一种编码溶菌酶的基因及其应用的制作方法
专利名称：一种编码溶菌酶的基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的编码溶菌酶的基因，特别是涉及克隆自环境宏基因组的一种 新的编码溶菌酶的基因lyase，该基因编码的蛋白质可用于抗菌和溶菌。
背景技术：
溶菌酶又称胞壁质酶，是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶，其化学名称为N 一乙酰胞壁质聚糖水解酶。溶菌酶具有多种独特而重要的药理作用。它具有抗菌消炎的作用。溶菌酶主要通 过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β_1，4糖苷键，使细胞壁不溶 性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶还能增加抗 生素和其他抗菌药物的疗效，改善组织基质的黏多糖代谢从而达到抗炎和修复的目的。此外 溶菌酶也能抗病毒，它与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐， 使病毒失活。因此该酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用(余若黔.2004.溶菌酶的活性测定方 法.生物技术通报.(5) =40-42.) 0同时由于溶菌酶本身是一种无毒、无害的蛋白质，可以选 择性地、有目的地杀灭微生物而不作用于食品中的其他物质，保证食品原有营养成分不受损 失。因此，它是一种很好的天然防腐剂，在食品工业中可以安全地替代有害人体健康的化学防 腐剂，如苯甲酸及其钠盐等，以达到延长食品保质期的目的。张凤凯等人利用溶菌酶作为主要 成分，成功研制了一种纯天然的冷却肉保鲜剂-HnSafety2008冷却肉保鲜剂，该保鲜剂可以 延长冷却肉的保质期1 4倍(张凤凯，马美湖.2001.溶菌酶及其食品保鲜剂的应用.肉类 研究，20(4) =41-42.) 0同时溶菌酶也是一种安全性高的饲料酶添加剂，可以用作饲料防腐剂 和杀菌剂。沈彦萍等人将溶菌酶用到仔猪腹泻的防治上，发现溶菌酶具有显著的作用，可以达 到抗生素的使用效果，仔猪腹泻的治愈率达80%以上(沈彦萍，陈宇光，潘宏涛，等.2005.溶 菌酶可溶性粉剂防治仔猪腹泻的效果观察.饲料工业，26 (3) :16 181)。目前国内外对溶菌酶基因研究主要集中于动物，如人(Chen ZH, Xie XD, Guo TK, et al. 2007. Theanti-proliferativeeffectsofrecombinant human lysozyme onhuman gastric cancer cells. The Jourmal Of Intermational Medical Research,35 (3) 360.)、鸡蛋清(权志中、张丞斌、余荣等.2007.鸡蛋清溶菌酶基因的克隆及其在毕赤酵母 中的表达研究· 28(24) 18-22.)、大鼠(Yamaokaky，Yoshiokat. 1983. Effects of lysozyme chloride on immune responsesof patients withuterinecervical cancer. Gan to kagaka kyoho,10(8) :8_20.)的溶菌酶上，对这些不同动物来源的溶菌酶基因进行研究和 应用。而通过建立环境样品的宏基因组文库克隆各种基因已经成为筛选和获得各种特殊作 用的新基因的有效方法(Lorenz P. Schleper C. 2002. Metagenome-a challenging source of enzymediscovery. Journal ofMolecular Catalysis B :Enzymatic 19—20 :13_19.)。
发明内容
本发明通过构建土壤微生物的宏基因组DNA文库和文库亚克隆序列的随机测序法，得到了新的编码溶菌酶的基因，可在宿主细胞中大量表达该基因以生产该溶菌酶，用于 溶菌和抗菌。本发明涉及一种新的编码溶菌酶的基因lyase，具有序列表中SEQ ID NO. 1所述的 碱基序列，是从广西武鸣县糖厂周围土壤微生物宏基因组文库中分离得到。土壤微生物的 文库中的亚克隆、具有序列表中SEQ ID NO. 1所述的碱基序列的外源DNA是由1977个碱基 组成，含有完整的溶菌酶基因lyase的开放阅读框(Open Reading Frame，0RF)，lyase基因 的起始密码为ATG，终止密码子为TAA。SEQ ID NO. 2的蛋白质是基因lyase编码的溶菌酶产物Lyase，由659个氨基酸 组成，和Lyase催化功能域同源性最高的为亚硝化海洋球菌ATCC19707 (Nitrosococcus oceani ATCC 19707)的 hypothetical protein Noc_2530 的催化功能域(e_ 值为 le_75)， 两者的相似性为32%、相同性为48%。基因lyase在大肠杆菌中表达的重组产物Lyase能够溶菌抗菌。本发明还涉及含有本发明基因的表达载体，及用于转化本发明基因的宿主。本发明提供了一种新的溶菌酶基因，该基因所编码的溶菌酶在溶菌抗菌中具有广 泛的用途。
具体实施例方式下述实施方法是为了更好的解释本发明，而不应该被解释为限制本发明的目的。在本发明的实施例中所用到的材料包括大肠杆菌(Escherichia coli)株 系EPIlOO (属购自Epicentre公司的文库制备试剂盒CopyControl FosmidLibrary Production Kit(目录号CCF0S110)的一个组分)；载体为购自Epicentre公司的柯斯质 粒载体CopyControl pCClFOS ;购自Epicentre公司的文库制备试剂盒(CopyControl Fosmid Library Production Kit，目录号 CCF0S110)，购自 TaKaRA、MBI 的限制性内切酶、 修饰酶等试剂。下面将通过实施例对本发明作详细描述1)广西武鸣县糖厂周围土壤微生物总DNA的提取取200克糖厂周围的土壤，悬浮在IOOmL的0. 18mol/L磷酸钾缓冲液(pH7. 2)中， 然后在600g离心力下离心10分钟收集上清液。上清中加入40mLPVPP (聚乙烯聚吡咯烷 酮，polyvinylpolypyrrolidone (购自 Sigma 公司，目录号 P-6755))溶液(PVPP 溶液每 IOOmg PVPP与ImL 0. 18mol/L磷酸钾缓冲液(pH 7. 2)混勻)，振荡30秒，再加入200 μ L 3mol/L CaCl2溶液，振荡30秒后，在600转/分钟离心力离心5分钟，收集上清液于另一个 离心管中并用8000转/分钟离心力离心15分钟收集上清液中的细菌细胞。收集到的菌体 沉淀块悬浮在 ImL TE(10mmol/L Tris · HCl, pH 8. 0，lmmol/L EDTA, pH 8. 0)溶液中，并在 37°C下加入100 μ L溶菌酶(20mg/mL，溶于TE溶液)作用30分钟，然后以10000转/分钟 离心1分钟再次沉淀细胞，细胞沉淀块悬浮在600 μ L PUREGENE公司的基因组DNA纯化试 剂盒(Genomic DNA Purification Kit,目录号 R-5500A)的细胞裂解缓冲液(Cell Lysis Solution)中，置80°C水浴锅5分钟以裂解细胞，待样品冷却到室温后，加入200 μ L上述试 剂盒中的蛋白质沉淀溶液(Protein Precipitation Solution)，充分混勻后13000转/分 钟离心3分钟，将上清液转移到一个新的1.5!^微量离心管中，加入60(^1^ 100%异丙醇，充分混勻后即见DNA絮状沉淀析出，挑出DNA絮状沉淀，用70%乙醇洗2次DNA，干燥后将 DNA溶于500 μ LTE溶液即得DNA粗提物。将DNA粗提物加到含有S印hadex G200 (购自Pharmacia公司，目录号 17-0080-01)和2% PVPP的层析柱(200mm χ 10mm)上，用TE缓冲液洗脱，按每组分ImL分 部收集洗脱液，每一组分加入100 μ L的3mol/L醋酸钠溶液(pH4. 8)及ImL异丙醇沉淀DNA， 把沉淀物溶于TE中，合并所得DNA溶液，0. 7%琼脂糖凝胶电泳后切下含20kb以上的DNA 的凝胶，用电洗脱法回收纯化DNA。2)构建糖厂周围土壤微生物宏基因组文库为了用这些纯化的DNA制做基因文库，首先对这些DNA进行末端修补以产生平 头末端而和文库制备试剂盒中已处理好的同样具平头末端的CopyControlTMpCClFOSTM载 体相连，依次在冰上向一个新的灭过菌的微量离心管中加入8 μ LlOX末端修补缓冲液 (330mmol/L Tris-醋酸[pH 7. 8]，660mmol/L 醋酸钾，100mmol/L 醋酸镁，5mmol/L DTT)， 8 μ L 2. 5mmol/L dNTP 混合物(每种 2. 5mmol/L)，8 μ LlOmM ATP, 20 μ g DNA (0· 5 μ g/ μ L)，4μ L末端修补酶混合物(T4DNA聚合酶和T4多聚核苷酸激酶)。室温下放置45分 钟，再转移到70°C水浴锅放置10分钟以终止酶反应，1. 0%低熔点琼脂糖凝胶电泳后切下 含25kb-45kb的DNA的凝胶进行DNA回收，为了使回收片段与文库制备试剂盒中已处理好 的具平头末端的载体在T4DNA连接酶的作用下连接起来，依次在冰上向一个新的灭过菌 的微量离心管中加入:2 μ L无菌水，1 μ LlO倍快速连接缓冲液(10Χ Fast-Link Ligation Buffer) ,IuL 10mmol/L ATP, 1 μ L CopyControlTMpCClF0S 载体(0· 5 μ g)，5 μ L 低熔点 琼脂糖凝胶回收的25kb-45kb的DNA (0. 1 μ g/ μ L), 1 μ L快速连接DNA连接酶(Fast-Link DNA Ligase, 2单位/ μ L)，混勻后在室温下放置2个小时，再在70°C放置10分钟以终止 酶反应。为了将连接反应产物用λ包装提取物(属购自Epicentre公司的文库制备试 剂盒 CopyControl Fosmid Library Production Kit (目录号 CCFOSl 10)的一个组分) 包装，将在冰上刚刚溶化的λ包装提取物(属购自Epicentre公司的文库制备试剂盒 CopyControl Fosmid Library Production Kit (目录号 CCFOSl 10)的一个组分)25yL 立即转移到一个新的灭过菌的微量离心管中并快速置于冰上，再往其中加入10 μ L连接反 应产物，充分混勻后置于30°C 90分钟后，再往其中加入25 μ L溶化的λ包装提取物，充分 混勻后置于30°C 90分钟，向其中加入935 μ L噬菌体稀释缓冲液(lOmmol/L Tris-HCl [pH 8. 3]，IOOmmol/L NaCl，IOmmol/L MgCl2)，再将该 ImL 包装反应产物加入到 IOmL 的 OD600 = 1.0的宿主大肠杆菌EPIlOO培养液(培养基为LB[每升含胰蛋白胨(Oxoid)，IOg ；酵母浸 出粉(Difco)，5g ;NaCl，5g ;pH 7. 0]+10mmol/L MgSO4)中，37°C下放置 20 分钟让上述得到 的包装的λ噬菌体吸附和侵染宿主细胞Ε. coli ΕΡΙ100，在含氯霉素(12. Syg/mL)的LA 平板上筛选转化子。结果共获得约10万个转化子。3)溶菌酶基因lyase序列的测定用限制性内切酶BamHI酶切文库中编号为Fosl_34的转化子，将获得的三个DNA 片段分别与去磷酸化的经BamHI酶切的pUC19质粒进行连接。再分别将连接产物转化到 大肠杆菌JM109中(转化方法为CaCl2法)，在含氨苄青霉素(100 μ g/mL)的LA平板上筛 选转化子，结果分别获得约352个、289个和16个亚克隆转化子。分别提取这这三个亚克 隆的质粒DNA，再分别用限制性内切酶BamHI完全酶切，进行0. 7 %琼脂糖凝胶电泳分析，结果这三个亚克隆除有一个2. 7kb的载体片段外，均有不同大小的外源DNA片段，大小分别 是· 3. 5kb、8. Ikb和16kb，分别命名为Si、S2和S3。于是，将这三个亚克隆进行序列测通。 送交上海生工生物工程公司测定DNA核苷酸序列。4)溶菌酶基因lyase的核苷酸序列分析用 NCBI(National Center for Biotechnologylnformation, http://www. ncbi. nlm. nih. gov)上的软件如 ORF finder (http //www, ncbi. nlm. nih. rov/Rorf/Rorf. html)， Blast (http: //www, ncbi. nlm. nih. gov/BLAST)对 S3 中的 DNA 序列进行分析。基因 lyase 的开放阅读框(Open Reading Frame, 0RF)由1977个核苷酸组成，序列如SEQ ID N0. 1。其 中，lyase'基因的起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。5)溶菌酶基因lyase编码的产物Lyase的氨基酸序列分析溶菌酶基因lyase编码一个含659个氨基酸的蛋白质，用DNAStar软件预测该蛋 白质的理论分子量大小为74398. 43道尔顿。6)溶菌酶基因lyase的克隆和表达使用上游引物5，-CACGAATTCATGCATCACCATCACCATCACGTGCCGATCCGCAGACCTC-3，和 下游引物5，CACAAGCTTCTCCCCAAAGAGACAGGACTTCAGC-3，，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增 溶菌酶基因lyase，用限制性内切酶EcoRI和Hindi11酶切溶菌酶基因lyase后，与经EcoRI 和HindIII酶切的表达载体PSE380进行连接。再将连接产物转化到大肠杆菌XLl-Blue中 (转化方法为CaCl2法)，涂布到含氨苄青霉素(100yg/mL)的LA平板上筛选克隆。进一 步提取该克隆的质粒DNA并将其命名为pSE-lyase，用限制性内切酶EcoRI和HindIII酶切 pSE-lyase后，进行0. 7%琼脂糖凝胶电泳分析，结果pSE-lyase除有一个4. Ikb的DNA片 段外，还有一条大小为2kb的DNA片段。将含有质粒pSE-lyase的重组大肠杆菌XLl-Blue菌株接种到20mL含氨苄青霉 素(100 μ g/mL)的LB培养基中，37°C振荡培养，待OD6tltl为0. 4时，加入IPTG使其终浓度为 0.5mmOl/L，3(TC诱导。诱导2小时时，摇瓶中培养液开始变得比对照(未加IPTG)明显透 明；4小时后，培养液变得完全透明(与未接种的培养液基本一样透明)；而没有加IPTG的 对照，其宿主细菌大量繁殖生长，培养液十分混浊。12000转/分钟离心10分钟，收集上清， 上清即为含有溶菌酶Lyase的粗酶液。7)溶菌酶Lyase酶活的测定超虑浓缩溶菌酶的粗酶液。取30 μ 1溶菌酶Lyase的浓缩粗酶液，滴加在涂布大肠 杆菌LB平板的滤纸片上，以购自sigma公司的溶菌酶(目录号L6876)作为阳性对照，37°C 温箱内培养12小时后，观察抑菌圈的情况。在滴加溶菌酶Lyase浓缩粗酶液的滤纸片周围 形成一个圆形的抑菌圈，直径约为13. 6mm,与45 μ g溶菌酶阳性对照组形成的抑菌圈相接 近。
权利要求
一种编码溶菌酶的基因lyase，其特征在于，具有序列表中SEQ ID NO.1核苷酸序列或其功能等同变异体。
2.权利要求1的基因，其中所述功能等同变异体为SEQID NO. 1的核苷酸序列的突变 形式，突变形式包括缺失、无义、插入、错义。
3.根据权利要求1的基因所编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQID NO. 2所示。
4.一种表达载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的基因。
5.一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求3所述表达载体转化的原核细胞或真 核细胞。
6 .权利要求3所述的蛋白质在抗菌和溶菌中的应用。
全文摘要
一种编码溶菌酶的基因lyase，含有SEQ ID NO.1的核苷酸序列或其功能等同变异体，该基因或其功能等同变异体编码的溶菌酶SEQ ID NO.2及该酶在抗菌和溶菌中的应用。
文档编号A61K38/47GK101892252SQ20101011448
公开日2010年11月24日 申请日期2010年2月26日 优先权日2010年2月26日
发明者左文朴, 庞浩, 杜丽琴, 裴建新, 韦宇拓, 黄日波, 黎贞崇 申请人:广西大学
技术领域：
本发明涉及一种新的编码溶菌酶的基因，特别是涉及克隆自环境宏基因组的一种 新的编码溶菌酶的基因lyase，该基因编码的蛋白质可用于抗菌和溶菌。
背景技术：
溶菌酶又称胞壁质酶，是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶，其化学名称为N 一乙酰胞壁质聚糖水解酶。溶菌酶具有多种独特而重要的药理作用。它具有抗菌消炎的作用。溶菌酶主要通 过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β_1，4糖苷键，使细胞壁不溶 性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶还能增加抗 生素和其他抗菌药物的疗效，改善组织基质的黏多糖代谢从而达到抗炎和修复的目的。此外 溶菌酶也能抗病毒，它与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐， 使病毒失活。因此该酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用(余若黔.2004.溶菌酶的活性测定方 法.生物技术通报.(5) =40-42.) 0同时由于溶菌酶本身是一种无毒、无害的蛋白质，可以选 择性地、有目的地杀灭微生物而不作用于食品中的其他物质，保证食品原有营养成分不受损 失。因此，它是一种很好的天然防腐剂，在食品工业中可以安全地替代有害人体健康的化学防 腐剂，如苯甲酸及其钠盐等，以达到延长食品保质期的目的。张凤凯等人利用溶菌酶作为主要 成分，成功研制了一种纯天然的冷却肉保鲜剂-HnSafety2008冷却肉保鲜剂，该保鲜剂可以 延长冷却肉的保质期1 4倍(张凤凯，马美湖.2001.溶菌酶及其食品保鲜剂的应用.肉类 研究，20(4) =41-42.) 0同时溶菌酶也是一种安全性高的饲料酶添加剂，可以用作饲料防腐剂 和杀菌剂。沈彦萍等人将溶菌酶用到仔猪腹泻的防治上，发现溶菌酶具有显著的作用，可以达 到抗生素的使用效果，仔猪腹泻的治愈率达80%以上(沈彦萍，陈宇光，潘宏涛，等.2005.溶 菌酶可溶性粉剂防治仔猪腹泻的效果观察.饲料工业，26 (3) :16 181)。目前国内外对溶菌酶基因研究主要集中于动物，如人(Chen ZH, Xie XD, Guo TK, et al. 2007. Theanti-proliferativeeffectsofrecombinant human lysozyme onhuman gastric cancer cells. The Jourmal Of Intermational Medical Research,35 (3) 360.)、鸡蛋清(权志中、张丞斌、余荣等.2007.鸡蛋清溶菌酶基因的克隆及其在毕赤酵母 中的表达研究· 28(24) 18-22.)、大鼠(Yamaokaky，Yoshiokat. 1983. Effects of lysozyme chloride on immune responsesof patients withuterinecervical cancer. Gan to kagaka kyoho,10(8) :8_20.)的溶菌酶上，对这些不同动物来源的溶菌酶基因进行研究和 应用。而通过建立环境样品的宏基因组文库克隆各种基因已经成为筛选和获得各种特殊作 用的新基因的有效方法(Lorenz P. Schleper C. 2002. Metagenome-a challenging source of enzymediscovery. Journal ofMolecular Catalysis B :Enzymatic 19—20 :13_19.)。
发明内容
本发明通过构建土壤微生物的宏基因组DNA文库和文库亚克隆序列的随机测序法，得到了新的编码溶菌酶的基因，可在宿主细胞中大量表达该基因以生产该溶菌酶，用于 溶菌和抗菌。本发明涉及一种新的编码溶菌酶的基因lyase，具有序列表中SEQ ID NO. 1所述的 碱基序列，是从广西武鸣县糖厂周围土壤微生物宏基因组文库中分离得到。土壤微生物的 文库中的亚克隆、具有序列表中SEQ ID NO. 1所述的碱基序列的外源DNA是由1977个碱基 组成，含有完整的溶菌酶基因lyase的开放阅读框(Open Reading Frame，0RF)，lyase基因 的起始密码为ATG，终止密码子为TAA。SEQ ID NO. 2的蛋白质是基因lyase编码的溶菌酶产物Lyase，由659个氨基酸 组成，和Lyase催化功能域同源性最高的为亚硝化海洋球菌ATCC19707 (Nitrosococcus oceani ATCC 19707)的 hypothetical protein Noc_2530 的催化功能域(e_ 值为 le_75)， 两者的相似性为32%、相同性为48%。基因lyase在大肠杆菌中表达的重组产物Lyase能够溶菌抗菌。本发明还涉及含有本发明基因的表达载体，及用于转化本发明基因的宿主。本发明提供了一种新的溶菌酶基因，该基因所编码的溶菌酶在溶菌抗菌中具有广 泛的用途。
具体实施例方式下述实施方法是为了更好的解释本发明，而不应该被解释为限制本发明的目的。在本发明的实施例中所用到的材料包括大肠杆菌(Escherichia coli)株 系EPIlOO (属购自Epicentre公司的文库制备试剂盒CopyControl FosmidLibrary Production Kit(目录号CCF0S110)的一个组分)；载体为购自Epicentre公司的柯斯质 粒载体CopyControl pCClFOS ;购自Epicentre公司的文库制备试剂盒(CopyControl Fosmid Library Production Kit，目录号 CCF0S110)，购自 TaKaRA、MBI 的限制性内切酶、 修饰酶等试剂。下面将通过实施例对本发明作详细描述1)广西武鸣县糖厂周围土壤微生物总DNA的提取取200克糖厂周围的土壤，悬浮在IOOmL的0. 18mol/L磷酸钾缓冲液(pH7. 2)中， 然后在600g离心力下离心10分钟收集上清液。上清中加入40mLPVPP (聚乙烯聚吡咯烷 酮，polyvinylpolypyrrolidone (购自 Sigma 公司，目录号 P-6755))溶液(PVPP 溶液每 IOOmg PVPP与ImL 0. 18mol/L磷酸钾缓冲液(pH 7. 2)混勻)，振荡30秒，再加入200 μ L 3mol/L CaCl2溶液，振荡30秒后，在600转/分钟离心力离心5分钟，收集上清液于另一个 离心管中并用8000转/分钟离心力离心15分钟收集上清液中的细菌细胞。收集到的菌体 沉淀块悬浮在 ImL TE(10mmol/L Tris · HCl, pH 8. 0，lmmol/L EDTA, pH 8. 0)溶液中，并在 37°C下加入100 μ L溶菌酶(20mg/mL，溶于TE溶液)作用30分钟，然后以10000转/分钟 离心1分钟再次沉淀细胞，细胞沉淀块悬浮在600 μ L PUREGENE公司的基因组DNA纯化试 剂盒(Genomic DNA Purification Kit,目录号 R-5500A)的细胞裂解缓冲液(Cell Lysis Solution)中，置80°C水浴锅5分钟以裂解细胞，待样品冷却到室温后，加入200 μ L上述试 剂盒中的蛋白质沉淀溶液(Protein Precipitation Solution)，充分混勻后13000转/分 钟离心3分钟，将上清液转移到一个新的1.5!^微量离心管中，加入60(^1^ 100%异丙醇，充分混勻后即见DNA絮状沉淀析出，挑出DNA絮状沉淀，用70%乙醇洗2次DNA，干燥后将 DNA溶于500 μ LTE溶液即得DNA粗提物。将DNA粗提物加到含有S印hadex G200 (购自Pharmacia公司，目录号 17-0080-01)和2% PVPP的层析柱(200mm χ 10mm)上，用TE缓冲液洗脱，按每组分ImL分 部收集洗脱液，每一组分加入100 μ L的3mol/L醋酸钠溶液(pH4. 8)及ImL异丙醇沉淀DNA， 把沉淀物溶于TE中，合并所得DNA溶液，0. 7%琼脂糖凝胶电泳后切下含20kb以上的DNA 的凝胶，用电洗脱法回收纯化DNA。2)构建糖厂周围土壤微生物宏基因组文库为了用这些纯化的DNA制做基因文库，首先对这些DNA进行末端修补以产生平 头末端而和文库制备试剂盒中已处理好的同样具平头末端的CopyControlTMpCClFOSTM载 体相连，依次在冰上向一个新的灭过菌的微量离心管中加入8 μ LlOX末端修补缓冲液 (330mmol/L Tris-醋酸[pH 7. 8]，660mmol/L 醋酸钾，100mmol/L 醋酸镁，5mmol/L DTT)， 8 μ L 2. 5mmol/L dNTP 混合物(每种 2. 5mmol/L)，8 μ LlOmM ATP, 20 μ g DNA (0· 5 μ g/ μ L)，4μ L末端修补酶混合物(T4DNA聚合酶和T4多聚核苷酸激酶)。室温下放置45分 钟，再转移到70°C水浴锅放置10分钟以终止酶反应，1. 0%低熔点琼脂糖凝胶电泳后切下 含25kb-45kb的DNA的凝胶进行DNA回收，为了使回收片段与文库制备试剂盒中已处理好 的具平头末端的载体在T4DNA连接酶的作用下连接起来，依次在冰上向一个新的灭过菌 的微量离心管中加入:2 μ L无菌水，1 μ LlO倍快速连接缓冲液(10Χ Fast-Link Ligation Buffer) ,IuL 10mmol/L ATP, 1 μ L CopyControlTMpCClF0S 载体(0· 5 μ g)，5 μ L 低熔点 琼脂糖凝胶回收的25kb-45kb的DNA (0. 1 μ g/ μ L), 1 μ L快速连接DNA连接酶(Fast-Link DNA Ligase, 2单位/ μ L)，混勻后在室温下放置2个小时，再在70°C放置10分钟以终止 酶反应。为了将连接反应产物用λ包装提取物(属购自Epicentre公司的文库制备试 剂盒 CopyControl Fosmid Library Production Kit (目录号 CCFOSl 10)的一个组分) 包装，将在冰上刚刚溶化的λ包装提取物(属购自Epicentre公司的文库制备试剂盒 CopyControl Fosmid Library Production Kit (目录号 CCFOSl 10)的一个组分)25yL 立即转移到一个新的灭过菌的微量离心管中并快速置于冰上，再往其中加入10 μ L连接反 应产物，充分混勻后置于30°C 90分钟后，再往其中加入25 μ L溶化的λ包装提取物，充分 混勻后置于30°C 90分钟，向其中加入935 μ L噬菌体稀释缓冲液(lOmmol/L Tris-HCl [pH 8. 3]，IOOmmol/L NaCl，IOmmol/L MgCl2)，再将该 ImL 包装反应产物加入到 IOmL 的 OD600 = 1.0的宿主大肠杆菌EPIlOO培养液(培养基为LB[每升含胰蛋白胨(Oxoid)，IOg ；酵母浸 出粉(Difco)，5g ;NaCl，5g ;pH 7. 0]+10mmol/L MgSO4)中，37°C下放置 20 分钟让上述得到 的包装的λ噬菌体吸附和侵染宿主细胞Ε. coli ΕΡΙ100，在含氯霉素(12. Syg/mL)的LA 平板上筛选转化子。结果共获得约10万个转化子。3)溶菌酶基因lyase序列的测定用限制性内切酶BamHI酶切文库中编号为Fosl_34的转化子，将获得的三个DNA 片段分别与去磷酸化的经BamHI酶切的pUC19质粒进行连接。再分别将连接产物转化到 大肠杆菌JM109中(转化方法为CaCl2法)，在含氨苄青霉素(100 μ g/mL)的LA平板上筛 选转化子，结果分别获得约352个、289个和16个亚克隆转化子。分别提取这这三个亚克 隆的质粒DNA，再分别用限制性内切酶BamHI完全酶切，进行0. 7 %琼脂糖凝胶电泳分析，结果这三个亚克隆除有一个2. 7kb的载体片段外，均有不同大小的外源DNA片段，大小分别 是· 3. 5kb、8. Ikb和16kb，分别命名为Si、S2和S3。于是，将这三个亚克隆进行序列测通。 送交上海生工生物工程公司测定DNA核苷酸序列。4)溶菌酶基因lyase的核苷酸序列分析用 NCBI(National Center for Biotechnologylnformation, http://www. ncbi. nlm. nih. gov)上的软件如 ORF finder (http //www, ncbi. nlm. nih. rov/Rorf/Rorf. html)， Blast (http: //www, ncbi. nlm. nih. gov/BLAST)对 S3 中的 DNA 序列进行分析。基因 lyase 的开放阅读框(Open Reading Frame, 0RF)由1977个核苷酸组成，序列如SEQ ID N0. 1。其 中，lyase'基因的起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。5)溶菌酶基因lyase编码的产物Lyase的氨基酸序列分析溶菌酶基因lyase编码一个含659个氨基酸的蛋白质，用DNAStar软件预测该蛋 白质的理论分子量大小为74398. 43道尔顿。6)溶菌酶基因lyase的克隆和表达使用上游引物5，-CACGAATTCATGCATCACCATCACCATCACGTGCCGATCCGCAGACCTC-3，和 下游引物5，CACAAGCTTCTCCCCAAAGAGACAGGACTTCAGC-3，，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增 溶菌酶基因lyase，用限制性内切酶EcoRI和Hindi11酶切溶菌酶基因lyase后，与经EcoRI 和HindIII酶切的表达载体PSE380进行连接。再将连接产物转化到大肠杆菌XLl-Blue中 (转化方法为CaCl2法)，涂布到含氨苄青霉素(100yg/mL)的LA平板上筛选克隆。进一 步提取该克隆的质粒DNA并将其命名为pSE-lyase，用限制性内切酶EcoRI和HindIII酶切 pSE-lyase后，进行0. 7%琼脂糖凝胶电泳分析，结果pSE-lyase除有一个4. Ikb的DNA片 段外，还有一条大小为2kb的DNA片段。将含有质粒pSE-lyase的重组大肠杆菌XLl-Blue菌株接种到20mL含氨苄青霉 素(100 μ g/mL)的LB培养基中，37°C振荡培养，待OD6tltl为0. 4时，加入IPTG使其终浓度为 0.5mmOl/L，3(TC诱导。诱导2小时时，摇瓶中培养液开始变得比对照(未加IPTG)明显透 明；4小时后，培养液变得完全透明(与未接种的培养液基本一样透明)；而没有加IPTG的 对照，其宿主细菌大量繁殖生长，培养液十分混浊。12000转/分钟离心10分钟，收集上清， 上清即为含有溶菌酶Lyase的粗酶液。7)溶菌酶Lyase酶活的测定超虑浓缩溶菌酶的粗酶液。取30 μ 1溶菌酶Lyase的浓缩粗酶液，滴加在涂布大肠 杆菌LB平板的滤纸片上，以购自sigma公司的溶菌酶(目录号L6876)作为阳性对照，37°C 温箱内培养12小时后，观察抑菌圈的情况。在滴加溶菌酶Lyase浓缩粗酶液的滤纸片周围 形成一个圆形的抑菌圈，直径约为13. 6mm,与45 μ g溶菌酶阳性对照组形成的抑菌圈相接 近。
权利要求
一种编码溶菌酶的基因lyase，其特征在于，具有序列表中SEQ ID NO.1核苷酸序列或其功能等同变异体。
2.权利要求1的基因，其中所述功能等同变异体为SEQID NO. 1的核苷酸序列的突变 形式，突变形式包括缺失、无义、插入、错义。
3.根据权利要求1的基因所编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQID NO. 2所示。
4.一种表达载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的基因。
5.一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求3所述表达载体转化的原核细胞或真 核细胞。
6 .权利要求3所述的蛋白质在抗菌和溶菌中的应用。
全文摘要
一种编码溶菌酶的基因lyase，含有SEQ ID NO.1的核苷酸序列或其功能等同变异体，该基因或其功能等同变异体编码的溶菌酶SEQ ID NO.2及该酶在抗菌和溶菌中的应用。
文档编号A61K38/47GK101892252SQ20101011448
公开日2010年11月24日 申请日期2010年2月26日 优先权日2010年2月26日
发明者左文朴, 庞浩, 杜丽琴, 裴建新, 韦宇拓, 黄日波, 黎贞崇 申请人:广西大学
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