人胎儿背根神经节干细胞的分离、制备及应用的制作方法
专利名称：人胎儿背根神经节干细胞的分离、制备及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及了利用有丝分裂因子EGF和bFGF，首次从周围神经系统分离出背根神经节(dorsal root ganglion，DRG)干细胞，并进行体外和诱导分化培养。这类细胞具有明显的干细胞特征，能分化为大小感觉神经元、卫星细胞和雪旺氏细胞的潜能。体内定位分布和周围神经损伤后的活性研究表明，DRG干细胞主要定位在成熟节细胞周围，受损伤刺激后部分细胞进入增殖分裂期。另外，DRG干细胞能够进行体外-196℃保存和复苏，复苏后细胞仍具有干细胞特性。这就为体外大量扩增、储存干细胞，用于治疗各种先天性或获得性神经系统疾病引起的神经细胞缺损、神经系统肿瘤以及周围神经损伤特别是神经根性撕脱伤提供了新途径。
目前，神经系统很多部位都分离出了神经干细胞，包括啮齿类成年和胚胎个体的脑室下区、端脑、海马、纹状体、脊髓，甚至人神经组织的大脑、脊髓和嗅球，这些科学进展为研究神经系统发育和治疗神经系统的疾病带来了前所未有光明前景。然而，这些神经干细胞都来自于中枢神经系统，治疗研究的方向也集中在中枢神经系统。实际上，我国乃至整个世界上，每年因各种原因所导致的周围神经损伤的病人不计其数。目前，周围神经损伤，特别是根部撕脱性损伤尚无很好的治疗解决办法。本实验小组在国际上首次体外培养出了周围神经来源的人背根神经节干细胞(dorsal root ganglion stem cell，DRG stem cell)，并发现了体外诱导分化、储存的有效方法及体内的定位，为DRG用于治疗周围神经损伤，特别是根性撕脱伤打下基础。
本发明的目的是通过下述方法实现的本发明通过分离流产胎儿脊髓两侧的DRG，制成单细胞悬液，培养于加有EGF和bFGF的DMEM/F12(GIBCO)无血清完全培养基中，3-5天后聚集形成悬浮生长的神经球，并可进行传代扩增。其中胶质细胞占大部分，神经元仅占2-10％。免疫组化结果显示神经球细胞表达nestin蛋白--一种神经干/祖细胞表达的神经内皮中间纤维丝蛋白；胶质细胞GFAP和S100染色阳性，神经元NF染色阳性。本发明显示，DRG干细胞对血清很敏感，少量血清能导致细胞发生分化，即具有多潜能分化特性。DRG干细胞能够进行体外-196℃保存和复苏，复苏后细胞仍具有干细胞特性。胎儿DRG经过固定后进行石蜡切片，采用nestin单克隆抗体和荧光标记的二抗对组织切片进行免疫显色检测，发现DRG干细胞分布在成熟节细胞的周边；从后肢根部切断SD大鼠坐骨神经，腹腔注射BrdU，对组织切片进行免疫荧光检测，显示相应DRG的节细胞周边出现S期细胞，说明当受到损伤刺激后，这些细胞被激活进入分裂增生期。
细胞冻存15天后，迅速37℃温水复苏，复苏后细胞仍具有干细胞特性。五.背根神经节干细胞在体研究为研究DRG干细胞的体内分布，我们把16-26周人胎儿DRG经过固定后进行石蜡切片，采用nestin单克隆抗体和荧光(FITC)标记的二抗对组织切片进行免疫显色检测，发现DRG干细胞分布在成熟节细胞的周边，为研究DRG干细胞在体内的增殖，我们采用成年的SD大鼠(150g左右)，从动物后肢根部切断坐骨神经，经腹腔注射BrdU，处死动物，免疫荧光显示相应DRG的节细胞周边出现S期细胞，说明部分细胞被激活进入增殖期。
本发明的优点1.本发明首次报道人胎儿背根神经节干细胞的分离和扩增过程，并证明了DRG细胞的多分化潜能，操作方法简单可行；2.本发明确定了DRG干细胞体外保存和复苏的条件，复苏后细胞仍具有干细胞特性，这就为干细胞移植治疗各种周围神经损伤、先天性神经系统疾病以及神经系统肿瘤打下基础；3.本发明为神经干细胞的研究增加了一个新来源，使神经系统的可塑性研究成为可能；4.本发明为分子生物学、药理学提供了一种工具细胞。
权利要求
1.首次从周围神经系统分离出背根神经节(dorsal rootganglion，DRG)干细胞，并利用有丝分裂因子EGF和bFGF进行体外和诱导分化培养。其特征在于这类细胞具有明显的干细胞特征，具有分化为大小感觉神经元、卫星细胞和雪旺氏细胞的潜能。体内定位分布和周围神经损伤后的活性研究表明，DRG干细胞主要定位在成熟节细胞周围，受损伤刺激后部分细胞进入增殖分裂期。另外，DRG干细胞能够进行体外-196℃保存和复苏，复苏后细胞仍具有干细胞特性。实现了体外大量扩增、储存干细胞，作为治疗各种先天性或获得性神经系统疾病引起的神经细胞缺损、神经系统肿瘤以及周围神经损伤特别是神经根性撕脱伤的新途径。
2.据权利要求1所述的方法，其特征在于人胎儿背根神经节干细胞的分离、培养、诱导分化、冻存和复苏；
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于人胎儿背根神经节干细胞作为一种细胞模型研究神经系统的正常或畸形发育过程，用于研究感觉神经元、卫星细胞和Schwann Cells的分化调节过程，还可作为分子生物学、药理学的工具细胞；
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于背根神经节干细胞用于治疗各种先天性或获得性神经系统疾病引起的神经细胞缺损、神经系统肿瘤以及周围神经损伤特别是神经根性撕脱伤。
全文摘要
本发明公开了一种背根神经节(dorsal root ganglion，DRG)干细胞的制备及分离方法。涉及了利用有丝分裂因子EGF和bFGF，首次从周围神经系统分离出背根神经节(dorsal root ganglion，DRG)干细胞，并进行体外和诱导分化培养。这类细胞具有明显的干细胞特征，能分化为大小感觉神经元、卫星细胞和雪旺氏细胞的潜能。体内定位分布和周围神经损伤后的活性研究表明，DRG干细胞主要定位在成熟节细胞周围，受损伤刺激后部分细胞进入增殖分裂期。另外，DRG干细胞能够进行体外－196℃保存和复苏，复苏后细胞仍具有干细胞特性。这就为体外大量扩增、储存干细胞，用于治疗各种先天性或获得性神经系统疾病引起的神经细胞缺损、神经系统肿瘤以及周围神经损伤特别是神经根性撕脱伤提供了新途径。
文档编号A61K35/12GK1458273SQ0210261
公开日2003年11月26日 申请日期2002年1月16日 优先权日2002年1月16日
发明者赵春华, 张帆, 谭耀红 申请人:中国医学科学院中国协和医科大学血液学研究所
技术领域：
本发明涉及了利用有丝分裂因子EGF和bFGF，首次从周围神经系统分离出背根神经节(dorsal root ganglion，DRG)干细胞，并进行体外和诱导分化培养。这类细胞具有明显的干细胞特征，能分化为大小感觉神经元、卫星细胞和雪旺氏细胞的潜能。体内定位分布和周围神经损伤后的活性研究表明，DRG干细胞主要定位在成熟节细胞周围，受损伤刺激后部分细胞进入增殖分裂期。另外，DRG干细胞能够进行体外-196℃保存和复苏，复苏后细胞仍具有干细胞特性。这就为体外大量扩增、储存干细胞，用于治疗各种先天性或获得性神经系统疾病引起的神经细胞缺损、神经系统肿瘤以及周围神经损伤特别是神经根性撕脱伤提供了新途径。
目前，神经系统很多部位都分离出了神经干细胞，包括啮齿类成年和胚胎个体的脑室下区、端脑、海马、纹状体、脊髓，甚至人神经组织的大脑、脊髓和嗅球，这些科学进展为研究神经系统发育和治疗神经系统的疾病带来了前所未有光明前景。然而，这些神经干细胞都来自于中枢神经系统，治疗研究的方向也集中在中枢神经系统。实际上，我国乃至整个世界上，每年因各种原因所导致的周围神经损伤的病人不计其数。目前，周围神经损伤，特别是根部撕脱性损伤尚无很好的治疗解决办法。本实验小组在国际上首次体外培养出了周围神经来源的人背根神经节干细胞(dorsal root ganglion stem cell，DRG stem cell)，并发现了体外诱导分化、储存的有效方法及体内的定位，为DRG用于治疗周围神经损伤，特别是根性撕脱伤打下基础。
本发明的目的是通过下述方法实现的本发明通过分离流产胎儿脊髓两侧的DRG，制成单细胞悬液，培养于加有EGF和bFGF的DMEM/F12(GIBCO)无血清完全培养基中，3-5天后聚集形成悬浮生长的神经球，并可进行传代扩增。其中胶质细胞占大部分，神经元仅占2-10％。免疫组化结果显示神经球细胞表达nestin蛋白--一种神经干/祖细胞表达的神经内皮中间纤维丝蛋白；胶质细胞GFAP和S100染色阳性，神经元NF染色阳性。本发明显示，DRG干细胞对血清很敏感，少量血清能导致细胞发生分化，即具有多潜能分化特性。DRG干细胞能够进行体外-196℃保存和复苏，复苏后细胞仍具有干细胞特性。胎儿DRG经过固定后进行石蜡切片，采用nestin单克隆抗体和荧光标记的二抗对组织切片进行免疫显色检测，发现DRG干细胞分布在成熟节细胞的周边；从后肢根部切断SD大鼠坐骨神经，腹腔注射BrdU，对组织切片进行免疫荧光检测，显示相应DRG的节细胞周边出现S期细胞，说明当受到损伤刺激后，这些细胞被激活进入分裂增生期。
细胞冻存15天后，迅速37℃温水复苏，复苏后细胞仍具有干细胞特性。五.背根神经节干细胞在体研究为研究DRG干细胞的体内分布，我们把16-26周人胎儿DRG经过固定后进行石蜡切片，采用nestin单克隆抗体和荧光(FITC)标记的二抗对组织切片进行免疫显色检测，发现DRG干细胞分布在成熟节细胞的周边，为研究DRG干细胞在体内的增殖，我们采用成年的SD大鼠(150g左右)，从动物后肢根部切断坐骨神经，经腹腔注射BrdU，处死动物，免疫荧光显示相应DRG的节细胞周边出现S期细胞，说明部分细胞被激活进入增殖期。
本发明的优点1.本发明首次报道人胎儿背根神经节干细胞的分离和扩增过程，并证明了DRG细胞的多分化潜能，操作方法简单可行；2.本发明确定了DRG干细胞体外保存和复苏的条件，复苏后细胞仍具有干细胞特性，这就为干细胞移植治疗各种周围神经损伤、先天性神经系统疾病以及神经系统肿瘤打下基础；3.本发明为神经干细胞的研究增加了一个新来源，使神经系统的可塑性研究成为可能；4.本发明为分子生物学、药理学提供了一种工具细胞。
权利要求
1.首次从周围神经系统分离出背根神经节(dorsal rootganglion，DRG)干细胞，并利用有丝分裂因子EGF和bFGF进行体外和诱导分化培养。其特征在于这类细胞具有明显的干细胞特征，具有分化为大小感觉神经元、卫星细胞和雪旺氏细胞的潜能。体内定位分布和周围神经损伤后的活性研究表明，DRG干细胞主要定位在成熟节细胞周围，受损伤刺激后部分细胞进入增殖分裂期。另外，DRG干细胞能够进行体外-196℃保存和复苏，复苏后细胞仍具有干细胞特性。实现了体外大量扩增、储存干细胞，作为治疗各种先天性或获得性神经系统疾病引起的神经细胞缺损、神经系统肿瘤以及周围神经损伤特别是神经根性撕脱伤的新途径。
2.据权利要求1所述的方法，其特征在于人胎儿背根神经节干细胞的分离、培养、诱导分化、冻存和复苏；
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于人胎儿背根神经节干细胞作为一种细胞模型研究神经系统的正常或畸形发育过程，用于研究感觉神经元、卫星细胞和Schwann Cells的分化调节过程，还可作为分子生物学、药理学的工具细胞；
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于背根神经节干细胞用于治疗各种先天性或获得性神经系统疾病引起的神经细胞缺损、神经系统肿瘤以及周围神经损伤特别是神经根性撕脱伤。
全文摘要
本发明公开了一种背根神经节(dorsal root ganglion，DRG)干细胞的制备及分离方法。涉及了利用有丝分裂因子EGF和bFGF，首次从周围神经系统分离出背根神经节(dorsal root ganglion，DRG)干细胞，并进行体外和诱导分化培养。这类细胞具有明显的干细胞特征，能分化为大小感觉神经元、卫星细胞和雪旺氏细胞的潜能。体内定位分布和周围神经损伤后的活性研究表明，DRG干细胞主要定位在成熟节细胞周围，受损伤刺激后部分细胞进入增殖分裂期。另外，DRG干细胞能够进行体外－196℃保存和复苏，复苏后细胞仍具有干细胞特性。这就为体外大量扩增、储存干细胞，用于治疗各种先天性或获得性神经系统疾病引起的神经细胞缺损、神经系统肿瘤以及周围神经损伤特别是神经根性撕脱伤提供了新途径。
文档编号A61K35/12GK1458273SQ0210261
公开日2003年11月26日 申请日期2002年1月16日 优先权日2002年1月16日
发明者赵春华, 张帆, 谭耀红 申请人:中国医学科学院中国协和医科大学血液学研究所
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