一种提取纯化马钱子总生物碱的方法及其在制药中的应用的制作方法

专利名称：：一种提取纯化马钱子总生物碱的方法及其在制药中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种中药活性成分的提取纯化方法，具体地说是涉及除去部分士的宁后得到的纯化马钱子总生物碱的提取纯化方法及其在制药中的应用。
背景技术：
：马钱子又名番木鳖，始载于《本草纲目·卷十八》，是马钱科植物马钱(Strychnounux-vomicaL.)的干燥成熟种子，具有通络止痛、散结消肿之功效，中医临床上常用来治疗喉痹、肿毒、风湿痹痛、骨折、面神经麻痹，重症肌无力等症。《本草纲目》言其能治“伤寒热病，咽喉痹痛，消痞块”作为活血化瘀药，常在“九分散”、“疏风定痛丸”、“虎健丸”、“青龙丸”等中成药中使用。总生物碱是马钱子中最主要的有效部位，目前的研究表明马钱子总生物碱中至少有16种生物碱成分，主要成分是士的宁和马钱子碱。马钱子碱作为马钱子的主要成分之一，具有很强的镇痛抗炎等药理活性，临床上常用于镇咳、祛痰、抑菌和抗肿瘤，而另一主要成分含量占总生物碱的约一半，但药理活性相对较低，是马钱子的主要毒性成分。马钱子总生物碱应用于临床的最大障碍在于具有强烈的中枢神经毒性。有文献(过振华等，马钱子药理毒理研究回顾及安全性研究展望，中西医结合学报，2008，6(6)645-649)报道士的宁及马钱子碱给小鼠灌胃，LD5(1分别为3.ZTmgkg—1和ZSSmgkg-1，腹腔注射为1.SSmgkg"1和etogkgA因此如能除去总生物碱中部分士的宁，则能降低其毒性，又能基本保留其原有的药理活性，提高临床用药的安全性。必须指出的是，全部除去士的宁虽然能够实现，但成本很高、同时其它生物碱成分损失也大，并且难以实现大规模工业化生产，因此，除去部分士的宁更具有可行性和应用前景。关于马钱子总生物碱中除去部分士的宁的方法至今未见报道。
发明内容1、发明目的本发明的目的在于提供一种除去部分士的宁的纯化马钱子总生物碱的方法。本发明所提供的纯化马钱子总生物碱与未除去部分士的宁的马钱子总生物碱相比，在镇痛、抗炎、免疫、抗肿瘤等方面的药理作用显著提高，且毒性显著下降，并且易于实现工业化生产。2、技术方案本发明的目的是采用下列技术方案来实现的一种提取纯化马钱子总生物碱的方法，其特征在于步骤如下(1)将马钱子药材，粉碎成粗粉，称取100-200克粗粉；(2)用1000-2000ml的乙醇回流提取，减压回收乙醇，得醇浸膏；(3)用400_1000ml的盐酸溶解上述醇浸膏，离心，取上清；(4)加入氢氧化钠，调节pH值为10-14，将该溶液用500_2000ml的二氯甲烷进行萃取，减压除去溶剂得马钱子总生物碱粉末；(5)将上述马钱子总生物碱粉末，用1000-3000ml50-90%乙醇超声溶解；(6)减压浓缩至原体积的0.4-0.05倍，离心浓缩液，取上清液；(7)将上清液冷藏静置，离心除去沉淀，然后上清液干燥得纯化马钱子总生物碱。步骤(2)中所述的乙醇浓度为50-95%，加热回流次数为1-5次，每次加热回流时间为0.5-2h。步骤(3)中所述的盐酸浓度为0.1-lmol/L。步骤(7)中所述的冷藏温度为0-10°C，所述的干燥方法为常压干燥或真空干燥。所述提取方法所得纯化马钱子总生物碱在制备镇痛药物中的应用。所述提取方法所得纯化马钱子总生物碱在制备抗炎药物中的应用。所述提取方法所得纯化马钱子总生物碱在制备抗肿瘤药物中的应用。所述提取方法所得纯化马钱子总生物碱在制备免疫调节药物中的应用。本发明提取的纯化马钱子总生物碱可以用于制备镇痛药、抗炎药、抗肿瘤药、免疫调节药。以上应用可经口服、腹腔注射和经皮途径给药。我们发现马钱子总生物碱和士的宁在一定浓度乙醇中溶解度相差非常大，利用这一溶解性质的差异可以实现保留马钱子总生物碱而除去部分士的宁。经药理实验表明本发明所提取获得的纯化马钱子总生物碱与纯化前未除去部分士的宁的马钱子总生物碱相比，在镇痛、抗炎、抗肿瘤、免疫调节等方面的药理作用显著增强，而毒性显著下降。纯化前的马钱子总生物碱中士的宁的含量用HPLC法测定其中士的宁的含量达到44%52%，经提取纯化即除去部分士的宁后得到的纯化马钱子总生物碱中士的宁的含量为14%23%，用酸性染料比色法测定纯化马钱子总生物碱的纯度为75%90%。具体实施例方式以下结合实例进一步阐明本发明的内容，但这些实施例并不限制本发明的保护范围。实施例1提取纯化马钱子总生物碱的方法(1)称取马钱子，粉碎，过筛，制得粗粉，称取200g粗粉；(2)用70%乙醇加热回流提取，每次lOOOmL，提取lh，共提取3次，过滤，合并三次滤液，减压回收乙醇，得醇浸膏；(3)用lmol/L盐酸400mL超声溶解，4000rpmin离心lOmin，取出上清；(4)用氢氧化钠调节pH到12，用2000mL二氯甲烷分5次萃取、合并，真空干燥除去二氯甲烷，精密称定重量，得到马钱子总生物碱粉末，用HPLC法测定其中士的宁含量占马钱子总生物碱的52%；(5)将上述所得马钱子总生物碱粉末超声溶解于2000mL50%乙醇中；(6)置旋转蒸发仪上旋蒸至原体积的0.05倍，可见烧瓶壁上有大量白色结晶析出，倒出浓缩液，4000rpm，离心lOmin，取上清液；(7)将上清液置4°C静置过夜，4000rpm,离心lOmin，弃去沉淀，上清液置真空干燥箱干燥，精密称重，得纯化马钱子总生物碱，用HPLC法测定其中士的宁的含量占纯化马钱子总生物碱的23%，酸性染料比色法测定纯化马钱子总生物碱的纯度为90%。实施例2提取纯化马钱子总生物碱的方法(1)称取马钱子，粉碎，过筛，制得粗粉，称取200g粗粉；(2)用90%乙醇加热回流提取，每次2000mL，提取2h，共提取2次，过滤，合并滤液，减压回收乙醇，得醇浸膏；(3)用0.2mol/L盐酸1000mL超声溶解，抽滤得滤液；(4)用氢氧化钠调节pH到14，用1000mL二氯甲烷分3次萃取、合并，减压回收除去二氯甲烷，精密称定重量，得到马钱子总生物碱，HPLC法测定其中士的宁含量占马钱子总生物碱的46%；(5)将上述所得马钱子总生物碱粉末超声溶解于3000mL70%乙醇中；(6)真空干燥至原体积的0.2倍，取出浓缩液，4000rpm离心lOmin，取上清液；(7)将上清液置0°C静置过夜，抽滤取滤液于真空干燥箱干燥得固体粉末，精密称重，得纯化马钱子总生物碱，HPLC法测定其中士的宁占纯化马钱子总生物碱的14%，酸性染料比色法测定纯化马钱子总生物碱的纯度为84%。实施例3提取纯化马钱子总生物碱的方法(1)称取马钱子，粉碎，过筛，制得粗粉，称取100g粗粉；(2)用50%乙醇加热回流提取，每次lOOOmL，提取lh，共提取4次，过滤，合并滤液，减压回收乙醇，得醇浸膏；(3)用0.5mol/L盐酸400mL超声溶解，抽滤得滤液；(4)用氢氧化钠调节pH到10，用500mL二氯甲烷分4次萃取、合并，减压回收除去二氯甲烷，精密称定重量，得到马钱子总生物碱，HPLC法测定其中士的宁含量占马钱子总生物碱的44%；(5)将上述所得马钱子总生物碱粉末超声溶解于1000mL75%乙醇中；(6)真空干燥至原体积的0.1倍，取出浓缩液，4000rpm离心lOmin，取上清液；(7)将上清液置8°C静置过夜，抽滤取滤液于真空干燥箱干燥得固体粉末，精密称重，得纯化马钱子总生物碱，HPLC法测定其中士的宁占纯化马钱子总生物碱21%，酸性染料比色法测定纯化马钱子总生物碱的纯度为75%。实施例4纯化马钱子总生物碱的毒性研究——对小鼠的急性毒性实验对实施例1所得纯化马钱子总生物碱进行药效评价1.实验材料1.1样品称取马钱子总生物碱、纯化马钱子总生物碱适量，用含20%乙醇的PBS(pH=7.4)溶解，配制成一系列浓度。1.2试剂乙醇。1.3动物ICR小鼠，体重1822g，早t各半，由扬州大学比较医学中心提供。2.方法与结果预试验首先找出0%及100%估计致死量(Dn，Dm)。首先用2倍稀释的一系列药液，以0.2mL/10g剂量各试4只小鼠，进而在4/4及0/4致死组之间，再按等比等级插入35档剂量，剂量按每10g用0.14mL、0.lmL、0.07mL、0.05mL、0.035mL递减，再各试4只小鼠。如果某组死亡率为4/4，其前一组是2/4或3/4，则以该组剂量为Dm；如果前一组是0/4或1/4，则以该组剂量的1.5倍为Dm。同法找出Dn。分组分组数为49组，保证最小剂量组100%动物存活。正式实验按0.2mL/10g给药量给予各组不同浓度的药物。统计每组死亡率求算每种药物的半数致死量。结果小鼠腹腔注射纯化马钱子总生物碱的LD5(1为12.303mgkg_SLD50的95%可信限范围为12.303士2.098mgkg—1；小鼠腹腔注射马钱子总生物碱的LD5(1为6.400mgkg—1，LD50的95%可信限范围为6.400士0.726mgkg—1。可见纯化马钱子总生物碱的毒性下降了约1.9倍，毒性显著降低。实施例5纯化马钱子总生物碱的镇痛作用——小鼠扭体实验对实施例1所得纯化马钱子总生物碱进行药效评价1.实验材料1.1样品称取马钱子总生物碱、纯化马钱子总生物碱适量，用含20%乙醇的PBS(pH=7.4)溶解，浓度为lmgmL—1；阿司匹林。1.2试剂乙醇、冰醋酸。1.3动物ICR小鼠，体重1822g，早$各半，由扬州大学比较医学中心提供。2.方法与结果实验小鼠随机分为6组，每组10只。给每组动物灌胃给以纯化马钱子总生物碱溶液、马钱子总生物碱溶液、阿司匹林溶液，空白对照组给以等量PBS(含20%乙醇)，给药后30min后各组小鼠分别腹腔注射0.6%醋酸溶液(0.2mL/10g)，观察25min内小鼠出现扭体反应的次数，记录，并计算药物的镇痛百分率。结果见表1.表1不同给药剂量对对醋酸致小鼠扭体反应的影响a士S，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注与空白组比较AP<0.05表1的结果显示阳性对照组能减少小鼠的扭体次数，与空白组比较有显著性差异；纯化马钱子总生物碱的有效剂量为12mg*kg—1。但中剂量组及低剂量组没有效果。而马钱子总生物碱在12mgkg"1与空白组比较没有显著性差异，提示纯化马钱子总生物碱的镇痛效果优于马钱子总生物碱。实施例6纯化马钱子总生物碱的镇痛作用——小鼠热板实验对实施例1所得纯化马钱子总生物碱进行药效评价1.实验材料1.1样品称取马钱子总生物碱、纯化马钱子总生物碱适量，用含20%乙醇的PBS(pH=7.4)溶解，浓度为lmgmL-1；云南白药酊。1.2试剂乙醇。1.3仪器HH_8型数显恒温水浴锅，国华电器有限公司。1.4动物ICR小鼠，体重1822g，早，由扬州大学比较医学中心提供。2.方法与结果将一块直径10cm的金属圆盘放入55士0.5°C水浴中，在圆盘上放置一个15cm高的玻璃圆筒，测定时将小鼠迅速放在圆盘上，从接触到金属圆盘开始计时，直至动物舔后足或者跳离金属圆盘。如超过30s仍无反应，则立即将小鼠取出以防灼伤动物，并计为反应时间(s)。取60只小鼠，随机分为6组(空白组，阳性对照组，纯化马钱子总生物碱高、中、低三个剂量组、马钱子总生物碱组各10只)，实验前24h，给小鼠腹部脱毛，脱毛面积2X2cm2,备用。给药前，测定各组小鼠的基础反应时间(s)，于每组动物腹部涂抹纯化马钱子总生物碱溶液、马钱子总生物碱溶液、云南白药酊，空白对照组涂抹等量PBS(含20%乙醇)，共给药3次，每次间隔lOmin，末次给药15min、45min、75min再次测定其反应时间，结果见表2。表2.不同给药剂量对小鼠热刺激反应的影响》士S，n=10)组别剂量给药体反应时间/mg-kg"1积/叫0min15min45min75min空白组24012.50±3.169.38士2.8310.88士2.8511.00±2.00云南白药组24012.38士3.5818.33土6.591)20.57±3.952)13.43士4.83纯化马钱子总生物碱高剂量组1224011.63±2.3318.57士4.692)20.38士5.373)13.75士1.49纯化马钱子总生物碱中剂量组612013.38士5.0113.00±2.4511.63土3.7013.00士2.93纯化马钱子总生物碱低剂量组36013.29士1.389.86士2.3413.2壯3.8613.14±2.79马钱子总生物碱组1.224012.22±3.1514.00±2.7618.OOt3.9414.75±3.74注与给药前比较Dp<0.05，2)P<0.01，3)P<0.001表2的结果显示阳性对照组能显著提高小鼠痛阈值，与空白组比较有显著性差异；纯化马钱子总生物碱的有效剂量为12mg*kg—1。但中剂量组及低剂量组没有效果。而马钱子总生物碱在12mgkg"1与空白组比较没有显著性差异，提示纯化马钱子总生物碱的镇痛效果优于马钱子总生物碱。实施例7纯化马钱子总生物碱的抗炎作用——小鼠耳肿胀实验7对实施例1所得纯化马钱子总生物碱进行药效评价1.实验材料1.1样品称取马钱子总生物碱、纯化马钱子总生物碱适量，用含20%乙醇的PBS(pH=7.4)溶解，浓度为Img·mL-1；云南白药酊。1.2试剂乙醇、二甲苯。1.3仪器电子称、打孔器。1.4动物ICR小鼠，体重1822g，早$各半，由扬州大学比较医学中心提供。2.方法与结果取60只小鼠，随机分为6组(空白组，阳性对照组，纯化马钱子总生物碱高、中、低三个剂量组、马钱子总生物碱组各10只)。小鼠右耳涂抹20μL二甲苯，左耳不涂作为对照，30min后，各组小鼠左右两耳均涂抹相应的受试药物，空白组给予含20%乙醇的PBS，给药组给予纯化马钱子总生物碱，共给药3次，每次80μL，每次间隔lOmin，末次给药40min后将小鼠颈部脱白处死，沿耳廓剪下左右两耳，用直径6mm的打孔器在左右两耳相同部位打下圆耳片，称重。耳肿胀度=右耳重_左耳重抑肿率=(空白组平均耳肿胀度_给药组平均耳肿胀度)/空白组平均耳肿胀度结果见表3。表3不同给药剂量对抗炎的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注与空白组比较ΔP<0.05，ΔΔΡ<0.01，ΔΔΔΡ<0.001，云南白药组给药体积为240μL表3结果表明，阳性对照组能明显抑制小鼠的耳肿胀，与空白组比较显著性差异(P<0.001)，表明造模成功。马钱子总生物碱组与空白组比较没有显著差异，而纯化马钱子总生物碱高剂量组和中剂量组与空白组比较，差异亦有显著性(P<0.05)，低剂量组无差异。实施例8纯化马钱子总生物碱的免疫作用——小鼠迟发型超敏反应实验对实施例1所得纯化马钱子总生物碱进行药效评价1.实验材料1.1样品称取马钱子总生物碱、纯化马钱子总生物碱适量，用含20%乙醇的PBS(pH=7.4)溶解，浓度为Img·mL—1；地塞米松。1.2试剂乙醇、二硝基氯苯、丙酮。1.3动物ICR小鼠，体重1822g，早t各半，由扬州大学比较医学中心提供。2.方法与结果实验动物处理取ICR小鼠，随机分为7组，每组10只，即经皮和腹腔注射两种给药方式，经皮方式给药的分为空白组、纯化马钱子总生物碱低剂量组、纯化马钱子碱总生物碱中剂量组、纯化马钱子总生物碱高剂量组，腹腔注射给药的为阳性组，经皮每组小鼠腹部给药前24h用润滑后的刀片刮去毛，面积约2X2cm2。给药时经皮给药的每组用移液器吸取药液均勻涂于小鼠腹部，空白组涂含20%乙醇的PBS作为对照，纯化马钱子总生物碱低、中、高剂量三组剂量分别为3mg·HiL-1Amg·mL^.^mg·mL—1，马钱子总生物碱组剂量为12mg·πιΓ1.腹腔注射的每组给予地塞米松，剂量均为Umg·!!^1。每日每组给药一次，连续给药10天。致敏第一天给药后，每组小鼠用微量进样器背部皮下注射3%的DNCB溶液50μL致敏，在第四天给药后，同样操作再强化一次。DTH反应的产生与测定给药第10天，将DNCB溶液20μL涂于小鼠右耳(两面)进行攻击，攻击后24h，颈椎脱白处死小鼠，剪下左右耳壳，用直径6mm的打孔器在相同的部位取下耳片，电子天平称重。同时取小鼠胸腺及脾脏称重，以左右耳片重量之差为肿胀度，分别以每IOg小鼠的脾重和胸腺重作为脾指数和胸腺指数，观察各组的差别。结果见表4、5。表4纯化马钱子总生物碱对二硝基氯苯诱导迟发性变态反应小鼠的耳肿胀度的影响(X士S，η=10)-1-剂量动物数耳肿胀度给药方式组别-—-———(mg-kg1)(η)‘(mg)空白组.103.50土1.34马钱子总生物碱组12103.23土1.32经皮纯化马钱子总生物碱低剂量组3102.63±0.66纯化马钱子总生物碱中剂量组6102.48±1.27纯化马钱子总生物碱高剂量组12102.07±0.85δδ腹腔注射地塞米松组30101.85±0.84δδδ注与空白组比较ΔΡ<0.05，δδΡ<0.01，ΔΔΔΡ<0.001实验证明，经皮给药的纯化马钱子总生物碱高剂量组可明显抑制DNCB所致小鼠耳肿胀度，与空白组比较，差异显著(P<0.01)，但中剂量与低剂量纯化马钱子总生物碱组与空白组比较无差异。腹腔注射给药的地塞米松与空白对照比较差异显著(P<0.001)，提示达到一定剂量的纯化马钱子总生物碱能明显减轻小鼠的耳肿胀度，对细胞免疫有抑制作用。表5纯化马钱子总生物碱对小鼠免疫器官重量的影响a士S，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注与各自空白对照组比较AAp<0.01经实验证明，与各自空白对照组比较，经皮给药高、中、低三个剂量组的纯化马钱子总碱和马钱子总碱组对免疫器官的重量指数无明显影响(p>0.05)，腹腔注射组地塞米松有极其显著的抑制免疫器官的作用(P<0.01)。提示短期给药，纯化马钱子总生物碱有免疫抑制作用，但对免疫器官的重量无影响。实施例9纯化马钱子总生物碱的抗肿瘤作用——对体外培养的肿瘤细胞的影响对实施例1所得纯化马钱子总生物碱进行药效评价1实验材料1.1样品称取马钱子总生物碱、纯化马钱子总生物碱适量，以二甲基亚砜(DMS0)助溶，DMS0最终浓度不超过1.0%。0.22iim微孔滤膜(GVMP01230,Millipore,USA)过滤除菌，4°C保存待用；顺钼。1.2试剂DMEM培养基(GIBC0，美国)；新生小牛血清(杭州四季青)(56°C水浴灭活0.5h)；胰蛋白酶(AMRESC0，美国)；MTT(AMRESC0，美国)；青霉素、链霉素(山东鲁抗医药股份有限公司)1.3仪器C02细胞培养箱(FORMASCIENTIFIC，美国)；酶标分光光度读板仪(Bio-RAD,Model680，美国)1.4细胞人肝癌细胞株SMMC-7721、H印G2、人胃癌细胞株MGC-803购自南京凯基生物科技发展有限公司；人肺癌细胞株A549由南京中医药大学基础医学院张旭博士惠赠；人结肠癌细胞株LoVo由南京医科大学蔡云青教授惠赠；人胃腺癌细胞株SGC-7901由南京鼓楼医院李如恬博士惠赠；人卵巢癌细胞株A2780由江苏省中医院提供。2方法与结果取处于对数生长期的各种癌细胞，接入96孔板中(细胞密度6X104cellS/ml)，每孔80iU。在细胞贴壁并生长融合至60-70%加药处理，每种药物设5个浓度梯度(药物终浓度马钱子总生物碱、纯化马钱子总生物碱为200，100，50，25，12.5ugmL—1；顺钼为20，10，5，2.5，1.25ug.mL-1)每种浓度设四个复孔。在72h后，每孔加入MTT(5mg.mL-1)20u1,平面混勻后，置于培养箱中继续孵育4h，然后弃去各孔中的上清液，再加入150ylDMS0，平面振荡混勻lOmin，待其各孔中的紫色结晶完全溶解后，置于酶标分光光度读板仪下测定各孔中的吸光值(A，X49(tam)。按下面公式计算细胞增殖抑制率IR:IR(%)=(1-给药组吸光度值/空白组吸光度值)X100%。实验重复三次，药物作用于各种细胞72h后的IC5(1值见表6。表6药物作用于各种细胞72h后的IC5Q(ugmL—1)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>权利要求一种提取纯化马钱子总生物碱的方法，其特征在于步骤如下(1)将马钱子药材，粉碎成粗粉，称取100-200克粗粉；(2)用1000-2000ml的乙醇回流提取，减压回收乙醇，得醇浸膏；(3)用400-1000ml的盐酸溶解上述醇浸膏，离心，取上清；(4)加入氢氧化钠，调节pH值为10-14，将该溶液用500-2000ml的二氯甲烷进行萃取，减压除去溶剂得马钱子总生物碱粉末；(5)将上述马钱子总生物碱粉末，用1000-3000ml50-90％乙醇超声溶解；(6)减压浓缩至原体积的0.4-0.05倍，离心浓缩液，取上清液；(7)将上清液冷藏静置，离心除去沉淀，然后上清液干燥得纯化马钱子总生物碱。2.根据权利要求1所述的提取纯化马钱子总生物碱的方法，其特征在于步骤(2)中所述的乙醇浓度为50-95%，加热回流次数为1-5次，每次加热回流时间为0.5-2h。3.根据权利要求1所述的提取纯化马钱子总生物碱的方法，其特征在于步骤(3)中所述的盐酸浓度为0.1-lmol/L。4.根据权利要求2所述的提取纯化马钱子总生物碱的方法，其特征在于步骤(7)中所述的冷藏温度为0-10°C，所述的干燥方法为常压干燥或真空干燥。5.如权利要求1提取方法所得纯化马钱子总生物碱在制备镇痛药物中的应用。6.如权利要求1提取方法所得纯化马钱子总生物碱在制备抗炎药物中的应用。7.如权利要求1提取方法所得纯化马钱子总生物碱在制备抗肿瘤药物中的应用。8.如权利要求1提取方法所得纯化马钱子总生物碱在制备免疫调节药物中的应用。全文摘要本发明公开了一种除去马钱子总生物碱中部分士的宁而得到纯化马钱子总生物碱的方法。该方法先采用一定浓度乙醇提取，然后将提取物用盐酸溶解，溶解后将pH调为碱性，再用二氯甲烷萃取、减压除去溶剂得到马钱子总生物碱；然后将马钱子总生物碱粉末用乙醇超声溶解，减压浓缩至一定体积，将浓缩液离心取上清液后，冷藏静置除去沉淀，把上清液干燥得纯化马钱子总生物碱。采用本发明方法提取纯化马钱子总生物碱士的宁的含量下降显著，提取过程安全，成本低，有利于工业化规模生产。经药理实验评价结果表明纯化马钱子总生物碱的镇痛、抗炎、免疫、抗肿瘤活性均显著优于马钱子总生物碱，而毒性明显下降。文档编号A61P37/02GK101804096SQ20101010729公开日2010年8月18日申请日期2010年2月8日优先权日2010年2月8日发明者蔡宝昌,陈军,陈志鹏申请人:南京中医药大学