭活疫苗；口蹄疫0型、亚洲1型和A型三价灭活疫苗；A型单价灭活疫苗与常规206佐剂配制的口蹄疫0型灭活疫苗；口蹄疫0型、亚洲1型二价灭活疫苗；口 蹄疫0型、亚洲1型和A型三价灭活疫苗；铝胶佐剂配制的A型单价灭活疫苗进行了免疫效 果更好。所述生产灭活疫苗的方法，选用的佐剂药剂均为市售产品。该双佐剂配制的口蹄疫0型、亚洲1型二价灭活疫苗、A型单价灭活疫苗与常规 206佐剂配制的口蹄疫0型、亚洲1型二价灭活疫苗、铝胶佐剂配制的A型单价灭活疫苗进 行了免疫，效果极佳。该双佐剂对免疫后的动物，通过MTT法检测淋巴细胞增殖能力、液相阻断ELISA法 检测口蹄疫抗体效价以及攻击病毒测定PD5tl试验来评判，该双佐剂疫苗与常规疫苗的效果 差异十分明显①口蹄疫0型、亚洲1型二价灭活疫苗双佐剂疫苗组细胞免疫水平(淋巴细 胞刺激指数SI为1. 235士0. 060)比常规206佐剂疫苗组(Si为1. 115士0. 035)和对照组 (Si为1.010士0.045)高，与常规206疫苗组相比差异显著(0.01 < P < 0.05)，与空白对 照组相比，差异极显著(P <0.01)。②双佐剂疫苗组0型和Asia-I抗体与常规佐剂疫苗组 相比，全剂量组抗原量较充分，两组抗体水平差距不大；1/3剂量组和1/9剂量组由于抗原 量较少和强缓释作用，导致抗体水平明显较低。③攻毒保护结果为双佐剂疫苗组略高于常 规佐剂疫苗组，前者每头份疫苗亚洲I型为9. OPD5tl，0型为11. 84PD5(I，后者每头份疫苗亚洲 I 型为 9. OPD50, 0 型为 9. OPD500分析结果可见，对口蹄疫二价灭活疫苗来讲，双佐剂疫苗可引起较好的细胞免疫 应答和抗原缓释作用，达到好的攻毒保护效果。另外，配制的口蹄疫A型双佐剂灭活疫苗和 口蹄疫A型双佐剂浓缩灭活疫苗(抗原经1倍浓缩)与口蹄疫A型铝胶佐剂灭活疫苗经测 定疫苗的PD5tl，结果双佐剂灭活疫苗和双佐剂浓缩灭活疫苗的效力达到国际动物卫生组织 规定的质量标准和中国兽药质量标准(》3PD50/头份)，半数保护剂量分别为4. 5PD50/头 份和4. 26PD50/头份，明显高于铝胶佐剂灭活疫苗(1. 93PD50/头份)。由此说明，在口蹄疫 灭活疫苗方面，双佐剂的效果，明显优于法国206油佐剂和铝胶佐剂。同时，该佐剂的复配 可以使用于其他灭活疫苗之中。上述双佐剂依据国家兽药标准，实施口蹄疫0型、亚洲I型双佐剂灭活疫苗检测， 验证其结果外观淡粉红色乳剂。剂型水包油包水油乳剂。粘度用Iml吸管(下口内径为1. 2mm，上口内径为2. 7mm)吸取25°C左右的疫苗 1.0ml,令其垂直自然流出，记录流出0. 4ml所需的时间，应在8秒以内。稳定性稳定性吸取疫苗IOml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析 出的水相应不多于0. 5mL·物理性状外观淡粉红色乳剂。剂型水包油包水油乳剂。粘度放出0. 4ml的 时间为2. 21秒。稳定性无渗出。本发明的双佐剂的复配使用，能提高灭活疫苗质量，增强免疫效力和延长免疫持 续期等，同时明显优于单一佐剂的使用效果，特别是优选免疫佐剂与乳化佐剂的复配构思 新颖，效果更佳，彰显技术进步。
具体实施例方式下面将结合实施例对本发明作进一步说明。实施例将提取的病毒液加入以百分比配制佐剂1和佐剂2，佐剂1氢氧化铝胶的用量为 1-50%;佐剂2Montanide ISA 206佐剂的用量为1-50%或用氢氧化铝胶佐剂1-50%、白油 1-50%、吐温-80为1-10%、司盘-20为1-10%:经复合，将佐剂1，充分搅拌、吸附、静置沉 淀，弃去上清液，再加入佐剂2乳化即可。病毒液处置操作1、病毒液灭活(1)制备病毒液将0型和亚洲I型生产用细胞毒按0. 5% -8%分别接种BHK21细 胞，接种后置37°C培养，当细胞病变达75%以上时，将细胞转瓶置-20°C冻结后解冻并分组 收集于储液瓶中，取样后置-20°C冻结保存。(2)病毒液纯化与浓缩将检验合格的两种制苗用病毒液分别解冻组批后，通过 其除细胞碎片设备除去细胞碎片，用物理或化学方法浓缩3倍以上。(3) 2-溴乙胺氢溴酸盐(BEA)的环化将BEA按2%量加至0. 2mol/L氢氧化钠溶 液中，置37°C水浴中，每12分钟震摇1次，作用1小时，即环化为二乙烯亚胺(BEI)。经无 菌过滤后备用。(4)灭活将除菌过滤的0. lmol/LBEI加入病毒液中，使其终浓度为0. 001mol/L, 期间不断搅拌，当温度升至30°C时开始计时，在30°C维持观小时。(5)灭活阻断将过滤除菌的50%硫代硫酸钠溶液加入灭活病毒液中，使其硫代 硫酸钠的终浓度为2%，充分混勻后，置5°C保存，同时取样进行灭活检验。2、氢氧化铝胶制备2. 1明矾溶液的配制，见表。表氨水比重与氨含量的百分率表(15°C )比重0. 8820.8840.8860. 8880. 8900. 8920. 8940.8960. 8980.900应取 (ml)400541004209423743084509460847144828492453090.9020. 9040. 9060.9080.9100. 9120. 9140. 9160.9180. 920应取 (ml)5060518753095460560057515911607762546282比重0. 9220. 9240. 9260. 9280. 9300.9320.9340. 9360. 9380. 940应取 (ml)6627683770447253734577638034832186218951比重0. 9420.9440.9460. 9480. 9500. 9520. 9540. 9560. 9580. 960应取 (ml)931696691008410518109861150112066126891336814124将上表中所需用量的明矾投入容器中，加需用量自来水，通蒸汽加热煮沸，打捞上 面的杂质，待完全溶解后，停蒸汽盖好沉淀到第二天使用。2. 2氨水溶液的配制用不锈钢桶装蒸馏水，通氨气制成。2. 3洗涤水的配制自来水处理7m3加铝胶8kg沉淀M小时备用。洗涤水的水质 应完全清澈透明，发现浑浊现象不能使用。2. 4 化合2. 4. 1检查耐腐蚀水泵、搅拌机以及各种辅料用具、挂好布袋。2. 4. 2过滤明矾溶液并稀释到比重为1. 04，加温到78°C。2. 4. 3将0. 90的氨水稀释至0. 97，并按上述比例倒入化合桶中备用。2. 4. 4将加温测好的明矾溶液用耐腐蚀泵打入备用的0. 97氨水溶液中进行化合， 开动搅拌机不断搅拌，直至有少量氨味，停机，PH值为8. 1，温度为70°C。2. 4. 5打入布袋中到2/3处，滤去母液。2. 5洗涤铝胶母液滤2. 5小时，加处理过的水搅拌洗涤，2小时洗一次，这样反复 13次，待测其中硫酸盐合格为止。2. 6倒胶过滤将初测硫酸盐残留量合格的铝胶倒入不锈钢桶中加沉淀水搅拌均 勻，用80m的绢纱过滤，再打入布袋滤去水。2. 7倒胶取样将过滤好的铝胶倒入桶中，加少量沉淀水搅拌均勻抽样化验，取两 个样，检验合格备用。3、水相制备将所需的病毒液加入反应缸中，再加入病毒液总体积的20%高压灭菌的干铝胶，搅拌15分钟，转速65转/分，使病毒被铝胶充分吸附后，静置沉淀M小时后，吸弃与加入 铝胶等体积的上清，剩余溶液作为疫苗配制的水相。水相=80%病毒抗原+20%铝胶4、佐剂准备灭菌将206佐剂进罐夹套普通蒸汽升温至121°C，储苗罐罐内通纯蒸汽升温至 121°C，开启罐底阀及相关阀门15秒后两罐同时保压40分钟，佐剂降温至20°C，保压待用。 均质机机头用均质机消毒液处理待用。配比206佐剂水相=1 1 (质量比)5、乳化(1)预乳将0型、Asia-I型灭活后抗原、铝胶打入同一罐内混合，搅拌30分钟，搅 拌转数90转/分以上。佐剂搅拌转数75转/分，15分钟后将混合后的水相以100万ml/ 小时的速度打入佐剂中，油水混合完毕后，将搅拌转数调至130转/分，再搅拌30分钟。(2)乳化均质机机头用灭菌注射水洗尽消毒液，用搅拌均勻的疫苗将残留的注 射用水顶掉。开启均质机将低压调至8Mpa，高压至14Mpa乳化，运行完毕，疫苗降温至15°C 取样检测，待分装。将双佐剂依据国家兽药标准，验证其结果A、安全检验(1)用体重350-450g的豚鼠2只，每只皮下注射疫苗2ml ；用体重18_22g小白鼠 5只，每只皮下注射疫苗0.5ml。观察7日，均不应出现因注射疫苗引起的死亡或明显的局 部反应或全身反应。(2)用6月龄的健康易感牛(乳鼠中和抗体滴度< 1 4或细胞中和抗体滴度 彡1 8或ELISA抗体效价彡1 16)3头，每头舌背面皮内分20点注射，每点0.1ml，共 2ml疫苗，逐日观察，连续4日，之后每头牛颈部肌肉接种6ml疫苗，连续观察6日。任何牛 不得出现口蹄疫症状或由疫苗引起的明显毒性反应。检验结果未出现出现由疫苗引起的死亡或明显的局部和全身不良反应。未出现 口蹄疫症状或由疫苗引起的明显毒性反应。B、效力检验用6月龄的健康易感牛(乳鼠中和抗体滴度 4或细胞中和抗体滴度 8 或ELISA抗体效价彡1 16) 30头，分为3组，每组10头。将待检疫苗分为1头份、1/3头 份、1/9头份，3个剂量组，每一剂量组分别于颈部肌肉注射10头牛。接种25日，将3个剂量 中的牛各随机均分为0型组和亚洲I型组，分圈饲养。0型组，连同对照牛2头，每头牛舌上 表面两侧分两点皮内注射牛源0型口蹄疫病毒强毒；亚洲I型组，连同对照牛2头，每头牛 舌上表面两侧分两点皮内注射牛源亚洲I型口蹄疫病毒强毒，每点均为0. Iml (共0. anl，含 IO4ID5tl),连续观察10日，对照牛应3个以上蹄出现病变(水泡或溃疡)。免疫牛仅在舌面 出现水泡或溃疡，而其他部位无病变时判为保护，除舌面以外任一部位出现典型口蹄疫病 变(水泡或溃疡)时判为不保护。根据免疫牛的保护数，按Kiber法计算被检疫苗的PD5tl， 每头份疫苗应至少含牛口蹄疫0型、亚洲I型口蹄疫各3个PD5tlt5检验结果0型11.84 PD50 ；亚洲 I 型9. 0 PD50o
权利要求
1.一种双佐剂用于生产灭活疫苗的制备方法，包括对病毒液的接种、纯化、浓缩、环化、 灭活阻断的预处置，其特征在于将提取的病毒液加入以百分比配制佐剂1和佐剂2，佐剂1 氢氧化铝胶的用量为1-50%;佐剂2Montanide ISA206佐剂的用量为1_50%或用氢氧化铝 胶佐剂1_50%、白油1-50%、吐温-80为1-10%、司盘-20为1-10% 经复合，将佐剂1充 分搅拌、吸附静置沉淀，弃去上清液，再加入佐剂2乳化即可获取灭活疫苗。
2.按照权利要求1所述生产灭活疫苗的方法，其特征在于采用双佐剂用于生产配制 口蹄疫0型灭活疫苗、口蹄疫0型、亚洲1型二价灭活疫苗；口蹄疫0型、亚洲1型和A型三 价灭活疫苗；A型单价灭活疫苗与常规206佐剂配制的口蹄疫0型灭活疫苗；口蹄疫0型、 亚洲1型二价灭活疫苗；口蹄疫0型、亚洲1型和A型三价灭活疫苗；铝胶佐剂配制的A型 单价灭活疫苗进行了免疫效果更好。
3.按照权利要求1所述生产灭活疫苗的方法，其特征在于选用的佐剂药剂均为市售产品。
全文摘要
本发明提供一种双佐剂用于生产灭活疫苗的制备方法，将提取的病毒液加入以百分比配制佐剂1和佐剂2，佐剂1氢氧化铝胶的用量为1-50％；佐剂2Montanide ISA 206佐剂的用量为1-50％或用氢氧化铝胶佐剂1-50％、白油1-50％、吐温-80为1-10％、司盘-20为1-10％经复合，将佐剂1充分搅拌、吸附静置沉淀，弃去上清液，再加入佐剂2乳化即可获取灭活疫。采用双佐剂用于生产配制口蹄疫O型灭活疫苗、口蹄疫O型、亚洲1型二价灭活疫苗；口蹄疫O型、亚洲1型和A型三价灭活疫苗；A型单价灭活疫苗与常规206佐剂配制的口蹄疫O型灭活疫苗；口蹄疫O型、亚洲1型二价灭活疫苗；口蹄疫O型、亚洲1型和A型三价灭活疫苗；铝胶佐剂配制的A型单价灭活疫苗进行免疫效果更好。
文档编号A61P31/14GK102133401SQ20101010010
公开日2011年7月27日 申请日期2010年1月22日 优先权日2010年1月22日
发明者乌斯曼江, 刘宏, 徐亚萍, 朱刚, 李延涛, 王力俭, 王延, 王莉君, 薛英, 黄炯 申请人:新疆天康畜牧生物技术股份有限公司, 新疆维吾尔自治区畜牧科学院兽医研究所
技术领域：
本发明涉及生物制剂的制备，采用双佐剂复配用于生产灭活疫苗，达到增强灭活 疫苗免疫的技术效果。
背景技术：
佐剂(Adjuvant) —词来源于拉丁语，原为辅助之意。佐剂在免疫中的作用主要是 提升机体免疫系统(体液或细胞免疫系统)对抗原或免疫原的免疫应答反应，包括增强免 疫反应强度和反应的持久性。随着生物技术的发展，疫苗的更新换代越来越快；其中，选择 合适的佐剂的已成为提高疫苗质量的重要手段，受到了科技工作者的重视。文献检索披露 国家药典和生物制品书籍中灭活疫苗均使用单个佐剂，例如矿物油佐剂，206佐剂，氢氧化 铝胶佐剂，中药免疫佐剂，蜂胶佐剂等文献资料。例如①中国农业科学院兰州兽医研究所王 永录等人发明了 口蹄疫0、A、Asia-I型三价灭活疫苗(专利申请号200710018543)的佐剂 为蒙太得206佐剂一Montanide ISA 206佐剂。②中国农业大学康友敏进行了增强口蹄疫 疫苗免疫反应及其调节机制的研究，将左旋咪唑(LMS)作为口蹄疫灭活疫苗的佐剂，并进 行了效果研究。③南京联海化工有限公司陈锡武等人发明了一种灭活疫苗的油佐剂(专利 申请号200910028379)，由注射白油和甘露醇油酸脂按90 10 100 8的体积份混合 而成。④北京生泰尔生物科技有限公司江厚生等人发明了一种新型疫苗佐剂(专利申请号 200710165168)，其制备方法为将几种免疫增强剂和表面活性剂分别溶于水和油中，然后 进行乳化配制和纳米处理，制备得到一种新型纳米微粒佐剂。上述文献的佐剂均为左旋咪 唑，或注射白油和甘露醇油酸脂混合物，或纳米微粒佐剂，或206油佐剂。本发明在口蹄疫灭活疫苗常规使用的法国SEPPIC公司Montanide ISA206佐剂 206佐剂的基础上，设计了一种缓释作用更强的双佐剂生产疫苗，用于配制口蹄疫0型、亚 洲1型二价灭活疫苗、A型单价灭活疫苗与常规206佐剂配制的口蹄疫0型、亚洲1型二价 灭活疫苗、铝胶佐剂配制的A型单价灭活疫苗进行的免疫，达到了设计效果；也可用于其他 灭活疫苗。
发明内容
本发明的目的在于提供的缓释作用更强的双佐剂生产疫苗，能提高灭活疫苗质 量，增强免疫效力和延长免疫持续期等。本发明的目的是这样实现的一种双佐剂用于生产灭活疫苗的制备方法，包括对病 毒液的接种、纯化、浓缩、环化、灭活阻断的预处置，将提取的病毒液加入以百分比配制佐剂1 和佐剂2，佐剂1氢氧化铝胶的用量为1-50%;佐剂2Montanide ISA 206佐剂的用量为1-50% 或用氢氧化铝胶佐剂1_50%、白油1-50%、吐温-80为1-10%、司盘-20为1-10% 经复合， 将佐剂1充分搅拌、吸附静置沉淀，弃去上清液，再加入佐剂2乳化即可获取灭活疫苗。所述生产灭活疫苗的方法，采用双佐剂用于生产配制口蹄疫0型灭活疫苗、口蹄 疫0型、亚洲1型二价灭活疫苗；口蹄疫0型、亚洲1型和A型三价灭活疫苗；A型单价灭活疫苗与常规206佐剂配制的口蹄疫0型灭活疫苗；口蹄疫0型、亚洲1型二价灭活疫苗；口 蹄疫0型、亚洲1型和A型三价灭活疫苗；铝胶佐剂配制的A型单价灭活疫苗进行了免疫效 果更好。所述生产灭活疫苗的方法，选用的佐剂药剂均为市售产品。该双佐剂配制的口蹄疫0型、亚洲1型二价灭活疫苗、A型单价灭活疫苗与常规 206佐剂配制的口蹄疫0型、亚洲1型二价灭活疫苗、铝胶佐剂配制的A型单价灭活疫苗进 行了免疫，效果极佳。该双佐剂对免疫后的动物，通过MTT法检测淋巴细胞增殖能力、液相阻断ELISA法 检测口蹄疫抗体效价以及攻击病毒测定PD5tl试验来评判，该双佐剂疫苗与常规疫苗的效果 差异十分明显①口蹄疫0型、亚洲1型二价灭活疫苗双佐剂疫苗组细胞免疫水平(淋巴细 胞刺激指数SI为1. 235士0. 060)比常规206佐剂疫苗组(Si为1. 115士0. 035)和对照组 (Si为1.010士0.045)高，与常规206疫苗组相比差异显著(0.01 < P < 0.05)，与空白对 照组相比，差异极显著(P <0.01)。②双佐剂疫苗组0型和Asia-I抗体与常规佐剂疫苗组 相比，全剂量组抗原量较充分，两组抗体水平差距不大；1/3剂量组和1/9剂量组由于抗原 量较少和强缓释作用，导致抗体水平明显较低。③攻毒保护结果为双佐剂疫苗组略高于常 规佐剂疫苗组，前者每头份疫苗亚洲I型为9. OPD5tl，0型为11. 84PD5(I，后者每头份疫苗亚洲 I 型为 9. OPD50, 0 型为 9. OPD500分析结果可见，对口蹄疫二价灭活疫苗来讲，双佐剂疫苗可引起较好的细胞免疫 应答和抗原缓释作用，达到好的攻毒保护效果。另外，配制的口蹄疫A型双佐剂灭活疫苗和 口蹄疫A型双佐剂浓缩灭活疫苗(抗原经1倍浓缩)与口蹄疫A型铝胶佐剂灭活疫苗经测 定疫苗的PD5tl，结果双佐剂灭活疫苗和双佐剂浓缩灭活疫苗的效力达到国际动物卫生组织 规定的质量标准和中国兽药质量标准(》3PD50/头份)，半数保护剂量分别为4. 5PD50/头 份和4. 26PD50/头份，明显高于铝胶佐剂灭活疫苗(1. 93PD50/头份)。由此说明，在口蹄疫 灭活疫苗方面，双佐剂的效果，明显优于法国206油佐剂和铝胶佐剂。同时，该佐剂的复配 可以使用于其他灭活疫苗之中。上述双佐剂依据国家兽药标准，实施口蹄疫0型、亚洲I型双佐剂灭活疫苗检测， 验证其结果外观淡粉红色乳剂。剂型水包油包水油乳剂。粘度用Iml吸管(下口内径为1. 2mm，上口内径为2. 7mm)吸取25°C左右的疫苗 1.0ml,令其垂直自然流出，记录流出0. 4ml所需的时间，应在8秒以内。稳定性稳定性吸取疫苗IOml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析 出的水相应不多于0. 5mL·物理性状外观淡粉红色乳剂。剂型水包油包水油乳剂。粘度放出0. 4ml的 时间为2. 21秒。稳定性无渗出。本发明的双佐剂的复配使用，能提高灭活疫苗质量，增强免疫效力和延长免疫持 续期等，同时明显优于单一佐剂的使用效果，特别是优选免疫佐剂与乳化佐剂的复配构思 新颖，效果更佳，彰显技术进步。
具体实施例方式下面将结合实施例对本发明作进一步说明。实施例将提取的病毒液加入以百分比配制佐剂1和佐剂2，佐剂1氢氧化铝胶的用量为 1-50%;佐剂2Montanide ISA 206佐剂的用量为1-50%或用氢氧化铝胶佐剂1-50%、白油 1-50%、吐温-80为1-10%、司盘-20为1-10%:经复合，将佐剂1，充分搅拌、吸附、静置沉 淀，弃去上清液，再加入佐剂2乳化即可。病毒液处置操作1、病毒液灭活(1)制备病毒液将0型和亚洲I型生产用细胞毒按0. 5% -8%分别接种BHK21细 胞，接种后置37°C培养，当细胞病变达75%以上时，将细胞转瓶置-20°C冻结后解冻并分组 收集于储液瓶中，取样后置-20°C冻结保存。(2)病毒液纯化与浓缩将检验合格的两种制苗用病毒液分别解冻组批后，通过 其除细胞碎片设备除去细胞碎片，用物理或化学方法浓缩3倍以上。(3) 2-溴乙胺氢溴酸盐(BEA)的环化将BEA按2%量加至0. 2mol/L氢氧化钠溶 液中，置37°C水浴中，每12分钟震摇1次，作用1小时，即环化为二乙烯亚胺(BEI)。经无 菌过滤后备用。(4)灭活将除菌过滤的0. lmol/LBEI加入病毒液中，使其终浓度为0. 001mol/L, 期间不断搅拌，当温度升至30°C时开始计时，在30°C维持观小时。(5)灭活阻断将过滤除菌的50%硫代硫酸钠溶液加入灭活病毒液中，使其硫代 硫酸钠的终浓度为2%，充分混勻后，置5°C保存，同时取样进行灭活检验。2、氢氧化铝胶制备2. 1明矾溶液的配制，见表。表氨水比重与氨含量的百分率表(15°C )比重0. 8820.8840.8860. 8880. 8900. 8920. 8940.8960. 8980.900应取 (ml)400541004209423743084509460847144828492453090.9020. 9040. 9060.9080.9100. 9120. 9140. 9160.9180. 920应取 (ml)5060518753095460560057515911607762546282比重0. 9220. 9240. 9260. 9280. 9300.9320.9340. 9360. 9380. 940应取 (ml)6627683770447253734577638034832186218951比重0. 9420.9440.9460. 9480. 9500. 9520. 9540. 9560. 9580. 960应取 (ml)931696691008410518109861150112066126891336814124将上表中所需用量的明矾投入容器中，加需用量自来水，通蒸汽加热煮沸，打捞上 面的杂质，待完全溶解后，停蒸汽盖好沉淀到第二天使用。2. 2氨水溶液的配制用不锈钢桶装蒸馏水，通氨气制成。2. 3洗涤水的配制自来水处理7m3加铝胶8kg沉淀M小时备用。洗涤水的水质 应完全清澈透明，发现浑浊现象不能使用。2. 4 化合2. 4. 1检查耐腐蚀水泵、搅拌机以及各种辅料用具、挂好布袋。2. 4. 2过滤明矾溶液并稀释到比重为1. 04，加温到78°C。2. 4. 3将0. 90的氨水稀释至0. 97，并按上述比例倒入化合桶中备用。2. 4. 4将加温测好的明矾溶液用耐腐蚀泵打入备用的0. 97氨水溶液中进行化合， 开动搅拌机不断搅拌，直至有少量氨味，停机，PH值为8. 1，温度为70°C。2. 4. 5打入布袋中到2/3处，滤去母液。2. 5洗涤铝胶母液滤2. 5小时，加处理过的水搅拌洗涤，2小时洗一次，这样反复 13次，待测其中硫酸盐合格为止。2. 6倒胶过滤将初测硫酸盐残留量合格的铝胶倒入不锈钢桶中加沉淀水搅拌均 勻，用80m的绢纱过滤，再打入布袋滤去水。2. 7倒胶取样将过滤好的铝胶倒入桶中，加少量沉淀水搅拌均勻抽样化验，取两 个样，检验合格备用。3、水相制备将所需的病毒液加入反应缸中，再加入病毒液总体积的20%高压灭菌的干铝胶，搅拌15分钟，转速65转/分，使病毒被铝胶充分吸附后，静置沉淀M小时后，吸弃与加入 铝胶等体积的上清，剩余溶液作为疫苗配制的水相。水相=80%病毒抗原+20%铝胶4、佐剂准备灭菌将206佐剂进罐夹套普通蒸汽升温至121°C，储苗罐罐内通纯蒸汽升温至 121°C，开启罐底阀及相关阀门15秒后两罐同时保压40分钟，佐剂降温至20°C，保压待用。 均质机机头用均质机消毒液处理待用。配比206佐剂水相=1 1 (质量比)5、乳化(1)预乳将0型、Asia-I型灭活后抗原、铝胶打入同一罐内混合，搅拌30分钟，搅 拌转数90转/分以上。佐剂搅拌转数75转/分，15分钟后将混合后的水相以100万ml/ 小时的速度打入佐剂中，油水混合完毕后，将搅拌转数调至130转/分，再搅拌30分钟。(2)乳化均质机机头用灭菌注射水洗尽消毒液，用搅拌均勻的疫苗将残留的注 射用水顶掉。开启均质机将低压调至8Mpa，高压至14Mpa乳化，运行完毕，疫苗降温至15°C 取样检测，待分装。将双佐剂依据国家兽药标准，验证其结果A、安全检验(1)用体重350-450g的豚鼠2只，每只皮下注射疫苗2ml ；用体重18_22g小白鼠 5只，每只皮下注射疫苗0.5ml。观察7日，均不应出现因注射疫苗引起的死亡或明显的局 部反应或全身反应。(2)用6月龄的健康易感牛(乳鼠中和抗体滴度< 1 4或细胞中和抗体滴度 彡1 8或ELISA抗体效价彡1 16)3头，每头舌背面皮内分20点注射，每点0.1ml，共 2ml疫苗，逐日观察，连续4日，之后每头牛颈部肌肉接种6ml疫苗，连续观察6日。任何牛 不得出现口蹄疫症状或由疫苗引起的明显毒性反应。检验结果未出现出现由疫苗引起的死亡或明显的局部和全身不良反应。未出现 口蹄疫症状或由疫苗引起的明显毒性反应。B、效力检验用6月龄的健康易感牛(乳鼠中和抗体滴度 4或细胞中和抗体滴度 8 或ELISA抗体效价彡1 16) 30头，分为3组，每组10头。将待检疫苗分为1头份、1/3头 份、1/9头份，3个剂量组，每一剂量组分别于颈部肌肉注射10头牛。接种25日，将3个剂量 中的牛各随机均分为0型组和亚洲I型组，分圈饲养。0型组，连同对照牛2头，每头牛舌上 表面两侧分两点皮内注射牛源0型口蹄疫病毒强毒；亚洲I型组，连同对照牛2头，每头牛 舌上表面两侧分两点皮内注射牛源亚洲I型口蹄疫病毒强毒，每点均为0. Iml (共0. anl，含 IO4ID5tl),连续观察10日，对照牛应3个以上蹄出现病变(水泡或溃疡)。免疫牛仅在舌面 出现水泡或溃疡，而其他部位无病变时判为保护，除舌面以外任一部位出现典型口蹄疫病 变(水泡或溃疡)时判为不保护。根据免疫牛的保护数，按Kiber法计算被检疫苗的PD5tl， 每头份疫苗应至少含牛口蹄疫0型、亚洲I型口蹄疫各3个PD5tlt5检验结果0型11.84 PD50 ；亚洲 I 型9. 0 PD50o
权利要求
1.一种双佐剂用于生产灭活疫苗的制备方法，包括对病毒液的接种、纯化、浓缩、环化、 灭活阻断的预处置，其特征在于将提取的病毒液加入以百分比配制佐剂1和佐剂2，佐剂1 氢氧化铝胶的用量为1-50%;佐剂2Montanide ISA206佐剂的用量为1_50%或用氢氧化铝 胶佐剂1_50%、白油1-50%、吐温-80为1-10%、司盘-20为1-10% 经复合，将佐剂1充 分搅拌、吸附静置沉淀，弃去上清液，再加入佐剂2乳化即可获取灭活疫苗。
2.按照权利要求1所述生产灭活疫苗的方法，其特征在于采用双佐剂用于生产配制 口蹄疫0型灭活疫苗、口蹄疫0型、亚洲1型二价灭活疫苗；口蹄疫0型、亚洲1型和A型三 价灭活疫苗；A型单价灭活疫苗与常规206佐剂配制的口蹄疫0型灭活疫苗；口蹄疫0型、 亚洲1型二价灭活疫苗；口蹄疫0型、亚洲1型和A型三价灭活疫苗；铝胶佐剂配制的A型 单价灭活疫苗进行了免疫效果更好。
3.按照权利要求1所述生产灭活疫苗的方法，其特征在于选用的佐剂药剂均为市售产品。
全文摘要
本发明提供一种双佐剂用于生产灭活疫苗的制备方法，将提取的病毒液加入以百分比配制佐剂1和佐剂2，佐剂1氢氧化铝胶的用量为1-50％；佐剂2Montanide ISA 206佐剂的用量为1-50％或用氢氧化铝胶佐剂1-50％、白油1-50％、吐温-80为1-10％、司盘-20为1-10％经复合，将佐剂1充分搅拌、吸附静置沉淀，弃去上清液，再加入佐剂2乳化即可获取灭活疫。采用双佐剂用于生产配制口蹄疫O型灭活疫苗、口蹄疫O型、亚洲1型二价灭活疫苗；口蹄疫O型、亚洲1型和A型三价灭活疫苗；A型单价灭活疫苗与常规206佐剂配制的口蹄疫O型灭活疫苗；口蹄疫O型、亚洲1型二价灭活疫苗；口蹄疫O型、亚洲1型和A型三价灭活疫苗；铝胶佐剂配制的A型单价灭活疫苗进行免疫效果更好。
文档编号A61P31/14GK102133401SQ20101010010
公开日2011年7月27日 申请日期2010年1月22日 优先权日2010年1月22日
发明者乌斯曼江, 刘宏, 徐亚萍, 朱刚, 李延涛, 王力俭, 王延, 王莉君, 薛英, 黄炯 申请人:新疆天康畜牧生物技术股份有限公司, 新疆维吾尔自治区畜牧科学院兽医研究所
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