溶液相合成低聚核苷酸的结构单元的制作方法
专利名称：溶液相合成低聚核苷酸的结构单元的制作方法
技术领域：
本发明涉及用酶方法由常规的前体制备3′-O和5′-O-乙酰丙酰基核苷的方法。这些方法对大规模生产低聚核苷酸很有用。
发明的
背景技术：
已经知道哺乳动物的身体状况，包括大部分疾病症状都会受到蛋白质的影响。这些蛋白质或者直接作用或通过它们的酶作用对动物和人的很多疾病有很大作用。传统的治疗方法一般集中在与这些蛋白质的相互作用，以努力减少这些疾病的起因或疾病可能的功能。但是，最近在尝试通过与这些蛋白质直接合成的例如细胞内RNA的相互作用减少这些蛋白质的实际生成量。通过对蛋白质生成过程的干扰希望能够达到最大的治疗效果和最小的副作用。这些治疗方法的一般目的是干扰或者减少导致不希望生成的蛋白质的基因表达。
抑制特定基因表达的一种方法是使用低聚核苷酸和低聚核苷酸类似物作为“反义”剂。使用与特定的、靶、信使RNA(mRNA)序列有互补作用的低聚核苷酸和低聚核苷酸类似物。反义的方法常常直接指向相对较小的低聚核苷酸和低聚核苷酸类似物与单链mRNA或单链DNA的互补杂交，如此可使这些细胞内核酸的正常、基本功能被切断。杂交是低聚核苷酸和低聚核苷酸类似物与RNA的Watson-Crick碱基对或单链DNA的序列以特定氢键键合。这些碱基对被认为是相互互补的。
现已经接受以低聚核苷酸和低聚核苷酸类似物作为治疗剂，对作为治疗和诊断的方法有更大的期望。但是用作反义剂的低聚核苷酸和低聚核苷酸类似物在用于治疗、诊断和作为研究试剂时常常需要大量生产低聚核苷酸和低聚核苷酸类似物。
生产低聚核苷酸有三种基本方法。Reese，Tetrahedron 1978，34，3143描述了磷酸三酯的方法；氨基磷酸(phosphoramidite)法由Beaucage在Methods in Molecular BiologyProtocols for Oligonucleotides andAnalogs描述；Agrawal编辑，Humana PressTotowa，1993，Vol.20，33-61；以及H-膦酸酯法由Froehier描述在Methods in Molecular BiologyProtocols for Oligonucleotides and Analogs，Agrawal编辑；Humana PressTotowa，1993，Vol.20，63-80。
磷酸三酯法被广泛用于溶液相合成，而氨基磷酸法和H-膦酸酯法主要应用于固相合成。最近，Reese报道了低聚核苷酸在H-膦酸酯上耦合的液相合成新方法，参见Reese等人，Nucleic Acids Research，1999，27，963-971，和Reese等人，Biorg.Med.Chem.Lett.，1997，7，2787-2792，它们被引入此文作为参考。溶液相合成是大规模生产低聚核苷酸选用的方法。
这些溶液相方法需要应用在3’-位和/或5’-位带有保护基团的核苷单体结构单元。保护基团在耦合条件下和选择性分解时应该是稳定的，不会影响分子中的其它保护基团。一种这样的保护基团是乙酰丙酰基-C(O)-(CH2)2-C(O)-CH3。但是，带有这些保护基团的核苷的制备包括几个冗长的化学保护/脱保护和/或纯化步骤。
例如，核苷的3′，5′-二-O-乙酰丙酰基保护用已知的方法完成，通过使核苷与乙酰丙酸在DCC(二环己基碳二亚胺)存在下进行反应，使其中的核苷在其羟基位置进行选择性酰化。虽然使用了这种方法，依然至少存在一个重要的问题。该方法需要大量过量的DCC以达到最佳的产率。在完成反应之后过量的DCC转化成DCU(二环己基碳二亚胺)，必须将其由反应混合物中分离。不辛的是，在大规模合成时，分离步骤需要可观的时间和费用。
在本发明之前，5′-O-乙酰丙酰基核苷的合成是通过使母体核苷与乙酰丙酸和2-氯-1-甲基氯化吡啶鎓进行反应来完成。Iwai等人，Nucleic Acids Res.，1988，16，9443-9456；Iwal等人，Tetrahedron，1990，46，6673-6688。但是，由于此方法对5′-羟基官能团不能进行选择性酰化，必须另外进行纯化和脱保护步骤，因为在反应中会形成3′-酰基和3′，5′-二酰基衍生物。通过色谱法将3′，5′-二酰基衍生物分离出来之后，残余物必须用DMTrCl处理以除去3′-酰基化合物。最后，还要附加色谱纯化步骤以很低的产率分离5′-O-乙酰丙酰基衍生物。
以前，3′-O-乙酰丙酰基核苷(2′-脱氧或2′-保护的)的合成是通过用乙酰丙酸或乙酰丙酸酐和DCC处理母体核苷来实现的。此方法主要的缺点之一是在用乙酰丙酸酰化之前必须将5′-羟基官能团保护成为5′-O-DMTr基团，而5′-O-DMTr基团必须在酸介质中除去以得到3′-O-保护的核苷。参见Reese等人，Nucleic Acids Res.，1999，27，963-971，和Reese等人，J.Chem.Soc.，Perkin Trans.，1，1999，1477-1486。
人们一直在探索大规模合成低聚核苷酸的工业上可利用的方法。现已发现在有机合成中应用生物催化剂比常规的化学合成方法更具有吸引力。参见Carrea，等人，Angew.Chem.Int.Ed.2000，39，2226-2254；Bomscheuer，等人，Hydrolases in Organic Synthesis.Regio- andStereoselective Biotransformations，Wiley-VCHWeinheim，1999，Enzymes catalyze reactions with high chemo-，reglo-，andstereoselectivity，参见Ferrero等人，Chem.Rev.，2000，100，4319-4347；Ferrero等人，Monatsh.Chem.，2000，131，585-616。以前已有报道南极洲假丝酵母(Candida antarctica)脂酶B(CAL-B)以高选择性催化核苷5′-羟基基团的酰化。葱头假单胞菌(Pseudomonas cepacia)脂酶(PSL)对2’-脱氧核苷的3′-位的仲醇有不寻常的区域选择性。Moris等人，J.Org.Chem.，1993，58，653-660；Gotor等人，Synthesis，1992，626-628。
最近几年，反义低聚核苷酸作为新的治疗方法脱颖而出。其结果是，不久的将来需要有大量应用低聚核苷酸的治疗。关于合成低聚核苷酸结构单元所需要的费用和时间，经过长期的努力已经成功地开发出高效和高产品纯度的制备方法。
发明综述本发明人已经发现例如用于大规模合成低聚核苷酸的方法和试剂。本发明的方法有助于以最少的步骤用酶方法达到所需产率。在一些实施方案中，本发明提供了由常用的前体合成3′-O-乙酰丙酰基核苷和5′-O-乙酰丙酰基核苷的方法和试剂。在这些实施方案中，使3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷进行区域选择性地脱保护，根据本文公开的参数，可得到3′-O-乙酰丙酰基核苷或5′-O-乙酰丙酰基核苷。具体地说，通过使相应的3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷前体与特定的水解酶如脂酶接触，可选择性地生成5′-O-乙酰丙酰基核苷或3′-O-乙酰丙酰基核苷。出人意料的是，已经发现在脱保护反应中，根据所选脂酶不同，选择性水解酶如脂酶的存在可提高3’-或5′-位脱酰基化的区域选择性。
在其它实施方案中，本发明提供了选择性制备在3′-O或5′-O位具有乙酰丙酰基的核苷的方法，该方法通过使核苷与酰化剂接触，以便能在所选择的水解酶(例如脂酶)存在下引入乙酰丙酰基。出人意料的是，已经发现根据为催化反应所选择的特定水解酶，可以在核苷的3’-或5′-位发生选择性酰化。
根据某些实施方案，提供了3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷区域选择性脱保护的方法，所说的方法包括选择水解酶，如脂酶，该水解酶对一个乙酰丙酰基位置的直接区域选择性水解是有效的，而其它位置的乙酰丙酰基不会发生不希望水平的水解，以及在有效生成3′-O-乙酰丙酰基核苷和5′-O-乙酰丙酰基核苷的时间和条件下使3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷与该脂酶接触。本发明所涉及的水解酶的实例包括南极洲假丝酵母(Candida antarctica)脂酶B(CAL-B)、南极洲假丝酵母脂酶A(CAL-A)、葱头假单胞菌(Pseudomonas cepacia)脂酶(PSL)、猪胰脂肪酶(porcine pancreatic lipase)、粘稠色杆菌(Chromobactenaum viscosum)脂酶、米赫毛霉(Mucor miehei)脂酶、Humicola lanuginosa脂酶、沙门氏柏干酪青霉(penicillium camemberti)脂酶、皱落念珠菌(Candidarugosa)脂酶等。
根据一些实施方案，提供了核苷区域选择性酰化的方法，该方法包括选择水解酶，如脂酶，所述的水解酶对核苷一个-OH位置的直接区域选择性酰化是有效的，而其它位置的羟基不会发生不希望水平的酰化，以及在有效生成3′-O-乙酰丙酰基和5′-O-乙酰丙酰基核苷的时间和条件下使核苷与酰化剂和所选的脂酶接触，以引入乙酰丙酰基。本发明所涉及的水解酶的实例包括南极洲假丝酵母脂酶B(CAL-B)、南极洲假丝酵母脂酶A(CAL-A)、葱头假单胞菌脂酶(PSL)、猪胰脂肪酶、粘稠色杆菌脂酶、米赫毛霉脂酶、Humicola lanuginosa脂酶、沙门氏柏干酪青霉脂酶、皱落念珠菌脂酶等。
根据本发明的某些实施方案，3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷在5′-O-乙酰丙酰基位脱保护，所说的脱保护是在5′-O-乙酰丙酰基位置能有效地进行区域选择性水解，但不会影响3′-O-乙酰丙酰基位置的时间和条件下使使二保护核苷与CAL-B接触。
根据本发明的另一些实施方案，核苷在5′-OH位(或简称5′-位)可选择性酰化，所述的酰化是在CAL-B存在下，和在使核苷在5’-位有效进行区域选择性酰化以形成5′-O-乙酰丙酰基核苷的时间和条件下使核苷与酰化剂接触，以引入乙酰丙酰基。
在另一些实施方案中，3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷的3′-O-位的乙酰丙酰基的脱保护是在3′-O-乙酰丙酰基的位置能有效地进行区域选择性水解，但不会影响5′-O-乙酰丙酰基位置的时间和条件下，使二保护核苷与CAL-A或PSL-C接触。
在另一实施方案中，在核苷3′-OH位进行区域选择性酰化，该酰化是在CAL-A或PSL-C存在下，和能使核苷在3’-位有效地进行区域选择性酰化的时间和条件下，通过将核苷与酰化剂接触引入乙酰丙酰基基团，以制备3′-O-乙酰丙酰基核苷。
在本发明的一些实施方案中，公开了多种使3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷的5′-O-乙酰丙酰基位区域选择性脱保护的方法，其中所述的核苷为下式之一 其中
R1是-H，-羟基，保护的羟基，2’-取代基或2′-保护的取代基；和R2和R3各自独立地是-H或氨基保护基团；G是N或CH；和Lev是-C(O)-(CH2)2-C(O)-CH3，乙酰丙酰基；该方法包括选择对所述核苷的5’-O-位乙酰丙酰基能进行直接有效的区域选择性水解，但不会引起3’-O-位乙酰丙酰基水解的水解酶，和使所述的3’，5’-二-O-乙酰丙酰基核苷在有效地生成3′-O-乙酰丙酰基核苷的时间和条件下，与所述的酶接触以产生3′-O-乙酰丙酰基核苷。对5′-O-乙酰丙酰基水解优选的酶是CAL-B。
在本发明的另一实施方案中提供了使3′-O-乙酰丙酰基位进行区域选择性脱保护的方法，其中所述的核苷为下式之一 其中
R6是-H或-羟基；R2、R3、R4和R5各自独立地是-H或氨基保护基团；G是N或CH；和Lev是-C(O)-(CH2)2-C(O)-CH3；该方法包括选择对所述3’-O-位乙酰丙酰基能进行直接有效的区域选择性水解，但不会引起5’-O-位乙酰丙酰基水解的水解酶，和使所述的3’，5’-二-O-乙酰丙酰基核苷在有效地生成5′-O-乙酰丙酰基核苷的时间和条件下，与所述的酶接触。对3′-O-乙酰丙酰基位水解优选的酶例如是CAL-A或PSL-C。
在本发明的一些实施方案中，公开了多种核苷的5′-OH位置上区域选择性地引入乙酰丙酰基的方法， 其中所述的核苷为下式之一 其中
R1是-H，-羟基，保护的羟基，2’-取代基或2′-保护的取代基；和R2和R3各自独立地是-H或氨基保护基团；G是N或CH；和Lev是-C(O)-(CH2)2-C(O)-CH3，乙酰丙酰基；该方法包括选择对所述核苷的5’-O-位能进行直接有效的区域选择性酰化，但不会引起3’-O-位酰化的水解酶，和使所述的核苷在有效地生成5′-O-乙酰丙酰基核苷的时间和条件下，与酰化剂和所述的酶接触，以制备5’-O-乙酰丙酰基核苷。对5′-O-乙酰丙酰基酰化而言，优选的酶是CAL-B。
在本发明的另一实施方案中，提供了使核苷的3′-OH位进行区域选择性酰化的方法， 其中所述的核苷为下式之一 其中
R6是-H或-羟基；R2、R3、R4和R5各自独立地是-H或氨基保护基团；G是N或CH；和Lev是-C(O)-(CH2)2-C(O)-CH3；该方法包括选择对所述核苷的3’-O-位能进行直接有效的区域选择性酰化，但不会引起5’-O-位酰化的水解酶，和使所述的核苷在有效地生成3′-O-乙酰丙酰基核苷的时间和条件下，与酰化剂和所述的酶接触，以制备3’-O-乙酰丙酰基核苷。对3′-O-乙酰丙酰基酰化而言，优选的酶是CAL-A或PSL-C。
在本发明一些实施方案中提供了多种使核酸如核苷或核苷酸的羟基部分，例如2′-O、3’-O或5′-O位的一个或多个羟基酰化的方法，该方法包括使所述的核酸与乙酰丙酸在有连接于高分子载体的偶合剂如碳二亚胺存在下，和能在2′-O、3′-O或5′-O位有效地形成酯的时间和条件下反应。优选的高分子载体包括连接于环己基碳二亚胺的聚苯乙烯或聚乙二醇高分子载体。
本发明还包括使例如碳水化合物或类固醇分子中的任何羟基部分酯化或酰化的方法，该方法包括使含有羟基部分的所述化合物与乙酰丙酸在有连接于高分子载体的偶合剂存在下，和在能使羟基部分和乙酰丙酸的乙酰丙酰基基团之间有效地形成酯的时间和条件下反应。
在本发明一些实施方案中，提供了多种使下式化合物上的至少一个羟基部分酰化的方法， 其中
Bx是核碱基(nucleobase)；T1和T2各自独立地是羟基、羟基保护基团、活化的磷酸酯基、核苷酸、核苷或低聚核苷酸；R是-H、-羟基、保护的羟基或2′-取代基；条件是T1、T2或R中至少一个是-羟基；该方法包括使所述的化合物与乙酰丙酸在有连接于固体载体的偶合剂如PS-环己基碳二亚胺存在下，和能在羟基部分和乙酰丙酰基之间有效地形成酯的时间和条件下反应。在优选的实施方案中，T1和T2是-OH，以及R是-H或是2′-取代基。
在优选的实施方案中，提供了酰化下式化合物的3′-O或5′-O位的方法 其中Bx是核碱基；R是-H或选择保护的2′-取代基；该方法包括使所述的化合物与乙酰丙酸在有连接于固体载体的偶合剂存在下，和在能有效地形成下式化合物的时间和条件下反应 其中Lev是乙酰丙酰基。
根据本发明一些实施方案，提供了多种由环己基脲衍生的高分子载体制备环己基碳二亚胺衍生的高分子载体的方法，该方法包括使所述环己基脲衍生的高分子载体与脱水剂如甲苯磺酰氯或POCl3在有机溶剂中，和在能有效地生成环己基碳二亚胺衍生的高分子载体的时间和条件下反应。在一些实施方案中，所用的有机溶剂是CH2Cl2，CHCl3，己烷或吡啶。
在本发明另一些实施方案中，提供了多种由环己基脲衍生的高分子载体制备环己基碳二亚胺衍生的高分子载体的方法，该方法包括以下步骤使所述环己基脲衍生的高分子载体与脱水剂在能有效地生成盐，进而使该盐与水溶液如NaOH水溶液接触，以形成环己基碳二亚胺衍生的高分子载体的时间和条件下反应。
附图的简要说明参照本发明的详细说明和下面说明性的附图，本领域技术人员能够更好的理解本发明。所述附图中
图1说明用乙酰丙酸和DCC，或乙酰丙酸和PS-碳二亚胺使2′-脱氧核苷的3′，5′-二-O-酰化。
图2说明3′，5′-二-O-乙酰丙酰基2′-脱氧核苷的酶区域选择性水解。
图3说明3′，5′-二-O-乙酰丙酰基2′-取代核苷的酶区域选择性水解。
图4列表说明了核苷2a-2g区域选择性水解的结果。
图5说明2′-脱氧核苷的区域选择性酰化。
图6列表说明2′-脱氧核糖核苷1a、1c、1e和1g区域选择性酰化的结果。
图7说明核糖核苷的区域选择性酰化。
图8列表说明核糖核苷5a-5g区域选择性酰化的结果。
发明的详细描述本发明涉及核苷结构单元如3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷、3′-O-乙酰丙酰基核苷和5′-O-乙酰丙酰基核苷的制备，该方法在大规模合成低聚核苷酸时特别有用。
根据本发明的一些实施方案，提供了多种保护核酸2′-O、3′-O或5′-O位羟基部分的至少一个羟基的方法，该方法包括使所述核酸在有与高分子载体连接的耦合剂存在下，和在2′-O、3′-O或5′-O位能有效地生成酯的时间和条件下，与乙酰丙反应。本发明所述的核酸包括核苷、核苷酸、低聚核苷和低聚核苷酸。在一些实施方案中，所述的核酸是核苷，所述的高分子载体是与耦合剂如环己基碳二亚胺耦合的聚苯乙烯载体或聚乙二醇载体。
在优选的实施方案中，所述的核酸具有下式结构 其中Bx是核碱基；T1和T2各自独立地是羟基、保护的羟基、活化的磷酸酯基、核苷酸、核苷或低聚核苷酸；R是-H、-羟基、保护的羟基或2′-取代基；条件是T1、T2或R中至少一个是-OH；该方法包括使所述的化合物与乙酰丙酸在有连接于固体载体的偶合剂存在下，和能在羟基部分和乙酰丙酰基之间有效地形成酯的时间和条件下反应。在优选的实施方案中，T1和T2是-OH，以及R是H。
本发明的保护方法并不限于核苷的羟基的酰化，任何羟基官能团都可以用本发明的方法酰化，包括碳水化合物或类固醇分子中的羟基。
按照本发明的一些实施方案，参见图1，由具有相应性质的核苷制备3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷(2)，所述的制备是在1，4-二噁烷中，以DMAP作为催化剂，用乙酰丙酸和PS-碳二亚胺进行处理，过滤出聚苯乙烯珠，除去聚合物键合的脲和N-乙酰丙酰基脲衍生物。分离出3′，5′-二-O-乙酰丙酰基胸苷(2a)和3′，5′-二-O-乙酰丙酰基-2′-脱氧腺苷(2d)，产率分别为91％和95％。PS-碳二亚胺是昂贵的试剂，使环己基脲衍生的高分子载体与脱水剂在有机溶剂中反应，以进行回收。优选的脱水剂包括POCl3和甲苯磺酰氯。优选的有机溶剂是CH2Cl2，CHCl3，己烷和吡啶。
参见图1，1，3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷还可以由相应性质的核苷(1)在1，4-二噁烷中，以DMAP作为催化剂，用5.2当量乙酰丙酸(LevOH)和二环己基碳二亚胺(DCC)进行处理来制备。通过用DCC活化乙酰丙酸而发生该反应，得到O-酰基脲中间体。在反应过程中，过量的加合物成为稳定的N-酰基脲，该化合物以DCU作为副产物分离出来。在进行快速色谱之后，以高产率(70-95％)生成3′，5′-二乙酰丙酰基衍生物(2)。该反应的粗制残余物用Et2O洗涤以消除N-酰基脲，接着将其溶于EtOAc，由该溶液中过滤分离出留下的DGU。此酰化反应的产率几乎是定量的。1H-NMR分析结果给出了纯度水平，指出只有痕量DCU和N-乙酰丙酰基脲。在此条件下，2′-脱氧腺苷(1d)和2′-脱氧鸟苷(1f)的氨基位置不发生酰化。在2′-脱氧胞苷(1b)的情况下，用较少量的LevOH和DCC(3当量)将氨基酰基衍生物的形成减到最少。其结果，需要较长的反应时间和，并且有一些反应原料不变。在进行快速色谱之后，以68％分离产率得到3′，5′-二-O-乙酰丙酰基-2′-胞苷(2b)。
常用前体，3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷在5′-O-乙酰丙酰基位置的区域选择性脱保护可通过下述方法进行选择可直接地在5’-乙酰丙酰基位置有效地进行区域选择性水解，但不会引起3′-O-乙酰丙酰基位置水解的水解酶，如脂酶，使二保护的核苷与所述的脂酶在使3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷的5′-O-乙酰丙酰基位置有效水解的时间和条件下接触。在一些实施方案中，二保护的核苷具有下式之一的结构 其中R1是-H，-羟基，保护的羟基或2’-取代基；和R2和R3各自独立地是-H或氨基保护基团；G是N或CH；和Lev是-C(O)-(CH2)2-C(O)-CH3。
例如，参见图2，于40℃和在含有18％1，4-二噁烷的0.15M磷酸盐缓冲溶液(pH＝7)中，将3′5′-二-O-乙酰丙酰基胸苷(2a)用CAL-B处理。TLC表明62小时后起始原料全部消失(表1，第一行)。经过如下文所述的常规的精制Myers等人，Trends Pharmacol.Sci.，2000，21，19-23；Cook，Nucleosides Nucleotides，1999，18，1141-1162；Crooke等人，Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.，1996，36，107-129；和Matteucci等人，1996，384，20-22，其中所述内容全部引入本文作为参考。1H-NMR谱清楚地指出5′-乙酰丙酰基酯选择性水解，以及3′-O-乙酰丙酰基胸苷(3a)是唯一的产物。在萃取之后，酶反应中形成的痕量的胸苷(如TLC所示)保留在水相中。因此，分离出纯的化合物(3a)，产率85％。
如图4所示，表1还指出基质3′，5′-二-O-乙酰丙酰基胞嘧啶(2b)、3′，5′-二-O-乙酰丙酰基腺苷(2d)和3′，5′-二-O-乙酰丙酰基-N-异丁基鸟苷(2g)在CAL-B存在下进行水解时，对5′-位有优良的选择性。没有5′-O-乙酰丙酰基衍生物，且反应以非常高的产率进行。而且，在这些情况下，TLC表明完全水解的核苷的痕量物很容易通过水萃取除去。
对N-苯甲酰基-二-O-乙酰丙酰基-2′-脱氧胞苷(2c)和N-苯甲酰基-二-O-乙酰丙酰基-2′-脱氧腺苷(2e)进行由CAL-B催化的水解反应可分别获得N-苯甲酰基-2′-脱氧胞苷(1c)和N-苯甲酰基-2′-脱氧腺苷(1e)。虽然尝试了几种反应条件，但反应过程不具有区域选择性。看来CAL-B的活性点不能以与其未保护的对应物那样相同的方式适用于N-保护的腺苷和胞苷。虽然不希望被任何特定的理论所束缚，但可能是由于苯基基团在其结合点有某些立体的接触，因此而导致了不希望的结果。
2′-取代的核苷在其5′-O-乙酰丙酰基位成功地进行了选择性地脱保护。参见图3，四种核苷，2′-甲氧基-3′，5′-二-O-乙酰丙酰基腺苷(6a)、2′-甲氧基乙氧基-3′，5′-二-O-乙酰丙酰基腺苷(6b)、2′-甲氧基-3′，5′-二-O-乙酰丙酰基-2′-脱氧胞嘧啶(6c)和2′-甲氧基乙氧基-3′，5′-二-O-乙酰丙酰基-5-甲基胞嘧啶(6d)全部可用CAL-B选择性水解，以高产率得到7a-7d。使核苷有效水解的时间和条件不限于本发明例举的内容。对本领域技术人员来说，使酯有效水解的各种时间和条件是可以理解的。
在本发明的一些实施方案中，3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷可由选择的水解酶如脂酶在3′-O-乙酰丙酰基位进行区域选择性脱保护，在3′-O-乙酰丙酰基位进行直接地区域选择性水解，但不会引起5′-O-乙酰丙酰基位的水解，使二保护的核苷与水解酶(如脂酶)在能使3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷的3′-O-乙酰丙酰基位有效水解的时间和条件下接触。在一些实施方案中，二保护的核苷是下述结构之一 其中R6是-H或-OH；R2、R3、R4和R5各自独立地是-H或氨基保护基团；G是N或CH；和Lev是-C(O)-(CH2)2-C(O)-CH3。
例如，参见图2，于60℃和在0.15M磷酸盐缓冲溶液中，使2与固定的葱头假单孢菌脂酶[PSL-C，比例为1∶3w/w(2/PSL-C)]反应，完成2，3′-二-O-的选择性水解，得到5’-O-乙酰丙酰基衍生物。对3′-O-乙酰丙酰基位，南极洲假丝酵母脂酶A(CAL-A)也显示出良好的选择性，并且比用PSL-C的反应温度更低(40℃代替60℃)，反应时间更短，酶/原料的比例更小(参见图4)。因此，可以高产率(70-85％)得到5′-O-乙酰丙酰基胸苷(4a)，N-苯甲酰基-5’-O-乙酰丙酰基-2′-脱氧胞苷(4c)，N-苯甲酰基-5’-O-乙酰丙酰基-2′-脱氧腺苷(4e)。对粗制反应混合物进行TLC或1H-NMR分析没有检出3′-乙酰丙酰基区域异构体。TLC表明有痕量的母体核苷1。
N-异丁酰基-3′，5′-二-O-乙酰丙酰基-2′-脱氧鸟苷(2g)不能用CAL-A选择性水解。但是，用PSL-C处理可得到N-异丁酰基-5′-O-乙酰丙酰基-2′-脱氧鸟苷(4g)，在60℃24小时后可以分离出来，产率93％(表1，第8项)。N-苯甲酰基-二-乙酰丙酰基衍生物(2c)和(2e)对PSL-C和CAL-A两种脂酶都是合适的基质。
如图3所示，将2′-OR核苷用PSL-C或CAL-A处理，得到3′-O-乙酰丙酰基和5′-O-乙酰丙酰基核苷的混合物，这说明对2′-O和2′-脱氧核苷没有选择性。虽然不能与任何特定的理论结合，但这可能是由于2′-O-R基团的空间位阻使3′-O-乙酰丙酰基难以接近以便由其中的一种脂酶进行选择性的水解。
在本发明的一些实施方案中，可以进行如图5所示的酶酰化。在氮气中，将1(0.2mmol)的悬浮液、肟酯(0.6mmol)和脂酶在无水THF(1mL)中在表3所指温度下于250rpm搅拌表3所指的时间(图8)。反应由TLC(10％MeOH/CH2Cl2)控制。过滤出所述的酶，用CH2Cl2洗涤，真空蒸出溶剂，将残余物溶于NaHCO3(水溶液)并用CH2Cl2萃取，合并的有机层用Na2SO4干燥并蒸发。残余物用乙醚中沉淀，过滤后得到单乙酰丙酰基核苷3或4。除了在第10和11项中需要分离出痕量的其它酰基衍生物以外，可以不必进一步纯化。
可以看出，酰化方法比水解需要的步骤更少，也更容易进行。起始原料是母体核苷，不必首先制备二乙酰丙酰基衍生物。水解方法需要两个步骤，而酰化方法只需要一个步骤。肟酯可以简单步骤制备和可通过简单的过滤纯化。酰化过程可避免快速色谱法。通过在CAL-B存在下进行酰化反应，可以得到5′-O-Lev-T、5′-O-Lev-dCBz、5′-O-Lev-dABz和5′-O-Lev-dGiBu。另一方面，用PSL-C可得到3′-O-Lev-T、3′-O-Lev-dCBz和5′-O-Lev-dABz(但不是3′-O-Lev-dGiBu)。为了制备3′-O-Lev-dGiBu必须进行酶水解反应。表3(图6)指出的扩大反应产率提高，在酶过滤(即避免萃取和沉淀)之后的快速色谱产率也较高。
在本发明的某些实施方案中，酰化方法也可用于如式XVI-XX定义的核糖核苷。核糖核苷的常规酰化方法如图7所示，其数据见表4(图8)。2′-烷基核糖核苷的单乙酰丙酰基衍生物可溶解于乙醚，不可能通过沉淀由剩余的肟酯中分离出来。因此，在酶过滤之后，残余物可用快速色谱法纯化(梯度淋洗液5-20％MeOH/CH2Cl2)。
用CAL-B，采用酰化方法，可能得到5′-0-Lev-2′-OMOE-T、5′-O-Lev-2′-O-MOE-5-Me-C、5′-O-Lev-2′-O-MOE-5Me-CBz、5′-O-Lev-2′-O-MOE-A、5′-O-Lev-2’-O-MOE-ABz、5′-O-Lev-2’-O-Me-A和5′-O-Lev-2′-O-MOE-GiBu。另一方面用PSL-C可得到3′-O-Lev-2’-O-MOE-5-Me-CBz、3′-O-Lev-2’-O-MOE-ABz和3′-O-Lev-2’-O-Me-ABz。需要通过水解反应制备相应的3′-Lev-T和3′-Lev-GiBu衍生物。
本发明实践中有用的核酸包括天然存在的和非天然存在的核苷和核苷酸。本发明所述的核苷和核苷酸不限于单体单元，而且也可以含有多个相连的单体单元形成二核苷、核苷酸和低聚核苷酸，并包括天然存在的和非天然存在的核碱基(nucleobase)、糖和骨架(backbones)。
非天然存在的核苷和核苷酸可以用其它具有伯和仲醇基团的、与这些核糖类似的结构取代糖结构以进行改性。非天然存在的糖和核苷碱在结构上通常可与天然存在的糖(如核糖和脱氧核糖)和核苷碱(如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶)区别，其功能是可以互换的。因此，非天然存在的核碱基和糖包括所有模仿天然存在物种的结构和/或功能，并有助于低聚核苷酸与目标结合，或者对低聚核苷酸的性能有有益的贡献的结构。
对骨架的改性包括对磷酸酯骨架进行改性以提高其对核酸酶的抗性。这些改性包括应用如膦酸甲酯、硫代磷酸酯和二硫代磷酸酯键连，以及这些改性使核苷酸间键合，如非-磷键合、肽核酸(PNAs)和2’，5’-键合的性质发生引人注目的改变本发明所包含的杂环碱部分(在本领域中常常被简称为“碱”或“核碱基”)包括天然存在和非天然存在的核碱基两部分。杂环碱部分可进一步地被保护，其中一个或多个碱官能团带有保护基团。本文所用的“未改性的”或“天然的”核碱基包括嘌啉碱腺嘌呤和鸟嘌呤，以及嘧啶碱胸腺嘧啶，胞嘧啶和尿嘧啶。改性的核碱基包括其它合成的和天然的核碱基如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)，5-羟甲基胞嘧啶，黄嘌呤，次黄嘌呤，2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物，腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物，2-硫脲嘧啶，2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶，5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶，6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(pseudouracil)，4-硫代尿嘧啶，8-卤代、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羟基和其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤代，特别是5-溴代、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤，8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤，7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤，以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。其它核碱基包括下述文献中公开的核碱基USP No.3,687,808；Concise Enyclopedia of PolymerScience and Engineering，p858-859，Kroschwitz，J.I.编辑，John Wiley &Sons出版，1990；Englisch等人，Angewandte Chemie，InternationalEdition，1991，30，613和Sanghvi，Y.S.，第15章Antisense Research andApplications，p289-302，Crooke，S.T.和Lebleu，B.编辑，CRC Press，1993。
在本发明的一些实施方案中，本发明的方法应用于所谓的C-核苷(即是核碱基通过C-C键连接于核苷环的核苷，这与天然存在的C-N键相反)。另外，在本发明的一些实施方案中，核苷环是α-构型(与天然存在的β-构型不同)、L-构型(与天然存在的D-构型不同) 或两者(即α-L-构型)。
某些杂环碱部分对于提高本发明低聚化合物的键合亲和力以补充靶标特别有用。这些包括5-取代嘧啶，6-氮杂嘧啶以及N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。已经知道5-甲基胞嘧啶取代可提高核酸双链稳定性0.6-1.2℃(同上，p276-278)，是目前优选的碱替代物，特别是在与选择的2′-糖改性如2′-甲氧基乙基基团结合更是如此。
杂环碱部分(改性核碱基)的制备已有教导中有代表性的美国专利包括，但不限于U.S P3,687,808；4,845,205；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121，5,596,091；5,614,617；和5,681,941，其中一些是共同拥有的，所有这些都引入本文作为参考，1996年12月10日申请的美国专利申请08/762,587也引入本文作为参考。
本发明所用有代表性的一系列2′-取代基包括C1-C20烷基、C2-C20链烯基、C2-C20炔基、C5-C20芳基、O-烷基、O-链烯基、O-炔基、O-烷基氨基、O-烷基烷氧基、O-烷基氨基烷基、O-烷基咪唑、S-链烯基、S-炔基、NH-烷基、NH-链烯基、NH-炔基、N-二烷基、O-芳基、S-芳基、NH-芳基、O-芳烷基、S-芳烷基、NH-芳烷基、N-邻苯二甲酰亚胺基、卤素(特别是氟)、酮、羧基、硝基、亚硝基、腈、三氟甲基、三氟甲氧基、咪唑、叠氮基、肼基、羟氨基、异氰酰基、亚砜、砜、硫化物、二硫化物、甲硅烷基、杂环、碳环、聚胺、聚酰胺、聚乙二醇和式(O-烷基)m的聚醚，其中m是1-大约10。在这些聚醚中优选的是线性的或环状的聚乙二醇(PEGs)，和含有(PEG)的类型，如冠醚，以及下述文献所公开Ouchi等人，(Drug Design and Discovery，1992，9，93)，Ravasio等人(J Org.Chem.，1991，56，4329)和Delgardo等人(Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1992，9，249)，上述文献均全文引入本申请作为参考。另外，糖的改性公开在Cook，P.D.，Anti-Cancer Drug Design，1991，6，585-607。氟代、O-烷基、O-烷基氨基、O-烷基咪唑、O-烷氨基烷基和烷基氨基取代公开在美国专利申请序列号08/398,901，1995年3月6日申请，发明名称是OligomericCompounds having Pyrimidine Nucleotide(s)with 2′and 5′Substitutions，该文献也全文引入本申请作为参考。
本发明所用其它取代基团包括-SR和-NR2基团，其中R各自独立的是氢、保护基团或取代或未取代的烷基、链烯基或炔基。2′-SR核苷公开在USP5,670,633，申请日1997年9月27日，该文献也全文引入本申请作为参考。2′-SR单体合成子的引入公开在Hamm等人，J.Org.Chem.，1997，62，3415-3420。2′-NR2核苷公开在Goettingen，M.，J.Org.Chem.，1996，61，73-6281；和Polushin等人，Tetrahedron Lett.，1996，37，3227-3230。
其它取代基团为式XXI或XXII之一
其中Z0是O、S或NH；J是单键、O或C(＝O)；E是C1-C10烷基、N(R1)(R2)、N(R1)(R5)、N＝C(R1)(R2)、N＝C(R1)(R5)或是下述式XXIII或XXIV之一
每个R6、R7、R8、R9和R10各自独立的是氢、C(O)R11、取代或未取代的C1-C10烷基、取代或未取代的C2-C10链烯基、取代或未取代的C2-C10炔基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、化学官能基团或共轭基团，其中取代基团选自羟基、氨基、烷氧基、羧基、苄基、苯基、硝基、巯基、硫代烷氧基、卤素、烷基、芳基、链烯基和炔基；或R7和R8与它们相连的氮原子一起选择性的形成邻苯二甲酰亚胺部分；或R9和R10与它们相连的氮原子一起选择性地形成邻苯二甲酰亚胺部分；每个R11个R12各自独立的是取代或未取代的C1-C10烷基、三氟甲基、氰基乙氧基、甲氧基、乙氧基、叔丁氧基、烯丙氧基、9-芴基甲氧基、2-(三甲基甲硅烷基)-乙氧基、2，2，2-三氯乙氧基、苯甲酰氧基、丁酰基、异丁酰基、苯基或芳基；
R5是T-L；T是键或是连接部分；L是化学官能基团、共轭基团或固体载体物质；每个R1和R2各自独立的是H、氮保护基团、取代或未取代的C1-C10烷基、取代或未取代的C2-C10链烯基、取代或未取代的C2-C10炔基，其中所说的取代基是OR3、SR3，、NH3+、N(R3)(R4)、胍基或酰基，其中所说的酰基是酸的酰胺或酯；或者R1和R2，一起是氮保护基团，或结合成环状结构，所述的环状结构选择性的含有其它选自N和O的杂原子；或R1、T和L一起是化学官能基团；每个R3和R4各自独立的是H、C1-C10烷基、氮保护基团，或R3和R4一起是氮保护基团；或R3和R4一起结合成环状结构，所述的环状结构选择性的含有其它选自N和O的杂原子；Z4是OX、SX或N(X)2；每个X各自独立的是H、C1-C8烷基、C1-C8卤代烷基、C(＝NH)N(H)R5、C(＝O)N(H)R5或OC(＝O)N(H)R5；R5是H或C1-C8烷基；Z1、Z2和Z3包括含有大约4-大约7个碳原子或含有大约3-大约6个碳原子和1或2个杂原子的环系，其中所说的杂原子选自氧、氮或硫，和所说的环系是脂族、不饱和脂族、芳族、或是饱和或不饱和的杂环；Z5是具有1至大约10个碳原子的烷基或卤代烷基、具有2至大约10个碳原子的链烯基、具有2至大约10个碳原子的炔基、具有6至大约14个碳原子的芳基、N(R1)(R2)OR1、卤素、SR1或CN；每个q1各自独立的是1-10整数；每个q2各自独立的是0或1；q3是0或1-10的整数；q4是1-10的整数；q5是0，1或2；和条件是当q3是0时，q4大于1。
式I有代表性的取代基团公开在美国专利申请序列号No.09/130,973，1998年8月7日申请，发明名称″Capped 2′-OxyethoxyOligonucleotides″，该文献全文引入本申请作为参考。
式II有代表性的取代基团公开在美国专利申请序列号No.09/123,108，1998年7月27日申请，发明名称″RNA Targeted 2’-Modified Oligonucleotides that are Conformationaliy Preorganized″，该文献全文引入本申请作为参考。
特别优选的取代基团包括O[(CH2)nO]mCH3，O(CH2)nOCH3，O(CH2)nNH2，O(CH2)nCH3，O(CH2)nONH2，O(CH2)nON[(CH2)nCH3]]2(其中n和m是1至大约10)，C1-C10低级烷基，取代的低级烷基，烷芳基，芳烷基，O-烷芳基或O-芳烷基，SH，SCH3，OCN，Cl，Br，CN，CF3，OCF3，SOCH3，SO2CH3，ONO2，NO2，N3，NH2，杂环烷基，杂环烷芳基，氨基烷基氨基，多烷基氨基和取代的甲硅烷基。其它特别优选的改性包括2′-甲氧基乙氧基(2′-O-CH2CH2OCH3或2′-MOE，Martin等人，Helv.Chim.Acta，1995，78，486)。更优选的取代基团是2′-二甲氨基氧基乙氧基，即O(CH2)2ON(CH3)2基团，也称作2′-DMAOE。有代表性的氨基氧基取代基公开在共同申请的美国专利申请序列号09/344,260，1999年6月25日申请，发明名称是″Aminooxy-Functionalized Oligomers”；和美国专利申请序列号09/370,541，1999年8月9日申请，代理序列编号ISIS-3993，发明名称“Aminooxy-Functionalized Oligomers andMethods for Making Same”；该文献全文引入本申请作为参考。
其它优选的改性包括2′-甲氧基(2′-O-CH3)，2′-氨基丙氧基(2′-OCH2CH2CH2NH2)和2′-氟(2′-F)。在核苷和低聚体的其它位置上也可以进行类似的改性，特别是在3′-末端核苷糖的3′-位，或在具有由2’-位键连的核苷如2’，5’-键连的低聚体的3′-位，和在5′-末端的5′-位。低聚体也具有糖的模拟形式如以环丁基部分代替呋喃戊糖基的糖。公开了这些改性糖结构制备的有代表性的美国专利包括，但不限于U.S.P4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,0531 5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；和5,700,920，其中一些是共同拥有的，每篇文献都全文引入本申请作为参考。共同拥有的美国专利5,859,221也全文引入本申请作为参考。
式III和IV表示的有代表性的胍基取代基基团公开在共同拥有的美国专利申请序列号09/349,040，1999年7月9日申请，发明名称是″Functionalized Oligomers”，该文献全文引入本申请作为参考。
有代表性的乙酰氨基取代基公开在美国专利申请序列号09/378,568，发明名称是″2′-O-Acetamido Modified Monomers andOligomers″，1999年8月19日申请，代理序列编号1515-4071，该文献全文引入本申请作为参考。
有代表性的二甲氨基乙氧基乙基取代基公开在国际专利申请PCT/US599/17895，发明名称″2’-O-Dimethylaminoethyioxy ethyl-Modified oligonucleotides″，1999年8月6日申请，代理序列编号ISIS-4045，该文献全文引入本申请作为参考。
在合成过程中，本发明的方法用不稳定的保护基团保护各种官能基团部分。在常规的低聚核苷酸合成方法经常使用保护基团以保护几种不同类型的官能团。通常，保护基团使化学官能团对特定的反应条件呈惰性，并可以在分子的这些官能团上添加和除去，基本上不会破坏分子的其余部分，例如参见Green和Wuts，Protective Groups inOrganic Synthesis，第二版，John Wiley & Sons，New York，1991。合成中用于保护核苷酸的有代表性的保护基团包括碱不稳定保护基团和酸不稳定保护基团。碱不稳定保护基团在合成期间用于保护杂环核碱基的外向环氨基。此类保护通常可通过酰化实现。为达到此目的常用的两种酰化基团是苯甲酰氯和异丁酰氯。这些保护基团在低聚核苷酸合成的反应条件下是稳定的，合成结束后用碱处理几乎可以等比率将其除去。
常用于低聚核苷酸合成的羟基保护基团可以用下式基团表示-C(R1)(R2)(R3)，其中每个R1，R2和R3是未取代的或单取代的和选自苯基、萘基、蒽基的芳基或杂芳基，具有一个选自N、O和S的杂原子、或二个氮杂原子的五或六元杂环，包括喹啉基、呋喃基和噻吩基；所述的取代基选自卤素(即F，Cl，Br，和I)，硝基，C1-C4-烷基或烷氧基，和最多有10个碳原子的芳基，芳烷基或环烷基；以及其中的R2和R3各自可以是C1-C4-烷基或最多有10个碳原子的芳烷基或环烷基。
本发明中，引入乙酰丙酰基的酰化剂是能够与活性基团如羟基反应产生酰化基团，且其中的酰基部分是如上所述乙酰丙酰基基团的酰化剂。这些酰化剂包括乙酰丙酸，以及乙酰丙酸的活化形式，包括其酸酐、酯、肟和卤代酸衍生物。对引入乙酰丙酰基基团而言，乙酰丙酸是优选的酰化剂。
本发明需要使用水解酶如脂酶，以影响核苷或改性核苷的脱保护或酰化。几类水解酶是自然界存在的。其中有两种水解酶脂酶和蛋白酶已经广泛用于非天然介质。由化学的观点看，可知脂酶和蛋白酶在有机溶剂中是温和的和选择性的试剂，它能够活化样品中通常的羧酸根，并且将其转移至大量的亲核体。在本发明的酰化反应(在核苷上引入乙酰丙酰基)或脱保护(即由保护的核苷上除去乙酰丙酰基)时需要这些水解酶。术语水解酶包括脂酶、蛋白酶，和能使核苷区域选择性的直接酰化或能使酰化的核苷脱保护的类似水解酶。
可以理解的是，通过考察了下面的实施例，对本领域技术人员来说，本发明的目的、优点和新颖的特征会更加清晰，但这些实施例并不限制本发明。
实施例试剂南美洲假丝酵母脂酶B(CAL-B)来自Novo Nordisk Co.，南美洲假丝酵母脂酶A(CAL-A)和固定的葱头假单胞菌脂酶(PSL-C)各自购自Roche Diagnostics S.L.和Amano Pharmaceuticals。PS-碳二亚胺购自Argonaut Technologies(San Carlos，CA，EE.UU.)。其它所有试剂购自Aldrich或Fluka。试剂用适当的干燥剂在氮气下蒸馏。
3’，5′-二-O-乙酰丙酰基-2′-脱氧核苷(2)方法A在氮气下，向1，4-二噁烷(20mL)中的1(2mmol)和Et3N(1.7mL，12mmol)的混合物加入乙酰丙酸(1.21g，10.4mmol)、DCC(2.14g，10.4mmol)和DMAP(20mg，0.16mmol)。于室温搅拌反应3小时。为了使三保护胞苷衍生物生成的最少，将6mmol的LevOH和DCC，和5mmol的Et3N用于1b。过滤收集不溶物，真空蒸发滤液。将残余物溶于NaHCO3(水溶液)，并用CH2Cl2萃取，合并的有机萃取液用Na2SO4干燥和蒸发。加入冷的Et2O，在浆液中划痕直到开始结晶。过滤出固体，用冷的Et2O洗涤，然后倾入EtOAc(在2f的情况下是MeOH)。过滤出不溶物，浓缩滤液得到目的化合物。得到的产物足够纯，可以直接进行酶水解步骤。用快速色谱(EtOAc)进一步纯化得到纯的3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷2a-g。
方法B在氮气下，向1，4-二噁烷(5mL)中的1(0.4mmol)和Et3N(0.15mL，1mmol)的混合物加入乙酰丙酸(0.14g，1.2mmol)、PS-碳二亚胺(1.05g，1.2mmol)、DMAP(4mg，0.032mmol)和DMAP·HCl(3mg，0.02mmol)。于室温搅拌反应3小时。过滤收集不溶物，真空蒸发滤液。将残余物溶于NaHCO3(水溶液)，并用CH2Cl2萃取，合并的有机萃取液用Na2SO4干燥和蒸发。固体用冷的Et2O洗涤，得到3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷2a和2d。
3′，5′-二-O-乙酰丙酰基胸苷(2a).Rf(10％MeOH/CH2Cl2)0.45；Mp87-89℃；IR(KBr)υ 3315，3074，3006，2967，2947，1743，1689，和1660cm-1；1H-NMR(CDCl3，300MHz)d 1.88(s，3H，Me)，2.14(s，3H，Me-Lev)，2.15(s，3H，Me-Lev)，2.18(m，1H，H2′)，2.41(m，1H，H2′)，2.54(m，4H，2CH2-Lev)，2.73(m，4H，2CH2-Lev)，4.19(m，1H，H4′)，4.31(m，2H，H5′)，5.18(m，1H，H3)，6.28(dd，1H，H1′，3JHH8.5，3JHH5.4Hz)，7.32(s，1H，H6)，和9.99(s，1H，NH)；13C-NMR(CDCl3，75.5MHz)d 12.3(Me)，27.48(CH2-Lev)，27.54(CH2-Lev)，29.4(2Me-Lev)，36.8(C2′)，37.5(2CH2-Lev)，63.7(C5′)，74.2，81.8，84.3(C1′+C3′+C4′)，111.2(C5)，134.6(C6)，150.3(C2)，163.8(C4)，171.97(C＝O Lev)，172.02 (C＝OLev)，和206.3(2C＝O Lev)；MS(ESI+，m/z)439[(M+H)+，100％]，和461[(M+Na)+，50].3′，5′-二-O-乙酰丙酰基-2′-脱氧胞苷(2b)Rf(20％MeOH/CH2Cl2)0.67；IR(KBr)υ 3390，2940，1737，1715，和1649cm-1；1H-NMR(MeOH-d4，200MHz)d 2.39(s，3H，Me-Lev)，2.40(s，3H，Me-Lev)，2.43(m，1H，H2′)，2.75(m，1H，H2′)，2.79(m，4H，2CH2-Lev)，3.02(m，4H，2CH2-Lev)，4.51(m，3H，H4′+2H5′)，5.46(m，1H，H3′)，6.17(d，1H，H5，3JHH7.6Hz)，6.45(dd，1H，H1′，3JHH8.6，3JHH5.7Hz)，和7.98(dd，1H，H6，3JHH7.3Hz)；13C-NMR(MeOH-d4，75.5MHz)d 29.1(CH2-Lev)，29.2(CH2-Lev)，29.9(Me-Lev)，38.9(2CH2-Lev)，39.2(C2′)，65.5(C5′)，76.5，84.1，87.9(C1′+C3′+C4′)，96.8(C5)，142.2(C6)，158.4(C2)，168.0(C4)，174.2(C＝O)，174.4(C＝O)，和209.7(C＝O)；MS(ESI+，m/z)446[(M+Na)+，70％]和462[(M+K)+，100]。
N-苯甲酰基-3′，5′-二-Q-乙酰丙酰基-2′-脱氧胞苷(2c)Rf(10％MeOH/CH2Cl2)0.61；Mp107-109℃；IR(KBr)υ 3233，1744，1731，和1668cm-1；1H-NMR(MeOH-d4，200MHz)d 2.31(s，3H，Me-Lev)，2.38(s，3H，Me-Lev)，2.50(m，1H，H2′)，2.75(m，4H，2CH2-Lev)，2.95(m，1H，H2′)，3.05(m，4H，2CH2-Lev)，4.59(m，3H，H4′+2H5′)，5.49(m，1H，H3′)，6.42(dd，1H，H1′，3JHH7.7，3JHH5.7Hz)，7.75(m，4H，H5+Hm+Hp)，8.15(m，2H，Ho)，和8.45(d，1H，H6，3JHH7.6Hz)；13C-NMR(MeOH-d4，75.5MHz)d 29.1(CH2-Lev)，29.2(CH2-Lev)，29.9(Me-Lev)，38.91(CH2-Lev)，38.94(CH2-Lev)，39.8(C2′)，65.3(C5′)，76.5，85.0，89.3(C1′+C3′+C4′)，99.0(C5)，129.5，130.1(Co+Cm)，134.4(Cp)，135.0(Ci)，146.2(C6)，158.0(C2)，165.1(C4)，169.2(PhC＝O)，174.3(C＝O)，174.4(C＝O)，209.67(C＝O)，和209.72(C＝O)；MS(ESI+，m/z)528[(M+H)+，100％]，550[(M+Na)+，30]，和566[(M+K)+，40].
3′，5′-二-O-乙酰丙酰基-2′-脱氧腺苷(2d)Rf(10％MeOH/CH2Cl2)0.44；IR(KBr)υ 3418，3165，2923，1738，1715，和1644cm-1；1H-NMR(MeOH-d4，200MHz)d2.33(s，3H，Me-Lev)，2.39(s，3H，Me-Lev)，2.79(m，5H，2CH2-Lev+1H2′)，3.00(m，4H，2CH2-Lev)，3.25(m，1H，H2′)，4.52(m，3H，H4′+2H5′)，5.65(m，1H，H3′)，6.61(dd，1H，H1′，3JHH6.0，3JHH7.9Hz)，8.41(s，1H，H2or H8)，和8.50(s，1H，H8or H2)；13C-NMR(MeOH-d4，75.5MHz)d 29.1(CH2-Lev)，29.2(CH2-Lev)，29.9(2Me-Lev)，38.1(C2′)，38.9(2CH2-Lev)，65.2(C5′)，76.5，84.2，86.2(C1′+C3′+C4′)，120.8(C5)，141.2(C8)，150.7(C4)，154.2(C2)，157.6(C6)，174.2(C＝O)，174.4(C＝O)，209.68(C＝O)，和209.73(C＝O)；MS(ESI+，m/z)448[(M+H)+，20％]，470[(M+Na)+，80]，和486[(M+K)+，100].
N-苯甲酰基-3′，5′-二-O-乙酰丙酰基-2′-脱氧腺苷(2e)Rf(10％MeOH/CH2Cl2)0.71；Mp69-71℃；IR(KBr)υ 3412，3086，2958，1738，1714，和1685cm-1；1H-NMR(MeOH-d4，300MHz)d 2.28(s，3H，Me-Lev)，2.35(s，3H，Me-Lev)，2.75(m，4H，2CH2-Lev)，2.87(m，1H，H2′)，2.99(m，4H，2CH2-Lev)，3.30(m，1H，H2′)，4.52(m，3H，H4′+2H5′)，5.65(m，1H，H3′)，6.70(表观 t，1H，H1′，3JHH6.8Hz)，7.75(m，3H，2Hm+Hp)，8.25(表观d，2H，2Ho，3JHH7.4Hz)，8.75(s，1H，H2or H8)，和8.88(s，1H，H8or H2)；13C-NMR(MeOH-d4，75.5MHz)d 29.0(CH2-Lev)，29.2(CH2-Lev)，30.0(Me-Lev)，37.9(C2′)，38.87(CH2-Lev)，38.91(CH2-Lev)，65.2(C5′)，76.4，84.3，86.5(C1′+C3+C4′)，125.5(C5)，129.7，130.0(Co+Cm)，134.1(Cp)，135.1(Ci)，144.5(C8)，151.3(C4)，153.3(C6)，153.5(C2)，168.1(PhC＝O)，174.2(C＝O)，174.3(C＝O)，209.6(C＝O)，和209.7(C＝O)；MS(ESI+，m/z)552[(M+H)+，100％]和574[(M+Na)+，17].
3′，5′-二-O-乙酰丙酰基-2′-脱氧鸟苷(2f)Rf(20％MeOH/CH2Cl2)0.65；Mp148-150℃；IR(KBr)υ 3397，3153，2940，和1711cm-1；1H-NMR(DMSO-d6，200MHz)d 2.16(s，3H，Me-Lev)，2.22(s，3H，Me-Lev)，2.60(m，5H，2CH2-Lev+1H2′)，2.83(m，4H，2CH2-Lev)，3.00(m，1H，H2′)，4.29(m，3H，H4′+2H5′)，5.35(m，1H，H3′)，6.22(dd，1H，H1′，3JHH5.8，3JHH8.8Hz)，6.69(br s，2H，NH)，和8.00(s，1H，Hs)；13C-NMR(DMSO-d6，50.3MHz)d 27.5(CH2-Lev)，27.7(CH2-Lev)，29.55(Me-Lev)，29.60(Me-Lev)，35.5，37.4，37.50(2CH2-Lev+C2′)，63.8(C5′)，74.7，81.5，82.6(C1′+C3′+C4′)，116.8(C5)，135.1(C8)，151.2(C4)，154.0(C2)，156.9(C6)，172.1(C＝O)，172.2(C＝O)，206.9(C＝O)，和207.1(C＝O)；MS(ESI+，m/z)464[(M+H)+，22％]，486[(M+Na)+，75]，and 502[(M+K)+，100].N-异丁酰基-3′，5′-二-O-乙酰丙酰基-2′-脱氧鸟苷(2g)Rf(20％MeOH/CH2Cl2)0.85；Mp45-47℃；IR(KBr)υ 3413，2935，1740，1714，1680，and 1613cm-1；1H-NMR(DMSO-d6，200MHz)d 1.23(d，6H，Me-iBu，3JHH6.5Hz)，2.15(s，3H，Me-Lev)，2.20(s，3H，Me-Lev)，2.55-3.19(几个m，11H，4CH2-Lev+2H2′+CH-iBu)，4.32(m，3H，H4′+2H5′)，5.35(m，1H，H3′)，6.35(表观 t，1H，H1′，3JHH7.2Hz)，8.35(s，1H，H8)，11.80(br s，1H，NH)，and 12.20(br s，1H，NH)；13C-NMR(DMSO-d6，50.3MHz)d 18.86(Me-iBu)，18.91(Me-iBu)，27.5(CH2-Lev)，27.6(CH2-Lev)，29.5(Me-Lev)，29.6(Me-Lev)，34.8(CH-iBu)，35.5(C2′)，37.38(CH2-Lev)，37.45(CH2-Lev)，63.7(C5′)，74.6，81.7，82.9(C1′+C3′+C4′)，120.3(C5)，137.3(C8)，148.3，148.7(C2+C4)，154.8(C6)，172.1(C＝O)，172.2(C＝O)，180.2(iBu-C＝O)，206.9(C＝O)，和207.1(C＝O)；MS(ESI+，m/z)534[(M+H)+，100％]，556[(M+Na)+，60]，和572[(M+K)+，27].
3′，5′-二-O-乙酰丙酰基-2′-脱氧核苷酶水解的一般方法。在2(0.2mmol)的1，4-二噁烷(0.35mL)溶液中加入0.15M磷酸盐缓冲溶液pH7(1.65mL)和相应的脂酶[对CAL-A或CAL-B，2∶酶＝1∶1(w/w)，对PSL-C为1∶3(w/w)]。使混合物在250rpm按照表1指出的温度和时间进行反应。反应由TLC(10％MeOH/CH2Cl2)控制。过滤出酶，用CH2Cl2洗涤，真空蒸发溶剂，残余物溶于NaHCO3(水溶液)，并用CH2Cl2萃取，合并的有机层用Na2SO4干燥，蒸发后得到单酰基核苷3或4。在3b的情况下，残余物用快速色谱而不是萃取进行纯化。
3′-O-乙酰丙酰基胸苷(3a)Rf(10％MeOH/CH2Cl2)0.32；Mp50-52℃；IR(KBr)υ 3449，3065，2927，和1706cm-1；1H-NMR(MeOH-d4，200MHz)d 2.09(d，3H，Me，JHH1.3Hz)，2.39(s，3H，Me-Lev′)，2.57(m，2H，H2′)，2.80(t，2H，CH2-Lev，3JHH6.0Hz)，3.05(t，2H，CH2-Lev，3JHH6.2Hz)，4.01(m，2H，H5′)，4.29(m，1H，H4′)，5.02(m，1H，H3′)，6.50(dd，1H，H1′，3JHH8.1，3JHH6.5Hz)，和8.04(d，1H，H6，JHH1.3Hz)；13C-NMR(CDCl3，75.5MHz)d 12.4(Me)，27.8(CH2-Lev)，29.6(Me-Lev)，37.1(C2′)，37.7(CH2-Lev)，62.2(C5′)，74.9，85.0，85.7(C1′+C3′+C4′)，111.1(C5)，136.5(C6)，150.6(C2)，164.3(C4)，172.4(2C＝O Lev)，和206.8(2C＝O Lev)；MS(ESI+，m/z)363[(M+Na)+，100％]和379[(M+K)+，30].
3′-O-乙酰丙酰基-2′-胞苷(3b)Rf(20％MeOH/CH2Cl2)0.41；1H-NMR(MeOH-d4，200MHz)d 2.39(s，3H，Me-Lev)，2.47(m，1H，H2′)，2.67(m，1H，H2′)，2.75(m，2H，CH2-Lev)，3.02(m，2H，CH2-Lev)，4.00(m，2H，2H5′)，4.30(m，1H，H4′)，5.49(m，1H，H3′)，6.15(d，1H，H5，3JHH6.8Hz)，6.48(表观 t，1H，H1′，3JHH6.8Hz)，and 8.32(d，1H，H6，3JHH7.3Hz)；13C-NMR(MeOH-d4，75.5MHz)d 29.2(CH2-Lev)，29.9(Me-Lev)，38.9，39.5(C2′+CH2-Lev)，63.2(C5′)，76.9，87.1，87.8(C1′+C3′+C4′)，96.6(C5)，143.0(C6)，158.2(C2)，167.6(C4)，174.2(C＝O)，and 209.8(C＝O).
3′-O-乙酰丙酰基-2′-脱氧腺苷(3d)Rf(20％MeOH/CH2Cl2)0.66；IR(KBr)υ3292，2925，1730，1715，1690，1644，和1610cm-1；1H-NMR(MeOH-d4，200MHz)d 2.40(s，3H，Me-Lev)，2.76(m，1H，H2′)，2.80(t，2H，CH2-Lev，3JHH6.2Hz)，3.05(t，2H，CH2-Lev，3JHH6.2Hz)，3.14(m，1H，H2′)，4.04(m，2H，2H5′)，4.40(m，1H，H4′)，5.66(d，1H，H3′，3JHH6.0Hz)，6.61(dd，1H，H1′，3JHH5.7，3JHH9.1Hz)，8.39(s，1H，H2or H8)，和8.50(s，1H，H8orH2)；13C-NMR(MeOH-d4，75.5MHz)d 29.1(CH2-Lev)，29.9(Me-Lev)，38.9，39.0(C2′+CH2-Lev)，64.0(C5′)，77.5，87.6，87.9(C1′+C3′+C4′)，121.2(C5)，141.9(C8)，150.1(C4)，153.8(C2)，157.8(C6)，174.3(C＝O)，和209.8(C＝O)；MS(ESI+，m/z)350[(M+H)+，100％]，372[(M+Na)+，100]，和388[(M+K)+，60].
N-异丁酰基-3′-O-乙酰丙酰基-2′-脱氧鸟苷(3g)Rf(20％MeOH/CH2Cl2)0.75；Mp170-172℃；IR(KBr)υ 3415，2961，2929，2859，1725，1686，和1614cm-1；1H-NMR(MeOH-d4，200MHz)d 1.41(d，6H，Me-iBu，3JHH6.8Hz)，2.38(s，3H，Me-Lev)，2.70-3.09(m，7H，2CH2-Lev+2H2+CH-iBu)，3.98(d，2H，2H5′，3JHH3.4Hz)，4.45(m，1H，H4′)，5.60(m，1H，H3′)，6.51(dd，1H，H1′，3JHH5.9，3JHH8.4Hz)，和8.45(s，1H，H8)；13C-NMR(MeOH-d4，50.3MHz)d 19.6(Me-iBu)，29.2(CH2-Lev)，30.0(Me-Lev)，37.2(CH-iBu)，38.9，39.3(C2′+CH2-Lev)，63.3(C5′)，76.8，85.8，87.3(C1′+C3′+C4′)，121.5(C5)，139.7(C8)，150.0，150.5(C2+C4)，157.6(C6)，174.2(C＝O)，182.0(iBu-C＝O)，和209.7(C＝O)；MS(ESI+，m/z)436[(M+H)+，15％]和458[(M+Na)+，50].
5′-O-乙酰丙酰基胸苷(4a)Rf(10％MeOH/CH2Cl2)0.22；Mp141-143℃；IR(KBr)υ 3393，3215，2934，1737，1724，1643，和1629cm-1；1H-NMR(DMSO-d6，200MHz)d 1.91(s，3H，Me)，2.27(s，3H，Me-Lev′)，2.30(m，2H，H2′)，2.66(m，2H，CH2-Lev)，2.89(t，2H，CH2-Lev，3JHH6.2Hz)，4.07(m，1H，H4′)，4.35(m，3H，H3′+2H5′)，5.55(d，1H，OH)，6.32(t，1H，H1′，3JHH7.0Hz)，7.6(s，1H，H6′)，和11.45(s，1H，NH)；13C-NMR(DMSO-d6，50.3MHz)d 12.02(Me)，27.4(CH2-Lev)，29.4(Me-Lev)，37.2(C2′)，38.4(CH2-Lev)，63.8(C5′)，70.1(C3′)，83.5，83.6(C1′+C4′)，109.7(C5)，135.7(C6)，150.3(C4)，163.6(C2)，172.1(C＝O Lev)，和206.7(C＝O Lev)；MS(ESI+，m/z)341[(M+H)+，40％]，379[(M+Na)+，100]，and 379[(M+K)+，80].
N-苯甲酰基-5′-O-乙酰丙酰基-2′-胞苷(4c)Rf(10％MeOH/CH2Cl2)0.37；Mp50-52℃.IR(KBr)υ 3410，2919，1738，1701，和1650cm-1；1H-NMR(CDCl3，300MHz)d 2.20(s，3H，Me-Lev)，2.25(m，1H，H2′)，2.58(m，2H，CH2-Lev)，2.75(m，1H，H2′)，2.82(m，2H，CH2-Lev)，3.35(s，1H，OH)，4.25(m，1H，H3′)，4.40(m，3H，2H5′+H4′)，6.30(表观 t，1H，H1′，3JHH6.2Hz)，7.55(m，4H，H5+2Hm+Hp)，7.90(表观 d，2H，Ho，3JHH7.1Hz)，8.20(d，1H，H6，3JHH7.4Hz)，和8.78(s，1H，NH)；13C-NMR(CDCl3，50.3MHz)d 27.7(CH2-Lev)，29.6(Me-Lev)，37.7(CH2-Lev)，41.3(C2′)，63.7(C5′)，70.6，84.8，87.4(C1′+C3′+C4′)，96.8(C5)，127.6，128.7(Co+Cm)，132.8(Ci)，133.0(Cp)，144.2(C6)，155.1(C2)，162.4(C4)，166.7(PhC＝O)，172.6(C＝O)，和206.8(C＝O)；MS(ESI+，m/z)430[(M+H)+，20％]，452[(M+Na)+，65]，和468[(M+K)+，40].
N-苯甲酰基-5′-O-乙酰丙酰基-2′-脱氧腺苷(4e)Rf(10％MeOH/CH2Cl2)0.50；Mp69-71℃；IR(KBr)υ 3413，2959，2928，1726，1637，和1616cm-1；1H-NMR(MeOH-d4，300MHz)d 2.30(s，3H，Me-Lev)，2.70(m，3H，CH2-Lev+1H2′)，2.92(m，2H，CH2-Lev)，3.15(m，1H，H2′)，4.40(m，1H，H4′)，4.52(m，2H，2H5′)，4.85(m，1H，H3′)，6.75(表观 t，1H，H1′，3JHH6.2Hz)，7.80(m，3H，2Hm+Hp)，8.30(m，2H，2Ho)，8.78(s，1H，H2or H8)，和8.92(s，1H，H8or H2)，13C-NMR(MeOH-d4，75.5MHz)d 29.0(CH2-Lev)，29.9(Me-Lev)，38.9，40.8(CH2-Lev+C2′)，65.3(C5′)，72.6，86.51，86.54(C1′+C3′+C4′)，125.7(C5)，129.7，130.0(Co+Cm)，134.2(Cp)，135.2(Ci)，144.6(C8)，151.4(C4)，153.3(C5)，153.5(C2)，168.4(PhC＝O)，174.5(C＝O)，和209.7(C＝O)；MS(ESI+，m/z)476[(M+Na)+，100％]和492[(M+K)+，53].
N-异丁酰基-3′-O-乙酰丙酰基-2′-脱氧鸟苷(4g)Rf(20％MeOH/CH2Cl2)0.60；Mp45-47℃；IR(KBr)υ3415，2930，1720，和1685 cm-1；1H-NMR(MeOH-d4，200MHz)d 1.41(d，6H，Me-iBu，3JHH6.8Hz)，2.33(s，3H，Me-Lev)，2.59-3.07(m，7H，2CH2-Lev+2H2′+CH-iBu)，4.32(m，1H，H4′)，4.50(m，2H，H5′)，4.75(m，1H，H3′)，6.50(表观t，1H，H1′，3JHH6.4Hz)，和8.32(s，1H，H8)；13C-NMR(MeOH-d4，75.5MHz)d 19.7(Me-iBu)，29.0(CH2-Lev)，29.9(Me-Lev)，37.2(CH-iBu)，38.9，41.1(C2′+CH2-Lev)，65.3(C5′)，72.6，86.1，86.5(C1′+C3′+C4′)，121.8(C5)，139.8(C8)，150.0，150.5(C2+C4)，157.8(C6)，174.5(C＝O)，182.0(iBu-C＝O)，和209.7(C＝O)；MS(ESI+，m/z)436[(M+H)+，20％]，458[(M+Na)+，100]，和474[(M+K)+，50].
带有乙酰丙酰基保护基团的胸苷四聚物在3′-O和5′-O端基的各个位置上进行酶水解的一般方法。
在二保护四聚物的1，4-二噁烷溶液中加入0.15M磷酸盐缓冲溶液pH＝7和相应的脂酶[对CAL-A或CAL-B，四聚物∶酶＝1∶1(w/w)，对PSL-C为1∶3(w/w)]。混合物在40℃于250rpm反应62h。反应用TLC(10％MeOH/CH2Cl2)控制。过滤出酶，用CH2Cl2洗涤，真空蒸发溶剂，残余物溶于NaHCO3(水溶液)，并用CH2Cl2萃取，合并的有机层用Na2SO4干燥，蒸发后得到单酰基聚核苷酸。
2′-脱氧核苷区域选择性酶酰化的一般方法。2′-脱氧核苷酶酰化的一般方法见图5。在氮气中，使1(0.2mmol)、肟酯(0.6mmol)和脂酶在无水THF(1mL)中的悬浮液在250rpm按照表3指出的温度和时间进行反应。反应由TLC(10％MeOH/CH2Cl2)控制。过滤出酶，用CH2Cl2洗涤，真空蒸发溶剂，残余物溶于NaHCO3(水溶液)，并用CH2Cl2萃取，合并的有机层用Na2SO4干燥和蒸发。残余物在乙醚中沉淀，过滤后得到单乙酰丙酰基核苷3或4。除了在10和11项的情况下，不需要进一步纯化分离出其它痕量的酰基衍生物。
2′-改性核糖核酸区域选择性酶酰化的一般方法。2′-改性核糖核酸酶酰化的一般方法见图7。使2′-改性核糖核酸5与肟乙酰丙酰基酯在THF中和在脂酶(CAL-B或PSL-C)存在下反应。反应产物8(CAL-B)在5’-位酰化，反应产物9(PSL-C)在3’-位酰化。
由前述可以看出，本发明提供了由核苷和/或3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷前体选择性制备3′-O-乙酰丙酰基核苷和5′-O-乙酰丙酰基核苷的温和的方法。本发明适合用于大规模生产保护的核苷。用本发明方法制备的化合物可用于制备低聚核苷酸的各种方法。
上文已经参照一些实施方案对本发明作了说明，本文所公开的方法是常规方法，可用于各种基质，特别是其中具有羟基的基质。因此，本领域技术人员可以理解的是这里所描述的一般方法的其它实施方案也在本发明的范围之内。没有任何特定的实施方案会限制本发明的范围。
本文所引用的所有文献都以全文引入本发明作为参考。
权利要求
1.使3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷选择性脱保护的方法，该方法包括a.选择对所述核苷的乙酰丙酰基位置能直接有效的区域选择性水解的水解酶；和b.使3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷与所述的水解酶在有效地生成相应的3′-O-乙酰丙酰基和5′-O-乙酰丙酰基核苷的条件下接触一定时间
2.权利要求1的方法，其中所述的水解酶是脂酶。
3.权利要求2的方法，其中所述的脂酶是CAL-A、CAL-B、PSL-C、猪胰脂肪酶(porcine pancreatic lipase)，粘稠色杆菌(Chromobactenaum viscosum)脂酶、米赫毛霉(Mucor miehei)脂酶，Humicola lanuginosa脂酶，沙门氏柏干酪青霉(Penicilliumcamemberti)脂酶或皱落念珠菌(Candida rugosa)脂酶。
4.权利要求3的方法，其中所述的脂酶是CAL-A。
5.权利要求3的方法，其中所述的脂酶是CAL-B。
6.权利要求3的方法，其中所述的脂酶是PSL-C。
7.使3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷在5’-O-乙酰丙酰基位置选择性脱保护的方法，该方法包括选择对所述3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷的5’-乙酰丙酰基位置能直接有效的区域选择性水解的水解酶，和使所述的3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷与所述的水解酶在有效地生成3′-O-乙酰丙酰基核苷时间和的条件下接触。
8.权利要求7的方法，其中所述的水解酶是脂酶。
9.权利要求8的方法，其中所述的脂酶是CAL-B。
10.使3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷在3’-O-乙酰丙酰基位置选择性脱保护的方法，该方法包括选择对所述3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷的3’-乙酰丙酰基位置能直接有效的区域选择性水解的水解酶，和使所述3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷与所述的水解酶在有效地生成相应的5′-O-乙酰丙酰基核苷的时间和条件下接触。
11.权利要求10的方法，其中所述的水解酶是脂酶。
12.权利要求11的方法，其中所述的脂酶是CAL-A。
13.权利要求11的方法，其中所述的脂酶是PSL-C。
14.使3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷在5’-O-乙酰丙酰基位置选择性脱保护的方法，该方法包括选择对所述3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷的5’-乙酰丙酰基位置能直接有效的区域选择性水解的水解酶，和使所述3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷与所述的水解酶在有效地生成3′-O-乙酰丙酰基核苷的时间和条件下接触，其中所述的3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷为下式之一 其中R1是-H，-羟基，保护的羟基，或2′-取代基；和R2和R3各自独立地是-H或氨基保护基团；G是N或CH；和Lev是-C(O)-(CH2)2-C(O)-CH3。
15.权利要求14的方法，其中所述的水解酶是脂酶。
16.权利要求15的方法，其中所述的脂酶是CAL-B。
17.权利要求14的方法，其中所述的3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷是腺苷、胞嘧啶、胸苷或N-异丁基鸟苷。
18.使3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷在3’-O-乙酰丙酰基位置选择性脱保护的方法，该方法包括选择对所述3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷的3’-乙酰丙酰基位置能直接有效的区域选择性水解的水解酶，和使所述3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷与所述的水解酶在有效地生成5′-O-乙酰丙酰基核苷的时间和条件下接触，其中所述的3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷为下式之一 其中R6是-H或-OH；R2、R3、R4和R5各自独立地是-H或氨基保护基团；G是N或CH；和Lev是-C(O)-(CH2)2-C(O)-CH3。
19.权利要求18的方法，其中所述的水解酶是脂酶。
20.权利要求19的方法，其中所述的脂酶是CAL-A。
21.权利要求19的方法，其中所述的脂酶是PSL-C。
22.权利要求18的方法，其中所述的3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷是3′，5′-二-O-乙酰丙酰基胸苷、3′，5′-二-O-乙酰丙酰基胞嘧啶或3′，5′-二-O-乙酰丙酰基N-苯甲酰基腺苷。
23.权利要求22的方法，其中所述的3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷是N-异丁基鸟苷。
24.使3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷在5′-O-乙酰丙酰基位置选择性脱保护的方法，其中所述的3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷为下式之一 其中R1是-H，-羟基，保护的羟基，或2′-取代基；和R2和R3各自独立地是-H或氨基保护基团；G是N或CH；和Lev是-C(O)-(CH2)2-C(O)-CH3；该方法包括使3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷与CAL-B在有效地水解所述的3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷的时间和条件下接触。
25.权利要求24的方法，其中所述的3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷包括腺苷、胞嘧啶、胸苷或N-异丁基鸟苷部分。
26.使3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷在3’-O-乙酰丙酰基位置选择性脱保护的方法，其中所述的3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷为下式之一 其中R6是-H或-OH；R2、R3、R4和R5各自独立地是-H或氨基保护基团；G是N或CH；和Lev是-C(O)-(CH2)2-C(O)-CH3；该方法包括使3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷与PSL-C在有效地水解所述的3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷的时间和条件下接触。
27.权利要求26的方法，其中所述的3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷包括N-异丁基鸟苷部分。
28.使3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷在3’-O-乙酰丙酰基位置选择性脱保护的方法，其中所述的3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷为下式之一 其中R6是-H或-OH；R2、R3、R4和R5各自独立地是-H或氨基保护基团；G是N或CH；和Lev是-C(O)-(CH2)2-C(O)-CH3；该方法包括使3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷与CAL-A在有效地水解所述的3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷的时间和条件下接触。
29.权利要求28的方法，其中所述的3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷包括胸苷、胞嘧啶、或N-苯甲酰基腺苷部分。
30.至少保护核酸2′-O-3′-O或5′-O的一个羟基部分的方法，该方法包括使所述核酸与乙酰丙酸在有连接于高分子载体的偶合剂存在下，和在使2′-O、3′-O或5′-O位有效地形成酯的时间和条件下反应。
31.权利要求30的方法，其中所述的核酸是核苷。
32.权利要求30的方法，其中所述的偶合剂是碳二亚胺。
33.权利要求32的方法，其中所述的碳二亚胺是环己基碳二亚胺。
34.权利要求30的方法，其中所述的高分子载体是聚苯乙烯。
35.权利要求30的方法，其中所述的高分子载体是聚乙二醇。
36.至少酰化碳水化合物的一个羟基部分的方法，该方法包括使所述的碳水化合物与乙酰丙酸在有连接于高分子载体的偶合剂存在下，和能有效地形成酯的时间和条件下反应。
37.权利要求36的方法，其中所述的偶合剂是碳二亚胺。
38.权利要求37的方法，其中所述的碳二亚胺是环己基碳二亚胺。
39.权利要求36的方法，其中所述的高分子载体是聚苯乙烯载体。
40.权利要求36的方法，其中所述的高分子载体是聚乙二醇载体。
41.至少酰化类固醇分子的一个羟基部分的方法，该方法包括使所述的类固醇分子与乙酰丙酸在有连接于高分子载体的偶合剂存在下，和能有效地形成酯的时间和条件下反应。
42.权利要求41的方法，其中所述的偶合剂是碳二亚胺。
43.权利要求42的方法，其中所述的碳二亚胺是环己基碳二亚胺。
44.权利要求41的方法，其中所述的高分子载体是聚苯乙烯载体。
45.权利要求41的方法，其中所述的高分子载体是聚乙二醇载体。
46.保护下式化合物的羟基的方法， 其中Bx是核碱基；T1和T2各自独立地是OH、羟基保护基团、活化的磷酸酯基、核苷酸、核苷或低聚核苷酸；R是-H、-羟基、保护的羟基或2′-取代基；条件是T1、T2或R中至少一个是-OH；该方法包括使所述的化合物与乙酰丙酸在有连接于高分子载体的偶合剂存在下，和在能使所述羟基部分和乙酰丙酰基部分之间有效地形成酯的时间和条件下反应。
47.权利要求46的方法，其中所述的偶合剂是碳二亚胺。
48.权利要求47的方法，其中所述的碳二亚胺是环己基碳二亚胺。
49.权利要求46的方法，其中所述的高分子载体是聚苯乙烯载体。
50.权利要求46的方法，其中所述的高分子载体是聚乙二醇载体。
51.保护下式化合物的3′-O或5′-O位的方法 其中Bx是核碱基；R是-H或2′-取代基；该方法包括使所述的化合物与乙酰丙酸在有连接于固体载体的偶合剂存在下，和在能有效地形成下式化合物的时间和条件下反应 其中Lev是乙酰丙酰基。
52.权利要求51的方法，其中所述的连接于高分子载体的偶合剂是连接于高分子载体的环己基碳二亚胺。
53.权利要求52的方法，其中所述的高分子载体是聚苯乙烯高分子载体。
54.保护下式化合物的3′-O或5′-O位的方法 其中Bx是核碱基；R是-H或2′-取代基；该方法包括使所述的化合物与乙酰丙酸在有连接于聚苯乙烯该分子载体的环己基碳二亚胺存在下，和能有效地形成下式化合物的时间和条件下反应 其中Lev是乙酰丙酰基。
55.酰化羟基部分的方法，该方法包括使所述的羟基部分与乙酰丙酸在有连接于高分子载体的偶合剂存在下，和能有效形成酯的时间和条件下反应。
56.权利要求55的方法，其中所述的偶合剂是碳二亚胺。
57.权利要求56的方法，其中所述的碳二亚胺是环己基碳二亚胺。
58.权利要求55的方法，其中所述的高分子载体是聚苯乙烯。
59.权利要求55的方法，其中所述的高分子载体是聚乙二醇。
60.由环己基脲衍生的高分子载体制备环己基碳二亚胺衍生的高分子载体的方法，该方法包括使所述环己基脲衍生的高分子载体与脱水剂在有机溶剂中，和在有效地形成所述环己基碳二亚胺衍生的高分子载体的时间和条件下反应。
61.权利要求60的方法，其中所述的脱水剂是POCl3。
62.权利要求61的方法，其中所述的脱水剂是甲苯磺酰氯。
63.权利要求62的方法，其中所述的有机溶剂是CH2Cl2、CHCl3、己烷或吡啶。
64.权利要求61的方法，其中所述的高分子载体是聚苯乙烯高分子载体。
65.由环己基脲衍生的高分子载体制备环己基碳二亚胺衍生的高分子载体的方法，该方法包括以下步骤a.使所述环己基脲衍生的高分子载体与脱水剂在有机溶剂中，和在有效地形成盐的时间和条件下反应；和b.使所述的盐与水溶液接触以生成所述的环己基碳二亚胺衍生的高分子载体。
66.权利要求65的方法，其中所述的脱水剂是POCl3。
67.权利要求65的方法，其中所述的脱水剂是甲苯磺酰氯。
68.权利要求65的方法，其中所述的有机溶剂是CH2Cl2、CHCl3、己烷或吡啶。
69.权利要求65的方法，其中所述的高分子载体是聚苯乙烯高分子载体。
70.使核苷选择性酰化的方法，该方法包括a.选择对所述核苷的5’-或3’-位能直接有效的区域选择性酰化的水解酶；和b.使所述核苷与酰化剂在该水解酶存在下，和在有效地生成选自3′-O-乙酰丙酰基核苷和5′-O-乙酰丙酰基核苷的时间和条件下接触。
71.权利要求70的方法，其中所述的水解酶是脂酶。
72.权利要求71的方法，其中所述的脂酶是CAL-A、CAL-B、PSL-C、猪胰脂肪酶(porcine pancreatic lipase)，粘稠色杆菌脂酶(Chromobactenaum viscosum)、米赫毛霉(Mucor miehei)脂酶，Humicola lanuginosa脂酶，沙门氏柏干酪青霉(Penicilliumcamemberti)脂酶或皱落念珠菌(Candida rugosa)脂酶。
73.权利要求72的方法，其中所述的脂酶是CAL-A。
74.权利要求72的方法，其中所述的脂酶是CAL-B。
75.权利要求72的方法，其中所述的脂酶是PSL-C。
76.使核苷在5’-位选择性酰化的方法，该方法包括选择对所述核苷的5’-位能直接有效的区域选择性酰化的水解酶，和使所述核苷在所述水解酶存在下和在有效地生成5′-O-乙酰丙酰基核苷的时间和条件下，与酰化剂接触。
77.权利要求76的方法，其中所述的水解酶是脂酶。
78.权利要求77的方法，其中所述的脂酶是CAL-B。
79.使核苷在3’-位选择性酰化的方法，该方法包括选择对所述核苷的3’-位能直接有效的区域选择性酰化的水解酶，和使所述核苷在所述水解酶存在下和在有效地生成3′-O-乙酰丙酰基核苷的时间和条件下，与酰化剂接触。
80.权利要求79的方法，其中所述的水解酶是脂酶。
81.权利要求80的方法，其中所述的脂酶是CAL-B。
82.权利要求80的方法，其中所述的脂酶是PSL-C。
83.使核苷在5’-位选择性酰化的方法，该方法包括选择对所述核苷的5’-位能直接有效的区域选择性酰化的水解酶，和使所述核苷在所述水解酶存在下和在有效地生成5′-O-乙酰丙酰基核苷的时间和条件下，与酰化剂接触，所述的核苷为下式之一 其中R1是-H，-羟基，保护的羟基，或2′-取代基；和R2和R3各自独立地是-H或氨基保护基团；和G是N或CH。
84.权利要求83的方法，其中所述的水解酶是脂酶。
85.权利要求84的方法，其中所述的脂酶是CAL-B。
86.权利要求83的方法，其中所述的核苷是腺苷、胞嘧啶、胸苷或N-异丁基鸟苷。
87.使核苷在3’-位选择性酰化的方法，该方法包括选择对所述核苷的3’-位能直接有效的区域选择性酰化的水解酶，和使所述核苷在所述水解酶存在下和在有效地生成3′-O-乙酰丙酰基核苷的时间和条件下，与酰化剂接触，所述的核苷为下式之一 其中R6是-H或-OH；R2、R3、R4和R5各自独立地是-H或氨基保护基团；G是N或CH；和Lev是-C(O)-(CH2)2-C(O)-CH3。
88.权利要求87的方法，其中所述的水解酶是脂酶。
89.权利要求88的方法，其中所述的脂酶是CAL-A。
90.权利要求88的方法，其中所述的脂酶是PSL-C。
91.权利要求87的方法，其中所述的核苷是胸苷、胞嘧啶或N-异丁基腺苷。
92.权利要求91的方法，其中所述的核苷是N-异丁基鸟苷。
93.使核苷在5’-位选择性酰化的方法，其中所述的核苷为下式之一 其中R1是-H，-羟基，保护的羟基，或2′-取代基；和R2和R3各自独立地是-H或氨基保护基团；和G是N或CH；该方法包括使所述的核苷在有效地酰化所述核苷5′-位的时间和条件下与酰化剂和CAL-B接触。
94.权利要求93的方法，其中所述的核苷包括腺苷、胞嘧啶、胸苷或N-异丁基鸟苷部分。
95.使核苷在3’-位选择性酰化的方法，其中所述的核苷为下式之一 其中R6是-H或-OH；R2、R3、R4和R5各自独立地是-H或氨基保护基团；G是N或CH；和Lev是-C(O)-(CH2)2-C(O)-CH3；该方法包括使所述核苷在PSL-C存在下和有效地酰化所述核苷3′-位的时间和条件下，与酰化剂接触。
96.权利要求95的方法，其中所述的核苷包括N-异丁基鸟苷部分。
97.使核苷在3’-位选择性酰化的方法，其中所述的核苷为下式之一 其中R6是-H或-OH；R2、R3、R4和R5各自独立地是-H或氨基保护基团；和G是N或CH；该方法包括使所述核苷在有效地酰化所述核苷3′-位的时间和条件下，与CAL-A接触。
98.权利要求97的方法，其中所述的核苷包括胸苷、胞嘧啶或N-异丁基腺苷部分。
全文摘要
本发明涉及由常规的前体用酶方法制备3’－和5’－乙酰丙酰基核苷的方法。a,B=T;b,B=C;c,B=C
文档编号C12P19/30GK1500094SQ02807529
公开日2004年5月26日 申请日期2002年3月20日 优先权日2001年3月30日
发明者约根施·S·桑维, 维桑斯·戈托尔, 米格尔·费雷罗, 苏珊娜·费尔南德斯, 雅维耶·加西亚, 加西亚, 戈托尔, 费尔南德斯, 费雷罗, 约根施 S 桑维 申请人:Isis药物公司, 奥维多大学
技术领域：
本发明涉及用酶方法由常规的前体制备3′-O和5′-O-乙酰丙酰基核苷的方法。这些方法对大规模生产低聚核苷酸很有用。
发明的
背景技术：
已经知道哺乳动物的身体状况，包括大部分疾病症状都会受到蛋白质的影响。这些蛋白质或者直接作用或通过它们的酶作用对动物和人的很多疾病有很大作用。传统的治疗方法一般集中在与这些蛋白质的相互作用，以努力减少这些疾病的起因或疾病可能的功能。但是，最近在尝试通过与这些蛋白质直接合成的例如细胞内RNA的相互作用减少这些蛋白质的实际生成量。通过对蛋白质生成过程的干扰希望能够达到最大的治疗效果和最小的副作用。这些治疗方法的一般目的是干扰或者减少导致不希望生成的蛋白质的基因表达。
抑制特定基因表达的一种方法是使用低聚核苷酸和低聚核苷酸类似物作为“反义”剂。使用与特定的、靶、信使RNA(mRNA)序列有互补作用的低聚核苷酸和低聚核苷酸类似物。反义的方法常常直接指向相对较小的低聚核苷酸和低聚核苷酸类似物与单链mRNA或单链DNA的互补杂交，如此可使这些细胞内核酸的正常、基本功能被切断。杂交是低聚核苷酸和低聚核苷酸类似物与RNA的Watson-Crick碱基对或单链DNA的序列以特定氢键键合。这些碱基对被认为是相互互补的。
现已经接受以低聚核苷酸和低聚核苷酸类似物作为治疗剂，对作为治疗和诊断的方法有更大的期望。但是用作反义剂的低聚核苷酸和低聚核苷酸类似物在用于治疗、诊断和作为研究试剂时常常需要大量生产低聚核苷酸和低聚核苷酸类似物。
生产低聚核苷酸有三种基本方法。Reese，Tetrahedron 1978，34，3143描述了磷酸三酯的方法；氨基磷酸(phosphoramidite)法由Beaucage在Methods in Molecular BiologyProtocols for Oligonucleotides andAnalogs描述；Agrawal编辑，Humana PressTotowa，1993，Vol.20，33-61；以及H-膦酸酯法由Froehier描述在Methods in Molecular BiologyProtocols for Oligonucleotides and Analogs，Agrawal编辑；Humana PressTotowa，1993，Vol.20，63-80。
磷酸三酯法被广泛用于溶液相合成，而氨基磷酸法和H-膦酸酯法主要应用于固相合成。最近，Reese报道了低聚核苷酸在H-膦酸酯上耦合的液相合成新方法，参见Reese等人，Nucleic Acids Research，1999，27，963-971，和Reese等人，Biorg.Med.Chem.Lett.，1997，7，2787-2792，它们被引入此文作为参考。溶液相合成是大规模生产低聚核苷酸选用的方法。
这些溶液相方法需要应用在3’-位和/或5’-位带有保护基团的核苷单体结构单元。保护基团在耦合条件下和选择性分解时应该是稳定的，不会影响分子中的其它保护基团。一种这样的保护基团是乙酰丙酰基-C(O)-(CH2)2-C(O)-CH3。但是，带有这些保护基团的核苷的制备包括几个冗长的化学保护/脱保护和/或纯化步骤。
例如，核苷的3′，5′-二-O-乙酰丙酰基保护用已知的方法完成，通过使核苷与乙酰丙酸在DCC(二环己基碳二亚胺)存在下进行反应，使其中的核苷在其羟基位置进行选择性酰化。虽然使用了这种方法，依然至少存在一个重要的问题。该方法需要大量过量的DCC以达到最佳的产率。在完成反应之后过量的DCC转化成DCU(二环己基碳二亚胺)，必须将其由反应混合物中分离。不辛的是，在大规模合成时，分离步骤需要可观的时间和费用。
在本发明之前，5′-O-乙酰丙酰基核苷的合成是通过使母体核苷与乙酰丙酸和2-氯-1-甲基氯化吡啶鎓进行反应来完成。Iwai等人，Nucleic Acids Res.，1988，16，9443-9456；Iwal等人，Tetrahedron，1990，46，6673-6688。但是，由于此方法对5′-羟基官能团不能进行选择性酰化，必须另外进行纯化和脱保护步骤，因为在反应中会形成3′-酰基和3′，5′-二酰基衍生物。通过色谱法将3′，5′-二酰基衍生物分离出来之后，残余物必须用DMTrCl处理以除去3′-酰基化合物。最后，还要附加色谱纯化步骤以很低的产率分离5′-O-乙酰丙酰基衍生物。
以前，3′-O-乙酰丙酰基核苷(2′-脱氧或2′-保护的)的合成是通过用乙酰丙酸或乙酰丙酸酐和DCC处理母体核苷来实现的。此方法主要的缺点之一是在用乙酰丙酸酰化之前必须将5′-羟基官能团保护成为5′-O-DMTr基团，而5′-O-DMTr基团必须在酸介质中除去以得到3′-O-保护的核苷。参见Reese等人，Nucleic Acids Res.，1999，27，963-971，和Reese等人，J.Chem.Soc.，Perkin Trans.，1，1999，1477-1486。
人们一直在探索大规模合成低聚核苷酸的工业上可利用的方法。现已发现在有机合成中应用生物催化剂比常规的化学合成方法更具有吸引力。参见Carrea，等人，Angew.Chem.Int.Ed.2000，39，2226-2254；Bomscheuer，等人，Hydrolases in Organic Synthesis.Regio- andStereoselective Biotransformations，Wiley-VCHWeinheim，1999，Enzymes catalyze reactions with high chemo-，reglo-，andstereoselectivity，参见Ferrero等人，Chem.Rev.，2000，100，4319-4347；Ferrero等人，Monatsh.Chem.，2000，131，585-616。以前已有报道南极洲假丝酵母(Candida antarctica)脂酶B(CAL-B)以高选择性催化核苷5′-羟基基团的酰化。葱头假单胞菌(Pseudomonas cepacia)脂酶(PSL)对2’-脱氧核苷的3′-位的仲醇有不寻常的区域选择性。Moris等人，J.Org.Chem.，1993，58，653-660；Gotor等人，Synthesis，1992，626-628。
最近几年，反义低聚核苷酸作为新的治疗方法脱颖而出。其结果是，不久的将来需要有大量应用低聚核苷酸的治疗。关于合成低聚核苷酸结构单元所需要的费用和时间，经过长期的努力已经成功地开发出高效和高产品纯度的制备方法。
发明综述本发明人已经发现例如用于大规模合成低聚核苷酸的方法和试剂。本发明的方法有助于以最少的步骤用酶方法达到所需产率。在一些实施方案中，本发明提供了由常用的前体合成3′-O-乙酰丙酰基核苷和5′-O-乙酰丙酰基核苷的方法和试剂。在这些实施方案中，使3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷进行区域选择性地脱保护，根据本文公开的参数，可得到3′-O-乙酰丙酰基核苷或5′-O-乙酰丙酰基核苷。具体地说，通过使相应的3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷前体与特定的水解酶如脂酶接触，可选择性地生成5′-O-乙酰丙酰基核苷或3′-O-乙酰丙酰基核苷。出人意料的是，已经发现在脱保护反应中，根据所选脂酶不同，选择性水解酶如脂酶的存在可提高3’-或5′-位脱酰基化的区域选择性。
在其它实施方案中，本发明提供了选择性制备在3′-O或5′-O位具有乙酰丙酰基的核苷的方法，该方法通过使核苷与酰化剂接触，以便能在所选择的水解酶(例如脂酶)存在下引入乙酰丙酰基。出人意料的是，已经发现根据为催化反应所选择的特定水解酶，可以在核苷的3’-或5′-位发生选择性酰化。
根据某些实施方案，提供了3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷区域选择性脱保护的方法，所说的方法包括选择水解酶，如脂酶，该水解酶对一个乙酰丙酰基位置的直接区域选择性水解是有效的，而其它位置的乙酰丙酰基不会发生不希望水平的水解，以及在有效生成3′-O-乙酰丙酰基核苷和5′-O-乙酰丙酰基核苷的时间和条件下使3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷与该脂酶接触。本发明所涉及的水解酶的实例包括南极洲假丝酵母(Candida antarctica)脂酶B(CAL-B)、南极洲假丝酵母脂酶A(CAL-A)、葱头假单胞菌(Pseudomonas cepacia)脂酶(PSL)、猪胰脂肪酶(porcine pancreatic lipase)、粘稠色杆菌(Chromobactenaum viscosum)脂酶、米赫毛霉(Mucor miehei)脂酶、Humicola lanuginosa脂酶、沙门氏柏干酪青霉(penicillium camemberti)脂酶、皱落念珠菌(Candidarugosa)脂酶等。
根据一些实施方案，提供了核苷区域选择性酰化的方法，该方法包括选择水解酶，如脂酶，所述的水解酶对核苷一个-OH位置的直接区域选择性酰化是有效的，而其它位置的羟基不会发生不希望水平的酰化，以及在有效生成3′-O-乙酰丙酰基和5′-O-乙酰丙酰基核苷的时间和条件下使核苷与酰化剂和所选的脂酶接触，以引入乙酰丙酰基。本发明所涉及的水解酶的实例包括南极洲假丝酵母脂酶B(CAL-B)、南极洲假丝酵母脂酶A(CAL-A)、葱头假单胞菌脂酶(PSL)、猪胰脂肪酶、粘稠色杆菌脂酶、米赫毛霉脂酶、Humicola lanuginosa脂酶、沙门氏柏干酪青霉脂酶、皱落念珠菌脂酶等。
根据本发明的某些实施方案，3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷在5′-O-乙酰丙酰基位脱保护，所说的脱保护是在5′-O-乙酰丙酰基位置能有效地进行区域选择性水解，但不会影响3′-O-乙酰丙酰基位置的时间和条件下使使二保护核苷与CAL-B接触。
根据本发明的另一些实施方案，核苷在5′-OH位(或简称5′-位)可选择性酰化，所述的酰化是在CAL-B存在下，和在使核苷在5’-位有效进行区域选择性酰化以形成5′-O-乙酰丙酰基核苷的时间和条件下使核苷与酰化剂接触，以引入乙酰丙酰基。
在另一些实施方案中，3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷的3′-O-位的乙酰丙酰基的脱保护是在3′-O-乙酰丙酰基的位置能有效地进行区域选择性水解，但不会影响5′-O-乙酰丙酰基位置的时间和条件下，使二保护核苷与CAL-A或PSL-C接触。
在另一实施方案中，在核苷3′-OH位进行区域选择性酰化，该酰化是在CAL-A或PSL-C存在下，和能使核苷在3’-位有效地进行区域选择性酰化的时间和条件下，通过将核苷与酰化剂接触引入乙酰丙酰基基团，以制备3′-O-乙酰丙酰基核苷。
在本发明的一些实施方案中，公开了多种使3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷的5′-O-乙酰丙酰基位区域选择性脱保护的方法，其中所述的核苷为下式之一 其中
R1是-H，-羟基，保护的羟基，2’-取代基或2′-保护的取代基；和R2和R3各自独立地是-H或氨基保护基团；G是N或CH；和Lev是-C(O)-(CH2)2-C(O)-CH3，乙酰丙酰基；该方法包括选择对所述核苷的5’-O-位乙酰丙酰基能进行直接有效的区域选择性水解，但不会引起3’-O-位乙酰丙酰基水解的水解酶，和使所述的3’，5’-二-O-乙酰丙酰基核苷在有效地生成3′-O-乙酰丙酰基核苷的时间和条件下，与所述的酶接触以产生3′-O-乙酰丙酰基核苷。对5′-O-乙酰丙酰基水解优选的酶是CAL-B。
在本发明的另一实施方案中提供了使3′-O-乙酰丙酰基位进行区域选择性脱保护的方法，其中所述的核苷为下式之一 其中
R6是-H或-羟基；R2、R3、R4和R5各自独立地是-H或氨基保护基团；G是N或CH；和Lev是-C(O)-(CH2)2-C(O)-CH3；该方法包括选择对所述3’-O-位乙酰丙酰基能进行直接有效的区域选择性水解，但不会引起5’-O-位乙酰丙酰基水解的水解酶，和使所述的3’，5’-二-O-乙酰丙酰基核苷在有效地生成5′-O-乙酰丙酰基核苷的时间和条件下，与所述的酶接触。对3′-O-乙酰丙酰基位水解优选的酶例如是CAL-A或PSL-C。
在本发明的一些实施方案中，公开了多种核苷的5′-OH位置上区域选择性地引入乙酰丙酰基的方法， 其中所述的核苷为下式之一 其中
R1是-H，-羟基，保护的羟基，2’-取代基或2′-保护的取代基；和R2和R3各自独立地是-H或氨基保护基团；G是N或CH；和Lev是-C(O)-(CH2)2-C(O)-CH3，乙酰丙酰基；该方法包括选择对所述核苷的5’-O-位能进行直接有效的区域选择性酰化，但不会引起3’-O-位酰化的水解酶，和使所述的核苷在有效地生成5′-O-乙酰丙酰基核苷的时间和条件下，与酰化剂和所述的酶接触，以制备5’-O-乙酰丙酰基核苷。对5′-O-乙酰丙酰基酰化而言，优选的酶是CAL-B。
在本发明的另一实施方案中，提供了使核苷的3′-OH位进行区域选择性酰化的方法， 其中所述的核苷为下式之一 其中
R6是-H或-羟基；R2、R3、R4和R5各自独立地是-H或氨基保护基团；G是N或CH；和Lev是-C(O)-(CH2)2-C(O)-CH3；该方法包括选择对所述核苷的3’-O-位能进行直接有效的区域选择性酰化，但不会引起5’-O-位酰化的水解酶，和使所述的核苷在有效地生成3′-O-乙酰丙酰基核苷的时间和条件下，与酰化剂和所述的酶接触，以制备3’-O-乙酰丙酰基核苷。对3′-O-乙酰丙酰基酰化而言，优选的酶是CAL-A或PSL-C。
在本发明一些实施方案中提供了多种使核酸如核苷或核苷酸的羟基部分，例如2′-O、3’-O或5′-O位的一个或多个羟基酰化的方法，该方法包括使所述的核酸与乙酰丙酸在有连接于高分子载体的偶合剂如碳二亚胺存在下，和能在2′-O、3′-O或5′-O位有效地形成酯的时间和条件下反应。优选的高分子载体包括连接于环己基碳二亚胺的聚苯乙烯或聚乙二醇高分子载体。
本发明还包括使例如碳水化合物或类固醇分子中的任何羟基部分酯化或酰化的方法，该方法包括使含有羟基部分的所述化合物与乙酰丙酸在有连接于高分子载体的偶合剂存在下，和在能使羟基部分和乙酰丙酸的乙酰丙酰基基团之间有效地形成酯的时间和条件下反应。
在本发明一些实施方案中，提供了多种使下式化合物上的至少一个羟基部分酰化的方法， 其中
Bx是核碱基(nucleobase)；T1和T2各自独立地是羟基、羟基保护基团、活化的磷酸酯基、核苷酸、核苷或低聚核苷酸；R是-H、-羟基、保护的羟基或2′-取代基；条件是T1、T2或R中至少一个是-羟基；该方法包括使所述的化合物与乙酰丙酸在有连接于固体载体的偶合剂如PS-环己基碳二亚胺存在下，和能在羟基部分和乙酰丙酰基之间有效地形成酯的时间和条件下反应。在优选的实施方案中，T1和T2是-OH，以及R是-H或是2′-取代基。
在优选的实施方案中，提供了酰化下式化合物的3′-O或5′-O位的方法 其中Bx是核碱基；R是-H或选择保护的2′-取代基；该方法包括使所述的化合物与乙酰丙酸在有连接于固体载体的偶合剂存在下，和在能有效地形成下式化合物的时间和条件下反应 其中Lev是乙酰丙酰基。
根据本发明一些实施方案，提供了多种由环己基脲衍生的高分子载体制备环己基碳二亚胺衍生的高分子载体的方法，该方法包括使所述环己基脲衍生的高分子载体与脱水剂如甲苯磺酰氯或POCl3在有机溶剂中，和在能有效地生成环己基碳二亚胺衍生的高分子载体的时间和条件下反应。在一些实施方案中，所用的有机溶剂是CH2Cl2，CHCl3，己烷或吡啶。
在本发明另一些实施方案中，提供了多种由环己基脲衍生的高分子载体制备环己基碳二亚胺衍生的高分子载体的方法，该方法包括以下步骤使所述环己基脲衍生的高分子载体与脱水剂在能有效地生成盐，进而使该盐与水溶液如NaOH水溶液接触，以形成环己基碳二亚胺衍生的高分子载体的时间和条件下反应。
附图的简要说明参照本发明的详细说明和下面说明性的附图，本领域技术人员能够更好的理解本发明。所述附图中
图1说明用乙酰丙酸和DCC，或乙酰丙酸和PS-碳二亚胺使2′-脱氧核苷的3′，5′-二-O-酰化。
图2说明3′，5′-二-O-乙酰丙酰基2′-脱氧核苷的酶区域选择性水解。
图3说明3′，5′-二-O-乙酰丙酰基2′-取代核苷的酶区域选择性水解。
图4列表说明了核苷2a-2g区域选择性水解的结果。
图5说明2′-脱氧核苷的区域选择性酰化。
图6列表说明2′-脱氧核糖核苷1a、1c、1e和1g区域选择性酰化的结果。
图7说明核糖核苷的区域选择性酰化。
图8列表说明核糖核苷5a-5g区域选择性酰化的结果。
发明的详细描述本发明涉及核苷结构单元如3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷、3′-O-乙酰丙酰基核苷和5′-O-乙酰丙酰基核苷的制备，该方法在大规模合成低聚核苷酸时特别有用。
根据本发明的一些实施方案，提供了多种保护核酸2′-O、3′-O或5′-O位羟基部分的至少一个羟基的方法，该方法包括使所述核酸在有与高分子载体连接的耦合剂存在下，和在2′-O、3′-O或5′-O位能有效地生成酯的时间和条件下，与乙酰丙反应。本发明所述的核酸包括核苷、核苷酸、低聚核苷和低聚核苷酸。在一些实施方案中，所述的核酸是核苷，所述的高分子载体是与耦合剂如环己基碳二亚胺耦合的聚苯乙烯载体或聚乙二醇载体。
在优选的实施方案中，所述的核酸具有下式结构 其中Bx是核碱基；T1和T2各自独立地是羟基、保护的羟基、活化的磷酸酯基、核苷酸、核苷或低聚核苷酸；R是-H、-羟基、保护的羟基或2′-取代基；条件是T1、T2或R中至少一个是-OH；该方法包括使所述的化合物与乙酰丙酸在有连接于固体载体的偶合剂存在下，和能在羟基部分和乙酰丙酰基之间有效地形成酯的时间和条件下反应。在优选的实施方案中，T1和T2是-OH，以及R是H。
本发明的保护方法并不限于核苷的羟基的酰化，任何羟基官能团都可以用本发明的方法酰化，包括碳水化合物或类固醇分子中的羟基。
按照本发明的一些实施方案，参见图1，由具有相应性质的核苷制备3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷(2)，所述的制备是在1，4-二噁烷中，以DMAP作为催化剂，用乙酰丙酸和PS-碳二亚胺进行处理，过滤出聚苯乙烯珠，除去聚合物键合的脲和N-乙酰丙酰基脲衍生物。分离出3′，5′-二-O-乙酰丙酰基胸苷(2a)和3′，5′-二-O-乙酰丙酰基-2′-脱氧腺苷(2d)，产率分别为91％和95％。PS-碳二亚胺是昂贵的试剂，使环己基脲衍生的高分子载体与脱水剂在有机溶剂中反应，以进行回收。优选的脱水剂包括POCl3和甲苯磺酰氯。优选的有机溶剂是CH2Cl2，CHCl3，己烷和吡啶。
参见图1，1，3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷还可以由相应性质的核苷(1)在1，4-二噁烷中，以DMAP作为催化剂，用5.2当量乙酰丙酸(LevOH)和二环己基碳二亚胺(DCC)进行处理来制备。通过用DCC活化乙酰丙酸而发生该反应，得到O-酰基脲中间体。在反应过程中，过量的加合物成为稳定的N-酰基脲，该化合物以DCU作为副产物分离出来。在进行快速色谱之后，以高产率(70-95％)生成3′，5′-二乙酰丙酰基衍生物(2)。该反应的粗制残余物用Et2O洗涤以消除N-酰基脲，接着将其溶于EtOAc，由该溶液中过滤分离出留下的DGU。此酰化反应的产率几乎是定量的。1H-NMR分析结果给出了纯度水平，指出只有痕量DCU和N-乙酰丙酰基脲。在此条件下，2′-脱氧腺苷(1d)和2′-脱氧鸟苷(1f)的氨基位置不发生酰化。在2′-脱氧胞苷(1b)的情况下，用较少量的LevOH和DCC(3当量)将氨基酰基衍生物的形成减到最少。其结果，需要较长的反应时间和，并且有一些反应原料不变。在进行快速色谱之后，以68％分离产率得到3′，5′-二-O-乙酰丙酰基-2′-胞苷(2b)。
常用前体，3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷在5′-O-乙酰丙酰基位置的区域选择性脱保护可通过下述方法进行选择可直接地在5’-乙酰丙酰基位置有效地进行区域选择性水解，但不会引起3′-O-乙酰丙酰基位置水解的水解酶，如脂酶，使二保护的核苷与所述的脂酶在使3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷的5′-O-乙酰丙酰基位置有效水解的时间和条件下接触。在一些实施方案中，二保护的核苷具有下式之一的结构 其中R1是-H，-羟基，保护的羟基或2’-取代基；和R2和R3各自独立地是-H或氨基保护基团；G是N或CH；和Lev是-C(O)-(CH2)2-C(O)-CH3。
例如，参见图2，于40℃和在含有18％1，4-二噁烷的0.15M磷酸盐缓冲溶液(pH＝7)中，将3′5′-二-O-乙酰丙酰基胸苷(2a)用CAL-B处理。TLC表明62小时后起始原料全部消失(表1，第一行)。经过如下文所述的常规的精制Myers等人，Trends Pharmacol.Sci.，2000，21，19-23；Cook，Nucleosides Nucleotides，1999，18，1141-1162；Crooke等人，Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.，1996，36，107-129；和Matteucci等人，1996，384，20-22，其中所述内容全部引入本文作为参考。1H-NMR谱清楚地指出5′-乙酰丙酰基酯选择性水解，以及3′-O-乙酰丙酰基胸苷(3a)是唯一的产物。在萃取之后，酶反应中形成的痕量的胸苷(如TLC所示)保留在水相中。因此，分离出纯的化合物(3a)，产率85％。
如图4所示，表1还指出基质3′，5′-二-O-乙酰丙酰基胞嘧啶(2b)、3′，5′-二-O-乙酰丙酰基腺苷(2d)和3′，5′-二-O-乙酰丙酰基-N-异丁基鸟苷(2g)在CAL-B存在下进行水解时，对5′-位有优良的选择性。没有5′-O-乙酰丙酰基衍生物，且反应以非常高的产率进行。而且，在这些情况下，TLC表明完全水解的核苷的痕量物很容易通过水萃取除去。
对N-苯甲酰基-二-O-乙酰丙酰基-2′-脱氧胞苷(2c)和N-苯甲酰基-二-O-乙酰丙酰基-2′-脱氧腺苷(2e)进行由CAL-B催化的水解反应可分别获得N-苯甲酰基-2′-脱氧胞苷(1c)和N-苯甲酰基-2′-脱氧腺苷(1e)。虽然尝试了几种反应条件，但反应过程不具有区域选择性。看来CAL-B的活性点不能以与其未保护的对应物那样相同的方式适用于N-保护的腺苷和胞苷。虽然不希望被任何特定的理论所束缚，但可能是由于苯基基团在其结合点有某些立体的接触，因此而导致了不希望的结果。
2′-取代的核苷在其5′-O-乙酰丙酰基位成功地进行了选择性地脱保护。参见图3，四种核苷，2′-甲氧基-3′，5′-二-O-乙酰丙酰基腺苷(6a)、2′-甲氧基乙氧基-3′，5′-二-O-乙酰丙酰基腺苷(6b)、2′-甲氧基-3′，5′-二-O-乙酰丙酰基-2′-脱氧胞嘧啶(6c)和2′-甲氧基乙氧基-3′，5′-二-O-乙酰丙酰基-5-甲基胞嘧啶(6d)全部可用CAL-B选择性水解，以高产率得到7a-7d。使核苷有效水解的时间和条件不限于本发明例举的内容。对本领域技术人员来说，使酯有效水解的各种时间和条件是可以理解的。
在本发明的一些实施方案中，3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷可由选择的水解酶如脂酶在3′-O-乙酰丙酰基位进行区域选择性脱保护，在3′-O-乙酰丙酰基位进行直接地区域选择性水解，但不会引起5′-O-乙酰丙酰基位的水解，使二保护的核苷与水解酶(如脂酶)在能使3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷的3′-O-乙酰丙酰基位有效水解的时间和条件下接触。在一些实施方案中，二保护的核苷是下述结构之一 其中R6是-H或-OH；R2、R3、R4和R5各自独立地是-H或氨基保护基团；G是N或CH；和Lev是-C(O)-(CH2)2-C(O)-CH3。
例如，参见图2，于60℃和在0.15M磷酸盐缓冲溶液中，使2与固定的葱头假单孢菌脂酶[PSL-C，比例为1∶3w/w(2/PSL-C)]反应，完成2，3′-二-O-的选择性水解，得到5’-O-乙酰丙酰基衍生物。对3′-O-乙酰丙酰基位，南极洲假丝酵母脂酶A(CAL-A)也显示出良好的选择性，并且比用PSL-C的反应温度更低(40℃代替60℃)，反应时间更短，酶/原料的比例更小(参见图4)。因此，可以高产率(70-85％)得到5′-O-乙酰丙酰基胸苷(4a)，N-苯甲酰基-5’-O-乙酰丙酰基-2′-脱氧胞苷(4c)，N-苯甲酰基-5’-O-乙酰丙酰基-2′-脱氧腺苷(4e)。对粗制反应混合物进行TLC或1H-NMR分析没有检出3′-乙酰丙酰基区域异构体。TLC表明有痕量的母体核苷1。
N-异丁酰基-3′，5′-二-O-乙酰丙酰基-2′-脱氧鸟苷(2g)不能用CAL-A选择性水解。但是，用PSL-C处理可得到N-异丁酰基-5′-O-乙酰丙酰基-2′-脱氧鸟苷(4g)，在60℃24小时后可以分离出来，产率93％(表1，第8项)。N-苯甲酰基-二-乙酰丙酰基衍生物(2c)和(2e)对PSL-C和CAL-A两种脂酶都是合适的基质。
如图3所示，将2′-OR核苷用PSL-C或CAL-A处理，得到3′-O-乙酰丙酰基和5′-O-乙酰丙酰基核苷的混合物，这说明对2′-O和2′-脱氧核苷没有选择性。虽然不能与任何特定的理论结合，但这可能是由于2′-O-R基团的空间位阻使3′-O-乙酰丙酰基难以接近以便由其中的一种脂酶进行选择性的水解。
在本发明的一些实施方案中，可以进行如图5所示的酶酰化。在氮气中，将1(0.2mmol)的悬浮液、肟酯(0.6mmol)和脂酶在无水THF(1mL)中在表3所指温度下于250rpm搅拌表3所指的时间(图8)。反应由TLC(10％MeOH/CH2Cl2)控制。过滤出所述的酶，用CH2Cl2洗涤，真空蒸出溶剂，将残余物溶于NaHCO3(水溶液)并用CH2Cl2萃取，合并的有机层用Na2SO4干燥并蒸发。残余物用乙醚中沉淀，过滤后得到单乙酰丙酰基核苷3或4。除了在第10和11项中需要分离出痕量的其它酰基衍生物以外，可以不必进一步纯化。
可以看出，酰化方法比水解需要的步骤更少，也更容易进行。起始原料是母体核苷，不必首先制备二乙酰丙酰基衍生物。水解方法需要两个步骤，而酰化方法只需要一个步骤。肟酯可以简单步骤制备和可通过简单的过滤纯化。酰化过程可避免快速色谱法。通过在CAL-B存在下进行酰化反应，可以得到5′-O-Lev-T、5′-O-Lev-dCBz、5′-O-Lev-dABz和5′-O-Lev-dGiBu。另一方面，用PSL-C可得到3′-O-Lev-T、3′-O-Lev-dCBz和5′-O-Lev-dABz(但不是3′-O-Lev-dGiBu)。为了制备3′-O-Lev-dGiBu必须进行酶水解反应。表3(图6)指出的扩大反应产率提高，在酶过滤(即避免萃取和沉淀)之后的快速色谱产率也较高。
在本发明的某些实施方案中，酰化方法也可用于如式XVI-XX定义的核糖核苷。核糖核苷的常规酰化方法如图7所示，其数据见表4(图8)。2′-烷基核糖核苷的单乙酰丙酰基衍生物可溶解于乙醚，不可能通过沉淀由剩余的肟酯中分离出来。因此，在酶过滤之后，残余物可用快速色谱法纯化(梯度淋洗液5-20％MeOH/CH2Cl2)。
用CAL-B，采用酰化方法，可能得到5′-0-Lev-2′-OMOE-T、5′-O-Lev-2′-O-MOE-5-Me-C、5′-O-Lev-2′-O-MOE-5Me-CBz、5′-O-Lev-2′-O-MOE-A、5′-O-Lev-2’-O-MOE-ABz、5′-O-Lev-2’-O-Me-A和5′-O-Lev-2′-O-MOE-GiBu。另一方面用PSL-C可得到3′-O-Lev-2’-O-MOE-5-Me-CBz、3′-O-Lev-2’-O-MOE-ABz和3′-O-Lev-2’-O-Me-ABz。需要通过水解反应制备相应的3′-Lev-T和3′-Lev-GiBu衍生物。
本发明实践中有用的核酸包括天然存在的和非天然存在的核苷和核苷酸。本发明所述的核苷和核苷酸不限于单体单元，而且也可以含有多个相连的单体单元形成二核苷、核苷酸和低聚核苷酸，并包括天然存在的和非天然存在的核碱基(nucleobase)、糖和骨架(backbones)。
非天然存在的核苷和核苷酸可以用其它具有伯和仲醇基团的、与这些核糖类似的结构取代糖结构以进行改性。非天然存在的糖和核苷碱在结构上通常可与天然存在的糖(如核糖和脱氧核糖)和核苷碱(如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶)区别，其功能是可以互换的。因此，非天然存在的核碱基和糖包括所有模仿天然存在物种的结构和/或功能，并有助于低聚核苷酸与目标结合，或者对低聚核苷酸的性能有有益的贡献的结构。
对骨架的改性包括对磷酸酯骨架进行改性以提高其对核酸酶的抗性。这些改性包括应用如膦酸甲酯、硫代磷酸酯和二硫代磷酸酯键连，以及这些改性使核苷酸间键合，如非-磷键合、肽核酸(PNAs)和2’，5’-键合的性质发生引人注目的改变本发明所包含的杂环碱部分(在本领域中常常被简称为“碱”或“核碱基”)包括天然存在和非天然存在的核碱基两部分。杂环碱部分可进一步地被保护，其中一个或多个碱官能团带有保护基团。本文所用的“未改性的”或“天然的”核碱基包括嘌啉碱腺嘌呤和鸟嘌呤，以及嘧啶碱胸腺嘧啶，胞嘧啶和尿嘧啶。改性的核碱基包括其它合成的和天然的核碱基如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)，5-羟甲基胞嘧啶，黄嘌呤，次黄嘌呤，2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物，腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物，2-硫脲嘧啶，2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶，5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶，6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(pseudouracil)，4-硫代尿嘧啶，8-卤代、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羟基和其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤代，特别是5-溴代、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤，8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤，7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤，以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。其它核碱基包括下述文献中公开的核碱基USP No.3,687,808；Concise Enyclopedia of PolymerScience and Engineering，p858-859，Kroschwitz，J.I.编辑，John Wiley &Sons出版，1990；Englisch等人，Angewandte Chemie，InternationalEdition，1991，30，613和Sanghvi，Y.S.，第15章Antisense Research andApplications，p289-302，Crooke，S.T.和Lebleu，B.编辑，CRC Press，1993。
在本发明的一些实施方案中，本发明的方法应用于所谓的C-核苷(即是核碱基通过C-C键连接于核苷环的核苷，这与天然存在的C-N键相反)。另外，在本发明的一些实施方案中，核苷环是α-构型(与天然存在的β-构型不同)、L-构型(与天然存在的D-构型不同) 或两者(即α-L-构型)。
某些杂环碱部分对于提高本发明低聚化合物的键合亲和力以补充靶标特别有用。这些包括5-取代嘧啶，6-氮杂嘧啶以及N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。已经知道5-甲基胞嘧啶取代可提高核酸双链稳定性0.6-1.2℃(同上，p276-278)，是目前优选的碱替代物，特别是在与选择的2′-糖改性如2′-甲氧基乙基基团结合更是如此。
杂环碱部分(改性核碱基)的制备已有教导中有代表性的美国专利包括，但不限于U.S P3,687,808；4,845,205；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121，5,596,091；5,614,617；和5,681,941，其中一些是共同拥有的，所有这些都引入本文作为参考，1996年12月10日申请的美国专利申请08/762,587也引入本文作为参考。
本发明所用有代表性的一系列2′-取代基包括C1-C20烷基、C2-C20链烯基、C2-C20炔基、C5-C20芳基、O-烷基、O-链烯基、O-炔基、O-烷基氨基、O-烷基烷氧基、O-烷基氨基烷基、O-烷基咪唑、S-链烯基、S-炔基、NH-烷基、NH-链烯基、NH-炔基、N-二烷基、O-芳基、S-芳基、NH-芳基、O-芳烷基、S-芳烷基、NH-芳烷基、N-邻苯二甲酰亚胺基、卤素(特别是氟)、酮、羧基、硝基、亚硝基、腈、三氟甲基、三氟甲氧基、咪唑、叠氮基、肼基、羟氨基、异氰酰基、亚砜、砜、硫化物、二硫化物、甲硅烷基、杂环、碳环、聚胺、聚酰胺、聚乙二醇和式(O-烷基)m的聚醚，其中m是1-大约10。在这些聚醚中优选的是线性的或环状的聚乙二醇(PEGs)，和含有(PEG)的类型，如冠醚，以及下述文献所公开Ouchi等人，(Drug Design and Discovery，1992，9，93)，Ravasio等人(J Org.Chem.，1991，56，4329)和Delgardo等人(Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1992，9，249)，上述文献均全文引入本申请作为参考。另外，糖的改性公开在Cook，P.D.，Anti-Cancer Drug Design，1991，6，585-607。氟代、O-烷基、O-烷基氨基、O-烷基咪唑、O-烷氨基烷基和烷基氨基取代公开在美国专利申请序列号08/398,901，1995年3月6日申请，发明名称是OligomericCompounds having Pyrimidine Nucleotide(s)with 2′and 5′Substitutions，该文献也全文引入本申请作为参考。
本发明所用其它取代基团包括-SR和-NR2基团，其中R各自独立的是氢、保护基团或取代或未取代的烷基、链烯基或炔基。2′-SR核苷公开在USP5,670,633，申请日1997年9月27日，该文献也全文引入本申请作为参考。2′-SR单体合成子的引入公开在Hamm等人，J.Org.Chem.，1997，62，3415-3420。2′-NR2核苷公开在Goettingen，M.，J.Org.Chem.，1996，61，73-6281；和Polushin等人，Tetrahedron Lett.，1996，37，3227-3230。
其它取代基团为式XXI或XXII之一
其中Z0是O、S或NH；J是单键、O或C(＝O)；E是C1-C10烷基、N(R1)(R2)、N(R1)(R5)、N＝C(R1)(R2)、N＝C(R1)(R5)或是下述式XXIII或XXIV之一
每个R6、R7、R8、R9和R10各自独立的是氢、C(O)R11、取代或未取代的C1-C10烷基、取代或未取代的C2-C10链烯基、取代或未取代的C2-C10炔基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、化学官能基团或共轭基团，其中取代基团选自羟基、氨基、烷氧基、羧基、苄基、苯基、硝基、巯基、硫代烷氧基、卤素、烷基、芳基、链烯基和炔基；或R7和R8与它们相连的氮原子一起选择性的形成邻苯二甲酰亚胺部分；或R9和R10与它们相连的氮原子一起选择性地形成邻苯二甲酰亚胺部分；每个R11个R12各自独立的是取代或未取代的C1-C10烷基、三氟甲基、氰基乙氧基、甲氧基、乙氧基、叔丁氧基、烯丙氧基、9-芴基甲氧基、2-(三甲基甲硅烷基)-乙氧基、2，2，2-三氯乙氧基、苯甲酰氧基、丁酰基、异丁酰基、苯基或芳基；
R5是T-L；T是键或是连接部分；L是化学官能基团、共轭基团或固体载体物质；每个R1和R2各自独立的是H、氮保护基团、取代或未取代的C1-C10烷基、取代或未取代的C2-C10链烯基、取代或未取代的C2-C10炔基，其中所说的取代基是OR3、SR3，、NH3+、N(R3)(R4)、胍基或酰基，其中所说的酰基是酸的酰胺或酯；或者R1和R2，一起是氮保护基团，或结合成环状结构，所述的环状结构选择性的含有其它选自N和O的杂原子；或R1、T和L一起是化学官能基团；每个R3和R4各自独立的是H、C1-C10烷基、氮保护基团，或R3和R4一起是氮保护基团；或R3和R4一起结合成环状结构，所述的环状结构选择性的含有其它选自N和O的杂原子；Z4是OX、SX或N(X)2；每个X各自独立的是H、C1-C8烷基、C1-C8卤代烷基、C(＝NH)N(H)R5、C(＝O)N(H)R5或OC(＝O)N(H)R5；R5是H或C1-C8烷基；Z1、Z2和Z3包括含有大约4-大约7个碳原子或含有大约3-大约6个碳原子和1或2个杂原子的环系，其中所说的杂原子选自氧、氮或硫，和所说的环系是脂族、不饱和脂族、芳族、或是饱和或不饱和的杂环；Z5是具有1至大约10个碳原子的烷基或卤代烷基、具有2至大约10个碳原子的链烯基、具有2至大约10个碳原子的炔基、具有6至大约14个碳原子的芳基、N(R1)(R2)OR1、卤素、SR1或CN；每个q1各自独立的是1-10整数；每个q2各自独立的是0或1；q3是0或1-10的整数；q4是1-10的整数；q5是0，1或2；和条件是当q3是0时，q4大于1。
式I有代表性的取代基团公开在美国专利申请序列号No.09/130,973，1998年8月7日申请，发明名称″Capped 2′-OxyethoxyOligonucleotides″，该文献全文引入本申请作为参考。
式II有代表性的取代基团公开在美国专利申请序列号No.09/123,108，1998年7月27日申请，发明名称″RNA Targeted 2’-Modified Oligonucleotides that are Conformationaliy Preorganized″，该文献全文引入本申请作为参考。
特别优选的取代基团包括O[(CH2)nO]mCH3，O(CH2)nOCH3，O(CH2)nNH2，O(CH2)nCH3，O(CH2)nONH2，O(CH2)nON[(CH2)nCH3]]2(其中n和m是1至大约10)，C1-C10低级烷基，取代的低级烷基，烷芳基，芳烷基，O-烷芳基或O-芳烷基，SH，SCH3，OCN，Cl，Br，CN，CF3，OCF3，SOCH3，SO2CH3，ONO2，NO2，N3，NH2，杂环烷基，杂环烷芳基，氨基烷基氨基，多烷基氨基和取代的甲硅烷基。其它特别优选的改性包括2′-甲氧基乙氧基(2′-O-CH2CH2OCH3或2′-MOE，Martin等人，Helv.Chim.Acta，1995，78，486)。更优选的取代基团是2′-二甲氨基氧基乙氧基，即O(CH2)2ON(CH3)2基团，也称作2′-DMAOE。有代表性的氨基氧基取代基公开在共同申请的美国专利申请序列号09/344,260，1999年6月25日申请，发明名称是″Aminooxy-Functionalized Oligomers”；和美国专利申请序列号09/370,541，1999年8月9日申请，代理序列编号ISIS-3993，发明名称“Aminooxy-Functionalized Oligomers andMethods for Making Same”；该文献全文引入本申请作为参考。
其它优选的改性包括2′-甲氧基(2′-O-CH3)，2′-氨基丙氧基(2′-OCH2CH2CH2NH2)和2′-氟(2′-F)。在核苷和低聚体的其它位置上也可以进行类似的改性，特别是在3′-末端核苷糖的3′-位，或在具有由2’-位键连的核苷如2’，5’-键连的低聚体的3′-位，和在5′-末端的5′-位。低聚体也具有糖的模拟形式如以环丁基部分代替呋喃戊糖基的糖。公开了这些改性糖结构制备的有代表性的美国专利包括，但不限于U.S.P4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,0531 5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；和5,700,920，其中一些是共同拥有的，每篇文献都全文引入本申请作为参考。共同拥有的美国专利5,859,221也全文引入本申请作为参考。
式III和IV表示的有代表性的胍基取代基基团公开在共同拥有的美国专利申请序列号09/349,040，1999年7月9日申请，发明名称是″Functionalized Oligomers”，该文献全文引入本申请作为参考。
有代表性的乙酰氨基取代基公开在美国专利申请序列号09/378,568，发明名称是″2′-O-Acetamido Modified Monomers andOligomers″，1999年8月19日申请，代理序列编号1515-4071，该文献全文引入本申请作为参考。
有代表性的二甲氨基乙氧基乙基取代基公开在国际专利申请PCT/US599/17895，发明名称″2’-O-Dimethylaminoethyioxy ethyl-Modified oligonucleotides″，1999年8月6日申请，代理序列编号ISIS-4045，该文献全文引入本申请作为参考。
在合成过程中，本发明的方法用不稳定的保护基团保护各种官能基团部分。在常规的低聚核苷酸合成方法经常使用保护基团以保护几种不同类型的官能团。通常，保护基团使化学官能团对特定的反应条件呈惰性，并可以在分子的这些官能团上添加和除去，基本上不会破坏分子的其余部分，例如参见Green和Wuts，Protective Groups inOrganic Synthesis，第二版，John Wiley & Sons，New York，1991。合成中用于保护核苷酸的有代表性的保护基团包括碱不稳定保护基团和酸不稳定保护基团。碱不稳定保护基团在合成期间用于保护杂环核碱基的外向环氨基。此类保护通常可通过酰化实现。为达到此目的常用的两种酰化基团是苯甲酰氯和异丁酰氯。这些保护基团在低聚核苷酸合成的反应条件下是稳定的，合成结束后用碱处理几乎可以等比率将其除去。
常用于低聚核苷酸合成的羟基保护基团可以用下式基团表示-C(R1)(R2)(R3)，其中每个R1，R2和R3是未取代的或单取代的和选自苯基、萘基、蒽基的芳基或杂芳基，具有一个选自N、O和S的杂原子、或二个氮杂原子的五或六元杂环，包括喹啉基、呋喃基和噻吩基；所述的取代基选自卤素(即F，Cl，Br，和I)，硝基，C1-C4-烷基或烷氧基，和最多有10个碳原子的芳基，芳烷基或环烷基；以及其中的R2和R3各自可以是C1-C4-烷基或最多有10个碳原子的芳烷基或环烷基。
本发明中，引入乙酰丙酰基的酰化剂是能够与活性基团如羟基反应产生酰化基团，且其中的酰基部分是如上所述乙酰丙酰基基团的酰化剂。这些酰化剂包括乙酰丙酸，以及乙酰丙酸的活化形式，包括其酸酐、酯、肟和卤代酸衍生物。对引入乙酰丙酰基基团而言，乙酰丙酸是优选的酰化剂。
本发明需要使用水解酶如脂酶，以影响核苷或改性核苷的脱保护或酰化。几类水解酶是自然界存在的。其中有两种水解酶脂酶和蛋白酶已经广泛用于非天然介质。由化学的观点看，可知脂酶和蛋白酶在有机溶剂中是温和的和选择性的试剂，它能够活化样品中通常的羧酸根，并且将其转移至大量的亲核体。在本发明的酰化反应(在核苷上引入乙酰丙酰基)或脱保护(即由保护的核苷上除去乙酰丙酰基)时需要这些水解酶。术语水解酶包括脂酶、蛋白酶，和能使核苷区域选择性的直接酰化或能使酰化的核苷脱保护的类似水解酶。
可以理解的是，通过考察了下面的实施例，对本领域技术人员来说，本发明的目的、优点和新颖的特征会更加清晰，但这些实施例并不限制本发明。
实施例试剂南美洲假丝酵母脂酶B(CAL-B)来自Novo Nordisk Co.，南美洲假丝酵母脂酶A(CAL-A)和固定的葱头假单胞菌脂酶(PSL-C)各自购自Roche Diagnostics S.L.和Amano Pharmaceuticals。PS-碳二亚胺购自Argonaut Technologies(San Carlos，CA，EE.UU.)。其它所有试剂购自Aldrich或Fluka。试剂用适当的干燥剂在氮气下蒸馏。
3’，5′-二-O-乙酰丙酰基-2′-脱氧核苷(2)方法A在氮气下，向1，4-二噁烷(20mL)中的1(2mmol)和Et3N(1.7mL，12mmol)的混合物加入乙酰丙酸(1.21g，10.4mmol)、DCC(2.14g，10.4mmol)和DMAP(20mg，0.16mmol)。于室温搅拌反应3小时。为了使三保护胞苷衍生物生成的最少，将6mmol的LevOH和DCC，和5mmol的Et3N用于1b。过滤收集不溶物，真空蒸发滤液。将残余物溶于NaHCO3(水溶液)，并用CH2Cl2萃取，合并的有机萃取液用Na2SO4干燥和蒸发。加入冷的Et2O，在浆液中划痕直到开始结晶。过滤出固体，用冷的Et2O洗涤，然后倾入EtOAc(在2f的情况下是MeOH)。过滤出不溶物，浓缩滤液得到目的化合物。得到的产物足够纯，可以直接进行酶水解步骤。用快速色谱(EtOAc)进一步纯化得到纯的3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷2a-g。
方法B在氮气下，向1，4-二噁烷(5mL)中的1(0.4mmol)和Et3N(0.15mL，1mmol)的混合物加入乙酰丙酸(0.14g，1.2mmol)、PS-碳二亚胺(1.05g，1.2mmol)、DMAP(4mg，0.032mmol)和DMAP·HCl(3mg，0.02mmol)。于室温搅拌反应3小时。过滤收集不溶物，真空蒸发滤液。将残余物溶于NaHCO3(水溶液)，并用CH2Cl2萃取，合并的有机萃取液用Na2SO4干燥和蒸发。固体用冷的Et2O洗涤，得到3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷2a和2d。
3′，5′-二-O-乙酰丙酰基胸苷(2a).Rf(10％MeOH/CH2Cl2)0.45；Mp87-89℃；IR(KBr)υ 3315，3074，3006，2967，2947，1743，1689，和1660cm-1；1H-NMR(CDCl3，300MHz)d 1.88(s，3H，Me)，2.14(s，3H，Me-Lev)，2.15(s，3H，Me-Lev)，2.18(m，1H，H2′)，2.41(m，1H，H2′)，2.54(m，4H，2CH2-Lev)，2.73(m，4H，2CH2-Lev)，4.19(m，1H，H4′)，4.31(m，2H，H5′)，5.18(m，1H，H3)，6.28(dd，1H，H1′，3JHH8.5，3JHH5.4Hz)，7.32(s，1H，H6)，和9.99(s，1H，NH)；13C-NMR(CDCl3，75.5MHz)d 12.3(Me)，27.48(CH2-Lev)，27.54(CH2-Lev)，29.4(2Me-Lev)，36.8(C2′)，37.5(2CH2-Lev)，63.7(C5′)，74.2，81.8，84.3(C1′+C3′+C4′)，111.2(C5)，134.6(C6)，150.3(C2)，163.8(C4)，171.97(C＝O Lev)，172.02 (C＝OLev)，和206.3(2C＝O Lev)；MS(ESI+，m/z)439[(M+H)+，100％]，和461[(M+Na)+，50].3′，5′-二-O-乙酰丙酰基-2′-脱氧胞苷(2b)Rf(20％MeOH/CH2Cl2)0.67；IR(KBr)υ 3390，2940，1737，1715，和1649cm-1；1H-NMR(MeOH-d4，200MHz)d 2.39(s，3H，Me-Lev)，2.40(s，3H，Me-Lev)，2.43(m，1H，H2′)，2.75(m，1H，H2′)，2.79(m，4H，2CH2-Lev)，3.02(m，4H，2CH2-Lev)，4.51(m，3H，H4′+2H5′)，5.46(m，1H，H3′)，6.17(d，1H，H5，3JHH7.6Hz)，6.45(dd，1H，H1′，3JHH8.6，3JHH5.7Hz)，和7.98(dd，1H，H6，3JHH7.3Hz)；13C-NMR(MeOH-d4，75.5MHz)d 29.1(CH2-Lev)，29.2(CH2-Lev)，29.9(Me-Lev)，38.9(2CH2-Lev)，39.2(C2′)，65.5(C5′)，76.5，84.1，87.9(C1′+C3′+C4′)，96.8(C5)，142.2(C6)，158.4(C2)，168.0(C4)，174.2(C＝O)，174.4(C＝O)，和209.7(C＝O)；MS(ESI+，m/z)446[(M+Na)+，70％]和462[(M+K)+，100]。
N-苯甲酰基-3′，5′-二-Q-乙酰丙酰基-2′-脱氧胞苷(2c)Rf(10％MeOH/CH2Cl2)0.61；Mp107-109℃；IR(KBr)υ 3233，1744，1731，和1668cm-1；1H-NMR(MeOH-d4，200MHz)d 2.31(s，3H，Me-Lev)，2.38(s，3H，Me-Lev)，2.50(m，1H，H2′)，2.75(m，4H，2CH2-Lev)，2.95(m，1H，H2′)，3.05(m，4H，2CH2-Lev)，4.59(m，3H，H4′+2H5′)，5.49(m，1H，H3′)，6.42(dd，1H，H1′，3JHH7.7，3JHH5.7Hz)，7.75(m，4H，H5+Hm+Hp)，8.15(m，2H，Ho)，和8.45(d，1H，H6，3JHH7.6Hz)；13C-NMR(MeOH-d4，75.5MHz)d 29.1(CH2-Lev)，29.2(CH2-Lev)，29.9(Me-Lev)，38.91(CH2-Lev)，38.94(CH2-Lev)，39.8(C2′)，65.3(C5′)，76.5，85.0，89.3(C1′+C3′+C4′)，99.0(C5)，129.5，130.1(Co+Cm)，134.4(Cp)，135.0(Ci)，146.2(C6)，158.0(C2)，165.1(C4)，169.2(PhC＝O)，174.3(C＝O)，174.4(C＝O)，209.67(C＝O)，和209.72(C＝O)；MS(ESI+，m/z)528[(M+H)+，100％]，550[(M+Na)+，30]，和566[(M+K)+，40].
3′，5′-二-O-乙酰丙酰基-2′-脱氧腺苷(2d)Rf(10％MeOH/CH2Cl2)0.44；IR(KBr)υ 3418，3165，2923，1738，1715，和1644cm-1；1H-NMR(MeOH-d4，200MHz)d2.33(s，3H，Me-Lev)，2.39(s，3H，Me-Lev)，2.79(m，5H，2CH2-Lev+1H2′)，3.00(m，4H，2CH2-Lev)，3.25(m，1H，H2′)，4.52(m，3H，H4′+2H5′)，5.65(m，1H，H3′)，6.61(dd，1H，H1′，3JHH6.0，3JHH7.9Hz)，8.41(s，1H，H2or H8)，和8.50(s，1H，H8or H2)；13C-NMR(MeOH-d4，75.5MHz)d 29.1(CH2-Lev)，29.2(CH2-Lev)，29.9(2Me-Lev)，38.1(C2′)，38.9(2CH2-Lev)，65.2(C5′)，76.5，84.2，86.2(C1′+C3′+C4′)，120.8(C5)，141.2(C8)，150.7(C4)，154.2(C2)，157.6(C6)，174.2(C＝O)，174.4(C＝O)，209.68(C＝O)，和209.73(C＝O)；MS(ESI+，m/z)448[(M+H)+，20％]，470[(M+Na)+，80]，和486[(M+K)+，100].
N-苯甲酰基-3′，5′-二-O-乙酰丙酰基-2′-脱氧腺苷(2e)Rf(10％MeOH/CH2Cl2)0.71；Mp69-71℃；IR(KBr)υ 3412，3086，2958，1738，1714，和1685cm-1；1H-NMR(MeOH-d4，300MHz)d 2.28(s，3H，Me-Lev)，2.35(s，3H，Me-Lev)，2.75(m，4H，2CH2-Lev)，2.87(m，1H，H2′)，2.99(m，4H，2CH2-Lev)，3.30(m，1H，H2′)，4.52(m，3H，H4′+2H5′)，5.65(m，1H，H3′)，6.70(表观 t，1H，H1′，3JHH6.8Hz)，7.75(m，3H，2Hm+Hp)，8.25(表观d，2H，2Ho，3JHH7.4Hz)，8.75(s，1H，H2or H8)，和8.88(s，1H，H8or H2)；13C-NMR(MeOH-d4，75.5MHz)d 29.0(CH2-Lev)，29.2(CH2-Lev)，30.0(Me-Lev)，37.9(C2′)，38.87(CH2-Lev)，38.91(CH2-Lev)，65.2(C5′)，76.4，84.3，86.5(C1′+C3+C4′)，125.5(C5)，129.7，130.0(Co+Cm)，134.1(Cp)，135.1(Ci)，144.5(C8)，151.3(C4)，153.3(C6)，153.5(C2)，168.1(PhC＝O)，174.2(C＝O)，174.3(C＝O)，209.6(C＝O)，和209.7(C＝O)；MS(ESI+，m/z)552[(M+H)+，100％]和574[(M+Na)+，17].
3′，5′-二-O-乙酰丙酰基-2′-脱氧鸟苷(2f)Rf(20％MeOH/CH2Cl2)0.65；Mp148-150℃；IR(KBr)υ 3397，3153，2940，和1711cm-1；1H-NMR(DMSO-d6，200MHz)d 2.16(s，3H，Me-Lev)，2.22(s，3H，Me-Lev)，2.60(m，5H，2CH2-Lev+1H2′)，2.83(m，4H，2CH2-Lev)，3.00(m，1H，H2′)，4.29(m，3H，H4′+2H5′)，5.35(m，1H，H3′)，6.22(dd，1H，H1′，3JHH5.8，3JHH8.8Hz)，6.69(br s，2H，NH)，和8.00(s，1H，Hs)；13C-NMR(DMSO-d6，50.3MHz)d 27.5(CH2-Lev)，27.7(CH2-Lev)，29.55(Me-Lev)，29.60(Me-Lev)，35.5，37.4，37.50(2CH2-Lev+C2′)，63.8(C5′)，74.7，81.5，82.6(C1′+C3′+C4′)，116.8(C5)，135.1(C8)，151.2(C4)，154.0(C2)，156.9(C6)，172.1(C＝O)，172.2(C＝O)，206.9(C＝O)，和207.1(C＝O)；MS(ESI+，m/z)464[(M+H)+，22％]，486[(M+Na)+，75]，and 502[(M+K)+，100].N-异丁酰基-3′，5′-二-O-乙酰丙酰基-2′-脱氧鸟苷(2g)Rf(20％MeOH/CH2Cl2)0.85；Mp45-47℃；IR(KBr)υ 3413，2935，1740，1714，1680，and 1613cm-1；1H-NMR(DMSO-d6，200MHz)d 1.23(d，6H，Me-iBu，3JHH6.5Hz)，2.15(s，3H，Me-Lev)，2.20(s，3H，Me-Lev)，2.55-3.19(几个m，11H，4CH2-Lev+2H2′+CH-iBu)，4.32(m，3H，H4′+2H5′)，5.35(m，1H，H3′)，6.35(表观 t，1H，H1′，3JHH7.2Hz)，8.35(s，1H，H8)，11.80(br s，1H，NH)，and 12.20(br s，1H，NH)；13C-NMR(DMSO-d6，50.3MHz)d 18.86(Me-iBu)，18.91(Me-iBu)，27.5(CH2-Lev)，27.6(CH2-Lev)，29.5(Me-Lev)，29.6(Me-Lev)，34.8(CH-iBu)，35.5(C2′)，37.38(CH2-Lev)，37.45(CH2-Lev)，63.7(C5′)，74.6，81.7，82.9(C1′+C3′+C4′)，120.3(C5)，137.3(C8)，148.3，148.7(C2+C4)，154.8(C6)，172.1(C＝O)，172.2(C＝O)，180.2(iBu-C＝O)，206.9(C＝O)，和207.1(C＝O)；MS(ESI+，m/z)534[(M+H)+，100％]，556[(M+Na)+，60]，和572[(M+K)+，27].
3′，5′-二-O-乙酰丙酰基-2′-脱氧核苷酶水解的一般方法。在2(0.2mmol)的1，4-二噁烷(0.35mL)溶液中加入0.15M磷酸盐缓冲溶液pH7(1.65mL)和相应的脂酶[对CAL-A或CAL-B，2∶酶＝1∶1(w/w)，对PSL-C为1∶3(w/w)]。使混合物在250rpm按照表1指出的温度和时间进行反应。反应由TLC(10％MeOH/CH2Cl2)控制。过滤出酶，用CH2Cl2洗涤，真空蒸发溶剂，残余物溶于NaHCO3(水溶液)，并用CH2Cl2萃取，合并的有机层用Na2SO4干燥，蒸发后得到单酰基核苷3或4。在3b的情况下，残余物用快速色谱而不是萃取进行纯化。
3′-O-乙酰丙酰基胸苷(3a)Rf(10％MeOH/CH2Cl2)0.32；Mp50-52℃；IR(KBr)υ 3449，3065，2927，和1706cm-1；1H-NMR(MeOH-d4，200MHz)d 2.09(d，3H，Me，JHH1.3Hz)，2.39(s，3H，Me-Lev′)，2.57(m，2H，H2′)，2.80(t，2H，CH2-Lev，3JHH6.0Hz)，3.05(t，2H，CH2-Lev，3JHH6.2Hz)，4.01(m，2H，H5′)，4.29(m，1H，H4′)，5.02(m，1H，H3′)，6.50(dd，1H，H1′，3JHH8.1，3JHH6.5Hz)，和8.04(d，1H，H6，JHH1.3Hz)；13C-NMR(CDCl3，75.5MHz)d 12.4(Me)，27.8(CH2-Lev)，29.6(Me-Lev)，37.1(C2′)，37.7(CH2-Lev)，62.2(C5′)，74.9，85.0，85.7(C1′+C3′+C4′)，111.1(C5)，136.5(C6)，150.6(C2)，164.3(C4)，172.4(2C＝O Lev)，和206.8(2C＝O Lev)；MS(ESI+，m/z)363[(M+Na)+，100％]和379[(M+K)+，30].
3′-O-乙酰丙酰基-2′-胞苷(3b)Rf(20％MeOH/CH2Cl2)0.41；1H-NMR(MeOH-d4，200MHz)d 2.39(s，3H，Me-Lev)，2.47(m，1H，H2′)，2.67(m，1H，H2′)，2.75(m，2H，CH2-Lev)，3.02(m，2H，CH2-Lev)，4.00(m，2H，2H5′)，4.30(m，1H，H4′)，5.49(m，1H，H3′)，6.15(d，1H，H5，3JHH6.8Hz)，6.48(表观 t，1H，H1′，3JHH6.8Hz)，and 8.32(d，1H，H6，3JHH7.3Hz)；13C-NMR(MeOH-d4，75.5MHz)d 29.2(CH2-Lev)，29.9(Me-Lev)，38.9，39.5(C2′+CH2-Lev)，63.2(C5′)，76.9，87.1，87.8(C1′+C3′+C4′)，96.6(C5)，143.0(C6)，158.2(C2)，167.6(C4)，174.2(C＝O)，and 209.8(C＝O).
3′-O-乙酰丙酰基-2′-脱氧腺苷(3d)Rf(20％MeOH/CH2Cl2)0.66；IR(KBr)υ3292，2925，1730，1715，1690，1644，和1610cm-1；1H-NMR(MeOH-d4，200MHz)d 2.40(s，3H，Me-Lev)，2.76(m，1H，H2′)，2.80(t，2H，CH2-Lev，3JHH6.2Hz)，3.05(t，2H，CH2-Lev，3JHH6.2Hz)，3.14(m，1H，H2′)，4.04(m，2H，2H5′)，4.40(m，1H，H4′)，5.66(d，1H，H3′，3JHH6.0Hz)，6.61(dd，1H，H1′，3JHH5.7，3JHH9.1Hz)，8.39(s，1H，H2or H8)，和8.50(s，1H，H8orH2)；13C-NMR(MeOH-d4，75.5MHz)d 29.1(CH2-Lev)，29.9(Me-Lev)，38.9，39.0(C2′+CH2-Lev)，64.0(C5′)，77.5，87.6，87.9(C1′+C3′+C4′)，121.2(C5)，141.9(C8)，150.1(C4)，153.8(C2)，157.8(C6)，174.3(C＝O)，和209.8(C＝O)；MS(ESI+，m/z)350[(M+H)+，100％]，372[(M+Na)+，100]，和388[(M+K)+，60].
N-异丁酰基-3′-O-乙酰丙酰基-2′-脱氧鸟苷(3g)Rf(20％MeOH/CH2Cl2)0.75；Mp170-172℃；IR(KBr)υ 3415，2961，2929，2859，1725，1686，和1614cm-1；1H-NMR(MeOH-d4，200MHz)d 1.41(d，6H，Me-iBu，3JHH6.8Hz)，2.38(s，3H，Me-Lev)，2.70-3.09(m，7H，2CH2-Lev+2H2+CH-iBu)，3.98(d，2H，2H5′，3JHH3.4Hz)，4.45(m，1H，H4′)，5.60(m，1H，H3′)，6.51(dd，1H，H1′，3JHH5.9，3JHH8.4Hz)，和8.45(s，1H，H8)；13C-NMR(MeOH-d4，50.3MHz)d 19.6(Me-iBu)，29.2(CH2-Lev)，30.0(Me-Lev)，37.2(CH-iBu)，38.9，39.3(C2′+CH2-Lev)，63.3(C5′)，76.8，85.8，87.3(C1′+C3′+C4′)，121.5(C5)，139.7(C8)，150.0，150.5(C2+C4)，157.6(C6)，174.2(C＝O)，182.0(iBu-C＝O)，和209.7(C＝O)；MS(ESI+，m/z)436[(M+H)+，15％]和458[(M+Na)+，50].
5′-O-乙酰丙酰基胸苷(4a)Rf(10％MeOH/CH2Cl2)0.22；Mp141-143℃；IR(KBr)υ 3393，3215，2934，1737，1724，1643，和1629cm-1；1H-NMR(DMSO-d6，200MHz)d 1.91(s，3H，Me)，2.27(s，3H，Me-Lev′)，2.30(m，2H，H2′)，2.66(m，2H，CH2-Lev)，2.89(t，2H，CH2-Lev，3JHH6.2Hz)，4.07(m，1H，H4′)，4.35(m，3H，H3′+2H5′)，5.55(d，1H，OH)，6.32(t，1H，H1′，3JHH7.0Hz)，7.6(s，1H，H6′)，和11.45(s，1H，NH)；13C-NMR(DMSO-d6，50.3MHz)d 12.02(Me)，27.4(CH2-Lev)，29.4(Me-Lev)，37.2(C2′)，38.4(CH2-Lev)，63.8(C5′)，70.1(C3′)，83.5，83.6(C1′+C4′)，109.7(C5)，135.7(C6)，150.3(C4)，163.6(C2)，172.1(C＝O Lev)，和206.7(C＝O Lev)；MS(ESI+，m/z)341[(M+H)+，40％]，379[(M+Na)+，100]，and 379[(M+K)+，80].
N-苯甲酰基-5′-O-乙酰丙酰基-2′-胞苷(4c)Rf(10％MeOH/CH2Cl2)0.37；Mp50-52℃.IR(KBr)υ 3410，2919，1738，1701，和1650cm-1；1H-NMR(CDCl3，300MHz)d 2.20(s，3H，Me-Lev)，2.25(m，1H，H2′)，2.58(m，2H，CH2-Lev)，2.75(m，1H，H2′)，2.82(m，2H，CH2-Lev)，3.35(s，1H，OH)，4.25(m，1H，H3′)，4.40(m，3H，2H5′+H4′)，6.30(表观 t，1H，H1′，3JHH6.2Hz)，7.55(m，4H，H5+2Hm+Hp)，7.90(表观 d，2H，Ho，3JHH7.1Hz)，8.20(d，1H，H6，3JHH7.4Hz)，和8.78(s，1H，NH)；13C-NMR(CDCl3，50.3MHz)d 27.7(CH2-Lev)，29.6(Me-Lev)，37.7(CH2-Lev)，41.3(C2′)，63.7(C5′)，70.6，84.8，87.4(C1′+C3′+C4′)，96.8(C5)，127.6，128.7(Co+Cm)，132.8(Ci)，133.0(Cp)，144.2(C6)，155.1(C2)，162.4(C4)，166.7(PhC＝O)，172.6(C＝O)，和206.8(C＝O)；MS(ESI+，m/z)430[(M+H)+，20％]，452[(M+Na)+，65]，和468[(M+K)+，40].
N-苯甲酰基-5′-O-乙酰丙酰基-2′-脱氧腺苷(4e)Rf(10％MeOH/CH2Cl2)0.50；Mp69-71℃；IR(KBr)υ 3413，2959，2928，1726，1637，和1616cm-1；1H-NMR(MeOH-d4，300MHz)d 2.30(s，3H，Me-Lev)，2.70(m，3H，CH2-Lev+1H2′)，2.92(m，2H，CH2-Lev)，3.15(m，1H，H2′)，4.40(m，1H，H4′)，4.52(m，2H，2H5′)，4.85(m，1H，H3′)，6.75(表观 t，1H，H1′，3JHH6.2Hz)，7.80(m，3H，2Hm+Hp)，8.30(m，2H，2Ho)，8.78(s，1H，H2or H8)，和8.92(s，1H，H8or H2)，13C-NMR(MeOH-d4，75.5MHz)d 29.0(CH2-Lev)，29.9(Me-Lev)，38.9，40.8(CH2-Lev+C2′)，65.3(C5′)，72.6，86.51，86.54(C1′+C3′+C4′)，125.7(C5)，129.7，130.0(Co+Cm)，134.2(Cp)，135.2(Ci)，144.6(C8)，151.4(C4)，153.3(C5)，153.5(C2)，168.4(PhC＝O)，174.5(C＝O)，和209.7(C＝O)；MS(ESI+，m/z)476[(M+Na)+，100％]和492[(M+K)+，53].
N-异丁酰基-3′-O-乙酰丙酰基-2′-脱氧鸟苷(4g)Rf(20％MeOH/CH2Cl2)0.60；Mp45-47℃；IR(KBr)υ3415，2930，1720，和1685 cm-1；1H-NMR(MeOH-d4，200MHz)d 1.41(d，6H，Me-iBu，3JHH6.8Hz)，2.33(s，3H，Me-Lev)，2.59-3.07(m，7H，2CH2-Lev+2H2′+CH-iBu)，4.32(m，1H，H4′)，4.50(m，2H，H5′)，4.75(m，1H，H3′)，6.50(表观t，1H，H1′，3JHH6.4Hz)，和8.32(s，1H，H8)；13C-NMR(MeOH-d4，75.5MHz)d 19.7(Me-iBu)，29.0(CH2-Lev)，29.9(Me-Lev)，37.2(CH-iBu)，38.9，41.1(C2′+CH2-Lev)，65.3(C5′)，72.6，86.1，86.5(C1′+C3′+C4′)，121.8(C5)，139.8(C8)，150.0，150.5(C2+C4)，157.8(C6)，174.5(C＝O)，182.0(iBu-C＝O)，和209.7(C＝O)；MS(ESI+，m/z)436[(M+H)+，20％]，458[(M+Na)+，100]，和474[(M+K)+，50].
带有乙酰丙酰基保护基团的胸苷四聚物在3′-O和5′-O端基的各个位置上进行酶水解的一般方法。
在二保护四聚物的1，4-二噁烷溶液中加入0.15M磷酸盐缓冲溶液pH＝7和相应的脂酶[对CAL-A或CAL-B，四聚物∶酶＝1∶1(w/w)，对PSL-C为1∶3(w/w)]。混合物在40℃于250rpm反应62h。反应用TLC(10％MeOH/CH2Cl2)控制。过滤出酶，用CH2Cl2洗涤，真空蒸发溶剂，残余物溶于NaHCO3(水溶液)，并用CH2Cl2萃取，合并的有机层用Na2SO4干燥，蒸发后得到单酰基聚核苷酸。
2′-脱氧核苷区域选择性酶酰化的一般方法。2′-脱氧核苷酶酰化的一般方法见图5。在氮气中，使1(0.2mmol)、肟酯(0.6mmol)和脂酶在无水THF(1mL)中的悬浮液在250rpm按照表3指出的温度和时间进行反应。反应由TLC(10％MeOH/CH2Cl2)控制。过滤出酶，用CH2Cl2洗涤，真空蒸发溶剂，残余物溶于NaHCO3(水溶液)，并用CH2Cl2萃取，合并的有机层用Na2SO4干燥和蒸发。残余物在乙醚中沉淀，过滤后得到单乙酰丙酰基核苷3或4。除了在10和11项的情况下，不需要进一步纯化分离出其它痕量的酰基衍生物。
2′-改性核糖核酸区域选择性酶酰化的一般方法。2′-改性核糖核酸酶酰化的一般方法见图7。使2′-改性核糖核酸5与肟乙酰丙酰基酯在THF中和在脂酶(CAL-B或PSL-C)存在下反应。反应产物8(CAL-B)在5’-位酰化，反应产物9(PSL-C)在3’-位酰化。
由前述可以看出，本发明提供了由核苷和/或3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷前体选择性制备3′-O-乙酰丙酰基核苷和5′-O-乙酰丙酰基核苷的温和的方法。本发明适合用于大规模生产保护的核苷。用本发明方法制备的化合物可用于制备低聚核苷酸的各种方法。
上文已经参照一些实施方案对本发明作了说明，本文所公开的方法是常规方法，可用于各种基质，特别是其中具有羟基的基质。因此，本领域技术人员可以理解的是这里所描述的一般方法的其它实施方案也在本发明的范围之内。没有任何特定的实施方案会限制本发明的范围。
本文所引用的所有文献都以全文引入本发明作为参考。
权利要求
1.使3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷选择性脱保护的方法，该方法包括a.选择对所述核苷的乙酰丙酰基位置能直接有效的区域选择性水解的水解酶；和b.使3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷与所述的水解酶在有效地生成相应的3′-O-乙酰丙酰基和5′-O-乙酰丙酰基核苷的条件下接触一定时间
2.权利要求1的方法，其中所述的水解酶是脂酶。
3.权利要求2的方法，其中所述的脂酶是CAL-A、CAL-B、PSL-C、猪胰脂肪酶(porcine pancreatic lipase)，粘稠色杆菌(Chromobactenaum viscosum)脂酶、米赫毛霉(Mucor miehei)脂酶，Humicola lanuginosa脂酶，沙门氏柏干酪青霉(Penicilliumcamemberti)脂酶或皱落念珠菌(Candida rugosa)脂酶。
4.权利要求3的方法，其中所述的脂酶是CAL-A。
5.权利要求3的方法，其中所述的脂酶是CAL-B。
6.权利要求3的方法，其中所述的脂酶是PSL-C。
7.使3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷在5’-O-乙酰丙酰基位置选择性脱保护的方法，该方法包括选择对所述3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷的5’-乙酰丙酰基位置能直接有效的区域选择性水解的水解酶，和使所述的3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷与所述的水解酶在有效地生成3′-O-乙酰丙酰基核苷时间和的条件下接触。
8.权利要求7的方法，其中所述的水解酶是脂酶。
9.权利要求8的方法，其中所述的脂酶是CAL-B。
10.使3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷在3’-O-乙酰丙酰基位置选择性脱保护的方法，该方法包括选择对所述3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷的3’-乙酰丙酰基位置能直接有效的区域选择性水解的水解酶，和使所述3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷与所述的水解酶在有效地生成相应的5′-O-乙酰丙酰基核苷的时间和条件下接触。
11.权利要求10的方法，其中所述的水解酶是脂酶。
12.权利要求11的方法，其中所述的脂酶是CAL-A。
13.权利要求11的方法，其中所述的脂酶是PSL-C。
14.使3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷在5’-O-乙酰丙酰基位置选择性脱保护的方法，该方法包括选择对所述3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷的5’-乙酰丙酰基位置能直接有效的区域选择性水解的水解酶，和使所述3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷与所述的水解酶在有效地生成3′-O-乙酰丙酰基核苷的时间和条件下接触，其中所述的3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷为下式之一 其中R1是-H，-羟基，保护的羟基，或2′-取代基；和R2和R3各自独立地是-H或氨基保护基团；G是N或CH；和Lev是-C(O)-(CH2)2-C(O)-CH3。
15.权利要求14的方法，其中所述的水解酶是脂酶。
16.权利要求15的方法，其中所述的脂酶是CAL-B。
17.权利要求14的方法，其中所述的3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷是腺苷、胞嘧啶、胸苷或N-异丁基鸟苷。
18.使3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷在3’-O-乙酰丙酰基位置选择性脱保护的方法，该方法包括选择对所述3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷的3’-乙酰丙酰基位置能直接有效的区域选择性水解的水解酶，和使所述3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷与所述的水解酶在有效地生成5′-O-乙酰丙酰基核苷的时间和条件下接触，其中所述的3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷为下式之一 其中R6是-H或-OH；R2、R3、R4和R5各自独立地是-H或氨基保护基团；G是N或CH；和Lev是-C(O)-(CH2)2-C(O)-CH3。
19.权利要求18的方法，其中所述的水解酶是脂酶。
20.权利要求19的方法，其中所述的脂酶是CAL-A。
21.权利要求19的方法，其中所述的脂酶是PSL-C。
22.权利要求18的方法，其中所述的3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷是3′，5′-二-O-乙酰丙酰基胸苷、3′，5′-二-O-乙酰丙酰基胞嘧啶或3′，5′-二-O-乙酰丙酰基N-苯甲酰基腺苷。
23.权利要求22的方法，其中所述的3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷是N-异丁基鸟苷。
24.使3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷在5′-O-乙酰丙酰基位置选择性脱保护的方法，其中所述的3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷为下式之一 其中R1是-H，-羟基，保护的羟基，或2′-取代基；和R2和R3各自独立地是-H或氨基保护基团；G是N或CH；和Lev是-C(O)-(CH2)2-C(O)-CH3；该方法包括使3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷与CAL-B在有效地水解所述的3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷的时间和条件下接触。
25.权利要求24的方法，其中所述的3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷包括腺苷、胞嘧啶、胸苷或N-异丁基鸟苷部分。
26.使3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷在3’-O-乙酰丙酰基位置选择性脱保护的方法，其中所述的3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷为下式之一 其中R6是-H或-OH；R2、R3、R4和R5各自独立地是-H或氨基保护基团；G是N或CH；和Lev是-C(O)-(CH2)2-C(O)-CH3；该方法包括使3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷与PSL-C在有效地水解所述的3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷的时间和条件下接触。
27.权利要求26的方法，其中所述的3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷包括N-异丁基鸟苷部分。
28.使3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷在3’-O-乙酰丙酰基位置选择性脱保护的方法，其中所述的3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷为下式之一 其中R6是-H或-OH；R2、R3、R4和R5各自独立地是-H或氨基保护基团；G是N或CH；和Lev是-C(O)-(CH2)2-C(O)-CH3；该方法包括使3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷与CAL-A在有效地水解所述的3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷的时间和条件下接触。
29.权利要求28的方法，其中所述的3′，5′-二-O-乙酰丙酰基核苷包括胸苷、胞嘧啶、或N-苯甲酰基腺苷部分。
30.至少保护核酸2′-O-3′-O或5′-O的一个羟基部分的方法，该方法包括使所述核酸与乙酰丙酸在有连接于高分子载体的偶合剂存在下，和在使2′-O、3′-O或5′-O位有效地形成酯的时间和条件下反应。
31.权利要求30的方法，其中所述的核酸是核苷。
32.权利要求30的方法，其中所述的偶合剂是碳二亚胺。
33.权利要求32的方法，其中所述的碳二亚胺是环己基碳二亚胺。
34.权利要求30的方法，其中所述的高分子载体是聚苯乙烯。
35.权利要求30的方法，其中所述的高分子载体是聚乙二醇。
36.至少酰化碳水化合物的一个羟基部分的方法，该方法包括使所述的碳水化合物与乙酰丙酸在有连接于高分子载体的偶合剂存在下，和能有效地形成酯的时间和条件下反应。
37.权利要求36的方法，其中所述的偶合剂是碳二亚胺。
38.权利要求37的方法，其中所述的碳二亚胺是环己基碳二亚胺。
39.权利要求36的方法，其中所述的高分子载体是聚苯乙烯载体。
40.权利要求36的方法，其中所述的高分子载体是聚乙二醇载体。
41.至少酰化类固醇分子的一个羟基部分的方法，该方法包括使所述的类固醇分子与乙酰丙酸在有连接于高分子载体的偶合剂存在下，和能有效地形成酯的时间和条件下反应。
42.权利要求41的方法，其中所述的偶合剂是碳二亚胺。
43.权利要求42的方法，其中所述的碳二亚胺是环己基碳二亚胺。
44.权利要求41的方法，其中所述的高分子载体是聚苯乙烯载体。
45.权利要求41的方法，其中所述的高分子载体是聚乙二醇载体。
46.保护下式化合物的羟基的方法， 其中Bx是核碱基；T1和T2各自独立地是OH、羟基保护基团、活化的磷酸酯基、核苷酸、核苷或低聚核苷酸；R是-H、-羟基、保护的羟基或2′-取代基；条件是T1、T2或R中至少一个是-OH；该方法包括使所述的化合物与乙酰丙酸在有连接于高分子载体的偶合剂存在下，和在能使所述羟基部分和乙酰丙酰基部分之间有效地形成酯的时间和条件下反应。
47.权利要求46的方法，其中所述的偶合剂是碳二亚胺。
48.权利要求47的方法，其中所述的碳二亚胺是环己基碳二亚胺。
49.权利要求46的方法，其中所述的高分子载体是聚苯乙烯载体。
50.权利要求46的方法，其中所述的高分子载体是聚乙二醇载体。
51.保护下式化合物的3′-O或5′-O位的方法 其中Bx是核碱基；R是-H或2′-取代基；该方法包括使所述的化合物与乙酰丙酸在有连接于固体载体的偶合剂存在下，和在能有效地形成下式化合物的时间和条件下反应 其中Lev是乙酰丙酰基。
52.权利要求51的方法，其中所述的连接于高分子载体的偶合剂是连接于高分子载体的环己基碳二亚胺。
53.权利要求52的方法，其中所述的高分子载体是聚苯乙烯高分子载体。
54.保护下式化合物的3′-O或5′-O位的方法 其中Bx是核碱基；R是-H或2′-取代基；该方法包括使所述的化合物与乙酰丙酸在有连接于聚苯乙烯该分子载体的环己基碳二亚胺存在下，和能有效地形成下式化合物的时间和条件下反应 其中Lev是乙酰丙酰基。
55.酰化羟基部分的方法，该方法包括使所述的羟基部分与乙酰丙酸在有连接于高分子载体的偶合剂存在下，和能有效形成酯的时间和条件下反应。
56.权利要求55的方法，其中所述的偶合剂是碳二亚胺。
57.权利要求56的方法，其中所述的碳二亚胺是环己基碳二亚胺。
58.权利要求55的方法，其中所述的高分子载体是聚苯乙烯。
59.权利要求55的方法，其中所述的高分子载体是聚乙二醇。
60.由环己基脲衍生的高分子载体制备环己基碳二亚胺衍生的高分子载体的方法，该方法包括使所述环己基脲衍生的高分子载体与脱水剂在有机溶剂中，和在有效地形成所述环己基碳二亚胺衍生的高分子载体的时间和条件下反应。
61.权利要求60的方法，其中所述的脱水剂是POCl3。
62.权利要求61的方法，其中所述的脱水剂是甲苯磺酰氯。
63.权利要求62的方法，其中所述的有机溶剂是CH2Cl2、CHCl3、己烷或吡啶。
64.权利要求61的方法，其中所述的高分子载体是聚苯乙烯高分子载体。
65.由环己基脲衍生的高分子载体制备环己基碳二亚胺衍生的高分子载体的方法，该方法包括以下步骤a.使所述环己基脲衍生的高分子载体与脱水剂在有机溶剂中，和在有效地形成盐的时间和条件下反应；和b.使所述的盐与水溶液接触以生成所述的环己基碳二亚胺衍生的高分子载体。
66.权利要求65的方法，其中所述的脱水剂是POCl3。
67.权利要求65的方法，其中所述的脱水剂是甲苯磺酰氯。
68.权利要求65的方法，其中所述的有机溶剂是CH2Cl2、CHCl3、己烷或吡啶。
69.权利要求65的方法，其中所述的高分子载体是聚苯乙烯高分子载体。
70.使核苷选择性酰化的方法，该方法包括a.选择对所述核苷的5’-或3’-位能直接有效的区域选择性酰化的水解酶；和b.使所述核苷与酰化剂在该水解酶存在下，和在有效地生成选自3′-O-乙酰丙酰基核苷和5′-O-乙酰丙酰基核苷的时间和条件下接触。
71.权利要求70的方法，其中所述的水解酶是脂酶。
72.权利要求71的方法，其中所述的脂酶是CAL-A、CAL-B、PSL-C、猪胰脂肪酶(porcine pancreatic lipase)，粘稠色杆菌脂酶(Chromobactenaum viscosum)、米赫毛霉(Mucor miehei)脂酶，Humicola lanuginosa脂酶，沙门氏柏干酪青霉(Penicilliumcamemberti)脂酶或皱落念珠菌(Candida rugosa)脂酶。
73.权利要求72的方法，其中所述的脂酶是CAL-A。
74.权利要求72的方法，其中所述的脂酶是CAL-B。
75.权利要求72的方法，其中所述的脂酶是PSL-C。
76.使核苷在5’-位选择性酰化的方法，该方法包括选择对所述核苷的5’-位能直接有效的区域选择性酰化的水解酶，和使所述核苷在所述水解酶存在下和在有效地生成5′-O-乙酰丙酰基核苷的时间和条件下，与酰化剂接触。
77.权利要求76的方法，其中所述的水解酶是脂酶。
78.权利要求77的方法，其中所述的脂酶是CAL-B。
79.使核苷在3’-位选择性酰化的方法，该方法包括选择对所述核苷的3’-位能直接有效的区域选择性酰化的水解酶，和使所述核苷在所述水解酶存在下和在有效地生成3′-O-乙酰丙酰基核苷的时间和条件下，与酰化剂接触。
80.权利要求79的方法，其中所述的水解酶是脂酶。
81.权利要求80的方法，其中所述的脂酶是CAL-B。
82.权利要求80的方法，其中所述的脂酶是PSL-C。
83.使核苷在5’-位选择性酰化的方法，该方法包括选择对所述核苷的5’-位能直接有效的区域选择性酰化的水解酶，和使所述核苷在所述水解酶存在下和在有效地生成5′-O-乙酰丙酰基核苷的时间和条件下，与酰化剂接触，所述的核苷为下式之一 其中R1是-H，-羟基，保护的羟基，或2′-取代基；和R2和R3各自独立地是-H或氨基保护基团；和G是N或CH。
84.权利要求83的方法，其中所述的水解酶是脂酶。
85.权利要求84的方法，其中所述的脂酶是CAL-B。
86.权利要求83的方法，其中所述的核苷是腺苷、胞嘧啶、胸苷或N-异丁基鸟苷。
87.使核苷在3’-位选择性酰化的方法，该方法包括选择对所述核苷的3’-位能直接有效的区域选择性酰化的水解酶，和使所述核苷在所述水解酶存在下和在有效地生成3′-O-乙酰丙酰基核苷的时间和条件下，与酰化剂接触，所述的核苷为下式之一 其中R6是-H或-OH；R2、R3、R4和R5各自独立地是-H或氨基保护基团；G是N或CH；和Lev是-C(O)-(CH2)2-C(O)-CH3。
88.权利要求87的方法，其中所述的水解酶是脂酶。
89.权利要求88的方法，其中所述的脂酶是CAL-A。
90.权利要求88的方法，其中所述的脂酶是PSL-C。
91.权利要求87的方法，其中所述的核苷是胸苷、胞嘧啶或N-异丁基腺苷。
92.权利要求91的方法，其中所述的核苷是N-异丁基鸟苷。
93.使核苷在5’-位选择性酰化的方法，其中所述的核苷为下式之一 其中R1是-H，-羟基，保护的羟基，或2′-取代基；和R2和R3各自独立地是-H或氨基保护基团；和G是N或CH；该方法包括使所述的核苷在有效地酰化所述核苷5′-位的时间和条件下与酰化剂和CAL-B接触。
94.权利要求93的方法，其中所述的核苷包括腺苷、胞嘧啶、胸苷或N-异丁基鸟苷部分。
95.使核苷在3’-位选择性酰化的方法，其中所述的核苷为下式之一 其中R6是-H或-OH；R2、R3、R4和R5各自独立地是-H或氨基保护基团；G是N或CH；和Lev是-C(O)-(CH2)2-C(O)-CH3；该方法包括使所述核苷在PSL-C存在下和有效地酰化所述核苷3′-位的时间和条件下，与酰化剂接触。
96.权利要求95的方法，其中所述的核苷包括N-异丁基鸟苷部分。
97.使核苷在3’-位选择性酰化的方法，其中所述的核苷为下式之一 其中R6是-H或-OH；R2、R3、R4和R5各自独立地是-H或氨基保护基团；和G是N或CH；该方法包括使所述核苷在有效地酰化所述核苷3′-位的时间和条件下，与CAL-A接触。
98.权利要求97的方法，其中所述的核苷包括胸苷、胞嘧啶或N-异丁基腺苷部分。
全文摘要
本发明涉及由常规的前体用酶方法制备3’－和5’－乙酰丙酰基核苷的方法。a,B=T;b,B=C;c,B=C
文档编号C12P19/30GK1500094SQ02807529
公开日2004年5月26日 申请日期2002年3月20日 优先权日2001年3月30日
发明者约根施·S·桑维, 维桑斯·戈托尔, 米格尔·费雷罗, 苏珊娜·费尔南德斯, 雅维耶·加西亚, 加西亚, 戈托尔, 费尔南德斯, 费雷罗, 约根施 S 桑维 申请人:Isis药物公司, 奥维多大学
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