生物标志物表达的可再现量化的制作方法
专利名称：生物标志物表达的可再现量化的制作方法
生物标志物表达的可再现量化相关申请交叉引用本申请要求2008年9月16日申请的美国专利申请61/097，415的优先权权益，其公开内容通过引用全部组合于此。
背景技术：
本发明涉及使用算法自动进行生物标志物表达分析的领域，以增强独立于操作员的分析和化验结果再现性从而在诊断化验中更好地预测值。迄今为止，组织切片的生物标志物评估依赖于传统的细胞化学和免疫组织化学 (IHC)技术，这些技术在大规模和大量化验存在之前已得到大量发展。传统方法的重大缺陷在于测试的主观性质及缺乏标准化。尽管IHC测试已展现了临床实用性(如Her2/ Here印Test)，但这些测试的值最近已表明受到进行测试的地点的影响。检验Her2测试的再现性的两个最近的研究已表明在本地和中央实验室测试之间可能有多达20%的误差 (Perez et al.J.Clinic. One. (2006)24:3032-8 ；Paik S et al. Benefit from adjuvant trastuzumab may not be confined topatients with IHC 3+and/or FISH positive tumors =Central testing results fromNSABP B-31 (2007) 25 :511-22)。组织微阵列技术为组织试样的大量分析提供机会(Konen，J. et al.，Nat. Med. 4 844-7(1998) ；Kallioniemi, 0. P. et al.，Hum. Mol. Genet. 10:657-62(2001) ；Rimm, D. L. et al. ,Cancer J. 7 :24-31 Q001))。例如，使用组织微阵列快速进行大规模研究的能力可为识别和确认药品靶点、预断标志(如雌激素受体(ER)和HER2/神经鞘)及候选疗法提供关键 fn息ο本发明首次实现了原地生物标志物量化的全自动标准化，使得实验室之间、机器之间、操作员之间及不同日期之间的染色变化最小。
发明内容
本发明涉及组织试样、整个组织切片(WTQ及组织微阵列(TMA)的生物标志物表达的可再现量化，以减小多次试验或多批之间因操作员、设备、设施及其它因素的差异引起的变化性。在此描述的系统和方法用得分的归一化实现生物标志物的自动定位和量化从而在多次试验之间具有更大的再现性，而与位置、操作员或仪器的变化无关。本发明的一实施例涉及在制作在载玻片上的组织试样中可再现量化生物标志物表达的方法，包括(a)获取制作在载玻片上的组织试样，其已被染色以使能定位至少一细胞区室和至少一生物标志物；(b)使用包括光源的标准化光学系统获取已染色组织试样的一个或多个包含像素的图像；(c)自动分析源自图像像素的一个或多个数据集以区分数据信号和噪声；(d)自动分析源自图像像素的一个或多个数据集以区分归属于至少一细胞区室中的每一细胞区室的数据信号；(e)可选地，自动分析源自图像像素的一个或多个数据集以区分归属于用于至少一细胞区室中的每一细胞区室的至少一生物标志物的数据信号； (f)量化表达在至少一细胞区室的每一细胞区室中的生物标志物的量；藉此制作在载玻片上的组织试样中的生物标志物表达可再现地量化。在一实施例中，标准化光学系统包括其强度和光通路变化性已归一化的光源。在另一实施例中，标准化光学系统允许自动调节曝光时间以优化在图像像素中捕获的动态数据范围。在一实施例中，每一自动分析步骤以无人监督的方式进行。在一实施例中，对归属于两个以上细胞区室的数据信号进行区分。在一实施例中，对表达在两个以上细胞区室的每一细胞区室中的生物标志物的量进行量化。在一实施例中，以约95%的置信区间区分归属于两个以上细胞区室的数据信号。在一实施例中，本发明方法还包括评估一个或多个制作在载玻片上的组织试样或一个或多个包含像素的图像或其一个或多个放大部分的质量。在一实施例中，本发明方法实现可再现割点确定。在一实施例中，对于每一试样，本发明方法在批次之间实现85%以上的试样分类一致性。在另一实施例中，对于每一试样，本发明方法在批次之间实现90%以上的试样分类
一致性。在一实施例中，本发明方法实现生物标志物表达的量化测量的再现性水平高于 80%。在另一实施例中，本发明方法实现生物标志物表达的量化测量的再现性水平高于 90%。在另一实施例中，本发明方法实现生物标志物蛋白质的量化测量的再现性水平高于 95%。在一实施例中，本发明方法实现生物标志物表达的量化测量的再现性水平落在约 90%到约97%的范围中。在一实施例中，本发明方法实现生物标志物表达的量化测量的变化系数(％ CV) 低于20%。在另一实施例中，本发明方法实现生物标志物表达的量化测量的变化系数(％ CV)低于10%。在另一实施例中，本发明方法实现生物标志物表达的量化测量的变化系数 (%CV)低于5%。在另一实施例中，本发明方法实现生物标志物表达的量化测量的变化系数(％ CV)落在约4%到约7%的范围中。在一实施例中，制作在载玻片上的组织试样已用一种或多种试剂的最佳稀释进行染色。在另一实施例中，最佳稀释产生具有最佳动态范围度量的一个或多个包含像素的图像。在一实施例中，本发明方法由计算机实施。在另一实施例中，本发明致力于一种计算机可读介质，该介质包括存储于其上的、由处理器运行以执行在此所述的方法的计算机可读指令。在另一实施例中，本发明致力于携载用于实施在此所述的方法的计算机可读指令的电磁信号。本发明还致力于具有存储于其上的计算机可读指令的计算机可读介质， 计算机可读指令由处理器运行以执行可再现量化制作在载玻片上的组织试样中的生物标志物表达的方法，该方法包括(a)获取制作在载玻片上的组织试样的一个或多个包含像素的图像，前述组织试样已被染色以使能使用包括光源的标准化光学系统定位至少一细胞区室和至少一生物标志物；(b)自动分析源自图像像素的一个或多个数据集以区分数据信号和噪声；(c)自动分析源自图像像素的一个或多个数据集以区分归属于至少一细胞区室中的每一细胞区室的数据信号；及(d)量化表达在至少一细胞区室的每一细胞区室中的生物标志物的量；藉此制作在载玻片上的组织试样中的生物标志物表达可再现地量化。在计算机可读介质的优选实施例中，存储于其上并由处理器运行的计算机可读指令还包括执行在所述量化步骤之前具有下述可选步骤的方法的指令自动分析源自图像像素的一个或多个数据集以区分归属于用于至少一细胞区室中的每一细胞区室的至少一生物标志物的数据信号。在本发明的又一实施例中，用于可再现量化制作在载玻片上的组织试样中的生物标志物表达的系统包括(a)配置成至少放大制作在载玻片上的组织试样的一部分的一个或多个透镜，所述组织试样已被染色以使能定位至少一细胞区室和至少一生物标志物；(b) 标准化光学系统，包括与一个或多个透镜光通信的光源和图像传感器，标准化光学系统获取已染色组织试样的一个或多个包含像素的图像；(C)与标准化光学系统通信的处理器模块，该处理器模块配置成(i)自动分析源自图像像素的一个或多个数据集以区分数据信号和噪声；(ii)自动分析源自图像像素的一个或多个数据集以区分归属于至少一细胞区室中的每一细胞区室的数据信号；及(iii)量化表达在至少一细胞区室的每一细胞区室中的生物标志物的量；藉此制作在载玻片上的组织试样中的生物标志物表达可再现地量化。 在该系统的优选实施例中，处理器模块还配置成可选地自动分析源自图像像素的一个或多个数据集以区分归属于用于至少一细胞区室中的每一细胞区室的至少一生物标志物的数据信号。该分析优选在量化步骤(iii)之前进行。本发明的其它特征、目标和优点可从下述附图、详细描述和强烈要求明显看出。
图1示出了可再现量化表达在制作在载玻片上的包含细胞的生物试样如病人的组织试样的一个或多个细胞组成的每一细胞组成中的生物标志物的量的过程。图2示出了可再现量化表达在制作在载玻片上的包含细胞的生物试样的一个或多个细胞组成的每一细胞组成中的生物标志物的量的图像处理步骤的过程。图3为按传统IHC得分(χ轴)对543种情形分类的变换的HER2 AQUA 得分(y轴)的框式图表，其中兼有AQUA 和IHC得分信息。用于跨所有类进行均值比较的单向ANOVA分析很有意义(P < 0. 001)。在此之后，对于多个比较使用Tamhane的T2统计量的分析表明每一类之间具有明显差异(所有P值< 0. 05)。图4A-C示出了对于583种情形比较跨仪器㈧、操作员⑶和染色批次(C)的归一化Lc^2变换的HER2 AQUA 得分的框式图表，其中指出了所有情形的平均<% CV。图5A-C示出了 Kaplan-Meier 5年特定疾病的生存分析图表，对于将簇群分为 HER2 低(84· 5% )和 HER2 高(I5· 5% )的仪器 1 HER2 AQUA 得分(A)的 X-tile 确定的割点，表明了累计生存17.8%的明显降低[Monte Carlo P < 0. 001 ；培训/确认P = 0.002]，即从75. 7降低到57.9%。该割点应用于仪器2(B)和仪器3 (C)，具有显著性(分别为P < 0.001和P = 0.004)及等效曲线形状和组成，对于仪器2[HER2低(83.6%)； HER2高(16.4% )；累计生存降低15.4%，即从75. 5降低到60. 1 % ]，及对于仪器3 [HER2 低(84.9% ) ；HER2高(14. 1% )；累计生存降低13. 5%，即从74. 9降低到61. 4% ]。图6A-F示出了对于每一指出的仪器组(A、B)、操作员组(C、D)和批次组(E、F)， 基于为参考目的产生的X-tile割点(如仪器1)比较阳性(POS)和阴性(NEG)簇群分离的 2X2列联表。还示出了 95%置信区间的总体一致性、阳性一致率和阴性一致率。
图7A-C为分为阴性一致、阳性一致和不一致情形的频率分布，以表明不一致出现在乳腺癌病例簇群内的哪里，其中㈧仪器2(AQUA 得分)对仪器1(割点)；(B)操作员2 (AQUA 得分)对操作员1 (割点)；及(C)批次2 (AQUA 得分)对批次ι (割点)。不一致的病例位于指出的割点中及附近，并不跨越整个分布。图8A-D示出了 AQUA 分析和EGFR化验的分析性能。㈧对于748个病例，跨3 天染色天数(D)、机器(M)和操作员(0)的HER2的log(2)变换的AQUA 得分的框式图表，其中指出了 ％CV。(B)对跨3个载玻片和3天染色天数的乳腺肿瘤、正常和细胞系控制 (η = 152)的测试阵列产生的EGFRAQUA 得分的线性回归分析，其中指出了平均R值和斜率。(C)来自⑶的40个肿瘤的EGFR的1呢2变换的AQUA 得分的框式图表，其中指出了 ％ CV。(D)来自(B)的35个细胞系O倍冗余)的EGFR的1呢2变换的AQUA 得分的框式图表，其中指出了 ％CV。图9A-D示出了下面例4的结果。图9A-C为来自三个病理学家的Allred得分相较于针对相同试样产生的AQUA 得分的框式图表。图9D为表明每一病理学家的Allred 和AQUA 得分之间的关联的表。图10A-B示出了㈧基于AQUA 得分的病人分群；及⑶群组的生存，如例4中所述。图IlA-B使用Allred得分㈧和AQUA 得分(B)比较特定疾病的五年生存。图12A-B示出了由3位病理学家使用Allred计分方法读同一 TMA载玻片确定的 ER表达得分的比较(A)，及由3台PM-2000仪器读同一 TMA载玻片确定的ER表达AQUA得分的比较(B)0
具体实施例方式除非另外定义，在此使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属技术领域的一般技术人员通常理解一样的含义。如本说明书及所附权利要求中使用的，单数形式“一” 及“该”包括多于一个的所提及对象，除非内容明确指示不同于此的含义。例如，提及“细胞”时包括两个以上细胞的组合等。通常，在此使用的命名法及下述细胞生物学、免疫组织化学及成像(如细胞和组织)中的实验室程序均众所周知并在本领域普遍采用。应意识到，在此所示和描述的具体实施均为本发明的例子，并不意于以任何方式限制本发明的范围。此外，这些技术适合远程会议、机器人视觉、无人驾驶车辆中的应用或任何其它类似的应用。适合在本发明中使用的技术也可在下述申请中找到2008年5月14日申请的 12/153，171,2008 年 6 月 13 日申请的 12/139，370,2008 年 8 月 5 日申请的 12/186，294, 2008年8月7日申请的12/188，133、及2008年8月四日申请的12/201，753，每一这些申请通过引用全部组合于此。图1示出了可再现量化表达在制作在载玻片上的包含细胞的生物试样如病人的组织试样的一个或多个细胞组成的每一细胞组成中的生物标志物的量的过程。过程100开始步骤105为获取已染色、制作在载玻片上的包含细胞的生物试样，其中染色剂以使能定位至少一细胞区室和至少一生物标志物的方式施加。至少一细胞区室包括但不限于细胞质、细胞核和细胞壁。至少一生物标志物可包括经CY5荧光信号标记或检测的生物标志物，用于检测肿瘤细胞。例子包括但不限于HER2、ER、PR、EGFR、ERCCl、TS等。过程100继续即步骤110，获取已染色组织试样的包含像素的图像或一组图像。包含像素的图像或一组图像可使用包括光源的标准化光学系统获取，如光学显微镜系统。包含像素的图像可通过使用数字图像传感器的标准化光学系统获得，如数码照相机。在一些实施例中，数字图像可通过模拟照相机取得，其中所得到的模拟图像或胶卷通过数字扫描仪或等效装置数字化。在至少部分实施例中，照相机可直接或间接安装到显微镜上以获取显微照片形式的包含像素的图像。作为备选或除此之外，照相机可依赖于到现有成像系统上的视频输出线的直接连接。在一些实施例中，光源包括具有可见光谱、红外(IR)光谱和紫外(UV)光谱中的一个或多个的波长的光。照相机可以是视频摄像机或延时摄影序列，提供包含动态细胞活动的实时及消逝时间的图像。由过程100获得的包含像素的图像接着在步骤115进行分析以从图像像素导出一个或多个数据集以区分数据信号和噪声。该分析可自动进行，例如使用处理器进行。处理器可包括一个或多个计算机处理器，可根据预编程的指令集进行控制。在一些实施例中，区分数据信号和噪声包括信号的统计分析，例如导致具有信号的像素与具有归属于噪声的信号的像素分离的无人监督的聚类分析。在一些实施例中，区分数据信号和噪声可包括将制作在载玻片上的组织试样的聚焦图像从制作在载玻片上的组织试样的散焦图像减去而实现。 在一些实施例中，散焦图像可包括刚好在制作在载玻片上的组织试样下面聚焦的图像。通常，使图像散焦相当于空间低通滤波器，使能进行数据信号可与其比较的背景测量。接下来，由过程100获得的包含像素的图像在步骤120进行分析以从图像像素导出一个或多个数据集以区分归属于至少一细胞区室中的每一细胞区室的数据信号。该分析也可自动进行，例如使用预编程的计算机或专用特殊用途处理器。在一些实施例中，分化可能取决于归属于施加到制作在载玻片上的试样的标志物或染色剂的荧光。在一些实施例中，致力于至少一细胞区室的染色剂的荧光的波长变化。在一些实施例中，蓝色荧光可与细胞核受体(DAPI)相关联，绿色荧光可与细胞质受体(细胞角蛋白)相关联，及红色荧光可与细胞膜受体(α-连结蛋白)相关联。优选地，染色剂按使能定位至少一细胞区室和至少一生物标志物的方式施加。在一些实施例中，前面在步骤105中描述的至少一生物标志物用于检测肿瘤细胞或目标蛋白质或目标抗原并可以是制作在载玻片上的组织试样中的肿瘤细胞的指示。过程100包括使先前分化的归属于至少一细胞区室中的每一细胞区室的数据信号与所检测的肿瘤细胞或肿瘤罩相关联的步骤。这样，在步骤125，自动分析源自图像像素的一个或多个数据集以区分归属于用于至少一细胞区室中的每一细胞区室的至少一生物标志物的数据信号。在过程 100的步骤130，可再现地量化表达在制作在载玻片上的组织试样的至少一细胞区室中的生物标志物的量。图2示出了可再现量化表达在制作在载玻片上的试样的一个或多个细胞组成的每一细胞组成中的生物标志物的量的图像处理步骤的详细过程200。过程200以步骤205 开始，获取已染色组织试样的数字图像。数字图像按与方法100中步骤105、110中所描述类似的方式获取。接着，过程200进行步骤210、215和220，测试在信号完整性、试样完整性和图像完整性方面的图像质量。如果信号完整性、试样完整性和图像完整性中的任一或多个图像质量测试失败，则分析时去除该数字图像，或作上标记以由操作员在步骤225人工查看该数字图像并决定在分析时接受该数字图像或在步骤2 去除该数字图像。通过信号完整性、试样完整性和图像完整性的图像质量测试或通过数字图像的人工查看将数字图像确定为候选图像以进一步在过程200中进行图像处理。未能通过信号完整性、试样完整性和图像完整性中的任一或多个的图像质量测试或未能通过数字图像的人工查看将数字图像确定为低质量，并拒绝该数字图像。简言之，信号完整性包括细胞区域化、荧光强度和饱和像素百分比估计。饱和可通过确定包含像素的图像中的预定数量的像素由包括最大或接近最大的值的数据和数据结构表示进行估计。试样完整性包括确定存在足够的感兴趣试样(如肿瘤组织)用于分析。图像完整性包括检测任何散焦图像，在TMA 的情形下，分析和检测任何裂开图像。在本发明已结合其具体实施例进行描述的同时，应当理解，其能够进行进一步的修改。此外，本申请意于覆盖本发明的任何变化、使用或调整，包括落在本发明所属技术领域的已知或通常实践内及落在所附权利要求的范围内的本发明派生技术方案。在本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用组合于此，就像特别及个别指出每一个别出版物、专利或专利申请以通过引用进行组合一样。1、试样任何包含细胞的试样均可由本发明方法进行分析。例如，试样可从病人收集的组织准备。作为备选，试样可以是包含细胞的生物试样如血液试样、骨髓试样或细胞系。试样可以是整个组织或显微镜载玻片上的TMA切片。具体地，当使用组织微阵列(TMA)时，试样可在载玻片上排列为“斑”或“组织斑”，每一组织斑对应于特定试样。这些准备制作在载玻片上的组织试样的方法在本领域众所周知并适合在本发明中使用。2、生物标志物如在此使用的，生物标志物是可在生物试样中进行测量的分子，其为组织类型、正常或病原过程、或对治疗干预的反应的指示。在特定实施例中，生物标志物选自下组蛋白质、肽、核酸、脂质及碳水化合物。更具体地，生物标志物可以是蛋白质。某些标志物为特定细胞的性状，同时其它标志物已确定与特定疾病或情况相关联。已知预断标志物的例子包括生化酶标志物，例如半乳糖基转移酶II、神经元特异性烯醇化酶、质子ATP酶、及酸性磷酸酶。激素或激素受体标志物包括人绒毛膜促性腺激素(HCG)、促肾上腺皮质激素、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原(PSA)、雌激素受体、孕酮受体、雄激素受体、gClq-R/p33补体受体、IL-2受体、p75神经营养蛋白受体、PTH受体、甲状腺激素受体、及胰岛素受体。淋巴标志物包括α -1-抗胰糜蛋白酶、α -1-抗胰蛋白酶、B细胞标志物、bcl_2、 bcl-6、B淋巴细胞抗原36kD、BMl (骨髓标志物)、BM2 (骨髓标志物)、半乳糖凝集素_3、颗粒酶B、HLA I类抗原、HLA II类(DP)抗原、HLA II类(DQ)抗原、HLA II类(DR)抗原、人中性粒细胞防御素、免疫球蛋白A、免疫球蛋白D、免疫球蛋白G、免疫球蛋白Μ、κ轻链、λ 轻链、淋巴细胞/组织细胞抗原、巨噬细胞标志物、胞壁质酶(溶菌酶)、Ρ80间变型淋巴瘤激酶、浆细胞标志物、分泌性白细胞蛋白酶抑制因子、T细胞抗原受体(JOVIl)、T细胞抗原受体(J0VI3)、末端脱氧核苷酸转移酶、未分类B细胞标志物。肿瘤标志物包括α胎蛋白、载脂蛋白D、BAG-I (RAP46蛋白)、CA19_9(唾液酸路易士)、CA50 (癌相关的粘蛋白抗原)、CA125 (卵巢癌抗原)、CA242 (肿瘤相关的粘蛋白抗原)、嗜铬粒蛋白A、簇蛋白(载脂蛋白J)、上皮膜抗原、上皮相关的抗原、上皮特异性抗原、表皮生长因子受体、雌激素受体(ER)、大囊肿病液体蛋白-15、肝细胞特异性抗原、HER2、 heregulin、人胃粘蛋白、人乳脂肪球、MAGE-1、基质金属蛋白酶、黑色素A、黑色素瘤标志物 (HMB45)、间皮蛋白、金属硫蛋白、小眼转录因子(MITF)、Muc-I核糖蛋白、Muc-I糖蛋白、 Muc-2糖蛋白、Muc-5AC糖蛋白、Muc-6糖蛋白、髓过氧物酶、Myf_3 (横纹肌肉瘤标志物)、 Myf_4(横纹肌肉瘤标志物)、MyoDl (横纹肌肉瘤标志物)、肌红蛋白、nm23蛋白、胎盘碱性磷酸酶、前清蛋白、孕酮受体、前列腺特异性抗原、前列腺酸性磷酸酶、前列腺抑制肽、PTEN、 肾细胞癌标志物、小肠粘蛋白抗原、四联凝集素、甲状腺转录因子-1、基质金属蛋白酶1的组织抑制因子、基质金属蛋白酶2的组织抑制因子、酪氨酸酶、酪氨酸酶有关的蛋白-1、绒毛蛋白、血管性血友病因子、CD34、CD34、II 类，CD51 Ab-I、CD63、CD69、Chkl、Chk2、claspin C-met、C0X6C、CREB、细胞周期蛋白D1、细胞角蛋白、细胞角蛋白8、DAPI、结蛋白、DHP(1， 6-二苯基-1，3，5-己三烯)、上皮钙粘蛋白、EEA1、EGFR、EGFRvIII、EMA(上皮膜抗原)、 ER、ERB3、ERCCl、ERK、E-选择蛋白，FAK、纤连蛋白、F0XP3、γ -Η2ΑΧ、GB3、GFAP、穿膜蛋白、 GM130、外周蛋白 97、GRB2、GRP78BiP、GSK3 β、HER-2、组蛋白 3、组蛋白 3_K14_Ace[乙酰化组蛋白H3(赖氨酸14)抗体]、组蛋白3_K18-Ace [组蛋白H3-赖氨酸乙酰化18]、组蛋白3_ K27-TriMe [组蛋白H3 (三甲基K27)]、组蛋白3_K4_diMe [ 二甲基组蛋白H3 (赖氨酸4)抗体]、组蛋白3_K9-Ace[乙酰化组蛋白H3(赖氨酸9)]、组蛋白3_K9_triMe [组蛋白3-三甲基赖氨酸9]、组蛋白3_S10-Phos [组蛋白H3磷酸化(Ser 10)抗体，有丝分裂标志物]、组蛋白4、组蛋白H2A.X_S139-Phos [组蛋白H2A. X磷酸化(Ser 139)抗体]、组蛋白H2B、二甲基组蛋白 H3 (K4)、三甲基组蛋白 H4(K20-Chip 级)、HSP70、尿激酶、VEGF Rl、ICAM-I、IGF-I、 IGF-1R、IGF-1 受体 β、IGF-II、IGF_IIR、IKB-α IKKE、IL6、IL8、整联蛋白 α νβ 3、整联蛋白 α νβ 6、整联蛋白α V/⑶51、整联蛋白Β5、整联蛋白Β6、整联蛋白Β8、整联蛋白β 1 (⑶四)、 整联蛋白β 3、整联蛋白0 5整联蛋白86、顶5-1、叫86(11、蛋白激酶(^2抗体、^^ -1、 轻链 Ab-4(鸡尾酒)、λ 轻链、κ 轻链、Μ6Ρ、Mach2、ΜΑΡΚΑΡΚ-2、ΜΕΚ1、MEKl/2(Ps222)、 MEK2、MEK1/2 (47E6)、MEK1/2 封闭肽、MET/HGFR、MGMT、线粒体抗原、Mitotracker 绿 FM、 MMP-2、MMP9、E-钙粘附蛋白、mTOR、ATP酶，N-钙粘附蛋白、肾病蛋白、NFKB、NFKB ρ 105/p50、 NF-KB P65、Notchl、Notch2、Notch3、OxPhos 络合物 IV、pl30Cas、p38MAPK、p44/42 MAPK 抗体、P504S、P53、P70、P70S6K、广谱钙粘附蛋白、桩蛋白、P-钙粘附蛋白、PDI、pEGFR、磷酸化AKT、磷酸化CREB、磷酸化EGF受体、磷酸化GSK3 β、磷酸化Η3、磷酸化HSP-70、磷酸化 ΜΑΡΚΑΡΚ-2、磷酸化ΜΕΚ1/2、磷酸化p38 MAP激酶、磷酸化p44/42 MAPK、磷酸化p53、磷酸化 H(C、磷酸化S6核糖蛋白、磷酸化Src、磷酸化Akt、磷酸化Bad、磷酸化IKB_a、磷酸化mTOR、 磷酸化NF- κ Bp65、磷酸化p38、磷酸化p44/42 MAPK、磷酸化p70 S6激酶、磷酸化Rb、磷酸化Smad2、PIM1、PIM2、PKC β、足细胞标志蛋白、PR、PTEN、Rl、Rb 4H1、R-钙粘附蛋白、核糖核苷酸还原酶、RRMl、RRMl 1、SLC7A5、NDRG, HTF9C、HTF9C、CEACAM、p33、S6 核糖蛋白、Src、 存活素、突触足蛋白、多配体聚糖4、踝蛋白、Tensin、胸苷酸合酶、Tuberlin、VCAM-l、VEGF、 波形蛋白、凝集素、YES、ZAP-70及Ζ^。 细胞周期相关的标志物包括凋亡蛋白酶活化因子-1、bcl-w, bcl-x、溴脱氧尿苷、 CAK(cdk活化激酶)、细胞凋亡敏感性蛋白(CAQ、半胱氨酸蛋白酶2、半胱氨酸蛋白酶8、 CPP32 (半胱氨酸蛋白酶3)、细胞周期蛋白依赖激酶、细胞周期蛋白A、细胞周期蛋白Bi、细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白D2、细胞周期蛋白D3、细胞周期蛋白E、细胞周期蛋白G、DNA
10片段裂解因子(^末端)、!^8(0)95)、？￡18相关的死亡结构域蛋白1￡18配体1611-1、1 0-38、 Mcl-1、微小染色体维持蛋白、错配修复蛋白(MSffi)、聚(ADP核糖)聚合酶、增生细胞核抗原、P16蛋白、p27蛋白、p3kdc2、p57蛋白(Kip2)、pl05蛋白、Stat 1 alpha、拓扑异构酶 I、拓扑异构酶Π α、拓扑异构酶III α、拓扑异构酶II β。神经系统组织和肿瘤标志物包括α B晶体蛋白、α介连蛋白、α核突触蛋白、淀粉样前体蛋白、β淀粉样蛋白、钙结合蛋白、胆碱乙酰转移酶、谷氨酸转运蛋白1、GAP43、神经胶质纤维酸性蛋白、谷氨酸受体2、髓磷脂碱性蛋白、神经生长因子受体(gp75)、成神经细胞瘤标志物、神经丝68kD、神经丝160kD、神经丝200kD、神经特异性烯醇化酶、烟碱型乙酰胆碱受体α 4、烟碱型乙酰胆碱受体日2、外周蛋白、蛋白基因产品9、5-100蛋白、5-羟色胺、SNAP-25、突触蛋白I、突触素τ、色氨酸羟化酶、酪氨酸羟化酶、泛素。簇群区分标志物包括CDla、CDlb, CDlc, CDld, CDle, CD2、CD3 δ、CD3 ε、CD3 γ、 CD4、CD5、CD6、CD7、CD8a、CD8 3、CD9、CD10、CDlla、CDllb、CDllc、CDwl2、CD13、CD14、CD15、 CD15s、CD16a、CD16b、CDwl7、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、 CD28、CD29、CD30、CD31、CD32、CD33、CD34,CD35,CD36、CD37、CD38、CD39、CD40、CD41、CD42a, CD42b、CD42c、CD42d、CD43、CD44、CD44R、CD45、CD46、CD47、CD48、CD49a、CD49b、CD49c、 CD49d、CD49e、CD49f、CD50、CD51、CD52、CD53、CD54、CD55、CD56、CD57、CD58、CD59、CDw60、 CD61、CD62E、CD62L、CD62P、CD63、CD64、CD65、CD65s、CD66a、CD66b、CD66c、CD66d、CD66e、 CD66f、CD68、CD69、CD70、CD71、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CD77、CD79a、CD79b、CD80、 CD81、CD82、CD83、CD84、CD85、CD86、CD87、CD88、CD89、CD90、CD91、CDw92、CDw93、CD94、 CD95、CD96、CD97、CD98、CD99、CD100、CDlOU CD102、CD103、CD104、CD105、CD106、CD107a、 CD107b、CDw 108, CD109、CD114、CD115、CD116、CD117、CDwll9、CD120a、CD 120b, CD121a、 CDwl21b、CD122、CD123、CD124、CDwl25、CD126、CD127、CDw 128a, CDw 128b, CD130、CDwl31、 CD132、CD134、CD135、CDwl36、CDwl37、CD138、CD139、CD140a、CD140b、CD141、CD142、CD143、 CD144、CDw 145, CD146、CD147、CD148、CDw 149, CDw 150, CD151、CD152、CD153、CD154、CD155、 CD156、CD157、CD158a、CD 158b, CD161、CD162、CD163、CD164、CD165、CD166、及 TCR- ζ。其它细胞标志物包括着丝粒蛋白F(CENP-F)、巨蛋白、内皮蛋白、核纤层蛋白 A&C [ΧΒ10]、LAP-70、粘蛋白、核孔复合蛋白、ρ180片状体蛋白、ran、r、组织蛋白酶D、Ps2蛋白、Her2-神经鞘、P53、SlOO、上皮标志物抗原(EMA)、TdT、MB2、MB3、PCNA 和 Ki67。3、组织染色包含细胞的试样可使用任何试剂或生物标志物标签进行染色，如与特定生物标志物或与各种类型的细胞或细胞区室直接反应的染料或染色剂、组织化学制品、或免疫组织化学制品。并非所有染色剂/试剂均适合。因此，采用的染色剂的类型及其施加顺序应进行适当考虑，但本领域技术人员可容易地确定。前述组织化学制品可以是可由透射显微镜法检测的生色团或可由荧光显微镜法检测的荧光团。总的来说，包含试样的细胞可用包括至少一组织化学制品的溶液孵育，其将与目标的化学基直接反应或结合。一些组织化学制品必须用媒染剂或金属共同孵育以使能染色。包含细胞的试样可用对感兴趣成分染色的至少一组织化学制品和用作复染剂并结合感兴趣成分外面区域的另一组织化学制品的混合物进行孵育。作为备选，多个探针的混合物可在染色时使用，并提供识别特定探针的位置的方式。对包含细胞的试样进行染色的过程在本领域众所周知。
下述非限制性的列表提供可用作组织学成像剂(染色剂或复染剂)的示例性生色团及其目标细胞、细胞区室或细胞组分曙红(碱性细胞组分、细胞质)、苏木精(核酸)、橘黄G (红色血液、胰、及垂体细胞)、亮绿SF (胶原)、Romanowsky-GiemsW整体细胞形态)、 May-Grunwald(血液细胞)、蓝色复染剂(Trevigen)、乙基绿(CAS)(淀粉样蛋白)、福尔根-萘酚黄S(DNA)、GiemSa(对不同细胞区室进行差异着色)、甲基绿(淀粉样蛋白)、派洛宁(核酸)、萘酚黄(红血细胞)、中性红(核)、巴氏(Papanicolaou)染色剂(通常包括苏木精、曙红Y、橘黄G和Bismarck褐的混合物)(整体细胞形态)、红色复染剂B (Trevigen)、 红色复染剂C(Trevigen)、天狼星红(淀粉样蛋白)、福尔根试剂(对品红)(DNA)、倍花青铬明矾(DNA)、倍花青铬明矾和萘酚黄S (DNA)、甲基绿-派洛宁Y (DNA)、硫堇-福尔根试剂 (DNA)、吖啶橘黄(DNA)、亚甲基蓝(RNA和DNA)、甲苯胺蓝(RNA和DNA)、阿尔新蓝(碳水化合物)、钌红(碳水化合物)、苏丹黑(类脂)、苏丹IV(类脂)、油红-0(类脂)、Van Gieson 三色染色剂(酸性品红和苦味酸混合物)(肌肉细胞)、Masson三色染色剂(苏木精、酸性品红和浅绿混合)(对胶原、细胞质、细胞核进行不同地着色)、醛品红(弹性蛋白纤维)、 及Weigert染色剂(区分网状和胶原纤维)。前述染色剂的综合列表、其描述及一般用途在 R. D. Lillie, "Conn' sBiological Stains，，,8th ed·,Williams and Wilkins Company, Baltimore, Md. (1969)中给出。前述适当的媒染剂及成分为本领域技术人员众所周知。下述非限制性列表提供了示例性的荧光组织染色剂及其适用的目标细胞、细胞区室或细胞组分4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(核酸)、曙红(碱性细胞组分、细胞质)、Hoechst 33258和Hoechst 33M2 (两种双苯甲亚胺)(核酸)、碘化丙啶(核酸)、光谱橘黄(核酸)、光谱绿(核酸)、喹吖因(核酸)、荧光素-鬼笔环肽(肌动蛋白纤维)、色霉素A3(核酸)、吖啶黄素-福尔根反应(核酸)、金胺O-福尔根反应(核酸)、溴化乙啶 (核酸)、Nissl染色剂(神经元)、高亲和力DNA荧光团如POPO、BOBO、YOYO和Τ0Τ0等、熔合到结合蛋白的绿色荧光蛋白，如组蛋白、ACMA、喹吖因和吖啶橘黄。大量专有荧光细胞器专用探针可通过商业途径获得，并包括线粒体专用探针 (MitoFluor 和 MitoTracker 染料)、内质网胃(ER)和 Golgi 探针(ER-Tracker 及各种神经酰胺共轭物)、及溶酶体探针(LysoTracker染料)。这些探针及许多非专有的荧光组织化学制品在可从俄勒冈州Eugene的MolecularProbes获得的Handbook of Fluorescent Probes and Research Products 8th Ed. (2001)中描述。每一包含细胞的试样可用适当的酶培养基共同孵育，其为感兴趣的细胞组分及在酶活动场所产生彩色沉淀物的适当试剂。前述酶组织化学染色剂专用于特定目标酶。用酶组织化学染色剂染色可用于确定细胞组分或特定类型的细胞。作为备选，酶组织化学染色剂可在诊断上用于测细胞中酶活性的量。多种酶培养基和检测化验在本领域众所周知。酸性磷酸酶可通过几种方法进行检测。在用于酸性磷酸酶的Gomori方法中，细胞制备用甘油磷酸盐和硝酸铅孵育。酶使磷酸盐游离，其与铅结合以产生磷酸铅，一种无色沉淀物。之后，将组织浸入硫化铵溶液中，其与磷酸铅反应以形成硫化铅，一种黑色沉淀物。作为备选，细胞可用包括pararosanilin-HCl、亚硝酸钠、萘酚ASBl磷酸盐(培养基)及醋酸佛罗那缓冲液的溶液孵育。该方法在酸性磷酸酶活动区域产生红色沉淀物。由于酸性磷酸酶的特性含量，溶酶体可通过使用该化验与其它细胞质颗粒和细胞器区分开。脱氢酶可通过用适于脱氢酶和四唑的种的培养基孵育细胞而进行定位。酶将氢子从培养基转移到四唑，将四唑还原为甲臢，一种黑色沉淀物。例如，NADH脱氢酶是呼吸链的络合物I的组分并主要定位到线粒体。针对其已开发众所周知的染色技术的其它酶及其主要细胞位置或活动包括但不限于ATP酶(肌纤维)、琥珀酸盐脱氢酶(线粒体)、细胞色素c氧化酶(线粒体)、磷酸化酶(线粒体)、磷酸果糖激酶(线粒体)、乙酰胆碱酯酶(神经细胞)、乳糖分解酵素(小肠)、白氨酸氨肽酶(肝细胞)>myodenylate脱氨酶(肌细胞),NADH心肌黄酶(红细胞)、 及蔗糖酶(小肠)。免疫组织化学是最敏感和特殊的组织化学技术之一。每一试样t可与包括特别结合的探针的示踪结合成分组合。可采用多种标记，如荧光团、或产生吸收光或发荧光产物的酶。大量标记已知可用于与单一结合事件有关的强信号。在染色时使用的多个探针可用一个以上可区别的荧光标记进行标记。这些颜色区别提供识别特定探针的位置的方式。制备荧光团和蛋白质的共轭物如抗体的方法在文献中广泛描述，因而不需要在此进行例证。尽管有至少120，000种商用抗体，示例性的主要抗体，其已知特别结合细胞组成且目前用为用于研究的免疫组织化学染色剂中的组分及在有限情形下用于诊断各种疾病， 包括雌激素受体抗体(乳腺癌)、孕酮受体抗体(乳腺癌)、P53抗体(多种癌)、Her-2/neU 抗体(多种癌)、EGFR抗体(上皮生长因子，多种癌)、组织蛋白酶D抗体(乳腺及其它癌)、 Bcl-2抗体(凋亡细胞)、E-钙粘蛋白抗体、CA125抗体(卵巢及其它癌)、CA15_3抗体(乳腺癌)、CA19-9抗体(结肠癌)、c-erbB-2抗体、P-糖蛋白抗体(MDR，多抗药性)、CEA抗体 (癌胚抗原)、视网膜母细胞瘤蛋白(Rb)抗体、ras oneoprotein(p21)抗体、Lewis X(也称为⑶15)抗体、Ki-67抗体(细胞增殖)、PCNA(多种癌)抗体、⑶3抗体(T细胞)、⑶4抗体 (协助T细胞)、CD5抗体(T细胞)、CD7抗体(胸腺细胞、未成熟的T细胞、NK杀伤细胞)、 ⑶8抗体(抑制基因T细胞)、⑶9/p24抗体(ALL)、⑶10 (也称为CALLA)抗体(急性淋巴细胞白血病)、CDllc抗体(单核细胞、粒细胞、AML)、CD13抗体(髓样单核细胞、AML)、CD14抗体(成熟的单核细胞、粒细胞)、⑶15抗体(Hodgkin病)、⑶19抗体(B细胞)、⑶20抗体(B 细胞)、⑶22抗体(B细胞)、⑶23抗体(活性B细胞、CLL)、⑶30抗体(活性T和B细胞、 Hodgkin病)、⑶31抗体(血管发生标志物)、⑶33抗体(骨髓细胞、AML)、⑶34抗体(内皮干细胞、间质瘤)、CD35抗体(树突细胞)、CD38抗体(浆细胞、活性T、B和骨髓细胞)、 ⑶41抗体(血小板、巨核细胞)、LCA/⑶45抗体(白细胞通用抗原)、⑶45R0抗体(协助、诱导T细胞)、⑶45RA抗体(B细胞)、⑶39，⑶100抗体、⑶95/Fas抗体(细胞凋亡)、⑶99抗体(Ewings肉瘤标志物、MIC2基因产品)、⑶106抗体(VCAM-1、活性内皮细胞)、泛素蛋白抗体(Alzheimer病)、CD71(运铁蛋白受体)抗体、c-myc (肿瘤蛋白和半抗原)抗体、细胞角蛋白(运铁蛋白受体)抗体、波形蛋白(内皮细胞)抗体(B和T细胞)、HPV蛋白(人乳头状瘤病毒)抗体、κ轻链抗体(B细胞)、λ轻链抗体(B细胞)、黑素体(HMB^)抗体(黑素瘤)、前列腺特异性抗原(PSA)抗体(前列腺癌)、S_100抗体(黑素瘤、salvary、神经胶质细胞)、τ抗原抗体(Alzheimer病)、纤维蛋白抗体(上皮细胞)、角蛋白抗体、细胞角蛋白抗体(肿瘤)、α-连环蛋白抗体(细胞膜)、Τη_抗原抗体(结肠癌、腺癌和胰腺癌)、1， 8-ANS(l-苯胺萘-8-磺酸)抗体、C4抗体、2C4 CASP级抗体、2C4 CASPa抗体、HER-2抗体、 a B晶体蛋白抗体、α半乳糖苷酶A抗体、a -连环蛋白抗体、人VEGF Rl(Flt-I)抗体、整联蛋白B5抗体、整联蛋白0 6抗体、磷酸化5此原癌基因抗体、8吐抗体、8(^-2抗体、8(^-6抗体、β-Catanin抗体、β-连环蛋白抗体、整联蛋白0\^3抗体工ErbB-2 Ab_12抗体、钙连蛋白抗体、钙网蛋白抗体、CAM5. 2(低摩尔重量细胞角蛋白抗体)抗体、Cardiotin(R2G) 抗体、组织蛋白酶D抗体、鸡多克隆半乳糖苷酶α抗体、c-Met抗体、CREB抗体、C0X6C抗体、细胞周期蛋白Dl Ab-4抗体、细胞角蛋白抗体、结蛋白抗体、DHP(l-6 二苯基-1，3，5-己三烯)抗体；DSB-X生物素化羊抗鸡抗体、E-钙粘蛋白抗体、EEAl抗体、EGFR抗体、EMA (上皮膜抗原)抗体、ER(雌激素受体)抗体、ERB3抗体、ERCCl ERK (Pan ERK)抗体、E-选择蛋白抗体、FAK抗体、纤连蛋白抗体；FITC-羊抗鼠IgM抗体、F0XP3抗体、GB3抗体、GFAP (胶质纤维酸性蛋白)抗体、巨蛋白抗体、GM130抗体、羊a h Met抗体、高尔基体蛋白97抗体、 GRB2抗体、GRP78BiP抗体、GSK-3 β抗体、肝细胞抗体、HER-2抗体、HER-3抗体、组蛋白3抗体、组蛋白4抗体、组蛋白Η2Α X抗体、组蛋白Η2Β抗体、HSP70抗体、ICAM-I抗体、IGF-I抗体、IGF-I受体抗体、IGF-I受体β抗体、IGF-II抗体、1KB- α抗体、IL6抗体、IL8抗体、整联蛋白β 3抗体、整联蛋白β 5抗体、整联蛋白b8抗体、Jagged 1抗体、蛋白激酶C0 2抗体、LAMP-I抗体、M6P (甘露糖6-磷酸盐受体)抗体、MAPKAPK-2抗体、MEKl抗体、MEK2抗体、线粒体抗原抗体、线粒体标志物抗体、Mitotracker绿FM抗体、MMP-2抗体、MMP9抗体、 Na+/K ATP酶抗体、Na+/K ATP酶α 1抗体、Na+/K ATP酶α 3抗体、N-钙粘蛋白抗体、去氧肾上腺素抗体、NF-p50抗体、NF-P65抗体、Notch 1抗体、OxPhos络合物IV_Alexa488偶联抗体、pl30Cas 抗体、P38 MAPK 抗体、p44/42 MAPK 抗体、P504S Clone 13H4 抗体、P53 抗体、P70 S6K抗体、P70磷酸化激酶封闭肽抗体、广谱钙粘蛋白抗体、桩蛋白抗体、P-钙粘蛋白抗体、PDI抗体、磷酸化AKT抗体、磷酸化CREB抗体、磷酸化GSK-3- β抗体、磷酸化Η3抗体、磷酸化ΜΑΡΚΑΡΚ-2抗体、磷酸化MEK抗体、磷酸化p44/42 MAPK抗体、磷酸化ρ53抗体、 磷酸化NF-p65抗体、磷酸化p70 S6激酶抗体、磷酸化PKC (广谱)抗体、磷酸化S6核糖体蛋白抗体、磷酸化Src抗体、磷酸化Bad抗体、磷酸化HSP27抗体、磷酸化IKB_a抗体、磷酸化P44/42 MAI3K抗体、磷酸化p70 S6激酶抗体、磷酸化Rb (Ser807/811)(视网膜母细胞瘤) 抗体、磷酸化HSP-7抗体、磷酸化p38抗体、Pim-I抗体、Pim_2抗体、PKC^抗体、PKC^ 11 抗体、足细胞标志蛋白抗体、I3R抗体、PTEN抗体、Rl抗体、Rb 4H1(视网膜母细胞瘤)抗体、 R-钙粘蛋白抗体、RRMl抗体、S6核糖体蛋白抗体、S-100抗体、足细胞骨架蛋白抗体、多配体蛋白聚糖4抗体、Talin抗体、Tensin抗体、Tuberlin抗体、尿激酶抗体、VCAM-I抗体、VEGF 抗体、波形蛋白抗体、ZAP-70抗体、及^B。 可与主要抗体偶联的荧光团包括但不限于荧光素、罗丹明、德克萨斯红、Cy2、 Cy3、Cy5、VECTOR 红、ELF (酶标记的荧光)、CyO, CyO. 5、CyU Cyl. 5、Cy3、Cy3. 5、Cy5、 Cy7、FluorX、钙黄绿素、钙黄绿素-AM、CRYPT0FLU0R 、橘黄(42kDa)、橘红(35kDa)、金 (3IkDa)、红(42kDa)、深红(40kDa)、BHMP、BHDMAP、Br-Oregon、Lucifer 黄、Alexa染料系列、 N-W-(7-硝基苯-2-草酸-1，3-重氮-4-基)氨基]己酰](NBD)、B0DIPY 、氟化硼络合二吡咯甲川、Oregon 绿、MIT0TRACKER 红、DiOC7 (3)、DiIC18、藻红蛋白、藻胆蛋白、BPE (240kDa)、 RPE(MOkDa)、CPC(264kDa),APC(104kDa)、光谱蓝、光谱浅绿、光谱绿、光谱金、光谱橘黄、光谱红、NADH、NADPH、FAD、红外(IR)染料、环状⑶P核糖(c⑶PR)、CalcofIuor白、丽丝胺、伞形酮、酪氨酸和色氨酸。多种其它荧光探针可从俄勒R州Eugene的Molecular ftx)beS及许多其它制造商获得禾口 / 或在 Handbook of Fluorescent Probesand Research Products 8th Ed. (2001)中广泛描述。
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信号的进一步修改可通过使用可通过使用特定结合成员的组合实现，如抗体和抗抗体，其中抗抗体结合到目标抗体探针的保存区域，尤其是其中抗体来自不同的种。作为备选，可使用特定结合的配体-受体对，如生物素-抗生蛋白链菌素，其中主要抗体与该对的一个成员偶联，及另一成员用可检测的探针标记。因此，有效地建立了结合成员的夹合，其中第一结合成员结合到细胞组成并用于为辅助结合作准备，其中辅助结合成员可以也可不包括标记，其可进一步为第三次结合作准备，其中第三结合成员将提供标记。辅助抗体、抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素或生物素中的每一个用可检测的基团单独标记，其可以是引导具有实质上不可溶颜色反应产物的底物、荧光染料(染色剂)、发光染料或非荧光染料的比色反应的酶。包含每一这些选择的例子在下面列出。原则上，可使用符合下述情形的任何酶(i)可与主要抗体偶联或间接结合(如经偶联的抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素、生物素、辅助抗体)；及(ii)使用可溶底物提供不可溶产物(沉淀)。例如，采用的酶可以是碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β -半乳糖苷酶和/或葡萄糖氧化酶；及底物可相应为碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β -半乳糖苷酶或葡萄糖氧化酶底物。碱性磷酸酶(AP)底物包括但不限于AP蓝底物(蓝色沉淀，Zymed目录p. 61)、AP 橘黄底物(橘黄、沉淀、Zymed)、AP红底物(红、红色沉淀、Zymed)、5_溴_4_氯-3-吲哚基磷酸酯(BCIP底物、青绿色沉淀)、5_溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯/硝基蓝四唑/碘硝基四唑(BCIP/INT底物、黄-棕沉淀、Biomeda)、5_溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯/硝基蓝四唑(BCIP/NBT底物、蓝/紫)、5_溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯/硝基蓝四唑/碘硝基四唑 (BCIP/NBT/INT、棕色沉淀、DAK0)、固红(红)、洋红-光(洋红)、萘酚AS-BI磷酸酯(NABP)/ 固红TR(红)、萘酚AS-BI磷酸酯(NABP)/新品红(红)、萘酚AS-MX磷酸酯(NABP)/新品红(红)、新品红AP底物(红)、对硝基苯磷酸酯(PNPP、黄、可水溶)、VECTOR 黑(黑)、 VECTOR 蓝(蓝)、VECTOR 红(红)、Vega红(树莓红色)。辣根过氧化物酶(HRP，有时缩写为P0)底物包括但不限于2，2’-连氮基-双-3-乙基苯-二氢噻唑磺酸酯(ABTS、绿、可水溶)、氨乙基咔唑、3-氨基-9-乙基咔唑AEC(3A9EC、 红)、α-萘酚派洛宁(红)、4_氯-1-萘酚GC1N、蓝、蓝-黑)、3，3' - 二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB、棕)、邻二茴香胺(绿)、邻苯二胺(0PD、棕、可水溶)、TACS蓝(蓝)、TACS红(红)、 3,3' ,5,5'-四甲基联苯胺(TMB、绿或绿/蓝)、TRUE BLUE (蓝)、VECTOR VIP(紫)、 VECTOR SG (烟蓝-灰)、及Zymed蓝HRP底物(鲜艳蓝)。葡萄糖氧化酶(GO)底物包括但不限于硝基蓝四唑(NBT、紫色沉淀)、四硝基蓝四唑(TNBT、黑色沉淀)、2-(4_碘苯基)-5-(4-硝基苯基)-3-苯基氯化四唑(INT、红或橘黄色沉淀)、四唑蓝(蓝)、硝基四唑紫(紫)、及溴化-3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基四唑(MTT、紫)。所有四唑底物均需要葡萄糖作为共同底物。葡萄糖氧化及四唑盐还原并形成不可溶甲臜，甲臜形成彩色沉淀。β -半乳糖苷酶底物包括但不限于5-溴-4-氯-3-吲哚β -D-半乳糖苷(X_gal、 蓝色沉淀)。与每一所列出的底物相关联的沉淀具有独一无二的可检测的光谱特征(组分)。酶也可在催化底物的发光反应时进行引导，例如但不限于荧光素酶和发光蛋白质，具有能够发光或引导第二底物的第二反应的实质上不可溶的反应产物，例如但不限于荧光素和ATP或腔肠素和Ca.2+，具有发光产物。下述整体组合于此的文献提供另外的例子J. M Elias (1990) Immunohistopathology :A practical approach to diagnosis.ASCP Press (AmericanSociety of Clinical Pathologists) , Chicago ； J.F. McGinty, F.E.B1 oom (1983)Doub1eimmunostaiηing reveals distinctions among opioidpeptidergic neurons in the medialbasal hypothalamus. Brain Res. 278 145-153 ； 及 Τ. Jowett(1997)Tissue In situHybridization :Methods in Animal Development. John Wiley & Sons, Inc. ,NewYork ；J Histochem Cytochem 1997 December 45(12) :1629-1641o核酸生物标志物可使用原位杂交(ISH)进行检测。总的来说，核酸序列探针用荧光探针或配体受体对如生物素/抗生物素蛋白的一成员合成和标记，其用可检测的基团标记。示例性的探针和基团在前面部分中描述。序列探针与细胞中的目标核苷酸序列互补。包含目标核苷酸序列的每一细胞或细胞区室可结合标记的探针。在分析时使用的探针可以是DNA或RNA寡核苷酸或多核苷酸，及不仅可包含自然出现的核苷酸而且还可包含其类似物如dioxygenindCTP、生物素dcTP 7-氮杂鸟嘌呤核苷、叠氮胸苷、肌苷或尿苷。其它有用的探针包括肽探针及其类似物、分支基因DNA、拟肽类、肽核酸和/或抗体。探针与感兴趣的目标核酸序列应具有足够的互补性，使得在目标核酸序列和探针之间出现稳定和特定的结合。稳定杂交所需要的同源度随杂交的严格性变化。传统的ISH、杂交和探针选择方法在下述文献中描述；Leitch, et al. In SituHybridization :a practical guide， Oxford BIOS Scientific Publishers, MicroscopyHandbooks v.27 (1994)；及 Sambrook， J.，Fritsch，E. F.，Maniatis，T.，MolecularCloning :A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press (1989)。在一实施例中，在这里描述的当前化验中使用的试剂如染色或IHC试剂的最佳稀释可在数量上自动确定。在一实施例中，对多个稀释组进行成像，其中每一稀释组包括不同的相应稀释值和免疫测定染色强度值的相应排列。对多个稀释组中的每一组，相对于免疫测定染色强度值的相应排列确定相应的动态范围度量。已发现相应的动态范围度量，选择具有数字上最佳动态范围度量的稀释组，及该稀释组的稀释值选择为在本发明中使用的试剂的最佳稀释水平的表示。例如，制作在载玻片上的组织试样利用上述普通免疫组织化学技术用主要抗体的稀释系列之一染色。所得到的已染色试样中的每一个使用用于查看可检测的信号并获得图像的系统成像，前述图像如数字染色图像。获取图像的方法在下面更详细地描述。因此，所获得的图像之后由本发明方法使用从而用于在数量上确定本发明中使用的试剂的最佳浓度。每一组组织试样包括多个不同的、用相应滴定量稀释准备的组织试样，使得不同的组织试样组具有不同的相应滴定量稀释。对多组组织试样的像素化图像进行量化分析。对于多个稀释组中的每一稀释组，计算动态范围度量及染色特异性。在本发明的一实施例中，动态范围度量为平均绝对偏差。在本发明的另一实施例中，对该数据进行log 变换，及动态范围度量为标准偏差、方差和摆幅比的加权组合。计算染色的特异性以在使噪声最小的同时使特定信号最大化。染色的特异性可这样计算将与染色特异性区室相关联的一组免疫测定染色强度值求和然后计算该染色特异性区室的染色特异性平均值；也将与非染色特异性区室相关联的一组免疫测定染色强度值求和然后计算非染色特异性平均值。 在计算这两个平均值之后，染色特异性平均值除以非染色特异性平均值以产生染色的特异性，或信噪度量。在这样的实施例中，数字上大灵敏度的染色值为最佳。在另一实施例中，非染色特异性平均值除以染色特异性平均值以产生染色的灵敏度。在前述实施例中，数字上小灵敏度的染色值为最佳。在计算每一稀释组的动态范围度量和染色灵敏度之后，动态范围度量和染色灵敏度可相互组合以产生每一稀释组的组合值。所得到的组合值用于选择具有数字上最佳组合值的稀释组。与所选稀释组相关联的是试剂的最佳稀释的稀释值表示。 可选地，该方法执行多个比较以试图识别多个染色特异性和非染色特异性区室。4、仪器标准化和图像收集一旦试样已被染色，任何光学或非光学成像装置可用于检测染色剂或生物标志物标记，例如竖立或倒置光学显微镜、扫描共焦显微镜、摄像机、扫描或隧穿电子显微镜、扫描探针显微镜、及成像红外检测器等。在一实施例中，成像装置为显微镜系统，其包括配置成照射目标试样的照明源、配置成产生所照射目标试样的放大图像的光学器件、及配置成捕获所放大图像的数字图像的检测器如数码相机。量化结果可通过处理所捕获的数字图像获得。前述图像处理可包括本领域技术人员已知的图像处理技术。在至少部分实施例中，前述图像捕获和图像处理中的一个或多个在处理器的帮助下完成。处理器可包括实施预编程的指令的计算机。例如，组织试样或组织微阵列可按如下所述成像用户将微阵列放在试样台上。用户调节试样台使得感兴趣的第一区域或第一组织斑位于视场中心并由CCD照相机聚焦。物镜应调节到适当的分辨率，例如0. 6毫米试样可以10倍放大率进行查看。如果有石蜡，试样通常对应于光强度比周围石蜡高的区域，与通过各种手段评估的一样，包括源自已染色组织的可见光散射、组织自身荧光或荧光标签的信号。计算机使用计算机软件(Softworx 2. 5, Applied Precision, Issaquah, WA)和成像平台(如 Deltavision)可获得低分辨率图像(如具有16位分辨率的64像素X64像素)。计算机自动将试样台平移约等于视场的量。之后，计算机获得第二低分辨率图像。该过程重复直到计算机已获得整个组织试样或微阵列的图像为止。之后，计算机使用商用软件产生整个组织试样或微阵列的合成图像。可选地，为标准化使用特定系统获得的量化结果，可确定系统内在因素以考虑例如沿光通路的激发源的强度变异性和设备变异性。为此，激发光源的强度的度量也可通过使用内嵌灯强度测量工具获得。同样，标准或校准试样如校准显微镜载玻片的测量可使用特定系统获得以确定一个或多个光通路因素。使用前述校准载玻片对于基于荧光的IHC应用特别有用，其中校准载玻片的试样荧光区在相应带宽内发出辐射。荧光发射使能以一个或多个相应波长中的每一波长表征光通路。这些测量可同时或分别获得。可选地，本发明系统还包括构造成将照明源的标准化试样重定向到检测器的校准装置，尽管已发现本发明方法不需要使用这样的装置。在至少部分实施例中，系统处理器配置成确定特定显微镜的校正因子。校正因子可从使用校准装置获得的照明源的标准化试样的测量结果确定。校正因子可(由处理器)用于校正目标试样的所检测图像的任何强度变化。例如，校准块因子(CC)通过与通用标准块比较进行确定。光源因子(LQ通过对捕获的校准表面图像的像素强度求和进行确定。光通路因子(OP)是对每一块/试样组合取的16个图像的平均总光强度的商。CC和OP因子对于进行研究的特定硬件系统是固有的，因而仅需要校准一次或在怀疑光学系统中已发生某些类型的修改时进行校准。标准化AQUA 得分如下所示标准化AQUA 得分=原始AQUA 得分*cc因子*LS因子*0P因子其中，CC和OP因子在系统安装/构造时确定，LS因子同时进行测量。在一些实施例中，系统处理器配置以用于获得校准因子的指令(如软件)。作为备选或另外，系统处理器配置以使用校正因子校正所检测的图像的指令。前述校准用于降低同一显微镜系统内照明源强度随着时间的过去可能出现的变化性，及降低使用不同显微镜系统和/或不同照明源获得的量化结果之间的变化性。5、图像优化a、曝光时间可选地，可对来自所收集图像的像素强度数据的动态范围进行优化以进一步降低批次之间的变化，尤其降低因染色强度和影响曝光时间的设备差异引起的变化。该过程包括在第一曝光时间捕获照相机视场内的对象的图像，使得所捕获的图像包括预定数量的像素，其中每一像素具有强度值。查询所捕获图像的像素强度的频率分布以确定频率分布的像素强度的最高出现频率的区域。然后，自第一曝光时间调节曝光时间以将该最高频率分布区域移向强度值范围的中间。换言之，确定直方图的质心(COM)或频率分布，从其计算调节的曝光时间以获得像素强度的优化动态范围。之后，在调节后的曝光时间捕获该对象的第二图像，从而使得图像具有最佳动态范围。有多种方式可校正在此描述的方法中的曝光。一种校正技术为以比先前图像更长或更短的曝光时间迭代获取新的图像，直到饱和像素最小化且获得最佳动态范围为止。该迭代过程使能快速调节曝光时间以在检测范围内减低像素强度从而优化曝光和动态范围。 然而，该过分简单化的方法可能导致系统饱和像素过校正并将新的曝光时间设置得太低。 因此，希望将曝光时间校正的攻击性修改为与先前图像中有多少像素饱和成正比。为此，新的曝光时间可计算为E = E' χ (1-(0. 5)(1+s)),其中
权利要求
1.在制作在载玻片上的组织试样中可再现量化生物标志物表达的方法，包括(a)获取制作在载玻片上的组织试样，其已被染色以使能定位至少一细胞区室和至少一生物标志物；(b)使用包括光源的标准化光学系统获取已染色组织试样的一个或多个包含像素的图像；(c)自动分析源自图像像素的一个或多个数据集以区分数据信号和噪声；(d)自动分析源自图像像素的一个或多个数据集以区分归属于至少一细胞区室中的每一细胞区室的数据信号；(e)可选地，自动分析源自图像像素的一个或多个数据集以区分归属于用于至少一细胞区室中的每一细胞区室的至少一生物标志物的数据信号；(f)量化表达在至少一细胞区室的每一细胞区室中的生物标志物的量； 藉此，制作在载玻片上的组织试样中的生物标志物表达得以可再现地量化。
2.根据权利要求1的方法，其中所述标准化光学系统包括其强度和光通路变化性已归一化的光源。
3.根据权利要求1的方法，其中所述标准化光学系统允许自动调节曝光时间以优化在图像像素中捕获的动态数据范围。
4.根据权利要求1的方法，其中每一自动分析步骤以无人监督的方式进行。
5.根据权利要求1的方法，其中对归属于两个以上细胞区室的数据信号进行区分。
6.根据权利要求1的方法，其中对表达在两个以上细胞区室的每一细胞区室中的生物标志物的量进行量化。
7.根据权利要求1的方法，其中以约95%的置信区间区分归属于两个以上细胞区室的数据信号。
8.根据权利要求1的方法，还包括评估一个或多个制作在载玻片上的组织试样或一个或多个包含像素的图像或其一个或多个放大部分的质量。
9.根据权利要求1的方法，该方法实现可再现割点确定。
10.根据权利要求1的方法，对于每一试样，所述方法在批次之间实现85%以上的试样分类一致性。
11.根据权利要求1的方法，对于每一试样，所述方法在批次之间实现90%以上的试样分类一致性。
12.根据权利要求1的方法，所述方法实现生物标志物表达的量化测量的再现性水平高于80%。
13.根据权利要求1的方法，所述方法实现生物标志物表达的量化测量的再现性水平高于90%。
14.根据权利要求1的方法，所述方法实现生物标志物蛋白质的量化测量的再现性水平高于95%。
15.根据权利要求1的方法，所述方法实现生物标志物表达的量化测量的再现性水平落在约90%到约97%的范围中。
16.根据权利要求1的方法，所述方法实现生物标志物表达的量化测量的变化系数％ CV低于20%。
17.根据权利要求1的方法，所述方法实现生物标志物表达的量化测量的变化系数％ CV低于10%。
18.根据权利要求1的方法，所述方法实现生物标志物表达的量化测量的变化系数％ CV低于5%。
19.根据权利要求1的方法，所述方法实现生物标志物表达的量化测量的变化系数％ CV落在约4%到约7%的范围中。
20.根据权利要求1的方法，其中制作在载玻片上的组织试样已用一种或多种试剂的最佳稀释进行染色。
21.根据权利要求20的方法，其中所述最佳稀释产生具有最佳动态范围度量的一个或多个包含像素的图像。
22.—种计算机可读介质，该介质包括存储于其上的、由处理器运行以执行在制作在载玻片上的组织试样中可再现量化生物标志物表达的方法的计算机可读指令，所述方法包括(a)获取制作在载玻片上的组织试样的一个或多个包含像素的图像，所述组织试样已被染色以使能使用包括光源的标准化光学系统定位至少一细胞区室和至少一生物标志物；(b)自动分析源自图像像素的一个或多个数据集以区分数据信号和噪声；(c)自动分析源自图像像素的一个或多个数据集以区分归属于至少一细胞区室中的每一细胞区室的数据信号；及(d)量化表达在至少一细胞区室的每一细胞区室中的生物标志物的量；藉此，制作在载玻片上的组织试样中的生物标志物表达可再现地量化。
23.根据权利要求22的计算机可读介质，其中存储于其上并由处理器运行的计算机可读指令还包括执行在所述量化步骤之前具有下述可选步骤的方法的指令自动分析源自图像像素的一个或多个数据集以区分归属于用于至少一细胞区室中的每一细胞区室的至少一生物标志物的数据信号。
24.用于可再现量化制作在载玻片上的组织试样中的生物标志物表达的系统，包括(a)配置成至少放大制作在载玻片上的组织试样的一部分的一个或多个透镜，所述组织试样已被染色以使能定位至少一细胞区室和至少一生物标志物；(b)标准化光学系统，包括与一个或多个透镜光通信的光源和图像传感器，标准化光学系统获取已染色组织试样的一个或多个包含像素的图像；(c)与标准化光学系统通信的处理器模块，该处理器模块配置成(i)自动分析源自图像像素的一个或多个数据集以区分数据信号和噪声；(ii)自动分析源自图像像素的一个或多个数据集以区分归属于至少一细胞区室中的每一细胞区室的数据信号；及(iii)量化表达在至少一细胞区室的每一细胞区室中的生物标志物的量；藉此，制作在载玻片上的组织试样中的生物标志物表达可再现地量化。
25.根据权利要求M的系统，其中所述处理器模块还配置成可选地自动分析源自图像像素的一个或多个数据集以区分归属于用于至少一细胞区室中的每一细胞区室的至少一生物标志物的数据信号。
全文摘要
本发明方法涉及生物标志物表达的可再现量化，包括组织试样中的生物标志物表达。本发明描述了方法和系统，其中生物标志物表达的可再现得分独立于仪器、其位置或操作员获得。
文档编号G06T7/00GK102165489SQ200980137750
公开日2011年8月24日 申请日期2009年9月15日 优先权日2008年9月16日
发明者B·伯克, C·威廉斯, D·M·赖利, D·王, G·R·特德斯奇, J·克里斯琴森, M·P·泽科夫斯基, M·古斯达夫逊, R·皮纳德 申请人:赫斯托克斯公司
生物标志物表达的可再现量化相关申请交叉引用本申请要求2008年9月16日申请的美国专利申请61/097，415的优先权权益，其公开内容通过引用全部组合于此。
背景技术：
本发明涉及使用算法自动进行生物标志物表达分析的领域，以增强独立于操作员的分析和化验结果再现性从而在诊断化验中更好地预测值。迄今为止，组织切片的生物标志物评估依赖于传统的细胞化学和免疫组织化学 (IHC)技术，这些技术在大规模和大量化验存在之前已得到大量发展。传统方法的重大缺陷在于测试的主观性质及缺乏标准化。尽管IHC测试已展现了临床实用性(如Her2/ Here印Test)，但这些测试的值最近已表明受到进行测试的地点的影响。检验Her2测试的再现性的两个最近的研究已表明在本地和中央实验室测试之间可能有多达20%的误差 (Perez et al.J.Clinic. One. (2006)24:3032-8 ；Paik S et al. Benefit from adjuvant trastuzumab may not be confined topatients with IHC 3+and/or FISH positive tumors =Central testing results fromNSABP B-31 (2007) 25 :511-22)。组织微阵列技术为组织试样的大量分析提供机会(Konen，J. et al.，Nat. Med. 4 844-7(1998) ；Kallioniemi, 0. P. et al.，Hum. Mol. Genet. 10:657-62(2001) ；Rimm, D. L. et al. ,Cancer J. 7 :24-31 Q001))。例如，使用组织微阵列快速进行大规模研究的能力可为识别和确认药品靶点、预断标志(如雌激素受体(ER)和HER2/神经鞘)及候选疗法提供关键 fn息ο本发明首次实现了原地生物标志物量化的全自动标准化，使得实验室之间、机器之间、操作员之间及不同日期之间的染色变化最小。
发明内容
本发明涉及组织试样、整个组织切片(WTQ及组织微阵列(TMA)的生物标志物表达的可再现量化，以减小多次试验或多批之间因操作员、设备、设施及其它因素的差异引起的变化性。在此描述的系统和方法用得分的归一化实现生物标志物的自动定位和量化从而在多次试验之间具有更大的再现性，而与位置、操作员或仪器的变化无关。本发明的一实施例涉及在制作在载玻片上的组织试样中可再现量化生物标志物表达的方法，包括(a)获取制作在载玻片上的组织试样，其已被染色以使能定位至少一细胞区室和至少一生物标志物；(b)使用包括光源的标准化光学系统获取已染色组织试样的一个或多个包含像素的图像；(c)自动分析源自图像像素的一个或多个数据集以区分数据信号和噪声；(d)自动分析源自图像像素的一个或多个数据集以区分归属于至少一细胞区室中的每一细胞区室的数据信号；(e)可选地，自动分析源自图像像素的一个或多个数据集以区分归属于用于至少一细胞区室中的每一细胞区室的至少一生物标志物的数据信号； (f)量化表达在至少一细胞区室的每一细胞区室中的生物标志物的量；藉此制作在载玻片上的组织试样中的生物标志物表达可再现地量化。在一实施例中，标准化光学系统包括其强度和光通路变化性已归一化的光源。在另一实施例中，标准化光学系统允许自动调节曝光时间以优化在图像像素中捕获的动态数据范围。在一实施例中，每一自动分析步骤以无人监督的方式进行。在一实施例中，对归属于两个以上细胞区室的数据信号进行区分。在一实施例中，对表达在两个以上细胞区室的每一细胞区室中的生物标志物的量进行量化。在一实施例中，以约95%的置信区间区分归属于两个以上细胞区室的数据信号。在一实施例中，本发明方法还包括评估一个或多个制作在载玻片上的组织试样或一个或多个包含像素的图像或其一个或多个放大部分的质量。在一实施例中，本发明方法实现可再现割点确定。在一实施例中，对于每一试样，本发明方法在批次之间实现85%以上的试样分类一致性。在另一实施例中，对于每一试样，本发明方法在批次之间实现90%以上的试样分类
一致性。在一实施例中，本发明方法实现生物标志物表达的量化测量的再现性水平高于 80%。在另一实施例中，本发明方法实现生物标志物表达的量化测量的再现性水平高于 90%。在另一实施例中，本发明方法实现生物标志物蛋白质的量化测量的再现性水平高于 95%。在一实施例中，本发明方法实现生物标志物表达的量化测量的再现性水平落在约 90%到约97%的范围中。在一实施例中，本发明方法实现生物标志物表达的量化测量的变化系数(％ CV) 低于20%。在另一实施例中，本发明方法实现生物标志物表达的量化测量的变化系数(％ CV)低于10%。在另一实施例中，本发明方法实现生物标志物表达的量化测量的变化系数 (%CV)低于5%。在另一实施例中，本发明方法实现生物标志物表达的量化测量的变化系数(％ CV)落在约4%到约7%的范围中。在一实施例中，制作在载玻片上的组织试样已用一种或多种试剂的最佳稀释进行染色。在另一实施例中，最佳稀释产生具有最佳动态范围度量的一个或多个包含像素的图像。在一实施例中，本发明方法由计算机实施。在另一实施例中，本发明致力于一种计算机可读介质，该介质包括存储于其上的、由处理器运行以执行在此所述的方法的计算机可读指令。在另一实施例中，本发明致力于携载用于实施在此所述的方法的计算机可读指令的电磁信号。本发明还致力于具有存储于其上的计算机可读指令的计算机可读介质， 计算机可读指令由处理器运行以执行可再现量化制作在载玻片上的组织试样中的生物标志物表达的方法，该方法包括(a)获取制作在载玻片上的组织试样的一个或多个包含像素的图像，前述组织试样已被染色以使能使用包括光源的标准化光学系统定位至少一细胞区室和至少一生物标志物；(b)自动分析源自图像像素的一个或多个数据集以区分数据信号和噪声；(c)自动分析源自图像像素的一个或多个数据集以区分归属于至少一细胞区室中的每一细胞区室的数据信号；及(d)量化表达在至少一细胞区室的每一细胞区室中的生物标志物的量；藉此制作在载玻片上的组织试样中的生物标志物表达可再现地量化。在计算机可读介质的优选实施例中，存储于其上并由处理器运行的计算机可读指令还包括执行在所述量化步骤之前具有下述可选步骤的方法的指令自动分析源自图像像素的一个或多个数据集以区分归属于用于至少一细胞区室中的每一细胞区室的至少一生物标志物的数据信号。在本发明的又一实施例中，用于可再现量化制作在载玻片上的组织试样中的生物标志物表达的系统包括(a)配置成至少放大制作在载玻片上的组织试样的一部分的一个或多个透镜，所述组织试样已被染色以使能定位至少一细胞区室和至少一生物标志物；(b) 标准化光学系统，包括与一个或多个透镜光通信的光源和图像传感器，标准化光学系统获取已染色组织试样的一个或多个包含像素的图像；(C)与标准化光学系统通信的处理器模块，该处理器模块配置成(i)自动分析源自图像像素的一个或多个数据集以区分数据信号和噪声；(ii)自动分析源自图像像素的一个或多个数据集以区分归属于至少一细胞区室中的每一细胞区室的数据信号；及(iii)量化表达在至少一细胞区室的每一细胞区室中的生物标志物的量；藉此制作在载玻片上的组织试样中的生物标志物表达可再现地量化。 在该系统的优选实施例中，处理器模块还配置成可选地自动分析源自图像像素的一个或多个数据集以区分归属于用于至少一细胞区室中的每一细胞区室的至少一生物标志物的数据信号。该分析优选在量化步骤(iii)之前进行。本发明的其它特征、目标和优点可从下述附图、详细描述和强烈要求明显看出。
图1示出了可再现量化表达在制作在载玻片上的包含细胞的生物试样如病人的组织试样的一个或多个细胞组成的每一细胞组成中的生物标志物的量的过程。图2示出了可再现量化表达在制作在载玻片上的包含细胞的生物试样的一个或多个细胞组成的每一细胞组成中的生物标志物的量的图像处理步骤的过程。图3为按传统IHC得分(χ轴)对543种情形分类的变换的HER2 AQUA 得分(y轴)的框式图表，其中兼有AQUA 和IHC得分信息。用于跨所有类进行均值比较的单向ANOVA分析很有意义(P < 0. 001)。在此之后，对于多个比较使用Tamhane的T2统计量的分析表明每一类之间具有明显差异(所有P值< 0. 05)。图4A-C示出了对于583种情形比较跨仪器㈧、操作员⑶和染色批次(C)的归一化Lc^2变换的HER2 AQUA 得分的框式图表，其中指出了所有情形的平均<% CV。图5A-C示出了 Kaplan-Meier 5年特定疾病的生存分析图表，对于将簇群分为 HER2 低(84· 5% )和 HER2 高(I5· 5% )的仪器 1 HER2 AQUA 得分(A)的 X-tile 确定的割点，表明了累计生存17.8%的明显降低[Monte Carlo P < 0. 001 ；培训/确认P = 0.002]，即从75. 7降低到57.9%。该割点应用于仪器2(B)和仪器3 (C)，具有显著性(分别为P < 0.001和P = 0.004)及等效曲线形状和组成，对于仪器2[HER2低(83.6%)； HER2高(16.4% )；累计生存降低15.4%，即从75. 5降低到60. 1 % ]，及对于仪器3 [HER2 低(84.9% ) ；HER2高(14. 1% )；累计生存降低13. 5%，即从74. 9降低到61. 4% ]。图6A-F示出了对于每一指出的仪器组(A、B)、操作员组(C、D)和批次组(E、F)， 基于为参考目的产生的X-tile割点(如仪器1)比较阳性(POS)和阴性(NEG)簇群分离的 2X2列联表。还示出了 95%置信区间的总体一致性、阳性一致率和阴性一致率。
图7A-C为分为阴性一致、阳性一致和不一致情形的频率分布，以表明不一致出现在乳腺癌病例簇群内的哪里，其中㈧仪器2(AQUA 得分)对仪器1(割点)；(B)操作员2 (AQUA 得分)对操作员1 (割点)；及(C)批次2 (AQUA 得分)对批次ι (割点)。不一致的病例位于指出的割点中及附近，并不跨越整个分布。图8A-D示出了 AQUA 分析和EGFR化验的分析性能。㈧对于748个病例，跨3 天染色天数(D)、机器(M)和操作员(0)的HER2的log(2)变换的AQUA 得分的框式图表，其中指出了 ％CV。(B)对跨3个载玻片和3天染色天数的乳腺肿瘤、正常和细胞系控制 (η = 152)的测试阵列产生的EGFRAQUA 得分的线性回归分析，其中指出了平均R值和斜率。(C)来自⑶的40个肿瘤的EGFR的1呢2变换的AQUA 得分的框式图表，其中指出了 ％ CV。(D)来自(B)的35个细胞系O倍冗余)的EGFR的1呢2变换的AQUA 得分的框式图表，其中指出了 ％CV。图9A-D示出了下面例4的结果。图9A-C为来自三个病理学家的Allred得分相较于针对相同试样产生的AQUA 得分的框式图表。图9D为表明每一病理学家的Allred 和AQUA 得分之间的关联的表。图10A-B示出了㈧基于AQUA 得分的病人分群；及⑶群组的生存，如例4中所述。图IlA-B使用Allred得分㈧和AQUA 得分(B)比较特定疾病的五年生存。图12A-B示出了由3位病理学家使用Allred计分方法读同一 TMA载玻片确定的 ER表达得分的比较(A)，及由3台PM-2000仪器读同一 TMA载玻片确定的ER表达AQUA得分的比较(B)0
具体实施例方式除非另外定义，在此使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属技术领域的一般技术人员通常理解一样的含义。如本说明书及所附权利要求中使用的，单数形式“一” 及“该”包括多于一个的所提及对象，除非内容明确指示不同于此的含义。例如，提及“细胞”时包括两个以上细胞的组合等。通常，在此使用的命名法及下述细胞生物学、免疫组织化学及成像(如细胞和组织)中的实验室程序均众所周知并在本领域普遍采用。应意识到，在此所示和描述的具体实施均为本发明的例子，并不意于以任何方式限制本发明的范围。此外，这些技术适合远程会议、机器人视觉、无人驾驶车辆中的应用或任何其它类似的应用。适合在本发明中使用的技术也可在下述申请中找到2008年5月14日申请的 12/153，171,2008 年 6 月 13 日申请的 12/139，370,2008 年 8 月 5 日申请的 12/186，294, 2008年8月7日申请的12/188，133、及2008年8月四日申请的12/201，753，每一这些申请通过引用全部组合于此。图1示出了可再现量化表达在制作在载玻片上的包含细胞的生物试样如病人的组织试样的一个或多个细胞组成的每一细胞组成中的生物标志物的量的过程。过程100开始步骤105为获取已染色、制作在载玻片上的包含细胞的生物试样，其中染色剂以使能定位至少一细胞区室和至少一生物标志物的方式施加。至少一细胞区室包括但不限于细胞质、细胞核和细胞壁。至少一生物标志物可包括经CY5荧光信号标记或检测的生物标志物，用于检测肿瘤细胞。例子包括但不限于HER2、ER、PR、EGFR、ERCCl、TS等。过程100继续即步骤110，获取已染色组织试样的包含像素的图像或一组图像。包含像素的图像或一组图像可使用包括光源的标准化光学系统获取，如光学显微镜系统。包含像素的图像可通过使用数字图像传感器的标准化光学系统获得，如数码照相机。在一些实施例中，数字图像可通过模拟照相机取得，其中所得到的模拟图像或胶卷通过数字扫描仪或等效装置数字化。在至少部分实施例中，照相机可直接或间接安装到显微镜上以获取显微照片形式的包含像素的图像。作为备选或除此之外，照相机可依赖于到现有成像系统上的视频输出线的直接连接。在一些实施例中，光源包括具有可见光谱、红外(IR)光谱和紫外(UV)光谱中的一个或多个的波长的光。照相机可以是视频摄像机或延时摄影序列，提供包含动态细胞活动的实时及消逝时间的图像。由过程100获得的包含像素的图像接着在步骤115进行分析以从图像像素导出一个或多个数据集以区分数据信号和噪声。该分析可自动进行，例如使用处理器进行。处理器可包括一个或多个计算机处理器，可根据预编程的指令集进行控制。在一些实施例中，区分数据信号和噪声包括信号的统计分析，例如导致具有信号的像素与具有归属于噪声的信号的像素分离的无人监督的聚类分析。在一些实施例中，区分数据信号和噪声可包括将制作在载玻片上的组织试样的聚焦图像从制作在载玻片上的组织试样的散焦图像减去而实现。 在一些实施例中，散焦图像可包括刚好在制作在载玻片上的组织试样下面聚焦的图像。通常，使图像散焦相当于空间低通滤波器，使能进行数据信号可与其比较的背景测量。接下来，由过程100获得的包含像素的图像在步骤120进行分析以从图像像素导出一个或多个数据集以区分归属于至少一细胞区室中的每一细胞区室的数据信号。该分析也可自动进行，例如使用预编程的计算机或专用特殊用途处理器。在一些实施例中，分化可能取决于归属于施加到制作在载玻片上的试样的标志物或染色剂的荧光。在一些实施例中，致力于至少一细胞区室的染色剂的荧光的波长变化。在一些实施例中，蓝色荧光可与细胞核受体(DAPI)相关联，绿色荧光可与细胞质受体(细胞角蛋白)相关联，及红色荧光可与细胞膜受体(α-连结蛋白)相关联。优选地，染色剂按使能定位至少一细胞区室和至少一生物标志物的方式施加。在一些实施例中，前面在步骤105中描述的至少一生物标志物用于检测肿瘤细胞或目标蛋白质或目标抗原并可以是制作在载玻片上的组织试样中的肿瘤细胞的指示。过程100包括使先前分化的归属于至少一细胞区室中的每一细胞区室的数据信号与所检测的肿瘤细胞或肿瘤罩相关联的步骤。这样，在步骤125，自动分析源自图像像素的一个或多个数据集以区分归属于用于至少一细胞区室中的每一细胞区室的至少一生物标志物的数据信号。在过程 100的步骤130，可再现地量化表达在制作在载玻片上的组织试样的至少一细胞区室中的生物标志物的量。图2示出了可再现量化表达在制作在载玻片上的试样的一个或多个细胞组成的每一细胞组成中的生物标志物的量的图像处理步骤的详细过程200。过程200以步骤205 开始，获取已染色组织试样的数字图像。数字图像按与方法100中步骤105、110中所描述类似的方式获取。接着，过程200进行步骤210、215和220，测试在信号完整性、试样完整性和图像完整性方面的图像质量。如果信号完整性、试样完整性和图像完整性中的任一或多个图像质量测试失败，则分析时去除该数字图像，或作上标记以由操作员在步骤225人工查看该数字图像并决定在分析时接受该数字图像或在步骤2 去除该数字图像。通过信号完整性、试样完整性和图像完整性的图像质量测试或通过数字图像的人工查看将数字图像确定为候选图像以进一步在过程200中进行图像处理。未能通过信号完整性、试样完整性和图像完整性中的任一或多个的图像质量测试或未能通过数字图像的人工查看将数字图像确定为低质量，并拒绝该数字图像。简言之，信号完整性包括细胞区域化、荧光强度和饱和像素百分比估计。饱和可通过确定包含像素的图像中的预定数量的像素由包括最大或接近最大的值的数据和数据结构表示进行估计。试样完整性包括确定存在足够的感兴趣试样(如肿瘤组织)用于分析。图像完整性包括检测任何散焦图像，在TMA 的情形下，分析和检测任何裂开图像。在本发明已结合其具体实施例进行描述的同时，应当理解，其能够进行进一步的修改。此外，本申请意于覆盖本发明的任何变化、使用或调整，包括落在本发明所属技术领域的已知或通常实践内及落在所附权利要求的范围内的本发明派生技术方案。在本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用组合于此，就像特别及个别指出每一个别出版物、专利或专利申请以通过引用进行组合一样。1、试样任何包含细胞的试样均可由本发明方法进行分析。例如，试样可从病人收集的组织准备。作为备选，试样可以是包含细胞的生物试样如血液试样、骨髓试样或细胞系。试样可以是整个组织或显微镜载玻片上的TMA切片。具体地，当使用组织微阵列(TMA)时，试样可在载玻片上排列为“斑”或“组织斑”，每一组织斑对应于特定试样。这些准备制作在载玻片上的组织试样的方法在本领域众所周知并适合在本发明中使用。2、生物标志物如在此使用的，生物标志物是可在生物试样中进行测量的分子，其为组织类型、正常或病原过程、或对治疗干预的反应的指示。在特定实施例中，生物标志物选自下组蛋白质、肽、核酸、脂质及碳水化合物。更具体地，生物标志物可以是蛋白质。某些标志物为特定细胞的性状，同时其它标志物已确定与特定疾病或情况相关联。已知预断标志物的例子包括生化酶标志物，例如半乳糖基转移酶II、神经元特异性烯醇化酶、质子ATP酶、及酸性磷酸酶。激素或激素受体标志物包括人绒毛膜促性腺激素(HCG)、促肾上腺皮质激素、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原(PSA)、雌激素受体、孕酮受体、雄激素受体、gClq-R/p33补体受体、IL-2受体、p75神经营养蛋白受体、PTH受体、甲状腺激素受体、及胰岛素受体。淋巴标志物包括α -1-抗胰糜蛋白酶、α -1-抗胰蛋白酶、B细胞标志物、bcl_2、 bcl-6、B淋巴细胞抗原36kD、BMl (骨髓标志物)、BM2 (骨髓标志物)、半乳糖凝集素_3、颗粒酶B、HLA I类抗原、HLA II类(DP)抗原、HLA II类(DQ)抗原、HLA II类(DR)抗原、人中性粒细胞防御素、免疫球蛋白A、免疫球蛋白D、免疫球蛋白G、免疫球蛋白Μ、κ轻链、λ 轻链、淋巴细胞/组织细胞抗原、巨噬细胞标志物、胞壁质酶(溶菌酶)、Ρ80间变型淋巴瘤激酶、浆细胞标志物、分泌性白细胞蛋白酶抑制因子、T细胞抗原受体(JOVIl)、T细胞抗原受体(J0VI3)、末端脱氧核苷酸转移酶、未分类B细胞标志物。肿瘤标志物包括α胎蛋白、载脂蛋白D、BAG-I (RAP46蛋白)、CA19_9(唾液酸路易士)、CA50 (癌相关的粘蛋白抗原)、CA125 (卵巢癌抗原)、CA242 (肿瘤相关的粘蛋白抗原)、嗜铬粒蛋白A、簇蛋白(载脂蛋白J)、上皮膜抗原、上皮相关的抗原、上皮特异性抗原、表皮生长因子受体、雌激素受体(ER)、大囊肿病液体蛋白-15、肝细胞特异性抗原、HER2、 heregulin、人胃粘蛋白、人乳脂肪球、MAGE-1、基质金属蛋白酶、黑色素A、黑色素瘤标志物 (HMB45)、间皮蛋白、金属硫蛋白、小眼转录因子(MITF)、Muc-I核糖蛋白、Muc-I糖蛋白、 Muc-2糖蛋白、Muc-5AC糖蛋白、Muc-6糖蛋白、髓过氧物酶、Myf_3 (横纹肌肉瘤标志物)、 Myf_4(横纹肌肉瘤标志物)、MyoDl (横纹肌肉瘤标志物)、肌红蛋白、nm23蛋白、胎盘碱性磷酸酶、前清蛋白、孕酮受体、前列腺特异性抗原、前列腺酸性磷酸酶、前列腺抑制肽、PTEN、 肾细胞癌标志物、小肠粘蛋白抗原、四联凝集素、甲状腺转录因子-1、基质金属蛋白酶1的组织抑制因子、基质金属蛋白酶2的组织抑制因子、酪氨酸酶、酪氨酸酶有关的蛋白-1、绒毛蛋白、血管性血友病因子、CD34、CD34、II 类，CD51 Ab-I、CD63、CD69、Chkl、Chk2、claspin C-met、C0X6C、CREB、细胞周期蛋白D1、细胞角蛋白、细胞角蛋白8、DAPI、结蛋白、DHP(1， 6-二苯基-1，3，5-己三烯)、上皮钙粘蛋白、EEA1、EGFR、EGFRvIII、EMA(上皮膜抗原)、 ER、ERB3、ERCCl、ERK、E-选择蛋白，FAK、纤连蛋白、F0XP3、γ -Η2ΑΧ、GB3、GFAP、穿膜蛋白、 GM130、外周蛋白 97、GRB2、GRP78BiP、GSK3 β、HER-2、组蛋白 3、组蛋白 3_K14_Ace[乙酰化组蛋白H3(赖氨酸14)抗体]、组蛋白3_K18-Ace [组蛋白H3-赖氨酸乙酰化18]、组蛋白3_ K27-TriMe [组蛋白H3 (三甲基K27)]、组蛋白3_K4_diMe [ 二甲基组蛋白H3 (赖氨酸4)抗体]、组蛋白3_K9-Ace[乙酰化组蛋白H3(赖氨酸9)]、组蛋白3_K9_triMe [组蛋白3-三甲基赖氨酸9]、组蛋白3_S10-Phos [组蛋白H3磷酸化(Ser 10)抗体，有丝分裂标志物]、组蛋白4、组蛋白H2A.X_S139-Phos [组蛋白H2A. X磷酸化(Ser 139)抗体]、组蛋白H2B、二甲基组蛋白 H3 (K4)、三甲基组蛋白 H4(K20-Chip 级)、HSP70、尿激酶、VEGF Rl、ICAM-I、IGF-I、 IGF-1R、IGF-1 受体 β、IGF-II、IGF_IIR、IKB-α IKKE、IL6、IL8、整联蛋白 α νβ 3、整联蛋白 α νβ 6、整联蛋白α V/⑶51、整联蛋白Β5、整联蛋白Β6、整联蛋白Β8、整联蛋白β 1 (⑶四)、 整联蛋白β 3、整联蛋白0 5整联蛋白86、顶5-1、叫86(11、蛋白激酶(^2抗体、^^ -1、 轻链 Ab-4(鸡尾酒)、λ 轻链、κ 轻链、Μ6Ρ、Mach2、ΜΑΡΚΑΡΚ-2、ΜΕΚ1、MEKl/2(Ps222)、 MEK2、MEK1/2 (47E6)、MEK1/2 封闭肽、MET/HGFR、MGMT、线粒体抗原、Mitotracker 绿 FM、 MMP-2、MMP9、E-钙粘附蛋白、mTOR、ATP酶，N-钙粘附蛋白、肾病蛋白、NFKB、NFKB ρ 105/p50、 NF-KB P65、Notchl、Notch2、Notch3、OxPhos 络合物 IV、pl30Cas、p38MAPK、p44/42 MAPK 抗体、P504S、P53、P70、P70S6K、广谱钙粘附蛋白、桩蛋白、P-钙粘附蛋白、PDI、pEGFR、磷酸化AKT、磷酸化CREB、磷酸化EGF受体、磷酸化GSK3 β、磷酸化Η3、磷酸化HSP-70、磷酸化 ΜΑΡΚΑΡΚ-2、磷酸化ΜΕΚ1/2、磷酸化p38 MAP激酶、磷酸化p44/42 MAPK、磷酸化p53、磷酸化 H(C、磷酸化S6核糖蛋白、磷酸化Src、磷酸化Akt、磷酸化Bad、磷酸化IKB_a、磷酸化mTOR、 磷酸化NF- κ Bp65、磷酸化p38、磷酸化p44/42 MAPK、磷酸化p70 S6激酶、磷酸化Rb、磷酸化Smad2、PIM1、PIM2、PKC β、足细胞标志蛋白、PR、PTEN、Rl、Rb 4H1、R-钙粘附蛋白、核糖核苷酸还原酶、RRMl、RRMl 1、SLC7A5、NDRG, HTF9C、HTF9C、CEACAM、p33、S6 核糖蛋白、Src、 存活素、突触足蛋白、多配体聚糖4、踝蛋白、Tensin、胸苷酸合酶、Tuberlin、VCAM-l、VEGF、 波形蛋白、凝集素、YES、ZAP-70及Ζ^。 细胞周期相关的标志物包括凋亡蛋白酶活化因子-1、bcl-w, bcl-x、溴脱氧尿苷、 CAK(cdk活化激酶)、细胞凋亡敏感性蛋白(CAQ、半胱氨酸蛋白酶2、半胱氨酸蛋白酶8、 CPP32 (半胱氨酸蛋白酶3)、细胞周期蛋白依赖激酶、细胞周期蛋白A、细胞周期蛋白Bi、细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白D2、细胞周期蛋白D3、细胞周期蛋白E、细胞周期蛋白G、DNA
10片段裂解因子(^末端)、!^8(0)95)、？￡18相关的死亡结构域蛋白1￡18配体1611-1、1 0-38、 Mcl-1、微小染色体维持蛋白、错配修复蛋白(MSffi)、聚(ADP核糖)聚合酶、增生细胞核抗原、P16蛋白、p27蛋白、p3kdc2、p57蛋白(Kip2)、pl05蛋白、Stat 1 alpha、拓扑异构酶 I、拓扑异构酶Π α、拓扑异构酶III α、拓扑异构酶II β。神经系统组织和肿瘤标志物包括α B晶体蛋白、α介连蛋白、α核突触蛋白、淀粉样前体蛋白、β淀粉样蛋白、钙结合蛋白、胆碱乙酰转移酶、谷氨酸转运蛋白1、GAP43、神经胶质纤维酸性蛋白、谷氨酸受体2、髓磷脂碱性蛋白、神经生长因子受体(gp75)、成神经细胞瘤标志物、神经丝68kD、神经丝160kD、神经丝200kD、神经特异性烯醇化酶、烟碱型乙酰胆碱受体α 4、烟碱型乙酰胆碱受体日2、外周蛋白、蛋白基因产品9、5-100蛋白、5-羟色胺、SNAP-25、突触蛋白I、突触素τ、色氨酸羟化酶、酪氨酸羟化酶、泛素。簇群区分标志物包括CDla、CDlb, CDlc, CDld, CDle, CD2、CD3 δ、CD3 ε、CD3 γ、 CD4、CD5、CD6、CD7、CD8a、CD8 3、CD9、CD10、CDlla、CDllb、CDllc、CDwl2、CD13、CD14、CD15、 CD15s、CD16a、CD16b、CDwl7、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、 CD28、CD29、CD30、CD31、CD32、CD33、CD34,CD35,CD36、CD37、CD38、CD39、CD40、CD41、CD42a, CD42b、CD42c、CD42d、CD43、CD44、CD44R、CD45、CD46、CD47、CD48、CD49a、CD49b、CD49c、 CD49d、CD49e、CD49f、CD50、CD51、CD52、CD53、CD54、CD55、CD56、CD57、CD58、CD59、CDw60、 CD61、CD62E、CD62L、CD62P、CD63、CD64、CD65、CD65s、CD66a、CD66b、CD66c、CD66d、CD66e、 CD66f、CD68、CD69、CD70、CD71、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CD77、CD79a、CD79b、CD80、 CD81、CD82、CD83、CD84、CD85、CD86、CD87、CD88、CD89、CD90、CD91、CDw92、CDw93、CD94、 CD95、CD96、CD97、CD98、CD99、CD100、CDlOU CD102、CD103、CD104、CD105、CD106、CD107a、 CD107b、CDw 108, CD109、CD114、CD115、CD116、CD117、CDwll9、CD120a、CD 120b, CD121a、 CDwl21b、CD122、CD123、CD124、CDwl25、CD126、CD127、CDw 128a, CDw 128b, CD130、CDwl31、 CD132、CD134、CD135、CDwl36、CDwl37、CD138、CD139、CD140a、CD140b、CD141、CD142、CD143、 CD144、CDw 145, CD146、CD147、CD148、CDw 149, CDw 150, CD151、CD152、CD153、CD154、CD155、 CD156、CD157、CD158a、CD 158b, CD161、CD162、CD163、CD164、CD165、CD166、及 TCR- ζ。其它细胞标志物包括着丝粒蛋白F(CENP-F)、巨蛋白、内皮蛋白、核纤层蛋白 A&C [ΧΒ10]、LAP-70、粘蛋白、核孔复合蛋白、ρ180片状体蛋白、ran、r、组织蛋白酶D、Ps2蛋白、Her2-神经鞘、P53、SlOO、上皮标志物抗原(EMA)、TdT、MB2、MB3、PCNA 和 Ki67。3、组织染色包含细胞的试样可使用任何试剂或生物标志物标签进行染色，如与特定生物标志物或与各种类型的细胞或细胞区室直接反应的染料或染色剂、组织化学制品、或免疫组织化学制品。并非所有染色剂/试剂均适合。因此，采用的染色剂的类型及其施加顺序应进行适当考虑，但本领域技术人员可容易地确定。前述组织化学制品可以是可由透射显微镜法检测的生色团或可由荧光显微镜法检测的荧光团。总的来说，包含试样的细胞可用包括至少一组织化学制品的溶液孵育，其将与目标的化学基直接反应或结合。一些组织化学制品必须用媒染剂或金属共同孵育以使能染色。包含细胞的试样可用对感兴趣成分染色的至少一组织化学制品和用作复染剂并结合感兴趣成分外面区域的另一组织化学制品的混合物进行孵育。作为备选，多个探针的混合物可在染色时使用，并提供识别特定探针的位置的方式。对包含细胞的试样进行染色的过程在本领域众所周知。
下述非限制性的列表提供可用作组织学成像剂(染色剂或复染剂)的示例性生色团及其目标细胞、细胞区室或细胞组分曙红(碱性细胞组分、细胞质)、苏木精(核酸)、橘黄G (红色血液、胰、及垂体细胞)、亮绿SF (胶原)、Romanowsky-GiemsW整体细胞形态)、 May-Grunwald(血液细胞)、蓝色复染剂(Trevigen)、乙基绿(CAS)(淀粉样蛋白)、福尔根-萘酚黄S(DNA)、GiemSa(对不同细胞区室进行差异着色)、甲基绿(淀粉样蛋白)、派洛宁(核酸)、萘酚黄(红血细胞)、中性红(核)、巴氏(Papanicolaou)染色剂(通常包括苏木精、曙红Y、橘黄G和Bismarck褐的混合物)(整体细胞形态)、红色复染剂B (Trevigen)、 红色复染剂C(Trevigen)、天狼星红(淀粉样蛋白)、福尔根试剂(对品红)(DNA)、倍花青铬明矾(DNA)、倍花青铬明矾和萘酚黄S (DNA)、甲基绿-派洛宁Y (DNA)、硫堇-福尔根试剂 (DNA)、吖啶橘黄(DNA)、亚甲基蓝(RNA和DNA)、甲苯胺蓝(RNA和DNA)、阿尔新蓝(碳水化合物)、钌红(碳水化合物)、苏丹黑(类脂)、苏丹IV(类脂)、油红-0(类脂)、Van Gieson 三色染色剂(酸性品红和苦味酸混合物)(肌肉细胞)、Masson三色染色剂(苏木精、酸性品红和浅绿混合)(对胶原、细胞质、细胞核进行不同地着色)、醛品红(弹性蛋白纤维)、 及Weigert染色剂(区分网状和胶原纤维)。前述染色剂的综合列表、其描述及一般用途在 R. D. Lillie, "Conn' sBiological Stains，，,8th ed·,Williams and Wilkins Company, Baltimore, Md. (1969)中给出。前述适当的媒染剂及成分为本领域技术人员众所周知。下述非限制性列表提供了示例性的荧光组织染色剂及其适用的目标细胞、细胞区室或细胞组分4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(核酸)、曙红(碱性细胞组分、细胞质)、Hoechst 33258和Hoechst 33M2 (两种双苯甲亚胺)(核酸)、碘化丙啶(核酸)、光谱橘黄(核酸)、光谱绿(核酸)、喹吖因(核酸)、荧光素-鬼笔环肽(肌动蛋白纤维)、色霉素A3(核酸)、吖啶黄素-福尔根反应(核酸)、金胺O-福尔根反应(核酸)、溴化乙啶 (核酸)、Nissl染色剂(神经元)、高亲和力DNA荧光团如POPO、BOBO、YOYO和Τ0Τ0等、熔合到结合蛋白的绿色荧光蛋白，如组蛋白、ACMA、喹吖因和吖啶橘黄。大量专有荧光细胞器专用探针可通过商业途径获得，并包括线粒体专用探针 (MitoFluor 和 MitoTracker 染料)、内质网胃(ER)和 Golgi 探针(ER-Tracker 及各种神经酰胺共轭物)、及溶酶体探针(LysoTracker染料)。这些探针及许多非专有的荧光组织化学制品在可从俄勒冈州Eugene的MolecularProbes获得的Handbook of Fluorescent Probes and Research Products 8th Ed. (2001)中描述。每一包含细胞的试样可用适当的酶培养基共同孵育，其为感兴趣的细胞组分及在酶活动场所产生彩色沉淀物的适当试剂。前述酶组织化学染色剂专用于特定目标酶。用酶组织化学染色剂染色可用于确定细胞组分或特定类型的细胞。作为备选，酶组织化学染色剂可在诊断上用于测细胞中酶活性的量。多种酶培养基和检测化验在本领域众所周知。酸性磷酸酶可通过几种方法进行检测。在用于酸性磷酸酶的Gomori方法中，细胞制备用甘油磷酸盐和硝酸铅孵育。酶使磷酸盐游离，其与铅结合以产生磷酸铅，一种无色沉淀物。之后，将组织浸入硫化铵溶液中，其与磷酸铅反应以形成硫化铅，一种黑色沉淀物。作为备选，细胞可用包括pararosanilin-HCl、亚硝酸钠、萘酚ASBl磷酸盐(培养基)及醋酸佛罗那缓冲液的溶液孵育。该方法在酸性磷酸酶活动区域产生红色沉淀物。由于酸性磷酸酶的特性含量，溶酶体可通过使用该化验与其它细胞质颗粒和细胞器区分开。脱氢酶可通过用适于脱氢酶和四唑的种的培养基孵育细胞而进行定位。酶将氢子从培养基转移到四唑，将四唑还原为甲臢，一种黑色沉淀物。例如，NADH脱氢酶是呼吸链的络合物I的组分并主要定位到线粒体。针对其已开发众所周知的染色技术的其它酶及其主要细胞位置或活动包括但不限于ATP酶(肌纤维)、琥珀酸盐脱氢酶(线粒体)、细胞色素c氧化酶(线粒体)、磷酸化酶(线粒体)、磷酸果糖激酶(线粒体)、乙酰胆碱酯酶(神经细胞)、乳糖分解酵素(小肠)、白氨酸氨肽酶(肝细胞)>myodenylate脱氨酶(肌细胞),NADH心肌黄酶(红细胞)、 及蔗糖酶(小肠)。免疫组织化学是最敏感和特殊的组织化学技术之一。每一试样t可与包括特别结合的探针的示踪结合成分组合。可采用多种标记，如荧光团、或产生吸收光或发荧光产物的酶。大量标记已知可用于与单一结合事件有关的强信号。在染色时使用的多个探针可用一个以上可区别的荧光标记进行标记。这些颜色区别提供识别特定探针的位置的方式。制备荧光团和蛋白质的共轭物如抗体的方法在文献中广泛描述，因而不需要在此进行例证。尽管有至少120，000种商用抗体，示例性的主要抗体，其已知特别结合细胞组成且目前用为用于研究的免疫组织化学染色剂中的组分及在有限情形下用于诊断各种疾病， 包括雌激素受体抗体(乳腺癌)、孕酮受体抗体(乳腺癌)、P53抗体(多种癌)、Her-2/neU 抗体(多种癌)、EGFR抗体(上皮生长因子，多种癌)、组织蛋白酶D抗体(乳腺及其它癌)、 Bcl-2抗体(凋亡细胞)、E-钙粘蛋白抗体、CA125抗体(卵巢及其它癌)、CA15_3抗体(乳腺癌)、CA19-9抗体(结肠癌)、c-erbB-2抗体、P-糖蛋白抗体(MDR，多抗药性)、CEA抗体 (癌胚抗原)、视网膜母细胞瘤蛋白(Rb)抗体、ras oneoprotein(p21)抗体、Lewis X(也称为⑶15)抗体、Ki-67抗体(细胞增殖)、PCNA(多种癌)抗体、⑶3抗体(T细胞)、⑶4抗体 (协助T细胞)、CD5抗体(T细胞)、CD7抗体(胸腺细胞、未成熟的T细胞、NK杀伤细胞)、 ⑶8抗体(抑制基因T细胞)、⑶9/p24抗体(ALL)、⑶10 (也称为CALLA)抗体(急性淋巴细胞白血病)、CDllc抗体(单核细胞、粒细胞、AML)、CD13抗体(髓样单核细胞、AML)、CD14抗体(成熟的单核细胞、粒细胞)、⑶15抗体(Hodgkin病)、⑶19抗体(B细胞)、⑶20抗体(B 细胞)、⑶22抗体(B细胞)、⑶23抗体(活性B细胞、CLL)、⑶30抗体(活性T和B细胞、 Hodgkin病)、⑶31抗体(血管发生标志物)、⑶33抗体(骨髓细胞、AML)、⑶34抗体(内皮干细胞、间质瘤)、CD35抗体(树突细胞)、CD38抗体(浆细胞、活性T、B和骨髓细胞)、 ⑶41抗体(血小板、巨核细胞)、LCA/⑶45抗体(白细胞通用抗原)、⑶45R0抗体(协助、诱导T细胞)、⑶45RA抗体(B细胞)、⑶39，⑶100抗体、⑶95/Fas抗体(细胞凋亡)、⑶99抗体(Ewings肉瘤标志物、MIC2基因产品)、⑶106抗体(VCAM-1、活性内皮细胞)、泛素蛋白抗体(Alzheimer病)、CD71(运铁蛋白受体)抗体、c-myc (肿瘤蛋白和半抗原)抗体、细胞角蛋白(运铁蛋白受体)抗体、波形蛋白(内皮细胞)抗体(B和T细胞)、HPV蛋白(人乳头状瘤病毒)抗体、κ轻链抗体(B细胞)、λ轻链抗体(B细胞)、黑素体(HMB^)抗体(黑素瘤)、前列腺特异性抗原(PSA)抗体(前列腺癌)、S_100抗体(黑素瘤、salvary、神经胶质细胞)、τ抗原抗体(Alzheimer病)、纤维蛋白抗体(上皮细胞)、角蛋白抗体、细胞角蛋白抗体(肿瘤)、α-连环蛋白抗体(细胞膜)、Τη_抗原抗体(结肠癌、腺癌和胰腺癌)、1， 8-ANS(l-苯胺萘-8-磺酸)抗体、C4抗体、2C4 CASP级抗体、2C4 CASPa抗体、HER-2抗体、 a B晶体蛋白抗体、α半乳糖苷酶A抗体、a -连环蛋白抗体、人VEGF Rl(Flt-I)抗体、整联蛋白B5抗体、整联蛋白0 6抗体、磷酸化5此原癌基因抗体、8吐抗体、8(^-2抗体、8(^-6抗体、β-Catanin抗体、β-连环蛋白抗体、整联蛋白0\^3抗体工ErbB-2 Ab_12抗体、钙连蛋白抗体、钙网蛋白抗体、CAM5. 2(低摩尔重量细胞角蛋白抗体)抗体、Cardiotin(R2G) 抗体、组织蛋白酶D抗体、鸡多克隆半乳糖苷酶α抗体、c-Met抗体、CREB抗体、C0X6C抗体、细胞周期蛋白Dl Ab-4抗体、细胞角蛋白抗体、结蛋白抗体、DHP(l-6 二苯基-1，3，5-己三烯)抗体；DSB-X生物素化羊抗鸡抗体、E-钙粘蛋白抗体、EEAl抗体、EGFR抗体、EMA (上皮膜抗原)抗体、ER(雌激素受体)抗体、ERB3抗体、ERCCl ERK (Pan ERK)抗体、E-选择蛋白抗体、FAK抗体、纤连蛋白抗体；FITC-羊抗鼠IgM抗体、F0XP3抗体、GB3抗体、GFAP (胶质纤维酸性蛋白)抗体、巨蛋白抗体、GM130抗体、羊a h Met抗体、高尔基体蛋白97抗体、 GRB2抗体、GRP78BiP抗体、GSK-3 β抗体、肝细胞抗体、HER-2抗体、HER-3抗体、组蛋白3抗体、组蛋白4抗体、组蛋白Η2Α X抗体、组蛋白Η2Β抗体、HSP70抗体、ICAM-I抗体、IGF-I抗体、IGF-I受体抗体、IGF-I受体β抗体、IGF-II抗体、1KB- α抗体、IL6抗体、IL8抗体、整联蛋白β 3抗体、整联蛋白β 5抗体、整联蛋白b8抗体、Jagged 1抗体、蛋白激酶C0 2抗体、LAMP-I抗体、M6P (甘露糖6-磷酸盐受体)抗体、MAPKAPK-2抗体、MEKl抗体、MEK2抗体、线粒体抗原抗体、线粒体标志物抗体、Mitotracker绿FM抗体、MMP-2抗体、MMP9抗体、 Na+/K ATP酶抗体、Na+/K ATP酶α 1抗体、Na+/K ATP酶α 3抗体、N-钙粘蛋白抗体、去氧肾上腺素抗体、NF-p50抗体、NF-P65抗体、Notch 1抗体、OxPhos络合物IV_Alexa488偶联抗体、pl30Cas 抗体、P38 MAPK 抗体、p44/42 MAPK 抗体、P504S Clone 13H4 抗体、P53 抗体、P70 S6K抗体、P70磷酸化激酶封闭肽抗体、广谱钙粘蛋白抗体、桩蛋白抗体、P-钙粘蛋白抗体、PDI抗体、磷酸化AKT抗体、磷酸化CREB抗体、磷酸化GSK-3- β抗体、磷酸化Η3抗体、磷酸化ΜΑΡΚΑΡΚ-2抗体、磷酸化MEK抗体、磷酸化p44/42 MAPK抗体、磷酸化ρ53抗体、 磷酸化NF-p65抗体、磷酸化p70 S6激酶抗体、磷酸化PKC (广谱)抗体、磷酸化S6核糖体蛋白抗体、磷酸化Src抗体、磷酸化Bad抗体、磷酸化HSP27抗体、磷酸化IKB_a抗体、磷酸化P44/42 MAI3K抗体、磷酸化p70 S6激酶抗体、磷酸化Rb (Ser807/811)(视网膜母细胞瘤) 抗体、磷酸化HSP-7抗体、磷酸化p38抗体、Pim-I抗体、Pim_2抗体、PKC^抗体、PKC^ 11 抗体、足细胞标志蛋白抗体、I3R抗体、PTEN抗体、Rl抗体、Rb 4H1(视网膜母细胞瘤)抗体、 R-钙粘蛋白抗体、RRMl抗体、S6核糖体蛋白抗体、S-100抗体、足细胞骨架蛋白抗体、多配体蛋白聚糖4抗体、Talin抗体、Tensin抗体、Tuberlin抗体、尿激酶抗体、VCAM-I抗体、VEGF 抗体、波形蛋白抗体、ZAP-70抗体、及^B。 可与主要抗体偶联的荧光团包括但不限于荧光素、罗丹明、德克萨斯红、Cy2、 Cy3、Cy5、VECTOR 红、ELF (酶标记的荧光)、CyO, CyO. 5、CyU Cyl. 5、Cy3、Cy3. 5、Cy5、 Cy7、FluorX、钙黄绿素、钙黄绿素-AM、CRYPT0FLU0R 、橘黄(42kDa)、橘红(35kDa)、金 (3IkDa)、红(42kDa)、深红(40kDa)、BHMP、BHDMAP、Br-Oregon、Lucifer 黄、Alexa染料系列、 N-W-(7-硝基苯-2-草酸-1，3-重氮-4-基)氨基]己酰](NBD)、B0DIPY 、氟化硼络合二吡咯甲川、Oregon 绿、MIT0TRACKER 红、DiOC7 (3)、DiIC18、藻红蛋白、藻胆蛋白、BPE (240kDa)、 RPE(MOkDa)、CPC(264kDa),APC(104kDa)、光谱蓝、光谱浅绿、光谱绿、光谱金、光谱橘黄、光谱红、NADH、NADPH、FAD、红外(IR)染料、环状⑶P核糖(c⑶PR)、CalcofIuor白、丽丝胺、伞形酮、酪氨酸和色氨酸。多种其它荧光探针可从俄勒R州Eugene的Molecular ftx)beS及许多其它制造商获得禾口 / 或在 Handbook of Fluorescent Probesand Research Products 8th Ed. (2001)中广泛描述。
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信号的进一步修改可通过使用可通过使用特定结合成员的组合实现，如抗体和抗抗体，其中抗抗体结合到目标抗体探针的保存区域，尤其是其中抗体来自不同的种。作为备选，可使用特定结合的配体-受体对，如生物素-抗生蛋白链菌素，其中主要抗体与该对的一个成员偶联，及另一成员用可检测的探针标记。因此，有效地建立了结合成员的夹合，其中第一结合成员结合到细胞组成并用于为辅助结合作准备，其中辅助结合成员可以也可不包括标记，其可进一步为第三次结合作准备，其中第三结合成员将提供标记。辅助抗体、抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素或生物素中的每一个用可检测的基团单独标记，其可以是引导具有实质上不可溶颜色反应产物的底物、荧光染料(染色剂)、发光染料或非荧光染料的比色反应的酶。包含每一这些选择的例子在下面列出。原则上，可使用符合下述情形的任何酶(i)可与主要抗体偶联或间接结合(如经偶联的抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素、生物素、辅助抗体)；及(ii)使用可溶底物提供不可溶产物(沉淀)。例如，采用的酶可以是碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β -半乳糖苷酶和/或葡萄糖氧化酶；及底物可相应为碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β -半乳糖苷酶或葡萄糖氧化酶底物。碱性磷酸酶(AP)底物包括但不限于AP蓝底物(蓝色沉淀，Zymed目录p. 61)、AP 橘黄底物(橘黄、沉淀、Zymed)、AP红底物(红、红色沉淀、Zymed)、5_溴_4_氯-3-吲哚基磷酸酯(BCIP底物、青绿色沉淀)、5_溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯/硝基蓝四唑/碘硝基四唑(BCIP/INT底物、黄-棕沉淀、Biomeda)、5_溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯/硝基蓝四唑(BCIP/NBT底物、蓝/紫)、5_溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯/硝基蓝四唑/碘硝基四唑 (BCIP/NBT/INT、棕色沉淀、DAK0)、固红(红)、洋红-光(洋红)、萘酚AS-BI磷酸酯(NABP)/ 固红TR(红)、萘酚AS-BI磷酸酯(NABP)/新品红(红)、萘酚AS-MX磷酸酯(NABP)/新品红(红)、新品红AP底物(红)、对硝基苯磷酸酯(PNPP、黄、可水溶)、VECTOR 黑(黑)、 VECTOR 蓝(蓝)、VECTOR 红(红)、Vega红(树莓红色)。辣根过氧化物酶(HRP，有时缩写为P0)底物包括但不限于2，2’-连氮基-双-3-乙基苯-二氢噻唑磺酸酯(ABTS、绿、可水溶)、氨乙基咔唑、3-氨基-9-乙基咔唑AEC(3A9EC、 红)、α-萘酚派洛宁(红)、4_氯-1-萘酚GC1N、蓝、蓝-黑)、3，3' - 二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB、棕)、邻二茴香胺(绿)、邻苯二胺(0PD、棕、可水溶)、TACS蓝(蓝)、TACS红(红)、 3,3' ,5,5'-四甲基联苯胺(TMB、绿或绿/蓝)、TRUE BLUE (蓝)、VECTOR VIP(紫)、 VECTOR SG (烟蓝-灰)、及Zymed蓝HRP底物(鲜艳蓝)。葡萄糖氧化酶(GO)底物包括但不限于硝基蓝四唑(NBT、紫色沉淀)、四硝基蓝四唑(TNBT、黑色沉淀)、2-(4_碘苯基)-5-(4-硝基苯基)-3-苯基氯化四唑(INT、红或橘黄色沉淀)、四唑蓝(蓝)、硝基四唑紫(紫)、及溴化-3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基四唑(MTT、紫)。所有四唑底物均需要葡萄糖作为共同底物。葡萄糖氧化及四唑盐还原并形成不可溶甲臜，甲臜形成彩色沉淀。β -半乳糖苷酶底物包括但不限于5-溴-4-氯-3-吲哚β -D-半乳糖苷(X_gal、 蓝色沉淀)。与每一所列出的底物相关联的沉淀具有独一无二的可检测的光谱特征(组分)。酶也可在催化底物的发光反应时进行引导，例如但不限于荧光素酶和发光蛋白质，具有能够发光或引导第二底物的第二反应的实质上不可溶的反应产物，例如但不限于荧光素和ATP或腔肠素和Ca.2+，具有发光产物。下述整体组合于此的文献提供另外的例子J. M Elias (1990) Immunohistopathology :A practical approach to diagnosis.ASCP Press (AmericanSociety of Clinical Pathologists) , Chicago ； J.F. McGinty, F.E.B1 oom (1983)Doub1eimmunostaiηing reveals distinctions among opioidpeptidergic neurons in the medialbasal hypothalamus. Brain Res. 278 145-153 ； 及 Τ. Jowett(1997)Tissue In situHybridization :Methods in Animal Development. John Wiley & Sons, Inc. ,NewYork ；J Histochem Cytochem 1997 December 45(12) :1629-1641o核酸生物标志物可使用原位杂交(ISH)进行检测。总的来说，核酸序列探针用荧光探针或配体受体对如生物素/抗生物素蛋白的一成员合成和标记，其用可检测的基团标记。示例性的探针和基团在前面部分中描述。序列探针与细胞中的目标核苷酸序列互补。包含目标核苷酸序列的每一细胞或细胞区室可结合标记的探针。在分析时使用的探针可以是DNA或RNA寡核苷酸或多核苷酸，及不仅可包含自然出现的核苷酸而且还可包含其类似物如dioxygenindCTP、生物素dcTP 7-氮杂鸟嘌呤核苷、叠氮胸苷、肌苷或尿苷。其它有用的探针包括肽探针及其类似物、分支基因DNA、拟肽类、肽核酸和/或抗体。探针与感兴趣的目标核酸序列应具有足够的互补性，使得在目标核酸序列和探针之间出现稳定和特定的结合。稳定杂交所需要的同源度随杂交的严格性变化。传统的ISH、杂交和探针选择方法在下述文献中描述；Leitch, et al. In SituHybridization :a practical guide， Oxford BIOS Scientific Publishers, MicroscopyHandbooks v.27 (1994)；及 Sambrook， J.，Fritsch，E. F.，Maniatis，T.，MolecularCloning :A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press (1989)。在一实施例中，在这里描述的当前化验中使用的试剂如染色或IHC试剂的最佳稀释可在数量上自动确定。在一实施例中，对多个稀释组进行成像，其中每一稀释组包括不同的相应稀释值和免疫测定染色强度值的相应排列。对多个稀释组中的每一组，相对于免疫测定染色强度值的相应排列确定相应的动态范围度量。已发现相应的动态范围度量，选择具有数字上最佳动态范围度量的稀释组，及该稀释组的稀释值选择为在本发明中使用的试剂的最佳稀释水平的表示。例如，制作在载玻片上的组织试样利用上述普通免疫组织化学技术用主要抗体的稀释系列之一染色。所得到的已染色试样中的每一个使用用于查看可检测的信号并获得图像的系统成像，前述图像如数字染色图像。获取图像的方法在下面更详细地描述。因此，所获得的图像之后由本发明方法使用从而用于在数量上确定本发明中使用的试剂的最佳浓度。每一组组织试样包括多个不同的、用相应滴定量稀释准备的组织试样，使得不同的组织试样组具有不同的相应滴定量稀释。对多组组织试样的像素化图像进行量化分析。对于多个稀释组中的每一稀释组，计算动态范围度量及染色特异性。在本发明的一实施例中，动态范围度量为平均绝对偏差。在本发明的另一实施例中，对该数据进行log 变换，及动态范围度量为标准偏差、方差和摆幅比的加权组合。计算染色的特异性以在使噪声最小的同时使特定信号最大化。染色的特异性可这样计算将与染色特异性区室相关联的一组免疫测定染色强度值求和然后计算该染色特异性区室的染色特异性平均值；也将与非染色特异性区室相关联的一组免疫测定染色强度值求和然后计算非染色特异性平均值。 在计算这两个平均值之后，染色特异性平均值除以非染色特异性平均值以产生染色的特异性，或信噪度量。在这样的实施例中，数字上大灵敏度的染色值为最佳。在另一实施例中，非染色特异性平均值除以染色特异性平均值以产生染色的灵敏度。在前述实施例中，数字上小灵敏度的染色值为最佳。在计算每一稀释组的动态范围度量和染色灵敏度之后，动态范围度量和染色灵敏度可相互组合以产生每一稀释组的组合值。所得到的组合值用于选择具有数字上最佳组合值的稀释组。与所选稀释组相关联的是试剂的最佳稀释的稀释值表示。 可选地，该方法执行多个比较以试图识别多个染色特异性和非染色特异性区室。4、仪器标准化和图像收集一旦试样已被染色，任何光学或非光学成像装置可用于检测染色剂或生物标志物标记，例如竖立或倒置光学显微镜、扫描共焦显微镜、摄像机、扫描或隧穿电子显微镜、扫描探针显微镜、及成像红外检测器等。在一实施例中，成像装置为显微镜系统，其包括配置成照射目标试样的照明源、配置成产生所照射目标试样的放大图像的光学器件、及配置成捕获所放大图像的数字图像的检测器如数码相机。量化结果可通过处理所捕获的数字图像获得。前述图像处理可包括本领域技术人员已知的图像处理技术。在至少部分实施例中，前述图像捕获和图像处理中的一个或多个在处理器的帮助下完成。处理器可包括实施预编程的指令的计算机。例如，组织试样或组织微阵列可按如下所述成像用户将微阵列放在试样台上。用户调节试样台使得感兴趣的第一区域或第一组织斑位于视场中心并由CCD照相机聚焦。物镜应调节到适当的分辨率，例如0. 6毫米试样可以10倍放大率进行查看。如果有石蜡，试样通常对应于光强度比周围石蜡高的区域，与通过各种手段评估的一样，包括源自已染色组织的可见光散射、组织自身荧光或荧光标签的信号。计算机使用计算机软件(Softworx 2. 5, Applied Precision, Issaquah, WA)和成像平台(如 Deltavision)可获得低分辨率图像(如具有16位分辨率的64像素X64像素)。计算机自动将试样台平移约等于视场的量。之后，计算机获得第二低分辨率图像。该过程重复直到计算机已获得整个组织试样或微阵列的图像为止。之后，计算机使用商用软件产生整个组织试样或微阵列的合成图像。可选地，为标准化使用特定系统获得的量化结果，可确定系统内在因素以考虑例如沿光通路的激发源的强度变异性和设备变异性。为此，激发光源的强度的度量也可通过使用内嵌灯强度测量工具获得。同样，标准或校准试样如校准显微镜载玻片的测量可使用特定系统获得以确定一个或多个光通路因素。使用前述校准载玻片对于基于荧光的IHC应用特别有用，其中校准载玻片的试样荧光区在相应带宽内发出辐射。荧光发射使能以一个或多个相应波长中的每一波长表征光通路。这些测量可同时或分别获得。可选地，本发明系统还包括构造成将照明源的标准化试样重定向到检测器的校准装置，尽管已发现本发明方法不需要使用这样的装置。在至少部分实施例中，系统处理器配置成确定特定显微镜的校正因子。校正因子可从使用校准装置获得的照明源的标准化试样的测量结果确定。校正因子可(由处理器)用于校正目标试样的所检测图像的任何强度变化。例如，校准块因子(CC)通过与通用标准块比较进行确定。光源因子(LQ通过对捕获的校准表面图像的像素强度求和进行确定。光通路因子(OP)是对每一块/试样组合取的16个图像的平均总光强度的商。CC和OP因子对于进行研究的特定硬件系统是固有的，因而仅需要校准一次或在怀疑光学系统中已发生某些类型的修改时进行校准。标准化AQUA 得分如下所示标准化AQUA 得分=原始AQUA 得分*cc因子*LS因子*0P因子其中，CC和OP因子在系统安装/构造时确定，LS因子同时进行测量。在一些实施例中，系统处理器配置以用于获得校准因子的指令(如软件)。作为备选或另外，系统处理器配置以使用校正因子校正所检测的图像的指令。前述校准用于降低同一显微镜系统内照明源强度随着时间的过去可能出现的变化性，及降低使用不同显微镜系统和/或不同照明源获得的量化结果之间的变化性。5、图像优化a、曝光时间可选地，可对来自所收集图像的像素强度数据的动态范围进行优化以进一步降低批次之间的变化，尤其降低因染色强度和影响曝光时间的设备差异引起的变化。该过程包括在第一曝光时间捕获照相机视场内的对象的图像，使得所捕获的图像包括预定数量的像素，其中每一像素具有强度值。查询所捕获图像的像素强度的频率分布以确定频率分布的像素强度的最高出现频率的区域。然后，自第一曝光时间调节曝光时间以将该最高频率分布区域移向强度值范围的中间。换言之，确定直方图的质心(COM)或频率分布，从其计算调节的曝光时间以获得像素强度的优化动态范围。之后，在调节后的曝光时间捕获该对象的第二图像，从而使得图像具有最佳动态范围。有多种方式可校正在此描述的方法中的曝光。一种校正技术为以比先前图像更长或更短的曝光时间迭代获取新的图像，直到饱和像素最小化且获得最佳动态范围为止。该迭代过程使能快速调节曝光时间以在检测范围内减低像素强度从而优化曝光和动态范围。 然而，该过分简单化的方法可能导致系统饱和像素过校正并将新的曝光时间设置得太低。 因此，希望将曝光时间校正的攻击性修改为与先前图像中有多少像素饱和成正比。为此，新的曝光时间可计算为E = E' χ (1-(0. 5)(1+s)),其中
权利要求
1.在制作在载玻片上的组织试样中可再现量化生物标志物表达的方法，包括(a)获取制作在载玻片上的组织试样，其已被染色以使能定位至少一细胞区室和至少一生物标志物；(b)使用包括光源的标准化光学系统获取已染色组织试样的一个或多个包含像素的图像；(c)自动分析源自图像像素的一个或多个数据集以区分数据信号和噪声；(d)自动分析源自图像像素的一个或多个数据集以区分归属于至少一细胞区室中的每一细胞区室的数据信号；(e)可选地，自动分析源自图像像素的一个或多个数据集以区分归属于用于至少一细胞区室中的每一细胞区室的至少一生物标志物的数据信号；(f)量化表达在至少一细胞区室的每一细胞区室中的生物标志物的量； 藉此，制作在载玻片上的组织试样中的生物标志物表达得以可再现地量化。
2.根据权利要求1的方法，其中所述标准化光学系统包括其强度和光通路变化性已归一化的光源。
3.根据权利要求1的方法，其中所述标准化光学系统允许自动调节曝光时间以优化在图像像素中捕获的动态数据范围。
4.根据权利要求1的方法，其中每一自动分析步骤以无人监督的方式进行。
5.根据权利要求1的方法，其中对归属于两个以上细胞区室的数据信号进行区分。
6.根据权利要求1的方法，其中对表达在两个以上细胞区室的每一细胞区室中的生物标志物的量进行量化。
7.根据权利要求1的方法，其中以约95%的置信区间区分归属于两个以上细胞区室的数据信号。
8.根据权利要求1的方法，还包括评估一个或多个制作在载玻片上的组织试样或一个或多个包含像素的图像或其一个或多个放大部分的质量。
9.根据权利要求1的方法，该方法实现可再现割点确定。
10.根据权利要求1的方法，对于每一试样，所述方法在批次之间实现85%以上的试样分类一致性。
11.根据权利要求1的方法，对于每一试样，所述方法在批次之间实现90%以上的试样分类一致性。
12.根据权利要求1的方法，所述方法实现生物标志物表达的量化测量的再现性水平高于80%。
13.根据权利要求1的方法，所述方法实现生物标志物表达的量化测量的再现性水平高于90%。
14.根据权利要求1的方法，所述方法实现生物标志物蛋白质的量化测量的再现性水平高于95%。
15.根据权利要求1的方法，所述方法实现生物标志物表达的量化测量的再现性水平落在约90%到约97%的范围中。
16.根据权利要求1的方法，所述方法实现生物标志物表达的量化测量的变化系数％ CV低于20%。
17.根据权利要求1的方法，所述方法实现生物标志物表达的量化测量的变化系数％ CV低于10%。
18.根据权利要求1的方法，所述方法实现生物标志物表达的量化测量的变化系数％ CV低于5%。
19.根据权利要求1的方法，所述方法实现生物标志物表达的量化测量的变化系数％ CV落在约4%到约7%的范围中。
20.根据权利要求1的方法，其中制作在载玻片上的组织试样已用一种或多种试剂的最佳稀释进行染色。
21.根据权利要求20的方法，其中所述最佳稀释产生具有最佳动态范围度量的一个或多个包含像素的图像。
22.—种计算机可读介质，该介质包括存储于其上的、由处理器运行以执行在制作在载玻片上的组织试样中可再现量化生物标志物表达的方法的计算机可读指令，所述方法包括(a)获取制作在载玻片上的组织试样的一个或多个包含像素的图像，所述组织试样已被染色以使能使用包括光源的标准化光学系统定位至少一细胞区室和至少一生物标志物；(b)自动分析源自图像像素的一个或多个数据集以区分数据信号和噪声；(c)自动分析源自图像像素的一个或多个数据集以区分归属于至少一细胞区室中的每一细胞区室的数据信号；及(d)量化表达在至少一细胞区室的每一细胞区室中的生物标志物的量；藉此，制作在载玻片上的组织试样中的生物标志物表达可再现地量化。
23.根据权利要求22的计算机可读介质，其中存储于其上并由处理器运行的计算机可读指令还包括执行在所述量化步骤之前具有下述可选步骤的方法的指令自动分析源自图像像素的一个或多个数据集以区分归属于用于至少一细胞区室中的每一细胞区室的至少一生物标志物的数据信号。
24.用于可再现量化制作在载玻片上的组织试样中的生物标志物表达的系统，包括(a)配置成至少放大制作在载玻片上的组织试样的一部分的一个或多个透镜，所述组织试样已被染色以使能定位至少一细胞区室和至少一生物标志物；(b)标准化光学系统，包括与一个或多个透镜光通信的光源和图像传感器，标准化光学系统获取已染色组织试样的一个或多个包含像素的图像；(c)与标准化光学系统通信的处理器模块，该处理器模块配置成(i)自动分析源自图像像素的一个或多个数据集以区分数据信号和噪声；(ii)自动分析源自图像像素的一个或多个数据集以区分归属于至少一细胞区室中的每一细胞区室的数据信号；及(iii)量化表达在至少一细胞区室的每一细胞区室中的生物标志物的量；藉此，制作在载玻片上的组织试样中的生物标志物表达可再现地量化。
25.根据权利要求M的系统，其中所述处理器模块还配置成可选地自动分析源自图像像素的一个或多个数据集以区分归属于用于至少一细胞区室中的每一细胞区室的至少一生物标志物的数据信号。
全文摘要
本发明方法涉及生物标志物表达的可再现量化，包括组织试样中的生物标志物表达。本发明描述了方法和系统，其中生物标志物表达的可再现得分独立于仪器、其位置或操作员获得。
文档编号G06T7/00GK102165489SQ200980137750
公开日2011年8月24日 申请日期2009年9月15日 优先权日2008年9月16日
发明者B·伯克, C·威廉斯, D·M·赖利, D·王, G·R·特德斯奇, J·克里斯琴森, M·P·泽科夫斯基, M·古斯达夫逊, R·皮纳德 申请人:赫斯托克斯公司
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