一种抗肿瘤转移作用的转筋草生物碱类化合物的制作方法

专利名称：：一种抗肿瘤转移作用的转筋草生物碱类化合物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种抗肿瘤转移作用的转筋草生物碱类化合物，属于中药有效成分研究领域。
背景技术：
：据WHO公布的数据显示，2005年在全球5800万例总死亡人数中，因各类肿瘤导致的死亡人数占13%，肿瘤已成为当今严重威胁人类健康的重大疾病之一。随着生命科学的进步和医学的发展，人类对肿瘤的认识已经深入到分子细胞层面，各种新的手术治疗手段和化疗药物不断问世。然而，据美国癌症研究所统计，50余年来，癌症治疗并没有得到根本改观，癌症死亡率仍然居高不下，主要原因是肿瘤转移，没有肿瘤转移的有效治疗手段和药物。目前世界公认转移是恶性肿瘤患者死亡的主要原因，大约90%的恶性肿瘤患者死于肿瘤转移。化学药物治疗，是原发肿瘤治疗及手术后预防转移的重要治疗手段。几十年的临床实践表明，化疗药物多药耐药性的发生以及化疗药物非常严重的毒副作用，不仅严重削弱了化疗效果，而且化疗药物严重损害患者的免疫系统，基本上破坏了抵抗肿瘤细胞侵袭迁移的第一道屏障，半年内的肿瘤复发率高达69%，这是化学治疗的两难选择。迄今为止，世界上尚没有抗肿瘤转移药物问世。虽然在不同的肿瘤形成过程中，肿瘤细胞的基因会发生不同的变化，但是在肿瘤的转移过程大致相同。2001年，ZlotnikA小组研究发现，细胞的趋化运动在肿瘤细胞的转移和扩散中起着关键的作用。趋化因子CXCL12可以诱导乳腺癌细胞发生趋化运动。如果使用抑制趋化因子CXCL12的受体CXCR4活性的抗体则可以减弱乳腺癌细胞的趋化能力，并抑制其扩散，抑制肿瘤细胞的趋化运动将能有效地抑制肿瘤细胞的转移和扩散。因此，在干扰或阻断恶性肿瘤在宿主体内播散的过程中，抑制肿瘤细胞的趋化运动是抗肿瘤转移药物研究中最重要的环节，是延长生存期、提高生存质量和降低死亡率的最有效手段。另一方面，由于常规原发肿瘤切除后的抗肿瘤转移药物治疗是持续的、长期给药过程，理想的抗肿瘤转移药物不仅阻断肿瘤细胞在体内的侵袭转移，而且应该是非细胞毒药物或者毒副作用很低，不会对免疫系统造成损害。转筋草(PachysandraterminalisSieb.Zucc)为黄杨科(Buxaceae)板凳果属(Pachysandra)植物粉蕊黄杨的带根全草，是湖北省土家族常用民间药物，主治风湿热痹，小腿转筋，月经不调。在对转筋草进行生物活性化学成分研究中，发现转筋草提取物具有很强的抗肿瘤转移活性，在1μg/ml和5μg/ml的浓度下，对乳腺癌细胞MB-MDA-231趋化抑制率分别为66%和95%(在同样浓度下未显示对乳腺癌细胞的毒性)。因此进一步开展了抗肿瘤转移化学成分研究，初步提取分离并鉴定了33个化学成分，其中12个新化合物，为酚酸类、木脂素类、紫罗兰酮及其生物碱(其中紫罗兰酮型生物碱为首次发现的新天然结构类型，均为新化合物)和孕留烷型生物碱化合物。对各单体化合物进行了抗肿瘤转移活性筛选试验表明只有生物碱类化合物显示了很强的抗肿瘤转移活性。
发明内容本发明的目的在于提供一种抗肿瘤转移作用的转筋草生物碱类化合物，该类生物碱具有紫罗兰酮生物碱结构和孕留烷生物碱结构类型，可用于制备抗肿瘤转移药物。本发明是通过以下提取分离、纯化和筛选技术方案加以实现的，其特征在于取自然干燥的转筋草粉碎后用以6倍量95%的乙醇加热回流提取3次，每次6h。提取液减压浓缩，得浸膏700g，浸膏加水混悬后，分别用石油醚、醋酸乙酯、正丁醇萃取，得石油醚提取物101g，醋酸乙酯提取物88g，正丁醇提取物360g和转筋草水层部分。石油醚提取物和转筋草水层总生物碱经硅胶柱色谱初步分离，进一步经制备HPLC色谱纯化得化合物1(18.5mg),2(16.Omg),3(9.5mg),4(16.Omg),5(9.5mg),6(16.Omg)和7(25.Omg)。其中化合物1为新发现的天然紫罗兰酮生物碱结构类型，化合物7为新化合物，文献未见报道。结构式如下1234567抗肿瘤转移活性评价Transwellchemotaxis方法原理在Transwell小室上腔直接将8μm孔径滤膜安放在侵袭腔室的上下腔室之间，肿瘤细胞通过变形运动穿过滤膜，用这种模型能够分析细胞运动能力的大小。在药物筛选时加入趋化诱导剂(趋化因子EGF)，通过衡量与测试药物共培养的肿瘤细胞和空白组肿瘤细胞趋化穿过滤膜的细胞数量变化，来表达测试药物抑制肿瘤细胞的趋化迁移能力的大小，进而评价测试药物抗肿瘤转移的活性强弱。实验步骤1.样品低细胞毒剂量的筛选利用MTT法筛选出低细胞毒作用的样品浓度。2.样品与细胞共培养将细胞铺于6孔板，置于37°C，5%CO2的孵箱内培养24小时使其贴壁，24小时后以确定的浓度将样品加于6孔板内，37°C5%CO2孵箱内共孵育24小时。3.趋化实验将用样品处理过的细胞分别用0.25%的胰酶消化后，用含10%FBS的培养液终止消化，该细胞悬液1300rpm离心5分钟。将上清倒出，加0.1%的BM将细胞混勻后再次离心5分钟后，计数，将细胞密度调成5X105，放置在孵箱内备用。于冰上配置趋化因子EGF，加于趋化小室的下室，每孔30ul，将包被好的膜铺于下室上，放好胶垫，固定上室，将之前准备好的细胞悬液加到上室，每孔50ul，每个样品浓度3个复孔，加好后置于CO2孵箱内培养3.5h后取出，取出下室，刮去没有趋化过来的细胞，然后用三步染色试剂进行固定和染色，染色后将膜用石蜡油固定，于显微镜下计数。4.统计计算方法计数时，每个孔选取5个视野分别计数，取平均值，三个复孔再取平均即为该样品浓度下的趋化细胞数。数据用SPSS11.5进行处理。计算公式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>各化合物对肿瘤细胞的毒性作用MTT比色测定法的原理此分析方法以还原3-(4，5_二甲基噻唑-2-基)-2，5_二苯基四唑溴化物(MTT)为基础，是一种检测细胞存活和生长状况的常用方法。MTT为一种通用的细胞染色剂，活细胞的线粒体中存在与NADP相关的琥珀酸脱氢酶，可将外源性黄色MTT还原为不溶性的蓝紫色结晶物甲臜(Formazane)，并沉积在细胞中，死细胞此酶消失，MTT不被还原。用DMSO溶解Formazane后用酶标仪在550nm波长处检测光密度的变化大小，来衡量测试药物对细胞的生长抑制作用，进而评价细胞毒性。实验步骤将培养好的细胞用0.25%的胰酶消化，吸出胰酶后，用含10%FBS的培养液终止消化，混勻细胞悬液，计数调节密度为ιχIO4,将调好的细胞悬液加于96孔板，每孔180ul，置于37°C，5%CO2的孵箱内培养24小时，24小时后加药，每个浓度5个复孔，加好药后继续置于37°C，5%CO2的孵箱内培养48小时，之后每孔加5mg/ml的MTT20ul，继续置于37°C，5%CO2的孵箱内培养4小时，4小时后取出96板，将上清吸出，每孔加IOOul的DMS0，用酶标仪在570nm波长下测量吸光度。抑制率=(1_加药组OD值/空白组OD值)X100%实验结果各化合物对MB-MDA-231(乳腺癌细胞)趋化抑制率(Cl(趋化指数)=6.67)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>各化合物对MB-MDA-231(乳腺癌细胞)生长抑制率(细胞毒性)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>抗肿瘤转移活性评价和细胞毒性评价表明，化合物1-7在0.2μg/ml的浓度下即呈现很强的抑制肿瘤细胞迁移活性，最高抑制率为89.5%。而在0.2μg/ml和0.8μg/ml浓度下没有显示细胞毒性，表明化合物1-7具有很强的抗肿瘤转移作用，而且毒性低。具体实施例方式转筋草生物碱化合物1-7的提取分离和结构鉴定1.转筋草生物碱化合物1-7的提取分离取自然干燥的转筋草IOkg粉碎后用以6倍量95%的乙醇加热回流提取3次，每次6h。提取液减压浓缩，得浸膏700g，浸膏加水混悬后，分别用石油醚、醋酸乙酯、正丁醇萃取，得石油醚提取物101g，醋酸乙酯提取物88g，正丁醇提取物360g和转筋草水层部分。石油醚提取物经硅胶柱色谱，以石油醚_醋酸乙酯_甲醇梯度洗脱，得到22个组分(Fre.122)，根据碘化铋钾显色TLC，将含有生物碱的组分Fre.815合并，以硅胶柱层析分离，二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，TLC合并相似组分得到Fre.8.18.14，Fre.8.7经制备HPLC分离(ODS-A，甲醇-水，8515)得到化合物6(16.Omg)和7(25.Omg)。转筋草水层部分以氨水调PH至10，再以醋酸乙酯萃取得到生物碱组分14g，经硅胶柱层析，二氯甲烷-甲醇-氨水(9811-731)梯度洗脱，得到组分Fra.3.13.16，其中Fra.3.10经制备HPLC分离(0DS-A，甲醇-水，982)得到化合物1(18.5mg)、4(16.Omg),5(9.5mg)；Fra.3.12经制备HPLC分离(0DS-A，甲醇-水，955)得到化合物2(16.Omg)>3(9.Omg)。2.化合物1-7的波谱数据化合物1黄色油状物，HRESI-MSm/z236.2004[M+H]+，calcd.236.2014，分子式C15H25Onzh-Wr(Cdcl3JOOMhz)δ:0.96(3Η,S,Η-12),1.00(3Η,S,Η-11),1.19(3Η,d,J=4.OHz,H-10)，1.91(3Η,s,H-13)，2.05(1Η,d,J=16.8Ηζ,Η_2)，2.35(1Η,d,J=16.8Ηζ，Η-2)，2·25(6Η，s，H-N(CH3)2)，2·54(1Η，d，Η_6)，2·93(lH，m，Η_9)，5·44(lH，m，H_7)，5.59(1Η,m,Η_8)，5·90(1Η，s,Η_4)；13C-WR(CDCL3,100MHz)δ:199.1(C-3)，161.9(C-5)，136.6(C-8)，128.4(C-7)，125.7(C-4),55.9(C-6),47.5(C-2),42.0(C-N(CH3)2)，36.1(C-1)，27.9(C-11)，27.1(C—12)，23.4(C—13)，18.1(C-IO)化合物2淡黄色油状物，FAB-MSm/z344[M+1]+，分子式C23H370N。1H-匪R(CDCL3,400MHz)δ:0.99(3Η,s,H-18)，0.88(3Η,s,H-19)，1.81(3H,d,J=7.5Hz,H_21)，6.46(1H,q,J=7.5Hz,H-20),2.31(6H,s,H-N(CH3)2)；13C-WR(CDCL3,100MHz)δ:206.0(C-16)，148.2(C-17)，128.0(C-20)，64.2(C-14)，54.2(C_9)，50.0(C-3)，46.6(C-5)，43.4(C-13)，41.4(C-N(CH3)2),37.9(C-15),37.3(C-12),36.4(C-I),35.9(C-IO),34.2(C-8)，32.6(C-2)，32.0(C-4)，28.7(C-7),24.3(C-6),20.9(C-Il)，17.4(C_21)，13.1(C-18)，12.3(C-19)。化合物3淡黄色油状物，FAB-MSm/z344[M+1]+，分子式C23H370N。1H-匪R(CDCL3,400MHz)δ:0.78(3H,s,H-18)，0.86(3H,s,H-19)，2.04(3H,d,J=7.OHz,Η-21)，5.66(1Η,q,J=7.OHz,H-20),2.30(6H,s,H-N(CH3)2)；13C-WR(CDCL3,100MHz)δ:208·4(C-16)，148.5(C-17)，129.9(C-20)，65.4(C-14)，54.2(C_9)，50.4(C-3)，45.7(C-5)，44.6(C-13)，41.6(C-N(CH3)2)，35.8(C-15)，38.3(C-12)，37.7(C-I)，36.1(C-10)，34.6(C-8)，30.7(C-2),32.3(C-4),28.9(C-7),24.3(C-6),20.7(C-Il)，19.4(C_21)，13.5(C-18)，12.4(C-19)。化合物4白色针晶，FAB-MSm/z414[M+1]+，分子式C27H43O2N。1H-WR(CDCL3,400MHz)δ:0.65(3Η,s,Η-18)，0·74(3H,s,H-19)，0·95(3H,d,J=6.8Hz,H-C4,-(CH3)2)，1.05(3H,d,J=6.4Hz,H-C4^-(CH3)2)；13C-NMR(CDCL3,100MHz)δ207.5(C-4),170.8(C-l，)，58.1(C-5)，58.0(C-3)，56.2(C_2，)，56.2(C-14)，54.6(C-17)，54.2(C-9)，42.5(C-13)，41.9(C_3，),41.8(C-10)，39.6(C-12)，36.4(C-I)，34.9(C-8)，30.2(C-7)，28.0(C-4，),27.5(C-16)，27.3(C-2)，27.3(C-20),24.0(C-15),21.6(C-6),20.3(C-Il)，19.9(C-C4,-(CH3)2)，13.8(C-19)，12.3(C-18)，10.2(C-21)。化合物5白色针晶，FAB-MSm/z457[M+1]+，分子式C29H48O2N2。1H-WR(O)CL3,400MHz)δ:0.65(3H,s,Η-18),0.75(3H,s,H-19),0.87(3H,d,J=6.4Hz,H-21)，0.95(3H,d,J=6.8Hz,H-C4,-(CH3)2)，1.05(3H,d,J=6.4Hz,H_C4’-(CH3)2)，2.18(6H,s,H-N(CH3)2)；13C-WR(CDCL3,100MHz)δ:207·4(C_4)，170.7(C_l，)，58.1(C_5)，58.0(C_3)，56.2(C-2，),56.2(C—14)，54.6(C—17)，54.2(C_9)，42.5(C—13)，41.9(C_3，),41.8(C-IO)，39.8(C-N(CH3)2),39.6(C-12),36.4(C-I),34.9(C-8),30.2(C-7),28.0(C_4，)，27.5(C-16),27.3(C-2),24.0(C-15),21.6(C-6),20.3(C_11)，19.9(C-C4,-(CH3)2)，13.8(C-19)，12.3(C—18)，9.3(C—21)。化合物6淡黄色油状物，FAB-MSm/z434[M+l]+，分子式C29H3902N。1H-NMR(CDCL3,400MHz)δ:0.65(3H,s,H-18),1.01(3H,s,H-19)，2.13(3H,s,H-COCH3)，3.38(3H,s,H-N(CH3))；13C-NMR(CDCL3,100MHz)δ209.7(C-20),170.O(C-CONCH3),152.5(C-2'),131.6(C-6，)，130.8(C-T)，127.7(C_3，)，123.3(C_4，)，120.9(C_5，),64.O(C-3)，63.7(C-17)，54.4(C_9)，44.2(C-13)，42.3(C_5)，39.6(C_4)，38.9(C-12)，35.5(C-I)，35.5(C-8)，35.O(C-IO)，32.1(C-2),31.7(C-7),31.5(C-COCH3)，29.5(C-CONCH3)，28.5(C-6),24.3(C-16),22.8(C-15),21.O(C-Il)，13.8(C-18)，11.5(C-19)。化合物7淡黄色油状物，FAB-MSm/z468[M+l]+，分子式C27H43O2N151H-NMR(O)CL3,400MHz)δ:0.61(3Η,s,Η-18),0.80(3Η,s,Η-19)，1.86/1.80(3Η,s,H-C3--(CH3)2)，2.13(3Η,s,H-C0CH3),3.04(3Η,s,H-N(CH3))；13C-NMR(CDCL3,100MHz)δ:209·7(C-20)，170.O(C-CONCH3)，144.4(C_3，)，120.2(C~2'),64.O(C-3),63.7(C-17),54.4(C-9)，44.2(C-13),41.5(C_5)，39.O(C-12)，35.6(C-I)，35.5(C-8)，35.2(C-IO),31.7(C_4)，31.7(C-7),31.5(C-COCH3),31.5(C-CONCH3),29.3(C-6),29.O(C-2),28.7(C-Il)，26.O(C-C3^-(CH3)2)，24.3(C-16)，22.7(C-15)，20.7(C_C3，-(CH3)2)，13.4(C-19)，12.5(C-18)。权利要求转筋草生物碱化合物用于制备抗肿瘤转移药物的用途，其中所述转筋草生物碱化合物结构为如下所示之一re-FSB00000165896200011.tif2.如权利要求1所述的用途，其中所述药物用于制备抗乳腺癌细胞转移的药物。3.转筋草类生物碱化合物，其结构如下所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>全文摘要本发明涉及一种抗肿瘤转移作用的转筋草生物碱化合物，包括9-dimethylamino-4，7-megastigmadien-3-one(1)，E-salignone(2)，Z-salignone(3)，3β-(3′α-isopropyl)-lactam-5α-pregn-4-one(4)，pachystermineA(5)，3-spiro-(3′-oxo-isoindole)-5α-pregn-20-one(6)，3β-(methylsenecioylamino)-5α-pregn-20-one(7)，具有很强的抗乳腺癌细胞趋化迁移的作用，可用于制备抗肿瘤转移药物。文档编号A61P35/04GK101822657SQ201010114809公开日2010年9月8日申请日期2010年2月26日优先权日2010年2月26日发明者唐生安,李晨阳,段宏泉,翟慧媛,靳美娜申请人:天津医科大学