一种长效生长激素的制作方法
专利名称：一种长效生长激素的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种聚乙二醇修饰的蛋白质药物。具体为双端活化的聚乙二醇修饰生长激素。
背景技术：
人生长激素(hGH)是二十世纪20年代发现的由人垂体前叶嗜酸细胞分泌的重要激素，是由191个氨基酸残基组成的单链、非糖化亲水性蛋白，在第53-165和第182-189氨基酸之间各有一个二硫键连接，相对分子质量约为21700道尔顿，pI4. 9-5. 2。用糜蛋白酶或胰蛋白酶处理生长激素使其部分水解，活性并不丧失，可见生长激素的活性并不需要整个分子。实验证实，人生长激素N-端的1 134氨基酸段肽链为活性所必需，C-端的一段肽链可能起保护作用，使生长激素在血循环中不致被酶破坏。人生长激素分子相当稳定，其活性在冰冻条件下可保持数年，在室温放置4 无变化。不同种属的哺乳动物的生长激素之间有明显的种属特异性，只有灵长类的生长激素对人有活性。hGH的作用机理一般认为是通过cAMP进行的，在与靶细胞结合后能改变氨基酸及代谢产物的运转，诱导某些特异性蛋白质和核酸的合成。1、人生长激素的促生长作用人生长激素最明显的作用是促进骨、软骨和组织的生长。它能刺激蛋白质和胶原的合成，促进组织对循环系统中氨基酸的摄取和利用。人在幼年与成年时hGH的水平并无多大的差异(血清或血浆中检测的常规参考值为成年男性< 2μ g/L ；成年女性< 10 μ g/ L ；儿童< 20 μ g/L)，但在人生长发育的幼年期时，机体组织对hGH更为敏感，hGH对骨的促生长作用取决于骺软骨在成长中的状况。人在幼年和育成期时GH对四肢长骨生长有促进作用，故出生后至性成熟期先是身高增长加快，随后主要促进躯干和脊柱的生长；此时体长的生长较为迅速，至成年时四肢和脊柱的生长已基本结束。hGH对维持骨的延长虽属必要， 但并非起直接作用。它是通过血中SM或称硫酸化因子(Sulfationfactor)来实现。这是一种肽类激素，分子量4000Da，能促进S042_、H-胸苷、H-尿苷和C-亮氨酸进入软骨，增加胶原组织和蛋白质合成，促进软骨细胞、肝、肌肉和纤维母细胞的分裂。SM-C及其运载蛋白的含量受hGH调控。2、hGH促进蛋白质合成hGH能促进氨基酸进入细胞，加速蛋白质的合成，减少尿素、肌酸和氮的排出，促使体内保持氮的动态平衡。在蛋白质的合成过程中，hGH可加强tRNA合成，促进氨基酸的摄取，嘌呤霉素不能阻断此效应，提示hGH不是促进细胞内形成某种新蛋白质而是加强氨基酸的运转。胰岛素能促进氨基酸进入细胞，但要在hGH存在时有此效应。3、hGH对脂肪和糖代谢的影响hGH能促使动物的脂肪分解，抑制葡萄糖氧化，减少葡萄糖的消耗、hGH对糖代谢作用较复杂。生理水平的hGH可刺激胰岛素B细胞，引起胰岛素分泌，加强葡萄糖的利用， 过量的hGH则抑制葡萄糖的利用。
人生长激素提取并试用于儿童侏儒症始于1958年。后经不断改进产品纯度和进行临床试验，在确认临床有效后自1975年起逐步在各国正式获准临床应用。由于提取的人生长激素来于死人脑垂体，临床用量难以保证，因此人们开始尝试用化学合成和基因重组方法生产人生长激素。其中前法效率甚低，无实用价值。后法却在美国Genentech公司等的努力下于1981年实现了工业化。Genentech公司生产的基因重组人生长激素商品名为Somatrem，在临床试验中被证明与提取的人生长激素生理活性完全相同。美国Li 1 Iy公司和丹麦Novo Nordisk公司等也相继开发成功了重组人生长激素。人生长激素的工业化生产现均已采用基因重组技术， 其一般方法是化学合成人生长激素的DNA片段，再用分子克隆技术扩增、克隆，获得人生长激素的完整基因，通过质粒转入大肠杆菌，经培养、发酵及后处理即得到目的蛋白纯品。但溶解度低、稳定性差、半衰期短、存在免疫原性等缺陷限制其给药途径和药效的发挥。目前PEG修饰技术日趋成熟，修饰后的蛋白其溶解性和稳定性增加，耐酶水解的能力增强，免疫原性减弱甚至消除，半衰期延长，增加药物的治疗指数，扩大临床使用，生物利用度提高，毒副作用减小，热稳定性和机械稳定性增加。基于此，利用我公司比较成熟的PEG 修饰技术平台对重组人生长激素进行修饰。
发明内容
本发明的目的在于提供一种聚乙二醇修饰的双价重组人生长激素，该修饰产物不仅延长了重组人生激素的半衰期，提高了稳定性，降低了免疫原性，而且降低了该药物的给药次数和给药剂量，一次给药比需每天注射多次给药具有高强的促进动物机体生长的生物活性和长效的药理作用。本发明通过对PEG双端活化，形成一种新的修饰剂ALD-PEG-ALD，方法参考文 献 J. MiltonHarris, Evelyn C.Struck. Synthesis and Characterrization of Poly (ethylene Glycol) Derivatives，采用该新型修饰剂对重组人生长激素进行修饰，获得一种双价蛋白质修饰药物GH-PEG-GH，其活性是GH的1. 7倍。
具体实施例方式实施例1双端活化聚乙二醇获得ALD-PEG-ALD以分子量为20000道尔顿药用级聚乙二醇为底物，加入草酰氯，DMSO在-60°C 到-70°C反应，反应结束后用三乙胺淬灭，二氯甲烷萃取，饱和的氯化钠洗，浓缩至干，加乙醚析出固体抽滤干燥生成双端活化的聚乙二醇ALD-PEG-ALD。实施例2重组人生长激素的纯化配制20mM ρΗ8· OTris-HCl,缓冲液Α,按菌体抽提缓冲液(g/ml)为1 20超声破碎，超声按工作Is间歇Is全程时间40min，1200-1600W，30°C过热保护，破碎后按 4900rpm*35min离心，收集沉淀，洗涤包涵体。将包涵体溶于8M尿素，20mM Tris-HCl中，PH9. 0，在室温下搅拌变性1小时，离心去除不溶物，上清用4倍体积的10%甘油，20mMTris-HCl PH8. 0稀释，4°C过夜，用Q柱纯化， GH单体和二聚体可用250mM NaCl洗脱，进一步用S-200可将二聚体和单体分离，单体可用于修饰反应。
实施例3修饰反应GH纯品浓度调节至5.0mg/ml，加入20mM氢硼氰化钠，充分溶解，按摩尔比 GH ALD-PEG-ALD = 1 1，1 5，1 10加入 ALD-PEG_ALD，4°C反应4hr，以确定两种试剂的最佳比例。用非还原电泳检测，结果发现主要为双修饰产物，扫描分析修饰率达到30%。 利用S-300分子筛层析将修饰物GH-PEG-GH与其他多修饰分子及未修饰的GH分离，目标物质可用非还原电泳检测，分离后纯品冻干保存。实施例4全身过敏反应检验豚鼠60只，雌雄各半，体重250_300g，均分为三组，将GH与GH-PEG-GH按人用剂量的三倍腹腔给药，隔日一次，给药三次，使其致敏，将GH与GH-PEG-GH按人用剂量的六倍与致敏后的第14天，21天分别于豚鼠小腿胫静脉注射激发，30min内观察并记录结果。表1豚鼠全身过敏试验级数判断标准
权利要求
1.一种聚乙二醇修饰的生长激素，其特征在于该聚乙二醇化生长激素是以聚乙二醇为连接物的两个生长激素分子的串联体。
2.权利要求1所述的聚乙二醇修饰的生长激素，其特征在于生长激素可以来源于动物，也可以是基因重组人源生长激素，优选基因重组人源生长激素。
3.权利要求1-2所述的聚乙二醇修饰的生长激素，其特征在于所用的聚乙二醇双端均经过活化，并且都能与生长激素共价交联。
4.权利要求1-3所述的聚乙二醇修饰的生长激素，其特征在于聚乙二醇两端被活化成醛或酮结构，优选为醛结构。
5.权利要求1-4所述的聚乙二醇修饰的生长激素，其特征在于所用聚乙二醇分子量从200-200000道尔顿，优选2000-10000道尔顿，更优选为2000道尔顿。
全文摘要
本发明公开了一种聚乙二醇修饰的双价生长激素，旨在提供一种免疫原性低、活性高、半衰期长、给药次数少、稳定的蛋白质药物，主要用于治疗生长迟缓性疾病。其中的聚乙二醇双端活化，通过与蛋白质的游离氨基连接将两个生长激素分子连接成一个双价的柔性分子。
文档编号A61P43/00GK102190721SQ201010117330
公开日2011年9月21日 申请日期2010年3月3日 优先权日2010年3月3日
发明者吴彦卓, 徐明波, 杨仲璠, 王俊玲 申请人:北京双鹭立生医药科技有限公司, 北京双鹭药业股份有限公司
技术领域：
本发明涉及一种聚乙二醇修饰的蛋白质药物。具体为双端活化的聚乙二醇修饰生长激素。
背景技术：
人生长激素(hGH)是二十世纪20年代发现的由人垂体前叶嗜酸细胞分泌的重要激素，是由191个氨基酸残基组成的单链、非糖化亲水性蛋白，在第53-165和第182-189氨基酸之间各有一个二硫键连接，相对分子质量约为21700道尔顿，pI4. 9-5. 2。用糜蛋白酶或胰蛋白酶处理生长激素使其部分水解，活性并不丧失，可见生长激素的活性并不需要整个分子。实验证实，人生长激素N-端的1 134氨基酸段肽链为活性所必需，C-端的一段肽链可能起保护作用，使生长激素在血循环中不致被酶破坏。人生长激素分子相当稳定，其活性在冰冻条件下可保持数年，在室温放置4 无变化。不同种属的哺乳动物的生长激素之间有明显的种属特异性，只有灵长类的生长激素对人有活性。hGH的作用机理一般认为是通过cAMP进行的，在与靶细胞结合后能改变氨基酸及代谢产物的运转，诱导某些特异性蛋白质和核酸的合成。1、人生长激素的促生长作用人生长激素最明显的作用是促进骨、软骨和组织的生长。它能刺激蛋白质和胶原的合成，促进组织对循环系统中氨基酸的摄取和利用。人在幼年与成年时hGH的水平并无多大的差异(血清或血浆中检测的常规参考值为成年男性< 2μ g/L ；成年女性< 10 μ g/ L ；儿童< 20 μ g/L)，但在人生长发育的幼年期时，机体组织对hGH更为敏感，hGH对骨的促生长作用取决于骺软骨在成长中的状况。人在幼年和育成期时GH对四肢长骨生长有促进作用，故出生后至性成熟期先是身高增长加快，随后主要促进躯干和脊柱的生长；此时体长的生长较为迅速，至成年时四肢和脊柱的生长已基本结束。hGH对维持骨的延长虽属必要， 但并非起直接作用。它是通过血中SM或称硫酸化因子(Sulfationfactor)来实现。这是一种肽类激素，分子量4000Da，能促进S042_、H-胸苷、H-尿苷和C-亮氨酸进入软骨，增加胶原组织和蛋白质合成，促进软骨细胞、肝、肌肉和纤维母细胞的分裂。SM-C及其运载蛋白的含量受hGH调控。2、hGH促进蛋白质合成hGH能促进氨基酸进入细胞，加速蛋白质的合成，减少尿素、肌酸和氮的排出，促使体内保持氮的动态平衡。在蛋白质的合成过程中，hGH可加强tRNA合成，促进氨基酸的摄取，嘌呤霉素不能阻断此效应，提示hGH不是促进细胞内形成某种新蛋白质而是加强氨基酸的运转。胰岛素能促进氨基酸进入细胞，但要在hGH存在时有此效应。3、hGH对脂肪和糖代谢的影响hGH能促使动物的脂肪分解，抑制葡萄糖氧化，减少葡萄糖的消耗、hGH对糖代谢作用较复杂。生理水平的hGH可刺激胰岛素B细胞，引起胰岛素分泌，加强葡萄糖的利用， 过量的hGH则抑制葡萄糖的利用。
人生长激素提取并试用于儿童侏儒症始于1958年。后经不断改进产品纯度和进行临床试验，在确认临床有效后自1975年起逐步在各国正式获准临床应用。由于提取的人生长激素来于死人脑垂体，临床用量难以保证，因此人们开始尝试用化学合成和基因重组方法生产人生长激素。其中前法效率甚低，无实用价值。后法却在美国Genentech公司等的努力下于1981年实现了工业化。Genentech公司生产的基因重组人生长激素商品名为Somatrem，在临床试验中被证明与提取的人生长激素生理活性完全相同。美国Li 1 Iy公司和丹麦Novo Nordisk公司等也相继开发成功了重组人生长激素。人生长激素的工业化生产现均已采用基因重组技术， 其一般方法是化学合成人生长激素的DNA片段，再用分子克隆技术扩增、克隆，获得人生长激素的完整基因，通过质粒转入大肠杆菌，经培养、发酵及后处理即得到目的蛋白纯品。但溶解度低、稳定性差、半衰期短、存在免疫原性等缺陷限制其给药途径和药效的发挥。目前PEG修饰技术日趋成熟，修饰后的蛋白其溶解性和稳定性增加，耐酶水解的能力增强，免疫原性减弱甚至消除，半衰期延长，增加药物的治疗指数，扩大临床使用，生物利用度提高，毒副作用减小，热稳定性和机械稳定性增加。基于此，利用我公司比较成熟的PEG 修饰技术平台对重组人生长激素进行修饰。
发明内容
本发明的目的在于提供一种聚乙二醇修饰的双价重组人生长激素，该修饰产物不仅延长了重组人生激素的半衰期，提高了稳定性，降低了免疫原性，而且降低了该药物的给药次数和给药剂量，一次给药比需每天注射多次给药具有高强的促进动物机体生长的生物活性和长效的药理作用。本发明通过对PEG双端活化，形成一种新的修饰剂ALD-PEG-ALD，方法参考文 献 J. MiltonHarris, Evelyn C.Struck. Synthesis and Characterrization of Poly (ethylene Glycol) Derivatives，采用该新型修饰剂对重组人生长激素进行修饰，获得一种双价蛋白质修饰药物GH-PEG-GH，其活性是GH的1. 7倍。
具体实施例方式实施例1双端活化聚乙二醇获得ALD-PEG-ALD以分子量为20000道尔顿药用级聚乙二醇为底物，加入草酰氯，DMSO在-60°C 到-70°C反应，反应结束后用三乙胺淬灭，二氯甲烷萃取，饱和的氯化钠洗，浓缩至干，加乙醚析出固体抽滤干燥生成双端活化的聚乙二醇ALD-PEG-ALD。实施例2重组人生长激素的纯化配制20mM ρΗ8· OTris-HCl,缓冲液Α,按菌体抽提缓冲液(g/ml)为1 20超声破碎，超声按工作Is间歇Is全程时间40min，1200-1600W，30°C过热保护，破碎后按 4900rpm*35min离心，收集沉淀，洗涤包涵体。将包涵体溶于8M尿素，20mM Tris-HCl中，PH9. 0，在室温下搅拌变性1小时，离心去除不溶物，上清用4倍体积的10%甘油，20mMTris-HCl PH8. 0稀释，4°C过夜，用Q柱纯化， GH单体和二聚体可用250mM NaCl洗脱，进一步用S-200可将二聚体和单体分离，单体可用于修饰反应。
实施例3修饰反应GH纯品浓度调节至5.0mg/ml，加入20mM氢硼氰化钠，充分溶解，按摩尔比 GH ALD-PEG-ALD = 1 1，1 5，1 10加入 ALD-PEG_ALD，4°C反应4hr，以确定两种试剂的最佳比例。用非还原电泳检测，结果发现主要为双修饰产物，扫描分析修饰率达到30%。 利用S-300分子筛层析将修饰物GH-PEG-GH与其他多修饰分子及未修饰的GH分离，目标物质可用非还原电泳检测，分离后纯品冻干保存。实施例4全身过敏反应检验豚鼠60只，雌雄各半，体重250_300g，均分为三组，将GH与GH-PEG-GH按人用剂量的三倍腹腔给药，隔日一次，给药三次，使其致敏，将GH与GH-PEG-GH按人用剂量的六倍与致敏后的第14天，21天分别于豚鼠小腿胫静脉注射激发，30min内观察并记录结果。表1豚鼠全身过敏试验级数判断标准
权利要求
1.一种聚乙二醇修饰的生长激素，其特征在于该聚乙二醇化生长激素是以聚乙二醇为连接物的两个生长激素分子的串联体。
2.权利要求1所述的聚乙二醇修饰的生长激素，其特征在于生长激素可以来源于动物，也可以是基因重组人源生长激素，优选基因重组人源生长激素。
3.权利要求1-2所述的聚乙二醇修饰的生长激素，其特征在于所用的聚乙二醇双端均经过活化，并且都能与生长激素共价交联。
4.权利要求1-3所述的聚乙二醇修饰的生长激素，其特征在于聚乙二醇两端被活化成醛或酮结构，优选为醛结构。
5.权利要求1-4所述的聚乙二醇修饰的生长激素，其特征在于所用聚乙二醇分子量从200-200000道尔顿，优选2000-10000道尔顿，更优选为2000道尔顿。
全文摘要
本发明公开了一种聚乙二醇修饰的双价生长激素，旨在提供一种免疫原性低、活性高、半衰期长、给药次数少、稳定的蛋白质药物，主要用于治疗生长迟缓性疾病。其中的聚乙二醇双端活化，通过与蛋白质的游离氨基连接将两个生长激素分子连接成一个双价的柔性分子。
文档编号A61P43/00GK102190721SQ201010117330
公开日2011年9月21日 申请日期2010年3月3日 优先权日2010年3月3日
发明者吴彦卓, 徐明波, 杨仲璠, 王俊玲 申请人:北京双鹭立生医药科技有限公司, 北京双鹭药业股份有限公司
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