重组Ⅱ型单纯疱疹病毒载体及其制备方法、重组病毒、药物组合物及应用的制作方法
专利名称：重组Ⅱ型单纯疱疹病毒载体及其制备方法、重组病毒、药物组合物及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及重组Ii型单纯疱疹病毒载体及其制备方法、包括该重组Ii型单纯疱 疹病毒载体的重组病毒、包括该重组II型单纯疱疹病毒载体药物组合物及所述重组II型 单纯疱疹病毒载体和重组病毒在制备治疗肿瘤的基因药物中的应用。
背景技术：
单纯疱疹病毒载体(Herps simplex virus,HSV)是一种长约IMkb的双链DNA病 毒，可在受染宿主细胞核中复制。HSV载体具有以下优点1)宿主细胞广泛；幻病毒滴度高； 3)外源基因容量大。HSV载体的缺点在于它的毒性。例如，ICP47蛋白影响与抗原处理相关的转运蛋白(TAP1和TAP2)的功能，阻碍MHC I分子的抗原表呈过程。所以剔除ICP47基因有利于增强免疫反应。另外，剔除ICP47基 因，使下游的USll基因表达增加，USll可对抗PKR对病毒生长繁殖的抑制。ICP34. 5为神 经毒因子，缺失了 ICP34. 5的病毒能选择性地杀伤肿瘤细胞，其机理为ICP34. 5能对抗I3KR 对翻译起始因子eIf-加的灭活，使病毒顺利繁殖。因此，失去了 ICP34. 5的病毒进入正常 细胞后，诱导干扰素/PKR通路活化，进而导致eIf-加失活，病毒蛋白不能合成、病毒繁殖受 阻。而大多数肿瘤细胞的干扰素/PKR信号通路受损。因此，失去了 ICP34.5的病毒可以在 肿瘤细胞内生长繁殖。以及ICP6基因编码核糖核苷酸还原酶，该酶为病毒DNA复制提供必 需的前体，在分裂细胞(如肿瘤细胞)中为非必需基因，剔除该基因可以增加病毒载体的载 量。现有的单纯疱疹病毒载体都是由野生型I型单纯疱疹病毒通过剔除以上基因获 得的。例如CN 1283803C公开了一种的减毒HSV-I基因治疗载体，该载体剔除了 ICP47、 ICP6和ICP34. 5三个基因。现有的由野生型I型单纯疱疹病毒制备的单纯疱疹病毒载体存 在生产周期长、溶瘤活性不足的问题；野生型II型单纯疱疹病毒是否能用做单纯疱疹病毒 载体，目前还没有报到。
发明内容
本发明的目的是克服现有的由野生型I型单纯疱疹病毒制备的单纯疱疹病毒载 体，生产周期长、溶瘤活性不足的缺点，提供一种生产周期短、溶瘤活性高的重组II型单纯 疱疹病毒载体。现有技术一般认为野生型II型单纯疱疹病毒(多寄生在生殖道内)比野生型I型 单纯疱疹病毒(多感染口腔及口周皮肤粘膜)安全性差，因此不选择野生型II型单纯疱疹 病毒制备单纯疱疹病毒载体。但是本发明的发明人发现，由野生型II型单纯疱疹病毒仅剔 除ICP47和ICP34. 5得到的重组II型单纯疱疹病毒载体，安全性好。此外，现有技术还认 为，ICP6基因在非分裂细胞(如正常细胞)中为必需基因，在分裂细胞中为非必需基因，因 此剔除ICP6可以增加病毒载体的载量和靶向分裂细胞的选择性。本发明的发明人发现实际上剔除ICP6以后使病毒的生长繁殖受到很大影响，溶瘤活性下降，并且很难生产出高滴 度的病毒；反而使保留ICP6的情况下，病毒生长繁殖好，容易生产出高滴度的病毒，并且减 少了剔除ICP6的步骤可以大大提高生产重组II型单纯疱疹病毒载体的效率，而且由于剔 除了 ICP34. 5，本发明重组II型单纯疱疹病毒载体的肿瘤选择性杀伤并未受到显著影响。本发明提供了一种重组II型单纯疱疹病毒载体，其中，所述载体剔除了野生II型 单纯疱疹病毒HG52株的ICP34. 5基因和ICP47基因。本发明提供了一种重组II型单纯疱疹病毒载体，其中，所述载体剔除了野生II型 单纯疱疹病毒HG52株的ICP34. 5基因和ICP47基因，并且所述载体在被剔除的ICP34. 5基 因的位置上插入了人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)表达盒。本发明还提供了一种重组II型单纯疱疹病毒载体的制备方法，其中，该方法包括 以下步骤(1)从野生型II型单纯疱疹病毒HG52株中剔除ICP47基因，构建HG52dICP47重 组II型单纯疱疹病毒a.提取II型单纯疱疹病毒HG52株的全长病毒DNA ；b.构建含有ICP47基因上游侧翼区序列和下游侧翼区序列的质粒pdICP47H2 bl.使用表1所示的引物，以步骤a得到的全长病毒DNA为模板，PCR扩增ICP47 基因上游侧翼区序列和下游侧翼区序列；表 权利要求
1.一种重组II型单纯疱疹病毒载体，其特征在于，所述载体剔除了野生II型单纯疱疹 病毒HG52株的ICP34. 5基因和ICP47基因。
2.根据权利要求1所述的重组II型单纯疱疹病毒载体，其中，所述载体在被剔除的 ICP34. 5基因的位置上插入了人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子表达盒。
3.—种重组II型单纯疱疹病毒载体的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤 (1)从野生型II型单纯疱疹病毒HG52株中剔除ICP47基因，构建HG52dICP47重组II型单纯疱疹病毒a.提取II型单纯疱疹病毒HG52株的全长病毒DNA；b.构建含有ICP47基因上游侧翼区序列和下游侧翼区序列的质粒pdICP47H2bl.使用表1所示的引物，以步骤a得到的全长病毒DNA为模板，PCR扩增ICP47基因 上游侧翼区序列和下游侧翼区序列； 表1
4.根据权利要求3所述的重组II型单纯疱疹病毒载体的制备方法，其特征在于，该方 法包括以下步骤(3)插入人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子表达盒，构建重组II型单纯疱疹病毒载体 HG52dICP47dICP34. 5-hGM-CSF i.提取步骤C5得到的重组II型单纯疱疹病毒载体HG52dICP47d34. 5的全长病毒DNA ； .将巨细胞病毒IE启动子控制的人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子表达盒插入到步 骤B3获得的pH2d34. 5质粒的EcoRV位点，得到pH2d34. 5-hGMCSF质粒；iii.将步骤i得到的重组II型单纯疱疹病毒载体HG52dICP47d34.5全长病毒DNA与 步骤ii得到的pH2d34. 5-hGMCSF质粒共转染BHK细胞，发生同源重组的病毒的毒斑表达人 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子；iv.挑选酶联免疫吸附测定阳性的毒斑，纯化出重组II型单纯疱疹病毒载体HG52dICP47dICP34. 5-hGM-CSF。
5.根据权利要求3所述的重组II型单纯疱疹病毒载体的制备方法，其特征在于，该方 法包括以下步骤I.提取步骤C2获得的重组II型单纯疱疹病毒HG52dICP47d34.5-GFP的全长病毒DNA ；II.将巨细胞病毒IE启动子控制的人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子表达盒插入到步 骤B3获得的pH2d34. 5质粒的EcoRV位点，得到pH2d34. 5-hGMCSF质粒；III.将步骤I得到的重组II型单纯疱疹病毒载体HG52dICP47d34.5-GFP全长病毒DNA 与步骤II得到的pH2d34. 5-hGMCSF质粒共转染BHK细胞，发生同源重组的病毒的毒斑表达 人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子但不发荧光；IV.挑选无荧光毒斑，纯化出重组II型单纯疱疹病毒载体 HG52dICP47dICP34. 5-hGM-CSF
6.根据权利要求3-5中任意一项所述的重组II型单纯疱疹病毒载体的制备方法，其特 征在于，所述方法还包括对所有涉及的质粒进行测序以证实无突变发生的步骤。
7.—种重组II型单纯疱疹病毒载体的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤 (1)从野生型II型单纯疱疹病毒HG52株中剔除ICP47基因，构建HG52dICP47重组II型单纯疱疹病毒a.提取II型单纯疱疹病毒HG52株的全长病毒DNA；b.构建含有ICP47基因上游侧翼区序列和下游侧翼区序列的质粒pdICP47H2bl.使用表1所示的引物，以步骤a得到的全长病毒DNA为模板，PCR扩增ICP47基因 上游侧翼区序列和下游侧翼区序列； 表1
8.根据权利要求7所述的重组II型单纯疱疹病毒载体的制备方法，其特征在于，所述 方法还包括对所有涉及的质粒进行测序以证实无突变发生的步骤。
9.一种重组II型单纯疱疹病毒载体，其特征在于，所述载体为由权利要求3-8中任意 一项所述的方法所制备的重组II型单纯疱疹病毒载体。
10.一种重组病毒，所述重组病毒包括作为载体的病毒和目的基因，其特征在于，所述 作为载体的病毒为权利要求1-2和9中任意一项所述的重组II型单纯疱疹病毒载体。
11.一种药物组合物，所述组合物包括权利要求1-2和9中任意一项所述的重组II型 单纯疱疹病毒载体和/或权利要求10所述的重组病毒，以及药物可接受的载体或赋形剂。
12.根据权利要求11所述的药物组合物，其中，所述药物组合物为注射液，所述注射液 包括药学上可接受的载体以及权利要求1-2和9中任意一项所述的重组II型单纯疱疹病 毒载体和/或权利要求10所述的重组病毒，每毫升所述注射液中含有IO2-IOki病毒噬斑形 成单位的所述病毒和/或重组病毒。
13.根据权利要求12所述的药物组合物，其中，所述药学上可接受的载体为PH值为 4. 0-9. 0的磷酸缓冲液。
14.根据权利要求12所述的药物组合物，其中，所述注射液还含有保护剂和/或渗透 压调节剂；以所述注射液为基准，所述保护剂的含量为0. 01-30重量％，所述保护剂选自 肌醇、山梨醇和蔗糖中的一种或几种；所述渗透压调节剂的含量使所述注射液的渗透压为 200-700毫渗摩尔/千克，所述渗透压调节剂为氯化钠和/或氯化钾。
15.根权利要求1-2和9中任意一项所述的重组II型单纯疱疹病毒载体和权利要求 10所述的重组病毒在制备治疗肿瘤的基因药物中的应用。
全文摘要
本发明提供一种重组Ⅱ型单纯疱疹病毒载体，其剔除了野生Ⅱ型单纯疱疹病毒HG52株的ICP34.5基因和ICP47基因，优选在被剔除的ICP34.5基因的位置上插入了hGM-CSF表达盒。本发明还提供了前述重组Ⅱ型单纯疱疹病毒载体的制备方法，以该重组Ⅱ型单纯疱疹病毒为载体的重组病毒，由该重组Ⅱ型单纯疱疹病毒载体和药物可接受的载体或赋形剂组成的药物组合物，以及所述的重组Ⅱ型单纯疱疹病毒载体在制备治疗肿瘤的基因药物中的应用。本发明提供的重组Ⅱ型单纯疱疹病毒载体，剔除了ICP34.5的基因，使溶瘤病毒更安全且能选择性地在肿瘤细胞内生长繁殖；剔除ICP47基因以促进免疫应答及增强溶瘤活性；疗效好于现有重组Ⅰ型单纯疱疹病毒载体且安全性高。
文档编号A61P35/00GK102146418SQ20101011627
公开日2011年8月10日 申请日期2010年2月9日 优先权日2010年2月9日
发明者刘滨磊 申请人:武汉滨会生物科技有限公司
技术领域：
本发明涉及重组Ii型单纯疱疹病毒载体及其制备方法、包括该重组Ii型单纯疱 疹病毒载体的重组病毒、包括该重组II型单纯疱疹病毒载体药物组合物及所述重组II型 单纯疱疹病毒载体和重组病毒在制备治疗肿瘤的基因药物中的应用。
背景技术：
单纯疱疹病毒载体(Herps simplex virus,HSV)是一种长约IMkb的双链DNA病 毒，可在受染宿主细胞核中复制。HSV载体具有以下优点1)宿主细胞广泛；幻病毒滴度高； 3)外源基因容量大。HSV载体的缺点在于它的毒性。例如，ICP47蛋白影响与抗原处理相关的转运蛋白(TAP1和TAP2)的功能，阻碍MHC I分子的抗原表呈过程。所以剔除ICP47基因有利于增强免疫反应。另外，剔除ICP47基 因，使下游的USll基因表达增加，USll可对抗PKR对病毒生长繁殖的抑制。ICP34. 5为神 经毒因子，缺失了 ICP34. 5的病毒能选择性地杀伤肿瘤细胞，其机理为ICP34. 5能对抗I3KR 对翻译起始因子eIf-加的灭活，使病毒顺利繁殖。因此，失去了 ICP34. 5的病毒进入正常 细胞后，诱导干扰素/PKR通路活化，进而导致eIf-加失活，病毒蛋白不能合成、病毒繁殖受 阻。而大多数肿瘤细胞的干扰素/PKR信号通路受损。因此，失去了 ICP34.5的病毒可以在 肿瘤细胞内生长繁殖。以及ICP6基因编码核糖核苷酸还原酶，该酶为病毒DNA复制提供必 需的前体，在分裂细胞(如肿瘤细胞)中为非必需基因，剔除该基因可以增加病毒载体的载 量。现有的单纯疱疹病毒载体都是由野生型I型单纯疱疹病毒通过剔除以上基因获 得的。例如CN 1283803C公开了一种的减毒HSV-I基因治疗载体，该载体剔除了 ICP47、 ICP6和ICP34. 5三个基因。现有的由野生型I型单纯疱疹病毒制备的单纯疱疹病毒载体存 在生产周期长、溶瘤活性不足的问题；野生型II型单纯疱疹病毒是否能用做单纯疱疹病毒 载体，目前还没有报到。
发明内容
本发明的目的是克服现有的由野生型I型单纯疱疹病毒制备的单纯疱疹病毒载 体，生产周期长、溶瘤活性不足的缺点，提供一种生产周期短、溶瘤活性高的重组II型单纯 疱疹病毒载体。现有技术一般认为野生型II型单纯疱疹病毒(多寄生在生殖道内)比野生型I型 单纯疱疹病毒(多感染口腔及口周皮肤粘膜)安全性差，因此不选择野生型II型单纯疱疹 病毒制备单纯疱疹病毒载体。但是本发明的发明人发现，由野生型II型单纯疱疹病毒仅剔 除ICP47和ICP34. 5得到的重组II型单纯疱疹病毒载体，安全性好。此外，现有技术还认 为，ICP6基因在非分裂细胞(如正常细胞)中为必需基因，在分裂细胞中为非必需基因，因 此剔除ICP6可以增加病毒载体的载量和靶向分裂细胞的选择性。本发明的发明人发现实际上剔除ICP6以后使病毒的生长繁殖受到很大影响，溶瘤活性下降，并且很难生产出高滴 度的病毒；反而使保留ICP6的情况下，病毒生长繁殖好，容易生产出高滴度的病毒，并且减 少了剔除ICP6的步骤可以大大提高生产重组II型单纯疱疹病毒载体的效率，而且由于剔 除了 ICP34. 5，本发明重组II型单纯疱疹病毒载体的肿瘤选择性杀伤并未受到显著影响。本发明提供了一种重组II型单纯疱疹病毒载体，其中，所述载体剔除了野生II型 单纯疱疹病毒HG52株的ICP34. 5基因和ICP47基因。本发明提供了一种重组II型单纯疱疹病毒载体，其中，所述载体剔除了野生II型 单纯疱疹病毒HG52株的ICP34. 5基因和ICP47基因，并且所述载体在被剔除的ICP34. 5基 因的位置上插入了人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)表达盒。本发明还提供了一种重组II型单纯疱疹病毒载体的制备方法，其中，该方法包括 以下步骤(1)从野生型II型单纯疱疹病毒HG52株中剔除ICP47基因，构建HG52dICP47重 组II型单纯疱疹病毒a.提取II型单纯疱疹病毒HG52株的全长病毒DNA ；b.构建含有ICP47基因上游侧翼区序列和下游侧翼区序列的质粒pdICP47H2 bl.使用表1所示的引物，以步骤a得到的全长病毒DNA为模板，PCR扩增ICP47 基因上游侧翼区序列和下游侧翼区序列；表 权利要求
1.一种重组II型单纯疱疹病毒载体，其特征在于，所述载体剔除了野生II型单纯疱疹 病毒HG52株的ICP34. 5基因和ICP47基因。
2.根据权利要求1所述的重组II型单纯疱疹病毒载体，其中，所述载体在被剔除的 ICP34. 5基因的位置上插入了人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子表达盒。
3.—种重组II型单纯疱疹病毒载体的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤 (1)从野生型II型单纯疱疹病毒HG52株中剔除ICP47基因，构建HG52dICP47重组II型单纯疱疹病毒a.提取II型单纯疱疹病毒HG52株的全长病毒DNA；b.构建含有ICP47基因上游侧翼区序列和下游侧翼区序列的质粒pdICP47H2bl.使用表1所示的引物，以步骤a得到的全长病毒DNA为模板，PCR扩增ICP47基因 上游侧翼区序列和下游侧翼区序列； 表1
4.根据权利要求3所述的重组II型单纯疱疹病毒载体的制备方法，其特征在于，该方 法包括以下步骤(3)插入人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子表达盒，构建重组II型单纯疱疹病毒载体 HG52dICP47dICP34. 5-hGM-CSF i.提取步骤C5得到的重组II型单纯疱疹病毒载体HG52dICP47d34. 5的全长病毒DNA ； .将巨细胞病毒IE启动子控制的人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子表达盒插入到步 骤B3获得的pH2d34. 5质粒的EcoRV位点，得到pH2d34. 5-hGMCSF质粒；iii.将步骤i得到的重组II型单纯疱疹病毒载体HG52dICP47d34.5全长病毒DNA与 步骤ii得到的pH2d34. 5-hGMCSF质粒共转染BHK细胞，发生同源重组的病毒的毒斑表达人 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子；iv.挑选酶联免疫吸附测定阳性的毒斑，纯化出重组II型单纯疱疹病毒载体HG52dICP47dICP34. 5-hGM-CSF。
5.根据权利要求3所述的重组II型单纯疱疹病毒载体的制备方法，其特征在于，该方 法包括以下步骤I.提取步骤C2获得的重组II型单纯疱疹病毒HG52dICP47d34.5-GFP的全长病毒DNA ；II.将巨细胞病毒IE启动子控制的人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子表达盒插入到步 骤B3获得的pH2d34. 5质粒的EcoRV位点，得到pH2d34. 5-hGMCSF质粒；III.将步骤I得到的重组II型单纯疱疹病毒载体HG52dICP47d34.5-GFP全长病毒DNA 与步骤II得到的pH2d34. 5-hGMCSF质粒共转染BHK细胞，发生同源重组的病毒的毒斑表达 人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子但不发荧光；IV.挑选无荧光毒斑，纯化出重组II型单纯疱疹病毒载体 HG52dICP47dICP34. 5-hGM-CSF
6.根据权利要求3-5中任意一项所述的重组II型单纯疱疹病毒载体的制备方法，其特 征在于，所述方法还包括对所有涉及的质粒进行测序以证实无突变发生的步骤。
7.—种重组II型单纯疱疹病毒载体的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤 (1)从野生型II型单纯疱疹病毒HG52株中剔除ICP47基因，构建HG52dICP47重组II型单纯疱疹病毒a.提取II型单纯疱疹病毒HG52株的全长病毒DNA；b.构建含有ICP47基因上游侧翼区序列和下游侧翼区序列的质粒pdICP47H2bl.使用表1所示的引物，以步骤a得到的全长病毒DNA为模板，PCR扩增ICP47基因 上游侧翼区序列和下游侧翼区序列； 表1
8.根据权利要求7所述的重组II型单纯疱疹病毒载体的制备方法，其特征在于，所述 方法还包括对所有涉及的质粒进行测序以证实无突变发生的步骤。
9.一种重组II型单纯疱疹病毒载体，其特征在于，所述载体为由权利要求3-8中任意 一项所述的方法所制备的重组II型单纯疱疹病毒载体。
10.一种重组病毒，所述重组病毒包括作为载体的病毒和目的基因，其特征在于，所述 作为载体的病毒为权利要求1-2和9中任意一项所述的重组II型单纯疱疹病毒载体。
11.一种药物组合物，所述组合物包括权利要求1-2和9中任意一项所述的重组II型 单纯疱疹病毒载体和/或权利要求10所述的重组病毒，以及药物可接受的载体或赋形剂。
12.根据权利要求11所述的药物组合物，其中，所述药物组合物为注射液，所述注射液 包括药学上可接受的载体以及权利要求1-2和9中任意一项所述的重组II型单纯疱疹病 毒载体和/或权利要求10所述的重组病毒，每毫升所述注射液中含有IO2-IOki病毒噬斑形 成单位的所述病毒和/或重组病毒。
13.根据权利要求12所述的药物组合物，其中，所述药学上可接受的载体为PH值为 4. 0-9. 0的磷酸缓冲液。
14.根据权利要求12所述的药物组合物，其中，所述注射液还含有保护剂和/或渗透 压调节剂；以所述注射液为基准，所述保护剂的含量为0. 01-30重量％，所述保护剂选自 肌醇、山梨醇和蔗糖中的一种或几种；所述渗透压调节剂的含量使所述注射液的渗透压为 200-700毫渗摩尔/千克，所述渗透压调节剂为氯化钠和/或氯化钾。
15.根权利要求1-2和9中任意一项所述的重组II型单纯疱疹病毒载体和权利要求 10所述的重组病毒在制备治疗肿瘤的基因药物中的应用。
全文摘要
本发明提供一种重组Ⅱ型单纯疱疹病毒载体，其剔除了野生Ⅱ型单纯疱疹病毒HG52株的ICP34.5基因和ICP47基因，优选在被剔除的ICP34.5基因的位置上插入了hGM-CSF表达盒。本发明还提供了前述重组Ⅱ型单纯疱疹病毒载体的制备方法，以该重组Ⅱ型单纯疱疹病毒为载体的重组病毒，由该重组Ⅱ型单纯疱疹病毒载体和药物可接受的载体或赋形剂组成的药物组合物，以及所述的重组Ⅱ型单纯疱疹病毒载体在制备治疗肿瘤的基因药物中的应用。本发明提供的重组Ⅱ型单纯疱疹病毒载体，剔除了ICP34.5的基因，使溶瘤病毒更安全且能选择性地在肿瘤细胞内生长繁殖；剔除ICP47基因以促进免疫应答及增强溶瘤活性；疗效好于现有重组Ⅰ型单纯疱疹病毒载体且安全性高。
文档编号A61P35/00GK102146418SQ20101011627
公开日2011年8月10日 申请日期2010年2月9日 优先权日2010年2月9日
发明者刘滨磊 申请人:武汉滨会生物科技有限公司
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