一种抑制人肺癌细胞增殖转移的siRNA的结构及用途的制作方法
专利名称：一种抑制人肺癌细胞增殖转移的siRNA的结构及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程药物领域，具体地说是一种针对血管内皮生长因子 (vascular endothelial growthfactor, VEGF)基因的小干扰 RNA(small interference RNA, siRNA)的序列结构及其成为治疗肺癌等恶性肿瘤细胞增殖及侵袭转移的新型药物。
背景技术：
肺癌已成为引起人类死亡的常见疾病之一，在我国大中城市的发病率与死亡率均 居各种恶性舯瘤首位。尽管采用多种治疗方法，但患者3年及5年生存率仍很低，导致患者 死亡的主要原因与肿瘤的复发与转移直接相关。癌细胞的增殖和侵袭转移是一个多因素调控的复杂过程。癌细胞的增殖是肿瘤 细胞通过细胞分裂增加细胞数量和增大肿瘤体积的过程，肿瘤体积的增大会破坏所在组织 器官的结构与功能。癌细胞的侵袭转移是指肿瘤细胞脱离原发部位，侵入并穿过周围基质 (此阶段为侵袭)，经血液或淋巴循环向远处扩散(该阶段为转移)的过程。研究显示，肿瘤细胞分泌的血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)在新血管形成和癌细胞的增殖及侵袭转移中发挥着重要作用，VEGF无论是 在体外培养的肺癌细胞中，还是在荷瘤动物的肿瘤细胞中，或是在人体肺癌组织中均有高 表达，且VEGF表达水平与肺癌预后密切相关。Ohta等[OhtaY，et al. Chest, 2002,121 1624-1627]对肺癌研究发现，有淋巴结转移的原发灶VEGF表达水平高于无转移者，在 转移淋巴结中VEGF的表达高于原发灶。VEGF是肺癌预后的独立因子，VEGF表达高的患 者预后较差[Seto T, et al. Lung Cancer, 2006, 53 (1) 91-96 ；SadasiwanC, et al. ASCO MeetingAbstract,2007，25 7696]。因此，利用相关技术手段降低VEGF表达就有可能降低肺癌增殖及转移的发生率， 延长患者生命，提高患者生存率和生活质量。RNAi是1998年建立的一种简便快速的转录后基因干预技术，通过20 23个碱 基对的小分子双链RNA片段特异性地与同源序列基因结合，从而沉默靶基因，可代替传统 DNA水平的基因敲除技术。与传统反义技术相比，RNAi具有作用特异性强，效果好、持续时 间长、细胞内表达稳定、可遗传等优势，可广泛用于目的基因的沉默[Liu G，et al. Histol Histopathol. 2007,22(2) 211-217 ；Fuchs U，et al. Adv cancer Res. 2007，96 :75_102·]。 2003年以来，RNAi在代谢性疾病、病毒感染性疾病、多种恶性肿瘤、神经系统疾病和药物筛 选等领域的研究应用日益广泛。鉴于RNAi技术的巨大价值与广阔应用前景，2002年美国 《SCIENCE》杂志将其评为全球年度十大科学进展之首。而RNAi的发现者美国科学家Craig Mello和Andrew Fire也因此荣获2006年诺贝尔生理学及医学奖。本发明的目的在于寻找能特异高效抑制肺癌细胞增殖的新型基因药物，即能明显 降低VEGF基因表达的小分子干扰RNA(SiRNA)及能改善其生物活性的化学修饰衍生物。
发明内容
本发明的内容是根据VEGF mRNA的序列信息和生物信息学技术设计若干靶向VEGF mRNA的siRNA序列，分别构建VEGF_siRNA质粒载体，转染A549细胞，建立转染细胞稳定株， 以荧光定量PCR检测VEGF-siRNA对VEGF mRNA表达的抑制效果。结果显示有1条siRNA 序列具有较为理想的抑制VEGF mRNA表达并在体外细胞学实验中能明显抑制A549细胞增 殖和转移，提示可用于肺癌细胞增殖转移的预防与治疗。根据本发明，针对美国国立生物技术信息中心NCBI数据库中人VEGF mRNA的序列 全长(序列号:NM001033756, CDS =492-1607)中1220 1238位点设计的siRNA能能抑制 VEGF基因表达，有可能成为预防和治疗肺癌等恶性肿瘤侵袭转移的新型生物工程药物。根据本发明，为增强siRNA的核酸酶抗性、生物利用度、组织靶向性等，本发明包 含了 VEGF-siRNA的各种化学修饰。根据本发明，发明的VEGF-SiRNA及其修饰物可按本领域已知方法配成非肠道给 药的试剂。根据本发明，本发明的VEGF-siRNA及其修饰物治疗组成可应用单独的有效成分 或组合物形式包括联合其它反义核酸及其衍生物。根据本发明，本发明的治疗组成，依不同情况包括特定药物的药物动力学、药代动 力学、给药模式、给药途径、受者的年龄、体重、肝肾功能状态、疾病的性质、程度及治疗时限 等，以适量的剂量给药。根据本发明，本发明的实施对严重危害人类健康的肺癌等恶性肿瘤增殖转移的预 防与治疗具有重要的社会和经济效益。
具体实施例方式实验设计、方法与实验结果如下1、siRNA设计合成及质粒载体构建在美国国立生物技术信息中心NCBI数据库中获取人VEGF mRNA的序列全长(序 列号匪001033756，⑶S =492-1607)。依据siRNA设计原则，结合设计软件和文献报道，分 别设计了 12条VEGF-siRNA靶序列。各siRNA靶序列长度19bp，均行BLAST比对检查，以保 证和其它基因没有同源性，合成的siRNA转录模板长度为64bp，在序列中间为加入9bp茎环 序列分隔的正反向靶序列，尾端插入5个T作为终止序列。上游和下游分别加了 BamHI和 HindllI酶切位点。质粒(经HindIII和BamHI酶切后与合成的表达模板DNA片段用T4DNA 连接酶连接，反应条件16°C，8h)改造可表达GFP，转化DH5ci菌株，涂卡那霉素琼脂平板， 挑选阳性克隆，扩增并提取质粒，用BamHI和Hind IlI双酶切鉴定。酶切鉴定正确的克隆 送生物公司测序。pGCsilencerTM U6/Neo/GFP/RNAi载体由上海吉凯基因化学公司合成。2、筛选转染VEGF-siRNA肺癌A549细胞稳定株2. 1瞬时转染①取复苏后第三代处于对数生长期的A549细胞，台盼蓝染色，存活 率> 95 %，显微镜下计数，以2 X 105个细胞/孔接种于24孔板内。细胞汇合度60 % 80 % 进行转染。②质粒DNA 1 μ g加入50 μ IOPTI-MEM中混勻；Lipofectamine 20002 μ 1加入 50 μ 1 OPTI-MEM中混合均勻，室温静置5min。Lipofectamine2000稀释液加入质粒DNA稀 释液中混勻，室温静置20min。吸弃细胞培养板内培养液，OPTI洗细胞两次，加入500 μ 1
40ΡΤΙ-ΜΕΜ。将混合液100 μ 1缓慢加入细胞培养板内，同时轻轻晃动培养板。37°C、5% C02 培养箱中培养，5h后换含10% FBS的1640培养液。2. 2 G418筛选转染稳定株瞬时转染后24h细胞按1 3传代，继续培养48h，吸弃培养液，加入含 G418500yg/ml的含10% FBS1640培养液。隔日换液，6d后大量细胞死亡，G418浓度调整 至200 μ g/ml，继续培养至单克隆形成。荧光显微镜下挑选出表达GFP的阳性克隆，转至培 养瓶内扩增。以GFP为报告子，荧光显微镜下观察细胞转染率。3、荧光定量PCR检测转染VEGF-siRNA对A549细胞VEGF mRNA表达影响。4、Western印迹检测转染VEGF-siRNA对A549细胞VEGF蛋白表达影响。5、MTT比色法检测各组细胞增殖能力改变。6、Transwell模型检测各组A549细胞体外侵袭能力结果1在设计的12条VEGF-siRNA中发现靶向VEGF mRNA 1220 1238位点(序列为 “GATCCGCAGACGTGTAAAT”)的siRNA有较为理想的抑制VEGF mRNA表达的效果，其抑制效率 为73%，经文献检索尚未发现有该位点被用于设计siRNA的文献报道，因此，本专利所发现 的VEGF基因位点和基于该位点所设计的VEGF-siRNA具有自主知识产权。2ffestern blot检测转染前后A549细胞内源性VEGF蛋白表达结果显示与对 照组(0. 73士0.01)相比，转染VEGF-siRNA后A549细胞内源性VEGF蛋白表达明显降低 (0. 38 士 0. 01，P < 0. 01)；3MTT实验显示单纯转染VEGF-siRNA组1 4d细胞增殖与对照组无差别(P > 0. 05)，5 6d明显低于对照组水平(P < 0.01)4细胞体外侵袭实验显示在Transwe 11小室中接种细胞后20h，与对照组 (108士9)比较，VEGF-siRNA组穿膜细胞数明显减少(56士9，P < 0. 01)，表明所设计的 VEGF-siRNA可降低A549细胞侵袭能力。
权利要求
一种可特异性结合人血管内皮生长因子(VEGF)基因的小干扰RNA(siRNA)，其沉默的VEGF mRNA(序列号NM 001033756；CDS492 1607)位点(1220～1238)序列为“GATCCGCAGACGTGTAAAT”。
2.含有权利要求1中的siRNA序列及可药用载体的药物组合物。
3.权利要求1中的siRNA用于制备抗肺癌及其它恶性肿瘤细胞增殖转移药物的用途。
全文摘要
本发明提供一种抑制人肺癌细胞增殖转移的siRNA的结构及用途。本发明涉及生物工程药物领域，具体地说是根据人血管内皮生长因子(vascular endothelial growthfactor，VEGF)基因序列信息，设计、合成、筛选小干扰RNA(small interference RNA，siRNA)，用于抑制(沉默)人VEGF基因表达从而抑制肺癌等恶性肿瘤细胞增殖及侵袭转移。本发明设计、发现了互补于VEGF mRNA特定区域的siRNA体外对培养的人肺癌A549细胞的增殖转移有抑制效应。故本发明涉及到针对VEGF基因的siRNA序列、结构及其成为预防和治疗肺癌等恶性肿瘤细胞增殖转移的新型药物。
文档编号A61P35/00GK101942441SQ20101011937
公开日2011年1月12日 申请日期2010年3月8日 优先权日2010年3月8日
发明者江其生 申请人:江其生
技术领域：
本发明涉及生物工程药物领域，具体地说是一种针对血管内皮生长因子 (vascular endothelial growthfactor, VEGF)基因的小干扰 RNA(small interference RNA, siRNA)的序列结构及其成为治疗肺癌等恶性肿瘤细胞增殖及侵袭转移的新型药物。
背景技术：
肺癌已成为引起人类死亡的常见疾病之一，在我国大中城市的发病率与死亡率均 居各种恶性舯瘤首位。尽管采用多种治疗方法，但患者3年及5年生存率仍很低，导致患者 死亡的主要原因与肿瘤的复发与转移直接相关。癌细胞的增殖和侵袭转移是一个多因素调控的复杂过程。癌细胞的增殖是肿瘤 细胞通过细胞分裂增加细胞数量和增大肿瘤体积的过程，肿瘤体积的增大会破坏所在组织 器官的结构与功能。癌细胞的侵袭转移是指肿瘤细胞脱离原发部位，侵入并穿过周围基质 (此阶段为侵袭)，经血液或淋巴循环向远处扩散(该阶段为转移)的过程。研究显示，肿瘤细胞分泌的血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)在新血管形成和癌细胞的增殖及侵袭转移中发挥着重要作用，VEGF无论是 在体外培养的肺癌细胞中，还是在荷瘤动物的肿瘤细胞中，或是在人体肺癌组织中均有高 表达，且VEGF表达水平与肺癌预后密切相关。Ohta等[OhtaY，et al. Chest, 2002,121 1624-1627]对肺癌研究发现，有淋巴结转移的原发灶VEGF表达水平高于无转移者，在 转移淋巴结中VEGF的表达高于原发灶。VEGF是肺癌预后的独立因子，VEGF表达高的患 者预后较差[Seto T, et al. Lung Cancer, 2006, 53 (1) 91-96 ；SadasiwanC, et al. ASCO MeetingAbstract,2007，25 7696]。因此，利用相关技术手段降低VEGF表达就有可能降低肺癌增殖及转移的发生率， 延长患者生命，提高患者生存率和生活质量。RNAi是1998年建立的一种简便快速的转录后基因干预技术，通过20 23个碱 基对的小分子双链RNA片段特异性地与同源序列基因结合，从而沉默靶基因，可代替传统 DNA水平的基因敲除技术。与传统反义技术相比，RNAi具有作用特异性强，效果好、持续时 间长、细胞内表达稳定、可遗传等优势，可广泛用于目的基因的沉默[Liu G，et al. Histol Histopathol. 2007,22(2) 211-217 ；Fuchs U，et al. Adv cancer Res. 2007，96 :75_102·]。 2003年以来，RNAi在代谢性疾病、病毒感染性疾病、多种恶性肿瘤、神经系统疾病和药物筛 选等领域的研究应用日益广泛。鉴于RNAi技术的巨大价值与广阔应用前景，2002年美国 《SCIENCE》杂志将其评为全球年度十大科学进展之首。而RNAi的发现者美国科学家Craig Mello和Andrew Fire也因此荣获2006年诺贝尔生理学及医学奖。本发明的目的在于寻找能特异高效抑制肺癌细胞增殖的新型基因药物，即能明显 降低VEGF基因表达的小分子干扰RNA(SiRNA)及能改善其生物活性的化学修饰衍生物。
发明内容
本发明的内容是根据VEGF mRNA的序列信息和生物信息学技术设计若干靶向VEGF mRNA的siRNA序列，分别构建VEGF_siRNA质粒载体，转染A549细胞，建立转染细胞稳定株， 以荧光定量PCR检测VEGF-siRNA对VEGF mRNA表达的抑制效果。结果显示有1条siRNA 序列具有较为理想的抑制VEGF mRNA表达并在体外细胞学实验中能明显抑制A549细胞增 殖和转移，提示可用于肺癌细胞增殖转移的预防与治疗。根据本发明，针对美国国立生物技术信息中心NCBI数据库中人VEGF mRNA的序列 全长(序列号:NM001033756, CDS =492-1607)中1220 1238位点设计的siRNA能能抑制 VEGF基因表达，有可能成为预防和治疗肺癌等恶性肿瘤侵袭转移的新型生物工程药物。根据本发明，为增强siRNA的核酸酶抗性、生物利用度、组织靶向性等，本发明包 含了 VEGF-siRNA的各种化学修饰。根据本发明，发明的VEGF-SiRNA及其修饰物可按本领域已知方法配成非肠道给 药的试剂。根据本发明，本发明的VEGF-siRNA及其修饰物治疗组成可应用单独的有效成分 或组合物形式包括联合其它反义核酸及其衍生物。根据本发明，本发明的治疗组成，依不同情况包括特定药物的药物动力学、药代动 力学、给药模式、给药途径、受者的年龄、体重、肝肾功能状态、疾病的性质、程度及治疗时限 等，以适量的剂量给药。根据本发明，本发明的实施对严重危害人类健康的肺癌等恶性肿瘤增殖转移的预 防与治疗具有重要的社会和经济效益。
具体实施例方式实验设计、方法与实验结果如下1、siRNA设计合成及质粒载体构建在美国国立生物技术信息中心NCBI数据库中获取人VEGF mRNA的序列全长(序 列号匪001033756，⑶S =492-1607)。依据siRNA设计原则，结合设计软件和文献报道，分 别设计了 12条VEGF-siRNA靶序列。各siRNA靶序列长度19bp，均行BLAST比对检查，以保 证和其它基因没有同源性，合成的siRNA转录模板长度为64bp，在序列中间为加入9bp茎环 序列分隔的正反向靶序列，尾端插入5个T作为终止序列。上游和下游分别加了 BamHI和 HindllI酶切位点。质粒(经HindIII和BamHI酶切后与合成的表达模板DNA片段用T4DNA 连接酶连接，反应条件16°C，8h)改造可表达GFP，转化DH5ci菌株，涂卡那霉素琼脂平板， 挑选阳性克隆，扩增并提取质粒，用BamHI和Hind IlI双酶切鉴定。酶切鉴定正确的克隆 送生物公司测序。pGCsilencerTM U6/Neo/GFP/RNAi载体由上海吉凯基因化学公司合成。2、筛选转染VEGF-siRNA肺癌A549细胞稳定株2. 1瞬时转染①取复苏后第三代处于对数生长期的A549细胞，台盼蓝染色，存活 率> 95 %，显微镜下计数，以2 X 105个细胞/孔接种于24孔板内。细胞汇合度60 % 80 % 进行转染。②质粒DNA 1 μ g加入50 μ IOPTI-MEM中混勻；Lipofectamine 20002 μ 1加入 50 μ 1 OPTI-MEM中混合均勻，室温静置5min。Lipofectamine2000稀释液加入质粒DNA稀 释液中混勻，室温静置20min。吸弃细胞培养板内培养液，OPTI洗细胞两次，加入500 μ 1
40ΡΤΙ-ΜΕΜ。将混合液100 μ 1缓慢加入细胞培养板内，同时轻轻晃动培养板。37°C、5% C02 培养箱中培养，5h后换含10% FBS的1640培养液。2. 2 G418筛选转染稳定株瞬时转染后24h细胞按1 3传代，继续培养48h，吸弃培养液，加入含 G418500yg/ml的含10% FBS1640培养液。隔日换液，6d后大量细胞死亡，G418浓度调整 至200 μ g/ml，继续培养至单克隆形成。荧光显微镜下挑选出表达GFP的阳性克隆，转至培 养瓶内扩增。以GFP为报告子，荧光显微镜下观察细胞转染率。3、荧光定量PCR检测转染VEGF-siRNA对A549细胞VEGF mRNA表达影响。4、Western印迹检测转染VEGF-siRNA对A549细胞VEGF蛋白表达影响。5、MTT比色法检测各组细胞增殖能力改变。6、Transwell模型检测各组A549细胞体外侵袭能力结果1在设计的12条VEGF-siRNA中发现靶向VEGF mRNA 1220 1238位点(序列为 “GATCCGCAGACGTGTAAAT”)的siRNA有较为理想的抑制VEGF mRNA表达的效果，其抑制效率 为73%，经文献检索尚未发现有该位点被用于设计siRNA的文献报道，因此，本专利所发现 的VEGF基因位点和基于该位点所设计的VEGF-siRNA具有自主知识产权。2ffestern blot检测转染前后A549细胞内源性VEGF蛋白表达结果显示与对 照组(0. 73士0.01)相比，转染VEGF-siRNA后A549细胞内源性VEGF蛋白表达明显降低 (0. 38 士 0. 01，P < 0. 01)；3MTT实验显示单纯转染VEGF-siRNA组1 4d细胞增殖与对照组无差别(P > 0. 05)，5 6d明显低于对照组水平(P < 0.01)4细胞体外侵袭实验显示在Transwe 11小室中接种细胞后20h，与对照组 (108士9)比较，VEGF-siRNA组穿膜细胞数明显减少(56士9，P < 0. 01)，表明所设计的 VEGF-siRNA可降低A549细胞侵袭能力。
权利要求
一种可特异性结合人血管内皮生长因子(VEGF)基因的小干扰RNA(siRNA)，其沉默的VEGF mRNA(序列号NM 001033756；CDS492 1607)位点(1220～1238)序列为“GATCCGCAGACGTGTAAAT”。
2.含有权利要求1中的siRNA序列及可药用载体的药物组合物。
3.权利要求1中的siRNA用于制备抗肺癌及其它恶性肿瘤细胞增殖转移药物的用途。
全文摘要
本发明提供一种抑制人肺癌细胞增殖转移的siRNA的结构及用途。本发明涉及生物工程药物领域，具体地说是根据人血管内皮生长因子(vascular endothelial growthfactor，VEGF)基因序列信息，设计、合成、筛选小干扰RNA(small interference RNA，siRNA)，用于抑制(沉默)人VEGF基因表达从而抑制肺癌等恶性肿瘤细胞增殖及侵袭转移。本发明设计、发现了互补于VEGF mRNA特定区域的siRNA体外对培养的人肺癌A549细胞的增殖转移有抑制效应。故本发明涉及到针对VEGF基因的siRNA序列、结构及其成为预防和治疗肺癌等恶性肿瘤细胞增殖转移的新型药物。
文档编号A61P35/00GK101942441SQ20101011937
公开日2011年1月12日 申请日期2010年3月8日 优先权日2010年3月8日
发明者江其生 申请人:江其生
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