一种含多硫键的哌嗪类化合物及其制备方法和用途的制作方法

专利名称：：一种含多硫键的哌嗪类化合物及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及用OidiodendrontruncatumGW3-13(保藏编号是CCTCCM2010043)生产含多硫键的哌嗪类化合物(ETPs)的方法；本发明还涉及该类化合物在制备细胞增殖抑制剂或缺氧诱导因子(HIF-I)靶向抗肿瘤剂中的用途。
背景技术：
：本发明人曾经从OidiodendrontruncatumGW3-13(保藏编号是CCTCCM2010043)液体发酵产物中发现具有明显抗肿瘤活性的含多硫键的哌嗪类化合物。研究发现所示含多硫键的哌嗪类化合物具有细胞增殖抑制活性、细胞毒活性及缺氧诱导因子(HIF-I)抑制活性，但是市场上尚未见有与此有关的药物。
发明内容本发明旨在提供一种结构独特的具有抑制肿瘤细胞增殖作用，具有抗肿瘤活性的化合物。其结构式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>式I其结构特征是含多硫键的二酮哌嗪二聚体，其中χ=2或3。本发明优选的式I化合物其中χ=3。本发明的式I化合物可通过微生物发酵培养来获取含有含多硫键的哌嗪类化合物的发酵物，然后从发酵物中采用硅胶柱层析、制备HPLC等方法分离纯化得到。本发明的下述实施例中列举了利用OidiodendrontruncatumGW3_13(保藏编号是CCTCCM2010043)制备本发明式I化合物的实例。具体实施例方式在如下的实施例中所指的化合物I的化学结构<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>化合物I实施例1化合物I的发酵生产及分离精制1发酵生产生产菌的发酵培养按培养微生物的常规方法，取OidiodendrontruncatumGW3-13(保藏编号是CCTCCM2010043)适量，接种到PDA固体斜面培养基上，在15摄氏度培养箱中培养10天。用接种针刮取适量孢子接种到接入装有300ml培养基[山梨醇2%、麦芽糖2%、味精1%、KH2P040.05%,MgSO40.03%、色氨酸0.05%、酵母浸膏0.1%、黄豆粉0.05%、味精0.2%]的IOOOml发酵三角瓶中，20°C左右静置培养约30天，获得菌丝体和发酵液。2浸膏的获得用棉布将菌丝体和发酵液分离。将菌丝体用丙酮浸提三次，减压浓缩至不含丙酮，所得水层用等体积乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯萃取液减压浓缩，得粗浸膏。发酵液减压浓缩为四分之一体积后，用乙酸乙酯萃取三次，合并菌丝体和发酵液的浸膏，共35.0克。3化合物的分离精制浸膏(35.0克)用氯仿-甲醇混合溶剂溶解后，加300克200-300目硅胶(青岛海洋化工集团公司产品)拌样，减压除去溶剂后，用硅胶柱层析，以石油醚、石油醚-氯仿，氯仿-甲醇为溶剂进行梯度洗脱，分为7个组份。Fr-4(氯仿-甲醇191洗脱物)，再经加压硅胶柱层析以氯仿甲醇(501)为溶剂进行洗脱，半制备反相高效液相色谱分离得化合物I(300mg)。化合物I白色无定形粉末，分子式C3tlH28N6O8S5。1H和13C-NMR数据见表1。表1化合物I的1H和13CNMR数据(400和IOOMHz，inCDCl3)a<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>a)本表信号归属基于DEPT、HMQC及HMBC图谱解析结果。碳信号的多重度利用DEPT方法确定并分别用s(单重峰)、d(二重峰)、t(三重峰)和q(四重峰)表不。b)此栏中的数字和代号分别代表在HMBC谱中与相应行中的1H给出偶合相关信号的13C核。实施例2体外抗肿瘤活性的测试细胞增殖抑制活性测试1实验样品及实验方法被测样品溶液的配制测试样品为上述实施例1中分离精制的化合物I纯品。精密称取适量样品，用甲醇配制成所需浓度的溶液，供测活性。细胞系及细胞的继代培养采用人肺癌A549细胞、人肝癌BEL-7402细胞、人白血病HL60细胞及小鼠白血病P388细胞等癌细胞系。各种细胞均用含10%FBS的RPMI-1640培养基，在32°C(P388细胞)或在37°C(A549、HL60及BEL-7402细胞)于通入5%二氧化碳的培养箱中继代培养。细胞增殖抑制活性测试方法丽丝胺罗丹明B(SRB)法取对数生长期的人肺癌A549细胞、人肝癌BEL-7402细胞，用新鲜的RPMI-1640培养基配制成密度为每毫升2XIO5个细胞的细胞悬液，按每孔200微升接种于96孔板中，每孔加入2微升不同浓度的样品或空白溶液，37°C下培养24小时。取药物作用下培养后的细胞，首先在光学显微镜下观察药物处理引起的形态学变化，判断有无细胞周期抑制，细胞凋亡或细胞坏死的形态学特征，继而在4°C、3000转/分钟离心3分钟，吸去上清。每孔细胞中加入20%三氯醋酸50微升，置于4°C固定1小时，用水冲洗5次并空气干燥。每孔加入0.4%SRB的醋酸溶液50微升并在室温静置30分钟。用醋酸水清洗4次，除去未结合的游离SRB染料。每孔加入150微升Tris缓冲液(10mmOl/L，pH10.5)溶解蛋白结合染料并利用MD公司产SPECTRAMAXPlus型酶标仪测定每孔在520nm处的光密度(OD)值。在同一块96孔板中样品的每个浓度均设置三孔，另设三孔空白对照和无细胞调零孔(如果药物有颜色要做相应药物浓度无细胞调零)。各孔OD值先做相应无细胞调零，再取三孔平均OD值按=(ODfi自对照-OD样/ODfi自对照X100%式计算每个浓度下的细胞增殖抑制率(IR%)。四氮唑盐(MTT)法取对数生长期的人白血病HL60细胞和小鼠白血病P388细胞，将细胞密度调至每毫升2XIO5个细胞，按每孔200微升接种于96孔细胞培养板中，于37°C通入5%CO2的培养箱中培养4小时。每孔加样品液或空白液各2微升，培养24小时后，每孔加MTT液(MTT的每毫升5毫克生理盐水溶液)10微升，继续培养4小时，372000转/分钟离心8分钟，吸去上清。每孔加入DMSO各100微升，在微量振荡器上振荡15分钟，至结晶完全溶解后，利用MD公司产SPECTRAMAXPlus型酶标仪测定每孔在570nm处的吸光值(0D值)。在同一块96孔板中样品的每个浓度均设置三孔，另设三孔空白对照和无细胞调零孔(如果药物有颜色要做相应药物浓度无细胞调零)。各孔OD值先做相应无细胞调零，再取三孔平均OD值按=(0D^swm-OD/OD空白对照XlOO%式计算每个浓度下的细胞增殖抑制率(IR%)。2实验结果细胞增殖抑制活性测试结果在SRB法或MTT法测试中，不同浓度的化合物I对人肺癌A549细胞、人肝癌BEL-7402细胞、人白血病HL60细胞的增殖抑制结果见表2。表2不同浓度的化合物I对癌细胞增殖的抑制率(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>3结论化合物I具有较明显的肿瘤细胞增殖抑制作用，可作为细胞增殖抑制剂或抗肿瘤剂用于抗肿瘤的研究。实施例3体外缺氧诱导因子-1(HIF-I)抑制活性测试1实验样品及实验方法被测样品溶液的配制测试样品为上述实施例1中分离精制的化合物I纯品。精密称取适量样品，用DMSO配制成所需浓度的溶液，供测活性。细胞系及细胞的继代培养采用人乳腺癌T47D细胞系。细胞用含10%FBS和L-谷氨酰胺的DMEM/F-12培养基，并加入50U/ml青霉素和50μg/ml链霉素，于通入5%二氧化碳的培养箱中37°C继代培养。缺氧诱导因子HIF-I抑制活性测试方法人乳腺癌T47D细胞，用pTK-HRE3-lucreporter转染后培养至对数生长期，用新鲜的含10%FBS和抗生素的DMEM/F-12培养基配制成密度为每毫升4.5XIO5个细胞的细胞悬液，按每100微升接种于96孔板中，37°C培养24h。不同浓度的样品用含抗生素的DMEM/F-12培养基稀释后，每孔加入100微升继续培养30min。然后细胞在自然缺氧条件(1%02/5%C02/94%N2)或化学诱导缺氧条件(10μM1，10-phenanthroline诱导)下培养，以正常氧条件(5%C02/95%air)为对照，16h后溶解细胞，以微孔板闪烁计数仪检测荧光素酶活性。抑制率由以下公式计算得到IR%=(1-lightoutputtreated/lightoutputinduced)X100%2实验结果在HIF-I抑制活性测试中，不同浓度的化合物I对人乳腺癌T47D细胞的HIF-I抑制结果见表3。表3不同浓度的化合物I对T47D细胞HIF-I的抑制率(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>3结论化合物I具有较明显的缺氧诱导因子(HIF-I)抑制作用，可作为肿瘤靶向抑制剂或靶向抗肿瘤剂用于抗肿瘤的研究。权利要求式I化合物式I其结构特征是含多硫键的二酮哌嗪二聚体，其中x＝2或3。本发明优选的式I化合物其中x＝3。FSA00000026410800011.tif2.权利要求1所述式I化合物的制备方法，其特征是发酵培养OidiodendrontruncatumGW3-13(中国典型培养物保藏中心，保藏编号是CCTCCM2010043)，获取含有上述式I的发酵物，然后从发酵物中分离纯化出式I化合物。3.权利要求2所述的制备方法，其中将所述发酵物经硅胶柱层析，以石油醚、石油醚-氯仿，氯仿_甲醇为溶剂进行梯度洗脱，分为7个流份，其中第4个洗脱流份氯仿_甲醇(191)洗脱部分，再经加压硅胶柱层析，半制备反相高效液相色谱分离纯化得式I化合物。4.权利要求1所述的式I化合物在制备细胞增殖抑制剂中的用途。5.权利要求1所述的式I化合物在制备缺氧诱导因子(HIF-I)靶向抗肿瘤剂中的用途6.权利要求1所述的式I化合物在制备抗肿瘤药物中的用途。全文摘要本发明涉及一种含多硫键的哌嗪类化合物的制备方法和用途。本发明用分离自南极长城站土壤样品的真菌OidiodendrontruncatumGW3-13生产出结构新颖的含多硫键的哌嗪类化合物。经实验证实，该类化合物可作为细胞增殖抑制剂或缺氧诱导因子-1(hypoxiainduciblefactor1，HIF-1)靶向抗肿瘤剂。文档编号A61K31/548GK101812079SQ201010119068公开日2010年8月25日申请日期2010年3月8日优先权日2010年3月8日发明者朱天骄,李德海,李莉媛,顾谦群申请人:中国海洋大学