依地酸钙钠与皮质激素复方制剂在制备抑制结缔组织生长因子、单胺氧化酶药物中的应用的制作方法

专利名称：：依地酸钙钠与皮质激素复方制剂在制备抑制结缔组织生长因子、单胺氧化酶药物中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及依地酸钙钠与皮质激素复方制剂在制备治疗人类疾病中的药物中的应用，又涉及一种依地酸钙钠与皮质激素复方注射剂。
背景技术：
：依地酸钙钠(Ca-Na2EDTA)是一种金属离子螯合剂，能够用于能与多种二价、三价金属螯合，形成稳定的可性金属络合物，现有的依地酸钙钠制剂主要为注射剂(lg，5ml)和片剂(0.5g/片)，在临床上主要用于治疗无机铅中毒，对铜、锌、铁、锰、镉、钒、钴及某些放射性元素如钍、铀、镭、钚等亦有一定的促排作用，但可以引起肾脏损害，使近曲小管发生严重水肿性退行性变等副作用，最主要的毒性作用是肾小管坏死，尿中出现蛋白、红白细胞、管型，也可出现肾功能衰竭，及时停药可以恢复。造成肾损害的原因，可能是由于大量金属络合物于短时间内经过肾脏上皮细胞，其中一部分离解，释出高浓度的金属离子，影响细胞酶活性所致，由于依地酸钙钠可能产生对肾脏的副作用，因此应用受到一定限制，一般被认为不能长期使用。肺纤维化是"弥漫性间质性肺疾病"即"间质性肺疾病"的简称。肺纤维化是一大组弥漫性肺实质疾病群，病理特征是肺泡壁(包括呼吸性细支气管)弥漫性慢性炎症和间质纤维化。特发性肺纤维化(idiopathicpulmonaryfibrosis,IPF)是最常见肺纤维化类型，占所有肺纤维化的65%。其它肺纤维化类型主要有矽肺、药物、中毒等引的肺纤维化。IPF病因不明，发病机制亦未完全阐明，但已有足够证据表明与免疫炎症损伤有关，多种发病机理完全不同的自身免疫性疾病如哮喘、慢性阻塞性肺炎、红斑狼疮、系统性硬化症均有相当一部分病例会并发肺纤维化疾病，因此在临床上多使用糖皮质激素和其它免疫抑制剂如来治疗肺部纤维化，然而由于糖皮质激素和其它免疫抑制剂具有很多副作用，并且对于其它类型的肺纤维化治疗效果也不明显，在使用时受到很多限制。其它治疗肺纤维化的药物主要有青霉胺，秋水仙碱等，但由于这些药物在治疗肺纤维化时疗效并不确切，并且副作用很大，因此在使用时也受到很大限制。朴红梅等(结缔组织生长因子在支气管哮喘大鼠肺组织中的表达及其与气道重塑的关系，中国呼吸和结核杂志，2007.9,705-707)公开了结缔组织生长因子CTGF与肺纤维化等多种器官纤维化有关，而单胺氧化酶(MA0)是一种细胞外酶，无FAD而含有磷酸吡哆醛，只对伯胺起作用。血清中MA0和结缔组织中的MA0性质相似，能促进结缔组织的成熟，在胶原形成过程中，参与胶原成熟的最后阶段架桥形成，使胶原和弹性硬蛋白结合。上述CTGF和MAO均是肺纤维化中起重要作用的酶或因子，现有技术中的治疗药物由于不能向针对肺纤维化的致病因子，因此治疗效果差。冯立等(肺耙向微粒的研究概况，中国药业，2005年第15巻第12期，1-2)公开了，粒径730iitm的微粒静脉注射后在肺部蓄积，从而产生肺部靶向作用。因此，找到一种能够针对肺纤维化致病因子或酶产生治疗作用的药物，更进一步的找到一种成为现有技术中要解决的问题。
发明内容为解决现有技术问题，我们意外的发现，依地酸钙钠能够同时抑制结缔组织生长因子(CTGF)和单胺氧化酶，治疗肺部纤维化。同时更为意外的是依地酸钙钠在治疗不同病因引起的肺部纤维化还存在一定的差异，依地酸钙钠对于由哮喘、慢性阻塞性肺炎引起的肺部纤维化疾病具有更好的疗效，目前造成这种情况的原因还不明确，可能是不同疾病引起肺部的结缔组织生长因子CTGF、单胺氧化酶(MAO)不同造成的，也有可能是不同疾病引起肺部纤维化机理不同造成的。另外我们还发现采用糖皮质激素与依地酸钙钠制成的复方制剂可以产生更好的治疗效果，同时降低依地酸钙钠和糖皮质激素的使用量，以降低依地酸钙钠的副作用。本发明提供了一种依地酸钙钠与皮质激素制成的复方制剂，由作为活性成分的依地酸钙钠与皮质激素和一种或几种可药用的辅料组成。本发明提供了依地酸钙钠与皮质激素制成的复方制剂在制备抑制人或哺乳动物结缔组织生长因子、单胺氧化酶药物中的应用。本发明还提供了依地酸钙钠与皮质激素制成的复方制剂在制备治疗人或哺乳动物肺部纤维化疾病药物中的应用。所述的肺部纤维化疾病为系统性硬化症引起的肺部纤维化疾病，红斑狼疮引起的肺部纤维化疾病，慢性阻塞性肺炎引起的肺部纤维化疾病，哮喘引起的肺部纤维化疾病，特发性肺纤维化以及矽肺引起的肺部纤维化。所述依地酸钙钠与皮质激素制成的复方制剂在治疗上述疾病时的依地酸钙钠的剂量为0.l-lg/日，优选为0.1-0.5g/日，糖皮质激素剂量为0.lmg-5mg，优选0.5_2mg/日。所述的复方制剂为注射剂，由作为活性成分的依地酸钙钠与皮质激素和一种或几种适用于注射剂的辅料组成。所述的皮质激素优选可溶于水的糖皮质激素，优选地塞米松磷酸钠、倍他米松磷酸钠。所述依地酸钙钠与皮质激素制成的复方注射剂，含有重量百分比2_20%的依地酸钙钠，重量百分比0.01-0.1%的糖皮质激素以及可用于注射剂的辅料；所述的糖皮质激素优选地塞米松磷酸钠、倍他米松磷酸钠一种或几种。所述的辅料优选为余量的注射用水；所述辅料还可以含有丙二醇，所述丙二醇的用量为0-30%，优选丙二醇含量为0-5%。所述辅料还可以含有作为pH缓冲剂的磷酸盐。所述用量均为注射剂的重量体积比。所述注射剂还可以制成肺部靶向注射剂，所述制成肺部靶向注射剂为微球剂，微囊剂，脂质体注射剂，所述微球、微囊、脂质体的粒径优选7-30ym，所述肺靶向制剂优选为脂质体注射液。本发明提供了依地酸钙钠在抑制人或哺乳动物结缔组织生长因子、单胺氧化酶药物中的应用，治疗人或哺乳动物肺部纤维化疾病药物中的应用，为了克服依地酸钙钠在长期使用时对肾脏产生的副作用，本发明提供了一种依地酸钙钠与糖皮质激素复方注射剂，4与现有技术中用于治疗肺部纤维化疾病的皮质激素如地塞米松磷酸钠注射液相比，该复方制剂能够更好的抑制结缔组织生长因子CTGF和单胺氧化酶(MAO)从而对肺部纤维化进行更有针对性的治疗，同时我们意外的发现，与单纯的依地酸钙钠相比，本发明提供的复方制剂在较低的依地酸钙钠用量下实现了较好的治疗效果，更有利于患者较长时间的使用。依地酸钙钠在治疗于哮喘引起的肺部纤维化时产生了更好的治疗效果，与地塞米松等激素类药相比，本发明提供的药物更加适用于治疗哮喘引起的肺部纤维化。同时由于实验表明，依地酸钙钠没有皮质激素的副作用，不会引起体重减少等副作用，更适用于长期治疗使用。具体实施例以下具体实施方式仅为对本发明技术方案实施的说明，不能解释为对本发明技术方案的限制，在配制封装过程中采用充氮方法避免氧化发生。还可以按照《中国药典》2005版中附录158液公开的的pH=6.57.0的磷酸盐缓冲液的配制方法，实施例1制备注射液地塞米松磷酸钠lg磷酸氢二钠lg磷酸二氢钠0.05g依地酸f丐钠200g将处方量地塞米松磷酸钠溶于适量的注射用水中，加入处方量的磷酸盐，搅拌溶清，加入依地酸钙钠。加注射用水至1000ml，溶清，过滤、分装、得到注射液每ml含有地塞米松磷酸钠lmg，依地酸^钠0.2g。实施例2地塞米松磷酸钠0.5g磷酸氢二钠lg依地酸钙钠200g磷酸二氢钠0.05g将处方量的地塞米松磷酸钠原料药溶于适量的注射用水中加入处方量的磷酸盐，加注射用水至1000ml，过滤、分装、灭菌得到注射液每ml含有地塞米松磷酸钠0.5mg、依地酸牵丐钠0.2g实施例3地塞米松磷酸钠磷酸氢二钠磷酸二氢钠0.lglg0.lg依地酸钙钠200g将处方量的地塞米松磷酸钠原料药溶于适量的注射用水加入处方量的磷酸盐，搅拌溶清，加入依地酸钙钠，加注射用水至1000ml，溶清过滤、分装、灭菌得到注射液每ml含有地塞米松磷酸钠0.lmg，依地酸钙钠0.2g。实施例4地塞米松磷酸钠lg磷酸氢二钠lg磷酸二氢钠0.05g药用丙二醇10g依地酸钙钠20g将处方量的地塞米松磷酸钠原料药溶于适量的注射用水加入处方量的磷酸盐、药用丙二醇搅拌均匀，加入溶清的依地酸钙钠溶液，加注射用水至1000ml，溶清过滤、分装、灭菌得到注射液每ml含有地塞米松磷酸钠lmg，依地酸钙钠0.02g。实施例5注射液地塞米松磷酸钠0.磷酸氢二钠lg磷酸二氢钠0.05g药用丙二醇20g依地酸钙钠20g注射用水至1000ml，将处方量的地塞米松磷酸钠原料药溶于适:的注射用水加入处方量的磷酸盐、药用丙二醇搅拌均匀，加入溶清的依地酸钙钠溶液，加注射用水至lOOOml，溶清过滤、分装、注射液每ml含有地塞米松磷酸钠0.5mg，依地酸钙钠0.02g。实施例6倍他米松磷酸钠0.lg药用丙二醇10g依地酸f丐钠20g注射用水至1000ml，将处方量的倍他米松磷酸钠原料药溶于适量的注射用水加入处方量的磷酸盐、药用丙二醇搅拌均匀，加入溶清的依地酸钙钠溶液，加注射用水至1000ml，溶清过滤、分装、注射液每ml含有倍他米松磷酸钠0.lmg，依地酸*丐钠0.02g。实施例7地塞米松磷酸钠lg依地酸f丐钠200g注射用水至1000ml，将处方量的地塞米松磷酸钠原料药溶于适量的注射用水加入处方量药用丙二醇搅拌均匀，加入溶清的依地酸钙钠溶液，加注射用水至1000ml，溶清过滤、分装、注射液每ml含有地塞米松磷酸钠lmg，依地酸钙钠0.2g。实施例8倍他米松磷酸钠0.5g依地酸钙钠100g注射用水至lOOOml，将处方量的倍他米松磷酸钠原料药溶于适量的注射用水加入处方量药用丙二醇搅拌均匀，加入溶清的依地酸钙钠溶液，加注射用水至1000ml，溶清过滤、分装、注射液每ml含有倍他米松磷酸钠0.5mg，依地酸钙钠0.lg。实施例9地塞米松磷酸钠0.lg依地酸钙钠lOOg注射用水至lOOOml，将处方量的地塞米松磷酸钠原料药溶于适量的注射用水加入处方量药用丙二醇搅拌均匀，加入溶清的依地酸钙钠溶液，加注射用水至1000ml，溶清过滤、分装、注射液每ml含有地塞米松磷酸钠0.lmg，依地酸钙钠0.lg。药理实施例1、对肺纤维化模型大鼠的作用6博莱霉素造模组雄性SD大鼠，SPF级，体重(300±20)g，将造模成功后随机分为模型组、假手术组(阴性对照组)和实验组i-io组，每组io只。各实验组给药情况如下表，表1(地塞米松磷酸钠，DEX;倍他米松磷酸钠，BEX;依地酸钙钠，EDTA)实验组1实验组2实验组3实验组4实验组5实验组6实验组7实验组8实验组9实验组10给药实施例1实施例2实施例3实施例4实施例5实施例7实施例9实施例8日剂量(DEX)mg/kg0.20.10.050.250.250.10.05lmg/kg日剂量(BEX)mg/kg0.25日剂量(EDTA)mg/kg8040100510205050100对照药物采用市售0.5%地塞米松磷酸钠注射液(以地塞米松磷酸钠计)、和市售20%依地酸钙钠注射液各组以12%乌拉坦腹腔内注射麻醉动物后，在额镜直视下将硬脊膜外麻.醉导管插入气管l-2cm，观察到导管内液柱随动物呼吸而波动后，对实验组和模型组按5mg/kg剂量缓慢注入博来霉素A5制作肺纤维化模型。假手术组只进行手术，不注入博来霉素。各组采用静脉注射给药，连续给药14d后(假手术组和对照组采用生理盐水)，分别对动物进行肺功能检测、脏器系数检测、CTGF检测并检测实验动物血清中的MAO(单胺氧化酶)含量。检测结缔组织生长因子CTFG在实验大鼠肺纤维化中的表达，实验仪器与试剂为CTGF-mRNA原位杂交试剂盒(武汉博±德生物工程有限公司)；0LYMPUSCX41图象采集显微镜(OLYMPUS公司)；复日FR-988生物显微图像分析软件(上海复日科技有限公司)。对实验动物的肺组织石蜡切片进行原位杂交；CTGFmRNA采用下列mRNA序列(5，-CTGCTGCCGCGTCTGCGCCAAGCAGCTGGG-3，；5'-CAACTGCCTGGTCCAGACCACAGAGTGGAG-3，；5'-TGTACTACAGGAAGATGTACGGAGACATGG-3')作为寡核苷酸探针。严格按照说明书进行操作。用PBS代替杂交液作为阴性对照。实验基底保持相对无菌，实验所用试剂均由含DEPC水配制以消除RNA酶的作用，所有实验用品均经高压消毒，整个操作过程戴口罩、手套，避免交叉污染，出现假阳性。胞浆内出现棕黄色颗粒即为阳性。7结果判定每个标本随机取5个不同的高倍视野(X400)，每个视野计算出两个平均灰度值(平均灰度值和阳性表达强度呈反比关系)。CTGF因子检测结果(i±s，n=10，平均灰度值范围0_1，值越小，阳性越强)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>与模型组相比，实验各组GTGF因子的平均灰度值均有显著提高(P<0.01)，并且采用复方制剂的实验组1-8的平均灰度值也显著高于采用地塞米松磷酸钠的实验组10(P<0.05)，说明本发明提供的复方制剂可以抑制CTGF因子的产生从而治疗肺部纤维化，在相同依地酸钙钠剂量下，采用本发明提供的复方制剂的实验组的平均灰度值显著高于单纯采用依地酸*丐钠的实验组。血清中单胺氧化酶(MAO)活力的检测结果(又士s，n=10，U/h/mgprot)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>与模型组相比，实验各组血清中单胺氧化酶(MAO)活力均有显著降低(P<0.05)，并且采用本发明提供的复方制剂的的实验组1-8的酶活力也低于采用采用地塞米松磷酸钠的实验组IO，说明依地酸钙钠可以抑制单胺氧化酶从而治疗肺部纤维化。特别是与单纯采用依地酸钙钠的实验组8相比，本发明提供的复方制剂以更小剂量的依地酸钙钠实现了相当或更好的抑制单胺氧化酶效果。动物肺功能检查方法以10%戊巴比妥钠(50mg/kg)腹腔注射麻醉动物后，将其固定在木板上，在无菌操作下做颈部正中切口，充分暴露气管，并下穿手术线待固定气管插管。在气管下段做一小"T"形切口，将自制的气管插管固定于气管内，然后将麻醉大鼠放入体描箱中，打开肺功能仪各开关，调整各项参数到备用状态后，将气管插管与体描箱中的导管联通，关闭体描箱，行肺功能检查，检查完毕后保存各项数据，计算每分钟通气量、肺顺应性。肺功能检测于处死实验动物前进行。动物肺功能分析系统型号AniRes2003，购于北京贝兰博科技公司。检验结果如下(5±s，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>与模型组相比，实验各组肺功能均有显著提高(P<0.01)，并且采用本发明提供复方制剂的实验组1-8的各组肺功能也好于采用地塞米松磷酸钠的实验组10，同时，复方制剂在较低的依地酸钙钠剂量和皮质激素剂量下实现了比较高的依地酸钙钠更好或相当的治疗效果，说明本发明提供复方制剂可以很好的治疗肺部纤维化。于肺功能检查后检测脏器系数，处死前称取大鼠体重，处死后，取肺脏，清除淤血和污物后计算脏器系数，脏器系数=(大鼠肺重量/大鼠体重)X1000，脏器系数检测结果(又土s，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>与模型组相比，实验各组脏器系数均有显著降低(P<0.01)，并且采用依地酸钙钠的实验组1-8的脏器系数也低于采用地塞米松磷酸钠的实验组IO，说明本发明提供的复方制剂可以很好的治疗肺部纤维化，说明本发明提供的复方制剂在治疗肺部纤维化的同时，能够很好的克服皮质激素容易引起体重降低的副作用。2、严重哮喘致肺部纤维化模型雄性SD大鼠，SPF级，体重(305±20)g，采用鸡卵蛋白(0VA，美国Sigma公司产品)即每组各在腹腔注射OVA10mg，Al(OH)310mg，生理盐水lml的混悬液，第10天重复一次；12天(即第18天)开始激发，给予1%OVA生理盐水5ml雾化吸入，每天1次，每次30min，持续2周，对照组采用生理盐水代替。取造模成功的大鼠分成实验组l-10、模型组，每组10只，对照组取10只，采用静脉给药，对照组和模型组采用生理盐水代替，连续给药14d后，检测血清中单胺氧化酶(MAO)活力和肺功能。各实验组给药情况如下表，表2(地塞米松磷酸钠，DEX;倍他米松磷酸钠，BEX;依地酸钙钠，EDTA)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>经过检测，模型组以及各实验组的血清中单胺氧化酶(MAO)活力与博莱霉素造模的模型组及相应实验组相比无显著差异，说明对于严重哮喘致肺部纤维化模型，各实验组药物的降低血清中单胺氧化酶(MAO)活力作用与对博莱霉素致肺纤维化模型基本相同。肺功能检查结果如下(X±s，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>本发明提供的复方制剂对于严重哮喘致肺部纤维化的模型的治疗效果比对于博来霉素致肺纤维化模型的治疗效果更好。经过同样的复方制剂的治疗，严重哮喘致肺部纤维化的模型动物的肺功能改善情况好于博来霉素致肺纤维化模型，与此同时，经过同样的地塞米松磷酸钠的治疗，博来霉素致肺纤维化模型动物的肺功能改善情况却好于严重哮喘致肺部纤维化的模型，说明与地塞米松磷酸钠相比，本发明提供的复方制剂更适合于对严重哮喘或慢性阻塞性肺炎引起的肺部纤维化的治疗。权利要求一种依地酸钙钠与皮质激素制成的复方制剂，由作为活性成分的依地酸钙钠与皮质激素和一种或几种可药用的辅料组成。2.如权利要求1所述的复方制剂在制备抑制人或哺乳动物结缔组织生长因子、单胺氧化酶药物中的应用。3.如权利要求1所述的复方制剂在制备治疗人或哺乳动物肺部纤维化疾病药物中的应用。4.如权利要求1所述的复方制剂，其特征是所述的制剂为注射剂，由作为活性成分的依地酸钙钠与皮质激素和一种或几种适用于注射剂的辅料组成。5.如权利要求1所述，其特征所述的复方制剂在治疗时依地酸钙钠的剂量为0.l-lg/日，糖皮质激素剂量为0.lmg-5mg/日。6.如权利要求4所述的注射剂，含有重量百分比2-20%的依地酸钙钠，重量百分比0.01-0.1%的糖皮质激素以及可用于注射剂的辅料。7.如权利要求6所述的注射剂，特征是所述的糖皮质激素优选地塞米松磷酸钠、倍他米松磷酸钠一种或几种。8.如权利要求6或7所述的注射剂，其特征是所述的辅料优选为余量的注射用水。9.如权利要求6-8任一所述的注射剂，其特征是所述辅料还可以含有丙二醇，所述丙二醇的用量为0-30%。10.如权利要求6-9任一所述的注射剂，其特征是所述辅料还可以含有作为pH缓冲剂的磷酸盐。全文摘要依地酸钙钠与皮质激素复方制剂在制备抑制结缔组织生长因子、单胺氧化酶药物中的应用，提供了一种依地酸钙钠与皮质激素制成的复方制剂，由作为活性成分的依地酸钙钠与皮质激素和一种或几种可药用的辅料组成，所述复方制剂含有重量百分比2-20％的依地酸钙钠，重量百分比0.01-0.1％的糖皮质激素以及可用于注射剂的辅料。文档编号A61P11/00GK101791313SQ20101012610公开日2010年8月4日申请日期2010年3月17日优先权日2010年3月17日发明者于润芳,刘凯,吴媛媛,张冬兰,张岚,李静,杨国存,林劼,王虹,程振国,肖敏霞申请人:天津金耀集团有限公司