用结合天然脑钠尿肽前体分子氨基酸38-44的单克隆抗体检测天然脑钠尿肽前体分子的方法
专利名称：用结合天然脑钠尿肽前体分子氨基酸38-44的单克隆抗体检测天然脑钠尿肽前体分子的方法
技术领域：
本发明涉及特异性结合总脑钠尿肽前体分子(proBNP)亚群即天然proBNP的抗 体、天然ProBNP的特异性检测方法、确定天然proBNP水平与心力衰竭诊断之间相关性的方 法、天然ProBNP的检测试剂盒以及产生抗天然proBNP抗体的杂交瘤细胞系。
背景技术：
心力衰竭是一个普遍现象，在西方世界尤其如此。按照Roche医学词典(Urban & Schwarzenberg, 1993)，心力衰竭是在运动时或者甚至在休息时心脏无法急性或慢性地产 生代谢所必需的血流，或者不能保证静脉回流(不能回流和流出)。因此削弱了心脏的泵功 能。心力衰竭的原因非常复杂。其中，在此要提到的是心肌的炎性变化和变性性变化、冠状 动脉灌注障碍、冠状动脉梗塞和损伤。这导致外周血流发生改变、呼吸系统障碍、肾功能障 碍和电解质代谢障碍(水肿)，降低骨骼肌系统的效率。按照纽约心脏协会(New York Heart Association，NYHA)，可在活动后，用物理实 验将心力衰竭分为下列NYHA级别1级，是指在正常体力活动后完全没有疼痛；II级，是指 体力活动受到轻微限制；III级，是指体力活动受到严重限制；IV级，是指在任何体力活动 都可能加重不适症状，甚至在大多数休息时间中也有不适症状。对于使用糖苷类药、血管扩张药、ACE抑制剂和/或β _阻滞剂对心力衰竭进行 有效药物治疗来说，首先，必须准确无误地鉴定和诊断出心力衰竭，有可能的话，按照严重 程度将其分类，外加监控治疗过程。在本领域，已经研究了一些血清标记作为心力衰竭早期诊断的标记候选者，例 如ANP (心房钠尿肽激素)和proANP、CNP (C-钠尿肽)、肾上腺髓质素、神经肽Y、内皮缩 血管肽和BNP(脑钠尿肽)。ANP和proANP在理论上均代表诊断心力衰竭的合适标记；然 而，在实践上，它们不很稳定，或者在血液中仅具有短的半寿期，这些对常规诊断性测定来 说是严重缺陷(Buckley, Μ. G.等，Clin. Sci. 95(1998)235-239 ；Cleland, J. G.等，Heart 75(1996)410-413)。通常引用和有意义的标记是BNP(脑钠尿肽)。最初BNP是在猪脑中被鉴定出来的。 BNP是在结构和功能上均类似于ANP (心房钠尿肽)的一种心脏激素(Sudoh，T.等，Nature 332(1988)78-81)。人BNP由32个氨基酸组成，主要由心室分泌并在人体血浆中循环。使用 BNP作为诊断标记，是从例如EP-A-O 542 255中得知的。BNP具有分子内二硫桥且是一种 不很稳定的分析物。推测这是由于其生理功能是作为激素，所以它必须很快被分解。因此， 用它作为诊断标记，在样品采集和操作过程中必须小心和特别注意(Masuta，C.等，Clin. Chem. 44(1998) 130 ；Tsuji, T.等，Clin. Chem. 40(1994)672-673)。BNP的前体分子，即proBNP，是由108个氨基酸组成。proBNP被切割成上述
332个C-端氨基酸(77-108)(称为BNP)和N-端氨基酸1_76 (称为N-端proBNP (或 NT-proBNP))。BNP、N-端 proBNP (1-76)以及其它分解产物(Hunt，P. J.，等，Biochem. Biophys. Res. Com. 214(1995) 1175-1183)均在血液中循环。还没有完全弄清楚是否完整前 体分子(proBNP 1-108)也存在于血浆中。然而，有报道表明(Hunt，P. J.等，P印tides，第 18卷，第10期(1997)，1475-1481)，在血浆中可检测到低量释放的proBNP (1-108)，但是因 为在N-端非常快速的部分分解，所以一些氨基酸会不存在。正如本领域所知的，N-端proBNP (1-76)被认为是心力衰竭的标记之一。WO 93/24531 (US 5，786，163)公开了 N-端proBNP的免疫学鉴定方法以及用于该 方法的抗体。在WO 93/24531中，制备了针对一种来自N-端proBNP的肽的多克隆抗体。已 经表明，在竞争性试验中，所产生的抗体能结合免疫肽(氨基酸47-64)。在WO 93/24531中所进行的竞争性试验中，标记形式的肽47_64作为示踪物，与样 品中的proBNP或者未标记的肽标准品47-64竞争性结合来自兔血清的多克隆抗体。孵育 48小时后，仅达到中等竞争，结果是检出下限约为250fmol/ml。在自动化实验室中，对于常 规样品检验来说，该竞争性试验的长时间孵育是不可接受的。Hunt，P. J.等，Clinical Endocrinology 47 (1997) 287-296，也介绍了用于检测 N-端proBNP的竞争性试验。在该项测定中，在进行测定之前，需要对血浆样品进行复杂的 提取；这可能导致分析物的破坏和测定误差。所用的抗血清是按照WO 93/24531的方法，通 过用合成肽进行免疫而类似地生产的。Hunt等通过用N-端proBNP氨基酸1-13进行免疫， 生产抗血清，并使用由氨基酸1-21所组成的肽作为标准品。对于该项试验，也需要长时间 孵育。在孵育24小时后，达到的检出下限为1. 3fmol/mL·Ng，L.等在WO 00/35951中公开了用于诊断N-端proBNP的另一方法。该方法基 于针对对应于人proBNP氨基酸65-76的合成肽所产生的抗体的应用。Hughes, D.等，Clin. Sci. 96 (1999) 373-380，报道了 N-端 proBNP 的两种不同测定 方法。在第一种测定方法中，使用由包含对应于proBNP氨基酸65-76的合成肽的免疫原所 产生的多克隆抗体；而在第二种测定方法中，按类似方法产生多克隆抗体，但是对应于氨基 酸37-49。按照Hughes，D.等报告的数据，由proBNP氨基酸37-49相应肽所产生的并与之 反应的抗体并不与完整的内源proBNP反应。根据这样的测定，无法区别患有左心室功能 障碍的患者和正常对照。对于基于proBNP 65-76的测定来说，则可以清楚地区别同样的患 者组。Goetze, J. P.等，Clin. Chem. 48 (2002) 1035-1042，介绍了用于 N-端 proBNP 的最 N-端氨基酸(1-21)的测定方法。该测定方法基于针对对应于相同的proBNP氨基酸(1_21) 的合成肽所产生的多克隆抗体。Goetze, J. P.等(参见上文)的测定方法需要完全消化样品及其中所包含的各种 proBNP。据称，该测定方法也能有效降低非特异性结合。Karl，J.等在WO 00/45176中首次公开，在夹心免疫测定中可以对N-端proBNP进 行灵敏而快速地检测。在WO 00/45176中公开的优选表位介于N-端proBNP氨基酸10和 50之间。US 2003/0219734引用了这一事实同一样品中可以存在来自proBNP(l-108)、 BNP (77-108)以及N-端proBNP (1-76)的多种不同来源的BNP相关多肽。
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Mair, J.等，Clin. Chem. Lab. Med. 39 (2001) 571-588，已经总结了心钠尿肽测定对 心力衰竭诊断和控制的影响。他们强调，目前市售的测定法未经标准化，即它们没有用通用 标准进行标定。在一些测定法中，甚至需要提取血浆。因此，用来自不同生产商的检测试剂 盒所获得的结果可能会有显著性差异。因此，来自临床研究的参考区间和决定限仅对于所 用的具体测定法来说是有效的，但决不能外推到N-端proBNP的其它测定法中。按照同一思路，Goetze，J.P.等(参见上文)和 Mair，J. (Clin. Chem. 48 (2002) 977-978)注意到，不同的N-端proBNP测定法之间的差异，无论是所得数值 上还是其临床结论上，对于该标记候选者的广泛使用来说，都有重大问题。显然，急需提供改进的N-端proBNP测定法，例如重复性更好、更标准化、更好表征 或/和临床相关性更好的N-端proBNP测定法。
发明内容
本发明的一个目的是开发一种更具特异性的检测方法，用于测定N-端proBNP和 /或N-端proBNP临床相关片段或亚群。如下所述的和如所附权利要求书要求保护的发明至少部分解决了本领域已知的 一个或多个问题。已经令人惊奇地发现，可以特异性检测循环中存在的所有proBNP类型(总 proBNP)的一个亚群。该亚群称为天然N-端proBNP或者简称为“天然proBNP”。引人注目 的是，天然proBNP亚群比起总proBNP来说具有更好的临床相关性。在第一个实施方案中，本发明涉及特异性结合天然proBNP的分离的抗体。本发明也涉及特异性检测天然proBNP的方法，所述方法包括下述步骤在允许形 成抗天然proBNP抗体-天然proBNP复合物的条件下，使怀疑或已知含有proBNP的样品与 特异性结合天然ProBNP的抗体接触，然后检测所形成的复合物。本发明还公开了诊断心力衰竭的方法，所述方法包括检测天然proBNP并确定天 然proBNP水平与心力衰竭之间的相关性。因此天然proBNP的这一相关值说明心力衰竭的 存在与否或其状态。本发明也涉及测定天然proBNP的试剂盒，所述试剂盒包括特异性结合天然 proBNP的抗体和用于检测天然proBNP的辅助试剂。还要求保护分别由杂交瘤细胞系MAB 10. 4. 63和MAB 16. 1. 39所产生的单克隆抗体，所述细胞系产生抗天然proBNP的特异性单 克隆抗体并且已经保藏于DSMZ。我们在通向本发明的实验过程中，已经发现并确定人血中至少存在两个proBNP 群体。其中一个ProBNP群体看来在所有可用免疫学方法检测的proBNP分子中占大多数。 该群体称为“总”proBNP。我们的研究已经表明，可概括为总proBNP的proBNP分子显然具 有共同的中部核心结构，其范围从proBNP的约10位氨基酸至约66位氨基酸。优选通过本 发明方法检测的总proBNP中包含氨基酸10-66。正如技术人员将会理解的，可通过免疫 学方法，用竞争性测定或夹心测定来容易地检测出所述总proBNP。优选用夹心测定来检测 总proBNP。所述夹心测定可设计成包括分别结合天然proBNP表位的C-端和N-端的抗体。 然而，也可以例如使用能进行夹心测定并能与天然proBNP表位的N-端表位反应的抗体，来 检测总proBNP。显而易见的是，在这样的总proBNP的竞争性测定或夹心测定中，不必使用
5抗天然ProBNP抗体。术语“天然proBNP”，是指其上存在为MAB 10. 4. 63所识别的表位的任何proBNP 分子。按照以下进一步证明的发现，该表位仅存在于所有proBNP分子的一个亚群(即 “总”proBNP的一个亚群)上。我们发现并能确定，总proBNP的这一亚群称为“天然proBNP”， 可用特异性结合配偶体、优选多克隆抗体和/或单克隆抗体进行检测。称为天然proBNP的亚群必定不是均一的多肽片段。天然proBNP多肽的长度可变 化。预期在用于天然proBNP的夹心免疫测定中鉴定的大多数分子代表N-端proBNP (1-76) 或其片段。优选以适于测定包含氨基酸10-66的NT-proBNP片段的方式，建立天然proBNP 的检测方法。天然proBNP的特性是存在为MAB 10. 4. 63所识别的天然proBNP表位。在一个实施方案中，本发明涉及特异性结合天然proBNP的抗体，其中所述特异性 结合天然proBNP的抗体是这样的抗体就患者样品中所测得的proBNP值而言，所述抗体与 MAB 10. 4. 63的相关性为r_值至少r = 0. 95或更高。基于本发明的发现、公开内容和保藏物，技术人员将能够毫无疑问地评价抗体是 特异性结合天然proBNP还是总proBNP。MAB 10. 4. 63被认为是特异性结合天然proBNP的 抗体的原型实例，而MAB 18. 4. 34被认为是结合总proBNP的抗体的原型实例。任何proBNP 的结合物，无论是什么，都可以分别评价其对天然proBNP或总proBNP的结合特异性。“特异性结合”天然proBNP的抗体是这样的抗体就患者样品中所测得的proBNP 值而言，所述抗体与MAB 10. 4. 63的相关性为r_值至少r = 0. 95或更高。用相关的临床样 品，评价天然proBNP的结合特异性与MAB 10. 4. 63结合特性的相关性。使用至少20个和至 多25个血清样品，该样品取自天然proBNP的NT-proBNP-水平为10ng/ml至150ng/ml的患 者。用BiaCOre 3000系统测定与proBNP的结合。确定测定值与用MAB 10. 4. 63所测得的 天然proBNP值之间的相关性，通过线性回归分析进行统计学评价。优选运用MS-Excel拟 合y = ax+b型线性回归，求出相关系数r和斜率。甚至更优选所述抗体将检测出总proBNP 中由MAB 10. 4. 63所结合的基本上相同的天然proBNP亚群，其中按照上述方法，对基本上 相同亚群的结合得到的相关性为r = 0. 98或更高。可以认为，MAB 18.4. 34是测定总proBNP的原型抗体。对于任何特异性结合天然 proBNP的抗体(使用如上所述的相同样品和方法)来说，与MAB 18. 4. 34即与总proBNP的 相关性通常比与MAB 10. 4. 63的相关性低。优选MAB 18. 4. 34与特异性结合proBNP的天 然proBNP亚部分的抗体的相关性为r = 0. 94或更低。甚至更优选该相关性为r = 0. 9或 更低，或者低到r = 0.8或更低。当比较用所述方法比较所测得的绝对量时，总proBNP的检测方法当与MAB 10. 4. 63相比较时，总是得到约2-20倍，在大多数情况下约2-5倍的较高proBNP值。除了 上述给定的相关性外，在以上方法比较中特异性结合天然proBNP的优选抗体的斜率也小 于1. 5。最优选斜率介于0. 4和1. 5之间。优选所述特异性结合发生在结合亲和性最少为IO7LAioI时。对天然proBNP来说， 特异性结合剂的亲和性更优选为108L/mol，或者甚至更优选为109L/mol。如上所解释的，MAB 10. 4. 63的一个非常重要和优选特征是这一事实该抗体仅 结合典型临床样品中所包含的总proBNP的约5%和约50%之间的可变部分。特异性结合天然proBNP的抗体的原型实例是由克隆MAB10. 4. 63所产生的单克隆
6抗体，克隆MAB 10. 4. 63已保藏于DSMZ。MAB 10. 4. 63结合与MAB 16. 1. 39基本上相同的 表位。然而，因为MAB10. 4. 63对天然proBNP的亲和性更高，所述已经选定该抗体作为特异 性结合天然ProBNP的(单克隆)抗体的原型。按照实施例小节所述的方法，已经产生MAB 10.4.63。通过使用对应于完全确定 的proBNP序列的短合成肽，已经对由MAB 10. 4. 63或其它抗体所识别的proBNP上的表位 进行了鉴定、表征和作图。该方法是已知的并称为P印Scan分析。简而言之，已经合成了包含proBNP的8个连续氨基酸的69个合成肽，所述合成肽 包含N-端半胱氨酸、间隔分子和生物素。每个这样的肽都从N-端至C-端向前步移1个氨 基酸。因此，肽1包含氨基酸1-8，肽2包含氨基酸2-9，以此类推，肽69包含氨基酸69-76。已经发现，MAB 10. 4. 63与肽35 (氨基酸35_42)至38 (氨基酸38-45)有明显反 应，所述肽共同具有proBNP的38-42位氨基酸。与肽37 (跨越proBNP的氨基酸37-44)的 反应性最强。因此，可推断MAB 10. 4. 63与基本上由proBNP氨基酸38至43或44所组成 的表位发生反应。正如技术人员将会理解的，表位的存在与否取决于三级结构、二级修饰、复合物的 形成、可及性等。显然，MAB 10. 4. 63和抗天然proBNP的其它抗体在这一方面具有非常特殊 的要求，并且不与典型样品中存在的大多数proBNP分子发生反应。因为短的合成P印Scan 肽不太可能具有三级结构或二级修饰，所以由MAB 10. 4. 63所识别的表位应该是未修饰 的，因此认为术语“天然”是适合的。当分别测定和比较临床样品(例如人血清)中所包含的合成proBNP(l-76)和 proBNP时，基于抗天然proBNP抗体的测定和检测总proBNP的测定在反应强度上表现出显 著性差异。使用合成proBNP(l-76)，可以容易地建立检测方法并标准化。使用这样的测定， 测定或者在合成基质中或者补充天然样品(例如人血清)的合成proBNP，在这两种测定中 所测出的水平相同。然而，令人惊奇的是，当在这两种测定中测定天然样品(例如人血清) 中所包含的proBNP时，发现了显著性差异。分别使用与总proBNP反应的抗体(例如单克隆抗体MAB 17. 3. 1、18. 4. 34或 18. 29. 23)来进行测定，看来能检测出血清样品中存在的所有proBNP分子，即总proBNP。相 比之下，基于与天然proBNP反应的抗体(例如MAB 10. 4. 63)仅检测到该总proBNP的一小 部分。本发明可以证明，总proBNP的天然proBNP亚群在临床上显示出与生物活性BNP 非常好的相关性。当然，在测定BNP时，已经观察了对于取样和处理中获取准确BNP值的所 有注意事项。对于天然proBNP的测定来说，无需特别注意的常规样品处理已证明是令人满 意的。用本发明建立的所有数据都清楚地表明，在本发明中鉴别的且与MAB 10. 4. 63特 异性结合的表位是合适抗天然proBNP抗体的主要表位。显然，由MAB 10. 4. 63所识别的 该天然proBNP表位可进行天然修饰或者可变成蛋白复合物的组成部分，所述修饰或复合 改变了该表位，使得MAB 10. 4. 63在较低程度上结合或者完全不结合所述修饰的或复合的 proBNP。携带所述修饰的“非天然”proBNP表位的proBNP仅在总proBNP测定中可明显检 测到。因为其内在的高度重现性，所以单克隆抗体是检测天然proBNP的优选工具。因
7此，在一个优选的实施方案中，本发明涉及特异性结合天然ProBNP的单克隆抗体。正如技术人员将会理解的，可以发现其它单克隆抗体，所述抗体比起MAB 10. 4. 63 来说在与P印Scan肽35-38的反应性上可表现出微小差异。抗天然proBNP的单克隆抗体 只要仅检测出总ProBNP的一个亚群就没有偏离本发明的精神，其与总proBNP群体中所包 含的并且为MAB 10. 4. 63所结合的天然proBNP亚群的相关性为r_值至少r = 0. 95或更 高。所述相关性是用Biacore 系统进行测定并如上所述进行统计学评价。甚至更优选所 述单克隆抗体将检测出总proBNP中由MAB 10. 4. 63所结合的基本上相同的天然proBNP亚 群，其中按照上述方法，对基本上相同亚群得到的相关性为r = 0. 98或更高。在一个优选的实施方案中，本发明也涉及一种制备单克隆抗体的方法，所述方法 包括下述步骤用proBNP免疫合适的非人类动物，优选小鼠、大鼠、兔子或绵羊，由此得到 产生抗体的B细胞，将这些B细胞与合适的融合配偶体融合，然后对由如此获得的杂交瘤所 产生的抗体对天然proBNP的反应性进行检验。优选仅选出这样的单克隆抗体并用于免疫 测定在合适的患者样品中所述单克隆抗体与MAB10. 4. 63的相关性为r_值至少0. 95。如 上所述对所述相关性进行评价。优选用合成proBNP或在原核宿主中产生的proBNP或者用 至少包含proBNP氨基酸41-44的proBNP合成肽或其片段，进行免疫。现在，该MAB 10. 4. 63是可得到的，当然也可以制备、纯化和鉴定可用于特异性检 测天然proBNP的多克隆抗体。例如，目前已经发现，可以制备、纯化抗天然proBNP的多克 隆抗体(PAB)并且按照其与MAB 10. 4. 63的相关性进行表征。正如技术人员将会理解的，有各种方式产生结合天然proBNP的PAB。显然，例如可 以在不同的成功的免疫纯化途径中使用一种或多种合成肽作为免疫吸附剂。抗天然proBNP的多克隆抗体只要仅检测出总proBNP的一个亚群就没有偏离本 发明的精神，其与总ProBNP群体中所包含的并且为MAB 10. 4. 63所结合的天然proBNP亚 群的相关性为r-值至少r = 0. 95或更高。所述相关性是用Biacore 系统进行测定并如 上所述进行统计学评价。甚至更优选所述多克隆抗体制备物将检测出总proBNP中为MAB 10. 4. 63所结合的基本上相同的天然proBNP亚群，其中按照上述方法，对基本上相同亚群 的结合得到的相关性为r = 0. 98或更高。获取所述抗天然proBNP的PAB的一种方法是，用重组产生或合成产生的proBNP 进行免疫，通过亲和纯化来纯化由此获得的天然proBNP的特异性抗体，如上所述通过患者 样品对如此获得的多克隆抗体进行评价。因此，在一个优选的实施方案中，本发明涉及产生多克隆抗体的方法，所述方法 包括下述步骤用proBNP免疫合适的非人类动物，由此得到多克隆抗体，然后对由如此获 得的抗体对天然proBNP的反应性进行检验。优选仅选出这样的多克隆抗体并用于天然 proBNP免疫测定在合适的患者样品中，所述多克隆抗体与MAB 10.4.63的相关性为r_值 至少0.95。如上所述对所述相关性进行评价。对于任何特异性结合天然proBNP的多克隆抗体(用相同样品和方法)来说，对 MAB 18. 4. 34的相关性，即对总proBNP的相关性明显低于对MAB 10. 4. 63的相关性。因 为多克隆抗体制备物通常含有不同特性的各种抗体，优选MAB 18. 4. 34对于特异性结合总 proBNP的天然proBNP亚部分的多克隆抗体的相关性为r = 0. 94或更低。甚至更优选低至 0. 9或更低。优选特异性结合天然proBNP的多克隆抗体制备物与MAB 10. 4. 63的相关性为
8r = 0. 98或更高，而与MAB 18. 4. 34的相关性为r = 0. 94或更低，或者与MAB 18. 4. 34的 相关性甚至更优选为r = 0. 9或更低。优选使用合成proBNP或在原核宿主中产生的proBNP或者用至少包含proBNP氨 基酸41-44的proBNP合成肽或其片段，来进行免疫，以获得抗天然proBNP的多克隆抗体。在我们的实验过程中，已经在不同的夹心测定法中制备、分析和联合应用了大量 不同的免疫学试剂并用于检测proBNP。这些不同的免疫学试剂的组合表明，大多数测定法 显然都是对总proBNP进行测定。已经发现，所研究的总proBNP测定法表现出对BNP的合理相关性，其与心力衰竭 诊断的合理诊断准确性密切相关，参见例如Mair，J.参见上文。然而，比起更好地分别区分NYHA 0级或I级患者和NYHA II级、III级或IV级患 者之间的总proBNP的测定来说，现在建立了仅检测天然proBNP的测定法。这也导致对心 力衰竭患者的改进的临床鉴别。因此，在一个优选的实施方案中，本发明涉及一种特异性检测天然proBNP的方 法，所述方法包括下述步骤在允许形成抗天然proBNP抗体-天然proBNP复合物的条件 下，使怀疑或已知含有proBNP的样品与特异性结合天然proBNP的抗体接触，然后检测所形 成的复合物。优选所述特异性检测天然proBNP的方法用来区别NYHA 0级和I级与NYHA II级、III级或IV级。“抗天然proBNP抗体-天然proBNP复合物”也简称为“抗体-天然proBNP复合 物，，。术语“抗体”是指单克隆抗体或多克隆抗体、嵌合抗体或人源化抗体或可通过基因 工程获得的其它抗体，以及技术人员已知的所有抗体片段，例如F(ab' )2、Fab'或Fab片 段。可以使用对天然proBNP具有合适特异性的其它结合剂，来替代抗体或抗体片段。但必 须保证仅特异性结合天然proBNP，即类似于MAB 10. 4. 63。正如技术人员所理解的，有许多方法使用特异性结合天然proBNP的抗体来 检测天然proBNP，所有这些方法在相关教科书中都有详细介绍(参见例如Tijssen， P. ， Practice and theory of enzymeimmunoassays 11(1990)Elsevier, Amsterdam 或 Diamandis 等主编.(1996) Immunoassays, Academic Press，Boston)。在本发明的正文中，已经通过Biacore 系统，分析了用于检测总proBNP或天然 proBNP的许多试剂和试剂组合，其中的部分结果见各实施例小节。在临床常规诊断中，通常使用基于不均一的免疫测定法。在本发明的一个优选实 施方案中，天然proBNP的检测方法是竞争性免疫测定法。甚至更优选的是依照夹心测定原理的免疫测定法，其中形成抗体_抗原_抗体复 合物，也称为夹心法。在本发明的一个优选实施方案中，天然proBNP的特异性检测方法是夹心免疫测 定法，其中使用第一抗天然proBNP抗体和第二抗总proBNP抗体，并且其中所述第二抗 proBNP抗体和第一抗天然proBNP抗体两者均在不同表位上结合天然proBNP，从而形成 (第一)抗天然proBNP抗体-天然proBNP-(第二)抗proBNP抗体复合物。正如技术人员将会理解的，也可以使用抗总proBNP抗体作为第一(捕获)抗体， 而用抗天然proBNP抗体作为(示踪、检测或标记)第二抗体，建立检测天然proBNP的夹心
9测定法。 优选测定天然proBNP的所述夹心法包括下述步骤a)将样品与携带适于结合固相的基团的第一天然proBNP-特异性抗体进行混合， 或者将样品与已经结合到固相上的第一天然proBNP-特异性抗体进行混合，b)在形成第一抗体_天然proBNP-第二抗体复合物的条件下，将该溶液与抗总 proBNP的第二抗体混合，所述第二抗体结合到天然proBNP表位除外的表位上，所述表位存 在于天然proBNP和总proBNP上并且携带标记，c)使所形成的免疫复合物结合到固相上，d)将固相从液相中分离出来，e)检测一相或两相中的标记。在定量测定中，用确定量的天然proBNP作为标准品进行同样的测定，并且在样品 测定之后进行步骤f)，即将标准测定值或标准曲线与样品测定值或曲线进行比较，外推天 然proBNP的相应浓度。对天然proBNP具有特异性的第一抗体可以直接与固相结合，或者通过特异性结 合对系统间接结合。该抗体按照技术人员已知方法例如以吸附方式与固相直接结合。当结 合是通过特异性结合对系统间接进行时，第一抗体是由抗天然proBNP抗体和特异性结合 对系统的第一配偶体组成的缀合物。特异性结合对系统是指彼此能特异性结合的两个配偶 体。这样的结合可以基于免疫结合或者基于交替的特异性结合。优选的组合分别是生物素 和抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白或抗生物素、半抗原和抗半抗原、抗体的Fc片段和抗 该Fc片段的抗体或者糖和凝集素。优选生物素和抗生物素蛋白的组合或者生物素和链霉 抗生物素蛋白的组合用作特异性结合对系统。特异性结合对系统的第二配偶体包被在固相上。优选使用链霉抗生物素蛋白或抗 生物素蛋白。可以按照技术人员已知的标准方法，将特异性结合对系统的该配偶体结合到 不溶性载体材料上。在此，共价结合以及吸附结合都是合适的。由聚苯乙烯或类似塑料制成的固相试管或微量滴定板是合适的并且已用特异性 结合对系统的第二配偶体进行包被。更合适的和特别优选的是颗粒状基质，例如乳胶颗粒、 磁颗粒、分子筛材料和玻璃珠。也可使用纸或硝化纤维素作为载体。特别优选使用用如上 所述的特异性结合对系统的第二配偶体包被的磁珠。当完成免疫反应且形成的免疫复合物 结合到固相上后，可以通过例如过滤、离心或者如果是磁颗粒的情况下通过磁力，从液相中 分离出这些微粒。然后，按照标准方法，检测与固相结合的标记物(或者检测残留在液相或 两者中的标记物)。与总proBNP结合的第二抗体结合天然proBNP表位除外的表位，所述表位存在于 天然proBNP和总proBNP上。这两种抗体很可能同时结合天然proBNP分子上的这两种表 位，因为在别的情况下则不能形成夹心复合物。本发明的研究人员也鉴定出proBNP上的表位，所述表位非常适合于上述夹心测定。已经产生了大量的单克隆抗体。可以确定，并非重组proBNP上鉴定的所有表位都 同样适合于测定患者样品中的proBNP。基本上分别由氨基酸13-16、27-31和64-67组成的并分别被MAB17. 3. 1,18. 4. 34
10和18. 29. 23所识别的三个表位，看来存在于绝大多数(N-端)proBNP分子上，即是总 proBNP的表位。这些杂交瘤已于2003年7月5日保藏于DSMZ。由这些杂交瘤产生的抗体代 表了测定总ProBNP的理想工具。如果单独用于竞争性测定法或者与相互或者与总proBNP 反应的PAB联合用于夹心测定中时，可以容易地测定总proBNP。已经依据国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约的规定，将本发 明优选的杂交瘤细胞系 MAB<NT-proBNP>16. 1. 39 ( = MAK<NT-proBNP>16. 1. 39 = MAB 16. 1. 39)、MAB<NT-proBNP>17. 3. 1、MAB<NT-proBNP>10. 4. 63、MAB<NT-proBNP>18. 4. 34 和MAB<NT-proBNP>18. 29. 23保藏于德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH(DSMZ),德国)
权利要求
一种特异性结合天然proBNP的抗体，其中所述特异性结合天然proBNP的抗体是这样的抗体就患者样品中所测得的针对proBNP的值而言，所述抗体与MAB 10.4.63的相关性为通过线性回归分析求出的r 值至少r＝0.95或0.95以上，其中使用至少20个和至多25个取自天然proBNP的NT proBNP 水平为10ng/ml至150ng/ml的患者的血清样品而且所述抗体结合由proBNP的氨基酸38 44组成的表位。
2.权利要求1的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。
3.权利要求2的抗体，其中所述单克隆抗体是单克隆抗体MAB10.4. 63，其由保藏号为 DSM ACC2654的杂交瘤细胞系产生。
4.权利要求1的抗体，其中所述抗体是分离的多克隆抗体。
5.一种测定天然proBNP的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1-4中任一项的抗体和检 测天然proBNP的辅助试剂。
6.杂交瘤细胞系DSMACC2654，其保藏于德意志微生物保藏中心。
全文摘要
本发明涉及特异性结合天然脑钠尿肽前体分子(proBNP)的抗体、天然proBNP的特异性检测方法、确定天然proBNP水平与心力衰竭诊断之间相关性的方法、天然proBNP的检测试剂盒以及产生抗天然proBNP抗体的杂交瘤细胞系。
文档编号A61K39/00GK101967190SQ20101011908
公开日2011年2月9日 申请日期2004年5月12日 优先权日2003年5月12日
发明者A·加卢塞尔, A·博格亚, C·赛德尔, K·哈勒迈尔, M·格罗尔, V·克勒姆特 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司
技术领域：
本发明涉及特异性结合总脑钠尿肽前体分子(proBNP)亚群即天然proBNP的抗 体、天然ProBNP的特异性检测方法、确定天然proBNP水平与心力衰竭诊断之间相关性的方 法、天然ProBNP的检测试剂盒以及产生抗天然proBNP抗体的杂交瘤细胞系。
背景技术：
心力衰竭是一个普遍现象，在西方世界尤其如此。按照Roche医学词典(Urban & Schwarzenberg, 1993)，心力衰竭是在运动时或者甚至在休息时心脏无法急性或慢性地产 生代谢所必需的血流，或者不能保证静脉回流(不能回流和流出)。因此削弱了心脏的泵功 能。心力衰竭的原因非常复杂。其中，在此要提到的是心肌的炎性变化和变性性变化、冠状 动脉灌注障碍、冠状动脉梗塞和损伤。这导致外周血流发生改变、呼吸系统障碍、肾功能障 碍和电解质代谢障碍(水肿)，降低骨骼肌系统的效率。按照纽约心脏协会(New York Heart Association，NYHA)，可在活动后，用物理实 验将心力衰竭分为下列NYHA级别1级，是指在正常体力活动后完全没有疼痛；II级，是指 体力活动受到轻微限制；III级，是指体力活动受到严重限制；IV级，是指在任何体力活动 都可能加重不适症状，甚至在大多数休息时间中也有不适症状。对于使用糖苷类药、血管扩张药、ACE抑制剂和/或β _阻滞剂对心力衰竭进行 有效药物治疗来说，首先，必须准确无误地鉴定和诊断出心力衰竭，有可能的话，按照严重 程度将其分类，外加监控治疗过程。在本领域，已经研究了一些血清标记作为心力衰竭早期诊断的标记候选者，例 如ANP (心房钠尿肽激素)和proANP、CNP (C-钠尿肽)、肾上腺髓质素、神经肽Y、内皮缩 血管肽和BNP(脑钠尿肽)。ANP和proANP在理论上均代表诊断心力衰竭的合适标记；然 而，在实践上，它们不很稳定，或者在血液中仅具有短的半寿期，这些对常规诊断性测定来 说是严重缺陷(Buckley, Μ. G.等，Clin. Sci. 95(1998)235-239 ；Cleland, J. G.等，Heart 75(1996)410-413)。通常引用和有意义的标记是BNP(脑钠尿肽)。最初BNP是在猪脑中被鉴定出来的。 BNP是在结构和功能上均类似于ANP (心房钠尿肽)的一种心脏激素(Sudoh，T.等，Nature 332(1988)78-81)。人BNP由32个氨基酸组成，主要由心室分泌并在人体血浆中循环。使用 BNP作为诊断标记，是从例如EP-A-O 542 255中得知的。BNP具有分子内二硫桥且是一种 不很稳定的分析物。推测这是由于其生理功能是作为激素，所以它必须很快被分解。因此， 用它作为诊断标记，在样品采集和操作过程中必须小心和特别注意(Masuta，C.等，Clin. Chem. 44(1998) 130 ；Tsuji, T.等，Clin. Chem. 40(1994)672-673)。BNP的前体分子，即proBNP，是由108个氨基酸组成。proBNP被切割成上述
332个C-端氨基酸(77-108)(称为BNP)和N-端氨基酸1_76 (称为N-端proBNP (或 NT-proBNP))。BNP、N-端 proBNP (1-76)以及其它分解产物(Hunt，P. J.，等，Biochem. Biophys. Res. Com. 214(1995) 1175-1183)均在血液中循环。还没有完全弄清楚是否完整前 体分子(proBNP 1-108)也存在于血浆中。然而，有报道表明(Hunt，P. J.等，P印tides，第 18卷，第10期(1997)，1475-1481)，在血浆中可检测到低量释放的proBNP (1-108)，但是因 为在N-端非常快速的部分分解，所以一些氨基酸会不存在。正如本领域所知的，N-端proBNP (1-76)被认为是心力衰竭的标记之一。WO 93/24531 (US 5，786，163)公开了 N-端proBNP的免疫学鉴定方法以及用于该 方法的抗体。在WO 93/24531中，制备了针对一种来自N-端proBNP的肽的多克隆抗体。已 经表明，在竞争性试验中，所产生的抗体能结合免疫肽(氨基酸47-64)。在WO 93/24531中所进行的竞争性试验中，标记形式的肽47_64作为示踪物，与样 品中的proBNP或者未标记的肽标准品47-64竞争性结合来自兔血清的多克隆抗体。孵育 48小时后，仅达到中等竞争，结果是检出下限约为250fmol/ml。在自动化实验室中，对于常 规样品检验来说，该竞争性试验的长时间孵育是不可接受的。Hunt，P. J.等，Clinical Endocrinology 47 (1997) 287-296，也介绍了用于检测 N-端proBNP的竞争性试验。在该项测定中，在进行测定之前，需要对血浆样品进行复杂的 提取；这可能导致分析物的破坏和测定误差。所用的抗血清是按照WO 93/24531的方法，通 过用合成肽进行免疫而类似地生产的。Hunt等通过用N-端proBNP氨基酸1-13进行免疫， 生产抗血清，并使用由氨基酸1-21所组成的肽作为标准品。对于该项试验，也需要长时间 孵育。在孵育24小时后，达到的检出下限为1. 3fmol/mL·Ng，L.等在WO 00/35951中公开了用于诊断N-端proBNP的另一方法。该方法基 于针对对应于人proBNP氨基酸65-76的合成肽所产生的抗体的应用。Hughes, D.等，Clin. Sci. 96 (1999) 373-380，报道了 N-端 proBNP 的两种不同测定 方法。在第一种测定方法中，使用由包含对应于proBNP氨基酸65-76的合成肽的免疫原所 产生的多克隆抗体；而在第二种测定方法中，按类似方法产生多克隆抗体，但是对应于氨基 酸37-49。按照Hughes，D.等报告的数据，由proBNP氨基酸37-49相应肽所产生的并与之 反应的抗体并不与完整的内源proBNP反应。根据这样的测定，无法区别患有左心室功能 障碍的患者和正常对照。对于基于proBNP 65-76的测定来说，则可以清楚地区别同样的患 者组。Goetze, J. P.等，Clin. Chem. 48 (2002) 1035-1042，介绍了用于 N-端 proBNP 的最 N-端氨基酸(1-21)的测定方法。该测定方法基于针对对应于相同的proBNP氨基酸(1_21) 的合成肽所产生的多克隆抗体。Goetze, J. P.等(参见上文)的测定方法需要完全消化样品及其中所包含的各种 proBNP。据称，该测定方法也能有效降低非特异性结合。Karl，J.等在WO 00/45176中首次公开，在夹心免疫测定中可以对N-端proBNP进 行灵敏而快速地检测。在WO 00/45176中公开的优选表位介于N-端proBNP氨基酸10和 50之间。US 2003/0219734引用了这一事实同一样品中可以存在来自proBNP(l-108)、 BNP (77-108)以及N-端proBNP (1-76)的多种不同来源的BNP相关多肽。
4
Mair, J.等，Clin. Chem. Lab. Med. 39 (2001) 571-588，已经总结了心钠尿肽测定对 心力衰竭诊断和控制的影响。他们强调，目前市售的测定法未经标准化，即它们没有用通用 标准进行标定。在一些测定法中，甚至需要提取血浆。因此，用来自不同生产商的检测试剂 盒所获得的结果可能会有显著性差异。因此，来自临床研究的参考区间和决定限仅对于所 用的具体测定法来说是有效的，但决不能外推到N-端proBNP的其它测定法中。按照同一思路，Goetze，J.P.等(参见上文)和 Mair，J. (Clin. Chem. 48 (2002) 977-978)注意到，不同的N-端proBNP测定法之间的差异，无论是所得数值 上还是其临床结论上，对于该标记候选者的广泛使用来说，都有重大问题。显然，急需提供改进的N-端proBNP测定法，例如重复性更好、更标准化、更好表征 或/和临床相关性更好的N-端proBNP测定法。
发明内容
本发明的一个目的是开发一种更具特异性的检测方法，用于测定N-端proBNP和 /或N-端proBNP临床相关片段或亚群。如下所述的和如所附权利要求书要求保护的发明至少部分解决了本领域已知的 一个或多个问题。已经令人惊奇地发现，可以特异性检测循环中存在的所有proBNP类型(总 proBNP)的一个亚群。该亚群称为天然N-端proBNP或者简称为“天然proBNP”。引人注目 的是，天然proBNP亚群比起总proBNP来说具有更好的临床相关性。在第一个实施方案中，本发明涉及特异性结合天然proBNP的分离的抗体。本发明也涉及特异性检测天然proBNP的方法，所述方法包括下述步骤在允许形 成抗天然proBNP抗体-天然proBNP复合物的条件下，使怀疑或已知含有proBNP的样品与 特异性结合天然ProBNP的抗体接触，然后检测所形成的复合物。本发明还公开了诊断心力衰竭的方法，所述方法包括检测天然proBNP并确定天 然proBNP水平与心力衰竭之间的相关性。因此天然proBNP的这一相关值说明心力衰竭的 存在与否或其状态。本发明也涉及测定天然proBNP的试剂盒，所述试剂盒包括特异性结合天然 proBNP的抗体和用于检测天然proBNP的辅助试剂。还要求保护分别由杂交瘤细胞系MAB 10. 4. 63和MAB 16. 1. 39所产生的单克隆抗体，所述细胞系产生抗天然proBNP的特异性单 克隆抗体并且已经保藏于DSMZ。我们在通向本发明的实验过程中，已经发现并确定人血中至少存在两个proBNP 群体。其中一个ProBNP群体看来在所有可用免疫学方法检测的proBNP分子中占大多数。 该群体称为“总”proBNP。我们的研究已经表明，可概括为总proBNP的proBNP分子显然具 有共同的中部核心结构，其范围从proBNP的约10位氨基酸至约66位氨基酸。优选通过本 发明方法检测的总proBNP中包含氨基酸10-66。正如技术人员将会理解的，可通过免疫 学方法，用竞争性测定或夹心测定来容易地检测出所述总proBNP。优选用夹心测定来检测 总proBNP。所述夹心测定可设计成包括分别结合天然proBNP表位的C-端和N-端的抗体。 然而，也可以例如使用能进行夹心测定并能与天然proBNP表位的N-端表位反应的抗体，来 检测总proBNP。显而易见的是，在这样的总proBNP的竞争性测定或夹心测定中，不必使用
5抗天然ProBNP抗体。术语“天然proBNP”，是指其上存在为MAB 10. 4. 63所识别的表位的任何proBNP 分子。按照以下进一步证明的发现，该表位仅存在于所有proBNP分子的一个亚群(即 “总”proBNP的一个亚群)上。我们发现并能确定，总proBNP的这一亚群称为“天然proBNP”， 可用特异性结合配偶体、优选多克隆抗体和/或单克隆抗体进行检测。称为天然proBNP的亚群必定不是均一的多肽片段。天然proBNP多肽的长度可变 化。预期在用于天然proBNP的夹心免疫测定中鉴定的大多数分子代表N-端proBNP (1-76) 或其片段。优选以适于测定包含氨基酸10-66的NT-proBNP片段的方式，建立天然proBNP 的检测方法。天然proBNP的特性是存在为MAB 10. 4. 63所识别的天然proBNP表位。在一个实施方案中，本发明涉及特异性结合天然proBNP的抗体，其中所述特异性 结合天然proBNP的抗体是这样的抗体就患者样品中所测得的proBNP值而言，所述抗体与 MAB 10. 4. 63的相关性为r_值至少r = 0. 95或更高。基于本发明的发现、公开内容和保藏物，技术人员将能够毫无疑问地评价抗体是 特异性结合天然proBNP还是总proBNP。MAB 10. 4. 63被认为是特异性结合天然proBNP的 抗体的原型实例，而MAB 18. 4. 34被认为是结合总proBNP的抗体的原型实例。任何proBNP 的结合物，无论是什么，都可以分别评价其对天然proBNP或总proBNP的结合特异性。“特异性结合”天然proBNP的抗体是这样的抗体就患者样品中所测得的proBNP 值而言，所述抗体与MAB 10. 4. 63的相关性为r_值至少r = 0. 95或更高。用相关的临床样 品，评价天然proBNP的结合特异性与MAB 10. 4. 63结合特性的相关性。使用至少20个和至 多25个血清样品，该样品取自天然proBNP的NT-proBNP-水平为10ng/ml至150ng/ml的患 者。用BiaCOre 3000系统测定与proBNP的结合。确定测定值与用MAB 10. 4. 63所测得的 天然proBNP值之间的相关性，通过线性回归分析进行统计学评价。优选运用MS-Excel拟 合y = ax+b型线性回归，求出相关系数r和斜率。甚至更优选所述抗体将检测出总proBNP 中由MAB 10. 4. 63所结合的基本上相同的天然proBNP亚群，其中按照上述方法，对基本上 相同亚群的结合得到的相关性为r = 0. 98或更高。可以认为，MAB 18.4. 34是测定总proBNP的原型抗体。对于任何特异性结合天然 proBNP的抗体(使用如上所述的相同样品和方法)来说，与MAB 18. 4. 34即与总proBNP的 相关性通常比与MAB 10. 4. 63的相关性低。优选MAB 18. 4. 34与特异性结合proBNP的天 然proBNP亚部分的抗体的相关性为r = 0. 94或更低。甚至更优选该相关性为r = 0. 9或 更低，或者低到r = 0.8或更低。当比较用所述方法比较所测得的绝对量时，总proBNP的检测方法当与MAB 10. 4. 63相比较时，总是得到约2-20倍，在大多数情况下约2-5倍的较高proBNP值。除了 上述给定的相关性外，在以上方法比较中特异性结合天然proBNP的优选抗体的斜率也小 于1. 5。最优选斜率介于0. 4和1. 5之间。优选所述特异性结合发生在结合亲和性最少为IO7LAioI时。对天然proBNP来说， 特异性结合剂的亲和性更优选为108L/mol，或者甚至更优选为109L/mol。如上所解释的，MAB 10. 4. 63的一个非常重要和优选特征是这一事实该抗体仅 结合典型临床样品中所包含的总proBNP的约5%和约50%之间的可变部分。特异性结合天然proBNP的抗体的原型实例是由克隆MAB10. 4. 63所产生的单克隆
6抗体，克隆MAB 10. 4. 63已保藏于DSMZ。MAB 10. 4. 63结合与MAB 16. 1. 39基本上相同的 表位。然而，因为MAB10. 4. 63对天然proBNP的亲和性更高，所述已经选定该抗体作为特异 性结合天然ProBNP的(单克隆)抗体的原型。按照实施例小节所述的方法，已经产生MAB 10.4.63。通过使用对应于完全确定 的proBNP序列的短合成肽，已经对由MAB 10. 4. 63或其它抗体所识别的proBNP上的表位 进行了鉴定、表征和作图。该方法是已知的并称为P印Scan分析。简而言之，已经合成了包含proBNP的8个连续氨基酸的69个合成肽，所述合成肽 包含N-端半胱氨酸、间隔分子和生物素。每个这样的肽都从N-端至C-端向前步移1个氨 基酸。因此，肽1包含氨基酸1-8，肽2包含氨基酸2-9，以此类推，肽69包含氨基酸69-76。已经发现，MAB 10. 4. 63与肽35 (氨基酸35_42)至38 (氨基酸38-45)有明显反 应，所述肽共同具有proBNP的38-42位氨基酸。与肽37 (跨越proBNP的氨基酸37-44)的 反应性最强。因此，可推断MAB 10. 4. 63与基本上由proBNP氨基酸38至43或44所组成 的表位发生反应。正如技术人员将会理解的，表位的存在与否取决于三级结构、二级修饰、复合物的 形成、可及性等。显然，MAB 10. 4. 63和抗天然proBNP的其它抗体在这一方面具有非常特殊 的要求，并且不与典型样品中存在的大多数proBNP分子发生反应。因为短的合成P印Scan 肽不太可能具有三级结构或二级修饰，所以由MAB 10. 4. 63所识别的表位应该是未修饰 的，因此认为术语“天然”是适合的。当分别测定和比较临床样品(例如人血清)中所包含的合成proBNP(l-76)和 proBNP时，基于抗天然proBNP抗体的测定和检测总proBNP的测定在反应强度上表现出显 著性差异。使用合成proBNP(l-76)，可以容易地建立检测方法并标准化。使用这样的测定， 测定或者在合成基质中或者补充天然样品(例如人血清)的合成proBNP，在这两种测定中 所测出的水平相同。然而，令人惊奇的是，当在这两种测定中测定天然样品(例如人血清) 中所包含的proBNP时，发现了显著性差异。分别使用与总proBNP反应的抗体(例如单克隆抗体MAB 17. 3. 1、18. 4. 34或 18. 29. 23)来进行测定，看来能检测出血清样品中存在的所有proBNP分子，即总proBNP。相 比之下，基于与天然proBNP反应的抗体(例如MAB 10. 4. 63)仅检测到该总proBNP的一小 部分。本发明可以证明，总proBNP的天然proBNP亚群在临床上显示出与生物活性BNP 非常好的相关性。当然，在测定BNP时，已经观察了对于取样和处理中获取准确BNP值的所 有注意事项。对于天然proBNP的测定来说，无需特别注意的常规样品处理已证明是令人满 意的。用本发明建立的所有数据都清楚地表明，在本发明中鉴别的且与MAB 10. 4. 63特 异性结合的表位是合适抗天然proBNP抗体的主要表位。显然，由MAB 10. 4. 63所识别的 该天然proBNP表位可进行天然修饰或者可变成蛋白复合物的组成部分，所述修饰或复合 改变了该表位，使得MAB 10. 4. 63在较低程度上结合或者完全不结合所述修饰的或复合的 proBNP。携带所述修饰的“非天然”proBNP表位的proBNP仅在总proBNP测定中可明显检 测到。因为其内在的高度重现性，所以单克隆抗体是检测天然proBNP的优选工具。因
7此，在一个优选的实施方案中，本发明涉及特异性结合天然ProBNP的单克隆抗体。正如技术人员将会理解的，可以发现其它单克隆抗体，所述抗体比起MAB 10. 4. 63 来说在与P印Scan肽35-38的反应性上可表现出微小差异。抗天然proBNP的单克隆抗体 只要仅检测出总ProBNP的一个亚群就没有偏离本发明的精神，其与总proBNP群体中所包 含的并且为MAB 10. 4. 63所结合的天然proBNP亚群的相关性为r_值至少r = 0. 95或更 高。所述相关性是用Biacore 系统进行测定并如上所述进行统计学评价。甚至更优选所 述单克隆抗体将检测出总proBNP中由MAB 10. 4. 63所结合的基本上相同的天然proBNP亚 群，其中按照上述方法，对基本上相同亚群得到的相关性为r = 0. 98或更高。在一个优选的实施方案中，本发明也涉及一种制备单克隆抗体的方法，所述方法 包括下述步骤用proBNP免疫合适的非人类动物，优选小鼠、大鼠、兔子或绵羊，由此得到 产生抗体的B细胞，将这些B细胞与合适的融合配偶体融合，然后对由如此获得的杂交瘤所 产生的抗体对天然proBNP的反应性进行检验。优选仅选出这样的单克隆抗体并用于免疫 测定在合适的患者样品中所述单克隆抗体与MAB10. 4. 63的相关性为r_值至少0. 95。如 上所述对所述相关性进行评价。优选用合成proBNP或在原核宿主中产生的proBNP或者用 至少包含proBNP氨基酸41-44的proBNP合成肽或其片段，进行免疫。现在，该MAB 10. 4. 63是可得到的，当然也可以制备、纯化和鉴定可用于特异性检 测天然proBNP的多克隆抗体。例如，目前已经发现，可以制备、纯化抗天然proBNP的多克 隆抗体(PAB)并且按照其与MAB 10. 4. 63的相关性进行表征。正如技术人员将会理解的，有各种方式产生结合天然proBNP的PAB。显然，例如可 以在不同的成功的免疫纯化途径中使用一种或多种合成肽作为免疫吸附剂。抗天然proBNP的多克隆抗体只要仅检测出总proBNP的一个亚群就没有偏离本 发明的精神，其与总ProBNP群体中所包含的并且为MAB 10. 4. 63所结合的天然proBNP亚 群的相关性为r-值至少r = 0. 95或更高。所述相关性是用Biacore 系统进行测定并如 上所述进行统计学评价。甚至更优选所述多克隆抗体制备物将检测出总proBNP中为MAB 10. 4. 63所结合的基本上相同的天然proBNP亚群，其中按照上述方法，对基本上相同亚群 的结合得到的相关性为r = 0. 98或更高。获取所述抗天然proBNP的PAB的一种方法是，用重组产生或合成产生的proBNP 进行免疫，通过亲和纯化来纯化由此获得的天然proBNP的特异性抗体，如上所述通过患者 样品对如此获得的多克隆抗体进行评价。因此，在一个优选的实施方案中，本发明涉及产生多克隆抗体的方法，所述方法 包括下述步骤用proBNP免疫合适的非人类动物，由此得到多克隆抗体，然后对由如此获 得的抗体对天然proBNP的反应性进行检验。优选仅选出这样的多克隆抗体并用于天然 proBNP免疫测定在合适的患者样品中，所述多克隆抗体与MAB 10.4.63的相关性为r_值 至少0.95。如上所述对所述相关性进行评价。对于任何特异性结合天然proBNP的多克隆抗体(用相同样品和方法)来说，对 MAB 18. 4. 34的相关性，即对总proBNP的相关性明显低于对MAB 10. 4. 63的相关性。因 为多克隆抗体制备物通常含有不同特性的各种抗体，优选MAB 18. 4. 34对于特异性结合总 proBNP的天然proBNP亚部分的多克隆抗体的相关性为r = 0. 94或更低。甚至更优选低至 0. 9或更低。优选特异性结合天然proBNP的多克隆抗体制备物与MAB 10. 4. 63的相关性为
8r = 0. 98或更高，而与MAB 18. 4. 34的相关性为r = 0. 94或更低，或者与MAB 18. 4. 34的 相关性甚至更优选为r = 0. 9或更低。优选使用合成proBNP或在原核宿主中产生的proBNP或者用至少包含proBNP氨 基酸41-44的proBNP合成肽或其片段，来进行免疫，以获得抗天然proBNP的多克隆抗体。在我们的实验过程中，已经在不同的夹心测定法中制备、分析和联合应用了大量 不同的免疫学试剂并用于检测proBNP。这些不同的免疫学试剂的组合表明，大多数测定法 显然都是对总proBNP进行测定。已经发现，所研究的总proBNP测定法表现出对BNP的合理相关性，其与心力衰竭 诊断的合理诊断准确性密切相关，参见例如Mair，J.参见上文。然而，比起更好地分别区分NYHA 0级或I级患者和NYHA II级、III级或IV级患 者之间的总proBNP的测定来说，现在建立了仅检测天然proBNP的测定法。这也导致对心 力衰竭患者的改进的临床鉴别。因此，在一个优选的实施方案中，本发明涉及一种特异性检测天然proBNP的方 法，所述方法包括下述步骤在允许形成抗天然proBNP抗体-天然proBNP复合物的条件 下，使怀疑或已知含有proBNP的样品与特异性结合天然proBNP的抗体接触，然后检测所形 成的复合物。优选所述特异性检测天然proBNP的方法用来区别NYHA 0级和I级与NYHA II级、III级或IV级。“抗天然proBNP抗体-天然proBNP复合物”也简称为“抗体-天然proBNP复合 物，，。术语“抗体”是指单克隆抗体或多克隆抗体、嵌合抗体或人源化抗体或可通过基因 工程获得的其它抗体，以及技术人员已知的所有抗体片段，例如F(ab' )2、Fab'或Fab片 段。可以使用对天然proBNP具有合适特异性的其它结合剂，来替代抗体或抗体片段。但必 须保证仅特异性结合天然proBNP，即类似于MAB 10. 4. 63。正如技术人员所理解的，有许多方法使用特异性结合天然proBNP的抗体来 检测天然proBNP，所有这些方法在相关教科书中都有详细介绍(参见例如Tijssen， P. ， Practice and theory of enzymeimmunoassays 11(1990)Elsevier, Amsterdam 或 Diamandis 等主编.(1996) Immunoassays, Academic Press，Boston)。在本发明的正文中，已经通过Biacore 系统，分析了用于检测总proBNP或天然 proBNP的许多试剂和试剂组合，其中的部分结果见各实施例小节。在临床常规诊断中，通常使用基于不均一的免疫测定法。在本发明的一个优选实 施方案中，天然proBNP的检测方法是竞争性免疫测定法。甚至更优选的是依照夹心测定原理的免疫测定法，其中形成抗体_抗原_抗体复 合物，也称为夹心法。在本发明的一个优选实施方案中，天然proBNP的特异性检测方法是夹心免疫测 定法，其中使用第一抗天然proBNP抗体和第二抗总proBNP抗体，并且其中所述第二抗 proBNP抗体和第一抗天然proBNP抗体两者均在不同表位上结合天然proBNP，从而形成 (第一)抗天然proBNP抗体-天然proBNP-(第二)抗proBNP抗体复合物。正如技术人员将会理解的，也可以使用抗总proBNP抗体作为第一(捕获)抗体， 而用抗天然proBNP抗体作为(示踪、检测或标记)第二抗体，建立检测天然proBNP的夹心
9测定法。 优选测定天然proBNP的所述夹心法包括下述步骤a)将样品与携带适于结合固相的基团的第一天然proBNP-特异性抗体进行混合， 或者将样品与已经结合到固相上的第一天然proBNP-特异性抗体进行混合，b)在形成第一抗体_天然proBNP-第二抗体复合物的条件下，将该溶液与抗总 proBNP的第二抗体混合，所述第二抗体结合到天然proBNP表位除外的表位上，所述表位存 在于天然proBNP和总proBNP上并且携带标记，c)使所形成的免疫复合物结合到固相上，d)将固相从液相中分离出来，e)检测一相或两相中的标记。在定量测定中，用确定量的天然proBNP作为标准品进行同样的测定，并且在样品 测定之后进行步骤f)，即将标准测定值或标准曲线与样品测定值或曲线进行比较，外推天 然proBNP的相应浓度。对天然proBNP具有特异性的第一抗体可以直接与固相结合，或者通过特异性结 合对系统间接结合。该抗体按照技术人员已知方法例如以吸附方式与固相直接结合。当结 合是通过特异性结合对系统间接进行时，第一抗体是由抗天然proBNP抗体和特异性结合 对系统的第一配偶体组成的缀合物。特异性结合对系统是指彼此能特异性结合的两个配偶 体。这样的结合可以基于免疫结合或者基于交替的特异性结合。优选的组合分别是生物素 和抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白或抗生物素、半抗原和抗半抗原、抗体的Fc片段和抗 该Fc片段的抗体或者糖和凝集素。优选生物素和抗生物素蛋白的组合或者生物素和链霉 抗生物素蛋白的组合用作特异性结合对系统。特异性结合对系统的第二配偶体包被在固相上。优选使用链霉抗生物素蛋白或抗 生物素蛋白。可以按照技术人员已知的标准方法，将特异性结合对系统的该配偶体结合到 不溶性载体材料上。在此，共价结合以及吸附结合都是合适的。由聚苯乙烯或类似塑料制成的固相试管或微量滴定板是合适的并且已用特异性 结合对系统的第二配偶体进行包被。更合适的和特别优选的是颗粒状基质，例如乳胶颗粒、 磁颗粒、分子筛材料和玻璃珠。也可使用纸或硝化纤维素作为载体。特别优选使用用如上 所述的特异性结合对系统的第二配偶体包被的磁珠。当完成免疫反应且形成的免疫复合物 结合到固相上后，可以通过例如过滤、离心或者如果是磁颗粒的情况下通过磁力，从液相中 分离出这些微粒。然后，按照标准方法，检测与固相结合的标记物(或者检测残留在液相或 两者中的标记物)。与总proBNP结合的第二抗体结合天然proBNP表位除外的表位，所述表位存在于 天然proBNP和总proBNP上。这两种抗体很可能同时结合天然proBNP分子上的这两种表 位，因为在别的情况下则不能形成夹心复合物。本发明的研究人员也鉴定出proBNP上的表位，所述表位非常适合于上述夹心测定。已经产生了大量的单克隆抗体。可以确定，并非重组proBNP上鉴定的所有表位都 同样适合于测定患者样品中的proBNP。基本上分别由氨基酸13-16、27-31和64-67组成的并分别被MAB17. 3. 1,18. 4. 34
10和18. 29. 23所识别的三个表位，看来存在于绝大多数(N-端)proBNP分子上，即是总 proBNP的表位。这些杂交瘤已于2003年7月5日保藏于DSMZ。由这些杂交瘤产生的抗体代 表了测定总ProBNP的理想工具。如果单独用于竞争性测定法或者与相互或者与总proBNP 反应的PAB联合用于夹心测定中时，可以容易地测定总proBNP。已经依据国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约的规定，将本发 明优选的杂交瘤细胞系 MAB<NT-proBNP>16. 1. 39 ( = MAK<NT-proBNP>16. 1. 39 = MAB 16. 1. 39)、MAB<NT-proBNP>17. 3. 1、MAB<NT-proBNP>10. 4. 63、MAB<NT-proBNP>18. 4. 34 和MAB<NT-proBNP>18. 29. 23保藏于德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH(DSMZ),德国)
权利要求
一种特异性结合天然proBNP的抗体，其中所述特异性结合天然proBNP的抗体是这样的抗体就患者样品中所测得的针对proBNP的值而言，所述抗体与MAB 10.4.63的相关性为通过线性回归分析求出的r 值至少r＝0.95或0.95以上，其中使用至少20个和至多25个取自天然proBNP的NT proBNP 水平为10ng/ml至150ng/ml的患者的血清样品而且所述抗体结合由proBNP的氨基酸38 44组成的表位。
2.权利要求1的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。
3.权利要求2的抗体，其中所述单克隆抗体是单克隆抗体MAB10.4. 63，其由保藏号为 DSM ACC2654的杂交瘤细胞系产生。
4.权利要求1的抗体，其中所述抗体是分离的多克隆抗体。
5.一种测定天然proBNP的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1-4中任一项的抗体和检 测天然proBNP的辅助试剂。
6.杂交瘤细胞系DSMACC2654，其保藏于德意志微生物保藏中心。
全文摘要
本发明涉及特异性结合天然脑钠尿肽前体分子(proBNP)的抗体、天然proBNP的特异性检测方法、确定天然proBNP水平与心力衰竭诊断之间相关性的方法、天然proBNP的检测试剂盒以及产生抗天然proBNP抗体的杂交瘤细胞系。
文档编号A61K39/00GK101967190SQ20101011908
公开日2011年2月9日 申请日期2004年5月12日 优先权日2003年5月12日
发明者A·加卢塞尔, A·博格亚, C·赛德尔, K·哈勒迈尔, M·格罗尔, V·克勒姆特 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司
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