Pcr方法

xiaoxiao2020-6-24  3

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专利名称:Pcr方法
背景本申请公开了一个快速的PCR方法,特别地聚焦于快速的增倍的QRT-PCR方法和相关的组合物和仪器。
聚合酶链式反应(PCR)在分子生物学领域是有效的工具。这一技术允许复制/扩增痕量的DNA片段成在有意义的方法中可以分析的量。正如这一技术已经适用于分子生物学应用途径中,如DNA测序,DNA指印等等。另外,这一方法具有检测样品中特定的DNA片段的能力,这些DNA片段的存在可以反映病理状态。所以,这一方法正在分子诊断领域中发现新的应用。另外,随着实时定量PCR(QPCR)的发展,这一技术已经变得更可靠和修改成自动化。目前,这一技术用于检测临床样品的病毒和细菌病原体,检测有白血病历史的患者的癌细胞(和其他癌症如在胸,肺,直肠,食管和皮肤中产生的)。
尽管有优点,但分子诊断中的PCR仍然有几个缺点。这经常是一个依赖于操作者的专门技术的。另外,这项技术也非常倾向于会污染。这两个上面提到的因素分别会导致假阴性和假阳性的结果。所以,需要对感兴趣的目标进行内部控制以及将该过程自动化保证操作的封闭的系统中进行(消除污染)。加入控制步骤包括扩增几个不同套的DNA片段以及需要的靶。这些控制步骤提供了关于待分析的样品的质量的信息以及在任何给定的循环中的实验的信息。由于技术原因,当目标在反应开始时没有以相似的丰度存在时,在PCR的相同的反应管中的样品是不能进行多个DNA目标的分析的(已知为增倍)。在历史上,有研究者试图通过限制PCR反应中的引物来克服。这一途径是基于在一个反应中限制试剂的思想的,它是在该目标的适当扩增已经发生之后,其他序列的扩增被抑制之前终止了反应。虽然这一方法可以扩大两个目标之间开始的丰度的差异,将仍然导致两个目标的成功的扩增,它不允许在大几个数量级丰度的第二个目标的环境中检测一个稀少的目标。另外,当要求一个快速的QPCR实验时,降低引物的浓度也使质量更糟。
目前的PCR技术的其他限制是进行PCR诊断花费的时间。通常PCR反应要花费的时间是以小时计算而不是分钟。如下所述,对于许多因素,减少进行PCR反应的时间是需要的。所以,需要谨慎分子诊断系统的自动PCR基点,特别是一个快速,增倍的(RT-)PCR试验。
发明概述提供了以分钟而不是小时进行完全的PCR反应的快速和需要劳动量的PCR和RT-PCR方法,允许在手术内的诊断中利用PCR,但不限制地也可以用于检测岗哨淋巴结中的微转移酶,作为典型的病理方法如淋巴结的组织病理学检测的优选的取代或辅助。
同时提供的有作为平衡增倍的PCR反应,特别是在QRT-PCR反应中有特殊用途的定量PCR扩增的一个方法的引物限制的替换物。该方法当待扩增的一个靶序列在同一反应混合物中比待扩增的另一个靶序列少得多的情况中有特别的用途。该方法包括在第一扩增时期和第二扩增时期,对PCR反应混合物中的DNA样品进行PCR扩增的步骤。在与第一扩增时期的PCR扩增不同的反应条件下进行第二扩增时期的PCR扩增来调节第一和第二扩增时期过程中第一引物套的第一扩增子和第二引物套的第二扩增子的生成相对速度。也可以加入其他扩增步骤。
公开了这一方法的两个非限制特定实施方案。在第一个实施方案中,在开始第二个扩增时期时在反应混合物中加入第二个引物套,从而限制了第一时期第二引物的实质性存在。在该方法中,优选地,在通常是一个对照如β-gus或18SrRNA序列的较多的序列之前扩增较少的目标序列。
在第二个实施方案中,PCR反应混合物包括具有第一个有效Tm的第一引物套和具有与第一有效Tm不同的第二个有效Tm的第二引物套。在与第二扩增时期的退火步骤不同的温度下进行第一扩增时期的退火步骤来调节在第一和第二扩增时期中第一引物套的第一扩增子和第二扩增时期的第二引物套的产生的相对速度。在这第二个实施方案中,第二扩增时期的退火温度可以比第一扩增时期的退火温度更高或更低。
同时提供的是快速RT-PCR方法,其根据是发现了RT-PCR方法的逆转录反应不需要进行10分钟以上,优选地只有约2分钟。这一快速步骤,当在RT反应的同一反应容器中与RT反应有顺序第进行的快速PCR过程结合时,允许在手术内利用RT-PCR反应,特别是当全部的过程自动化时。
各个上面叙述的PCR和RT-PCR方法在定量的PCR方法,如QPCR和QRT-PCR中在他们的用途中发现了特别的用途,通常通过荧光报道物的积累和丢失例如利用TAQMAN和分子光探针来检测的。
上面叙述的方法可以在基于柱体的系统中自动化,从而减少该方法中的人为错误以及污染的潜在性。同时提供了用于自动化系统中的柱体进行上述方法。
同时提供的是本文所述的快速PCR方法的特殊用途。在一个实施方案中,提供了手术内的PCR诊断方法,包括步骤从手术中的患者得到组织样品;根据上面所述的方法的一个分析样品;如果指示转录物超过了阈值水平进行缺点;在分析步骤的结果推断的方法中继续操作。在另一个实施方案中,提供了快速检测恶性肿瘤的方法,包括步骤从肿瘤活体组织切片得到核酸;根据上面叙述的PCR方法中的一个进行特异于核酸的指示转录的PCR方法;和如果指示转录物的表达超过了阈值水平进行测定,从而指示恶性肿瘤。
在其他实施方案中,提供了快速检测已转移的食管腺瘤的方法。该方法包括步骤从岗哨淋巴结得到RNA;根据上面叙述的PCR方法的任何一个对RNA进行特异于CEA的定量RT-PCR方法;和如果CEA的表达超过阈值水平来测定。
最后,还提供了用于检测特异于CEA和胰蛋白酶基因的序列以及β-gus和18SrRNA序列的特异的新寡聚核苷酸引物。
附图的简要说明

图1是根据本发明的一个实施方案的柱体的图解。
图2显示了比较有(B)和没有(A)分开RT和PCR反应的蜡的单管RT-PCR的敏感性的两个图。
图3是比较用和不用蜡层分开RT和PCR反应制备的RT-PCR产物的溴化乙锭染色凝胶的图。
图4提供了在如实施例3中所述的多重反应中的CEA和18SrRNA的扩增的四个图。组A和C显示了当在利用最佳条件的单倍中跑时,18SrRNA和CEA各自的结果。组B和D显示了多重的18SrRNA和CEA。
图5提供了CEA核苷酸序列,基因库登记号.XM 012777(SEQID NO1)。
图6是显示在10个食管肿瘤(淡灰色),4个组织学阳性(N1)淋巴结(白色),和10个来自没有癌症的患者的淋巴结(暗灰色)中测量的相对CEA的表达的图。
图7显示了来自30个食管癌症患者的组织阴性淋巴结中测量的相对CEA的表达。图中显示了每个患者中发现的最高CEA水平。患者1-20(暗灰柱)没有再发现,而患者21-30(轻灰柱)中有再发生。点线表明了预测再发生的最准确的截止值。利用这一截止值,QRT-PCR在3年中准确地鉴定了90%的患者是否有疾病再发生。
图8A-D是RT-PCR(8A and 8B)和QRT-PCR(8C and 8D)分类的患者的无疾病生存的Kaplan-Meier生存曲线。虽然log-rank实验表明,两个预示物在统计学上是明显的,QRT-PCR与RT-PCR比较下优越的特异性导致在再发生危险的基础上分开患者的能力更大(对于RT-PCR,P=0.0038,对于QRT-PCR<0.0001)。
图9显示了来自30个病理上食管癌阴性的患者的结的甲醛固定的淋巴结中CEA表达的SmartCycler分析。灰色条(21-30)表示再发生的患者,黑条(1-20)表示,不再发生的患者。没有可检测的CEA表达的淋巴结已经在0.02水平任意画图。点线表示预测疾病再发生的最准确的CEA表达截止值(0.183)。
图10显示了根据SmartcyclerQRT-PCR分类为LN阳性或阴性(在截止值0.183以上或以下)的30个pN0食管癌患者的无Kaplan-Meier疾病的生存曲线。
图11显示了在冷冻的淋巴结中的CEA表达的Smartcycler分析。白色(1-11)=来自没有癌症的患者的结;黑色(12-17)=测定最后病理是疾病阴性的结;灰色(20-23)=发现是疾病阳性的结;灰色(18和19)=手术内冷冻切片是阴性但固定的组织学是阳性的结;星=来自疾病再发生的结阴性患者的高度表达的结。0.001的值被任意指派到没有可检测的CEA的所有样品。
图12A-C显示β-Gus和CEA的快速QRT-PCR实验的最佳方式。图12A比较了在不同的变性时间和30秒扩展时间进行实验的Ct值。图12B比较了当变性时间保持恒定10秒不同的扩展时间对Ct值的影响。图12C证实了当PCR条件恒定,不同的RT时间的效果。
图13显示了β-Gus的恒定背景中,CEA的9倍系列稀释中的β-Gus和CEA的Ct值。该图比较了慢常规PCR(10秒的变性,接着30秒的退火/扩展步骤)和快速的PCR(1秒的变性接着6秒的退火/扩展步骤),◆=10,30GUS;□=1,6GUS;△=10,30CEA;和●=1,6CEA。
图14是在15分钟(2分钟RT和1/3PCR),17分钟(2分钟RT和1/6PCR),20分钟(5分钟RT,1/6PCR)和38分钟(10分钟RT和5/15PCR)实验之间的RT-PCR进行的时间比较。
图15显示了CEA单倍(组A),在温度控制的多重中的CEA(组B),在普通多重中的CEA(组C)和在常规引物限制的多重中的CEA(组D)的四个扩增图。
图16显示了CEA的单倍与温度控制的多重,普通多重和常规引物限制的多重的比较。比较了β-Gus的恒定背景中的CEA的系列稀释的delta Ct值。Delta Ct 25是不能扩增的系列稀释点。
图17是在淋巴结中的相对于β-Gus的CEA表达的直方图。黑色的条(1-3)对应于来自有癌症组织学迹象的患者的淋巴结。灰色的条(4-8)对应于来自没有癌症的患者的淋巴结。样品4和6没有可检测的CEA表达。
图18显示了有CEA(A)和酪氨酸酶(C)表达的样品,没有CEA(B)和酪氨酸酶(D)的表达的样品的代表性扩增图。在组A和B中,显示了β-gus(+),CEA(◇)和CEA IC(-)的荧光曲线。同样在组C和D中,显示了β-gus(◇),酪氨酸酶(-)和酪氨酸酶IC(*)。
发明详述提供了允许快速循环和/或PCR基础的分子诊断的敏感性提高的改良的PCR方法,特别是关于定量的PCR方法,包括QRT-PCR。这些改良的方法允许手术内利用PCR,同时即使在同时检测更多的对照核酸的多重PCR反应中也可以检测稀少核酸种类。
一个典型的PCR反应包括多个扩增步骤,或选择性扩增目标核酸种类的循环。PCR过程的全面叙述,和其常见的变化如定量PCR(QPCR),实时QPCR,逆转录PCR(RT-PCR)和定量逆转录PCR(QRT-PCR)是在本公开物的范围之外的,这些方法是本领域中已有叙述的,并且已经普遍商业化了。典型的PCR反应包括三个步骤变性步骤,其中目标核酸变性了;退火步骤,其中一套PCR引物(正向和反向引物)与互补DNA链退火;和扩展步骤,其中热稳定DNA聚合酶扩展了引物。通过重复这一步骤多次,DNA片段被扩增产生了一个对应于目标DNA序列的扩增子。典型的PCR反应包括30或更多变性,退火和扩展的循环。在许多情况中,退火和扩展步骤可以同时进行,其中循环只包括两个步骤。
变性,退火和扩展时期的长度可以是任何需要长度的时间。但是,在试图缩短PCR扩增反应的时间到适于手术内诊断的情况中,已经发现,这些步骤的长度可以在秒的范围而不是分钟的范围。具体地说,一些新的热循环仪能够产生至少约每秒5℃的热斜面速度(δT),在20分钟中PCR扩增是可能的。如本文所用,PCR循环的每个步骤提供的时间不包括斜面时间。变性步骤可以在1秒或更少的时间内进行。事实上,一些热循环仪不设定“0秒”,这可能是变性步骤的最适当的持久度。即热循环仪达到变性温度就足够了。退火和扩展步骤最适当是各小于10秒,并且当在相同的温度进行时,退火/扩展步骤的结合可以小于10秒。
如本文所用,虽然引物的最佳浓度在实验与实验之间可以有一些变化,但利用引物浓度的实际增加,通常大于约400nM,经常大于约800nM,而基本不破坏扩增子的生产,每个循环相当大地缩短。利用敏感的逆转录酶(本文所述)和/或高浓度的逆转录引物可以增强RT-PCR实验的敏感度来生产PCR开始时的目标PCR模板。
任何给定的PCR反应的特异性很大程度上依赖于,但不是唯一地依赖于引物套的同一性。引物套是与靶DNA序列退火的正向和反向寡聚核苷酸引物的对,允许目标序列的扩增,从而产生了特异于目标序列的扩增子。如本文所用,特异的寡聚核苷酸的“衍生物”是结合与特异的寡聚核苷酸相同的靶序列的寡聚核苷酸并且扩增同一目标序列,实质地产生与特异的寡聚核苷酸相同的扩增子,但在特异的寡聚核苷酸与衍生物之间是有差异的。衍生物通过插入,缺失和/或取代任何特异序列的残基而与特异的寡聚核苷酸相区别,只要衍生物在与特异序列相同目的的用途中保留特异序列的特征。
如本文所用,对于任何酶反应混合物,如逆转录和PCR反应混合物的“试剂”是加入反应混合物的任何化合物或组合物,不限制地是酶,核苷酸或其类似物,引物和引物套,缓冲液,盐和协同因子。如本文所用,除非特别表达,“反应混合物”包括所有进行酶反应必要的化合物和/或组合物,甚至是没有在表达中指示的那些化合物或组合物。
多重的PCR试验可以最佳化,或通过时间移变扩增子的产生而不是通过控制引物浓度来平衡。这可以利用两个引物套来达到,各个引物套具有不同的Tm值使可以进行两个时期的PCR试验,各个时期具有不同的退火和/或扩展温度一个和其他扩增子的产生。这一时间和温度移变方法允许当引物浓度的操作用于平衡反应时最好地平衡多重反应而不需要面对困难。这一技术特别可用于多重反应,其中需要扩增稀少cDNA和对照cDNA,如下所示的CEA/β-GUS的例子。
提供了在RNA分子(例如,不限制地总RNA或mRNA)群体中快速和准确检测低丰度RNA种类的定量逆转录聚合酶链式反应(QRT-PCR),包括步骤a)在适于产生cDNA的条件下,与逆转录酶和高浓度的靶序列特异逆转录酶引物一起温育RNA样品;b)随后在含有高浓度的特异于cDNA的高浓度PCR引物套的逆转录反应中加入适当的聚合酶链式反应(PCR)试剂,和在逆转录酶反应中加入热稳定DNA聚合酶,和c)将PCR反应循环需要数目的循环,和在适当的条件下生产特异于cDNA的PCR产物(“扩增子”)。通过暂时分开逆转录酶和PCR反应,和通过利用逆转录酶最佳化和PCR最佳化的引物,得到特别好的特异性。反应式在单个试管中进行的(所有试管,容器,小瓶,小室等等进行本文特指的反应的容器通常称为“反应容器”),单个试管中除去了双管反应中通常发现的污染源。高浓度的引物允许非常快速的QRT-PCR反应,通常从开始逆转录酶反应到40个循环的PCR反应结束有20分钟。这样的一个快速的QRT-PCR实验的进行是能够产生至少约5℃每秒的热斜面速度(δT)的热循环装置来辅助的。
反应c)可以在与逆转录酶反应相同的试管中,在逆转录酶(PT)反应中加入足够的试剂产生良好的,甚至PCR进行的最佳条件下进行的。在进行逆转录酶反应之前可以装载单个试管,装载物为1)逆转录酶反应混合物,和2)在逆转录酶反应完成后与cDNA混合物混合的PCR反应混合物。逆转录酶混合物和PCR反应混合物可以通过在熔化温度大于逆转录酶反应的温育温度,但低于PCR反应的变性温度的组合物的固体,或半固体(包括非结晶的,玻璃的物质和蜡的)屏障来物理地分离。屏障组合物可以是疏水特性的并且当液体形式时与RT和PCR反应混合物形成第二相。这样的屏障组合物的一个例子是通常用于PCR的蜡小珠,如AMPLIWAX PCR GEM产物,可以从加州Foster市的AppliedBiosystem购买得到和STRATASPHERE镁蜡小珠,可以从加州,La Jolla的Stratagene购买得到。
逆转录酶和PCR反应的分开可以在逆转录酶反应完成后通过加入PCR试剂,包括PCR引物套和热稳定DNA聚合酶来完成。优选地,PCR试剂是通过机器地或液体的方法来机械加入的,可以使样品污染相当少,可以消除人工的误差。
在固定数目的PCR循环后可以比较QRT-PCR方法的产物来确定与给定的报道基因相比的相对量的RNA种类。比较QRT-PCR方法的产物的相对量的方法是凝胶电泳,例如,将样品在凝胶上跑,和通过一个已知的方法包括不限制地可以是Southern印迹和用标记探针来检测,用溴化乙锭染色和在扩增子中掺入荧光或放射性标记中的一个方法来检测这些样品。
但是,PCR反应的方法通常是通过分析各个PCR引物套的扩增子产生的相对速度来检测的。通过许多方法,包括不限制地可以是荧光引物,荧光原探针和结合双链DNA的荧光染料来完成对扩增子产物的检测。常用的方法是荧光5’核酸酶实验。这一方法探测了一些热稳定DNA聚合酶的5’核酸酶活性(如Taq或Tf1 DNA聚合酶)以便在PCR方法中裂解寡聚物探针。选择寡聚物在扩展条件下与扩增的靶序列退火。探针通常在它的5’末端具有荧光报道因子,在它的3’末端具有报道因子的荧光淬灭物。只要寡聚物是完整的,就可以淬灭来自报道因子的荧光信号。但是,当在扩展过程中消化寡聚物时,荧光报道因子不再在淬灭物的附近扩展。给定扩增子的无荧光报道因子的相对积累可以与对照样品的相同扩增子的积累和/或与对照基因如不限制地可以是β-gus,β-激动素或18SrRNA比较来确定RNA群体中的给定RNA的给定cDNA产物的相对丰度。荧光5’核酸酶实验的产物和试剂是容易购买的,例如可以从Applied Biosystem购买。
根据荧光5’核酸酶实验和其他QPCR/QRT-PCR方法控制和检测PCR和QRT-PCR的仪器和软件也是容易得到的,包括Smart循环仪,可以从加州Sunnyvale的Cepheid得到,ABI Prism 7700序列检测系统(TaqMan),可以从Applied Biosystems得到。基于柱体的样品制备原型系统(GenXpert)结合了热循环仪和具有液体循环的Smart Cycler产物和能够自动从组织样品萃取特异的核酸和对核酸进行QPCR或QRT-PCR的加工元素容量的荧光检测装置。系统利用了可以构型和用许多试剂预装载的可任意处理柱体。这样的一个系统可以破坏组织和从样品萃取总RNA或mRNA。可以在RNA中自动加入逆转录酶反应成分,并且QPCR反应成分可以在完成逆转录酶反应基础上自动加入。
另外,可以检测PCR反应中特别的荧光团的产生(或丢失)。当荧光团水平达到(或落在)需要的水平中,自动系统将自动改变PCR条件。在一个非限制例子中,在上面所述的多重实施方案中这是特别有用的,其中通过第一的,更低的Tm,引物套在比第二,更高的Tm,引物套下扩增的更少的种类更低的温度时扩增更丰富的(对照)目标种类。在PCR的第一时期,在允许扩增更丰富的目标种类的温度时进行循环反应的退火步骤。然后,退火温度自动上升到基本上终止更丰富的目标种类的扩增的温度。
在上面所述的反应中,一些逆转录酶和PCR反应的量是非典型的,以便可以利用一些热循环仪的更快的斜面时间。具体地说,引物浓度是非常高的。逆转录酶反应的特异于典型基因的浓度小于约20nM。为了达到快速逆转录酶反应发生在一到二分钟,逆转录酶反应的引物浓度上升到大于20nM,优选地至少约50nM,通常约100nM。标准的PCR引物浓度的范围是100nM到300nM。也可以在标准PCR反应中利用更高的浓度补偿Tm的变化。但是,为了本文的目的,参考的引物浓度是针对各种情况的,其中不需要Tm补偿。根据经验可以确定成比例的更高的引物浓度,并且如果需要Tm补偿时也可以利用该浓度。为了完成快速的PCR反应,PCR引物浓度通常大于200nM,优选地大于约500nM,通常约800nM。通常,逆转录酶引物与PCR引物的比例是约1到8或更多。引物浓度的提高允许PCR实验在小于20分钟的时间内进行40个循环,如下面实施例2所述。
敏感的逆转录酶在一些情况中是优选地,其中存在少量的RNA,或者目标RNA是低丰度的RNA。术语“敏感逆转录酶”指能够从用作PCR模板的低拷贝数的转录物产生适当的PCR模板的逆转录酶。敏感逆转录酶的敏感度可以来自酶的物理特性,或来自产生增强的敏感性的逆转录酶反应混合物的特异的反应条件。敏感逆转录酶的一个例子是SensiScript RT逆转录酶,可以从加州Valencia公司,Qiagen购买得到。为了从小于50ng的RNA样品产生cDNA而将这一逆转录酶进行了最佳化,但具有从低拷贝数的转录物产生PCR模板的能力。
正如上面讨论的,本文所述的方法也可以在多重的QRT-PCR方法中利用。从最广泛的角度来看,多重PCR方法包括在相同的反应容器中两个或多个扩增子的生产。可以通过凝胶电泳来分析多重扩增子,通过许多方法中的一个,如不限制地可以是溴化乙锭染色,Southern印迹和与探针杂交,或通过在扩增子中掺入荧光或放射性成分和随后在凝胶上观察产物来检测扩增子。但是,实时检测两个或多个扩增子的产生是优选的。荧光5’核酸酶实验是最常见的检测方法。仪器是可以得到的(如,上面所述的Smart Cycler和TaqMan产品),允许实时检测同一试管中两个或多个荧光报道物的累积。对于多重地检测荧光5’核酸酶实验,提供了对应于待检测的各个扩增子种类的寡聚物。各个扩增子种类的寡聚物探针具有各个扩增子种类的最大发散波长与寡聚物探针不同的荧光报道物。各个未淬灭的荧光报道物的累积可以检测确定对应于各个扩增子的目标序列的相对量。
在传统的多重QPCR和QRT-PCR方法中,选择具有相同的退火和扩展动力学和相似的大小扩增子的PCR引物套是需要的。设计和选择适当的PCR引物套是本领域技术人员已知的。鉴定最佳的PCR引物套和其各个比例(引物限制,即在多重PCR实验中限制更丰富的RNA种类的PCR引物的丰度)达到平衡多重反应的方法也是已知的。“平衡”指一些扩增子对于来源如dNTP或酶没有截止竞争其他扩增子。同样推荐对所有PCR引物套进行Tm(熔化温度)的等量化。参见例如,ABI PRISM 7700序列检测系统使用者手册,#5,“多重PCR与TaqMan VIC Probes”,Applied Biosystems(1998/2001)。
尽管如此,对于非常低拷贝数的转录物,甚至通过限制更丰富的对照种类的PCR引物套,设计准确的多重PCR实验是困难的。这一问题的一个解决方案是对更丰富种类的PCR反应,在分开的试管中进行低丰度的RNA的PCR反应。但是,该方案没有利用进行多重PCR实验的优点。双试管方法具有几个缺点,包括耗费,加入更多的实验误差的空间,增加样品污染的机率,这些在PCR实验中是十分重要的。
所以提供了进行多重PCR方法的方法,包括QRT-PCR和QPCR,能够检测低拷贝数核酸种类和一个或多个更高拷贝数种类。低拷贝数和高拷贝数核酸种类的差异是相对的,但在本文中指低拷贝数种类和至少约30倍的高拷贝数种类但更通常是至少约100倍的高拷贝数种类的多少中的差异。为了本文的目的,两个待扩增的核酸种类的相对多少在给定数目的样品中的其他核酸种类的关系中比两个核酸种类的相对多少更突出,因为在核酸样品中的其他核酸种类不直接与PCR源的待扩增的种类竞争。
如本文所用,在实验之前,在给定核酸样品中的任何给定的核酸种类的多少是未知的。所以,在核酸样品中的给定核酸种类的拷贝的“期望”数目经常在此处使用,并且是基于核酸样品中的该种类的多少的历史数据。对于任何给定对数的核酸种类,可以预期,根据样品中的两个种类的相对多少的决定簇,各个种类的多少是在一个范围内的。通过确定这些范围,可以确定各个种类的预期数目的目标序列的倍数的差异。
多重PCR方法包括进行两(或多)时期的PCR扩增,允许调节第一个引物套的第一个扩增子,和第二个引物套的第二个扩增子在各个扩增时期的生产的相对速度。在与第一个扩增时期不同的反应条件下进行第二个扩增时期的PCR扩增,(“不同的反应条件“不限制地包括PCR循环中的步骤的不同温度,如退火步骤,或PCR反应混合物中的试剂的不同,如引物的不同和/或引物浓度的不同)。通过这一方法,用PCR扩增可以有效地”平衡“产生特异于更低丰度的核酸种类的扩增子的PCR扩增,来产生特异于更高丰度的核酸种类的扩增子的PCR扩增。通过删除不在第一个扩增时期产生额任何扩增子的PCR引物套可以将反应分成两个或更多的临时时期。然后可以在第二个扩增时期开始时,在PCR反应混合物中加入删除的PCR引物套。这最好是通过利用自动的方法来完成如上面所述的GenXpert原型系统。两个或多个分开的扩增时期可以用于剪裁或平衡多重的实验,和或例外地剪裁各个引物套的浓度。
临时分开PCR扩增方法成两个或更多时期的第二个方法是选择各自的Tm不同的PCR引物套。下面的实施例3和6中提供了这样的方法的两个实施例。在一个实施例中,更低拷贝数的核酸种类的引物具有比更高丰度的种类的引物(Tm2)更高的Tm(Tm1)。在这一方法中,在基本没有更高丰度的种类的扩增的足够高的温度下,进行PCR扩增的第一时期达到预定数目的循环。在第一个扩增时期后,在更低的温度,通常约Tm2进行PCR反应的退火和扩展步骤,使更低和更高丰度的引物能够扩增。应该注意,如本文所用,并且除非特别注明,Tm指“有效Tm”,是给定反应混合物中的任何给定引物的Tm,它依赖于一些因子,包括不限制地可以是引物的核酸序列和反应混合物中的引物浓度。
应该注意,PCR扩增是动力学方法。不限制地,当在多重PCR反应中利用调节各个PCR反应的温度时,可以在通常范围是刚刚大于较低的Tm到刚刚高于更高的Tm的任何温度下进行更高的温度退火时期,只要反应有利于更高的Tm引物套产生扩增子。同样,不限制地,更低温度的反应的退火通常是在低于低温引物套的更高Tm的任何温度,这将允许更低的Tm引物套的足够的扩增效率。
在上面提供的例子中,在更高的温度时期,低丰度的RNA的扩增子在比更高丰度的RNA的扩增子(优选地基本排除了产生第二个扩增子)更快的速度下扩增。所以,在第二个扩增时期,当需要所有扩增子的扩增以基本平衡的方式进行时,更低丰度的RNA的扩增是足够丰富的,使更高丰度的RNA的扩增不干扰更低的丰度的RNA的扩增。在扩增的第一个时期,当低丰度的核酸的扩增子优选地扩增,退火和扩展步骤可以在高于更高的Tm时进行,以得到超过有效性的特异性(在扩增的第二个时期,因为有相当大数目的低丰度核酸扩增子,选择性不再是明显的问题,扩增子生产的有效性是优选的)。所以,应该注意,虽然在许多情况中是有利的,温度的变化可能不必要地导致完全关闭一个扩增反应到另一个扩增反应。
在另一个实施方案中,用第一个Tm设定的第一个引物可以靶击更丰富的模板序列(例如,对照模板序列),并且用更高的Tm设定的第二个引物可以靶击更不丰富的模板序列。在这种情况中,更丰富的模板和更不丰富的模板可以在第一个时期,在足够的温度下进行,允许更低的Tm引物套,通常在第一Tm,更低的Tm,引物套的Tm或更高的Tm时充分扩增。当对应于更丰富的模板的扩增子的阈值量达到时,反应的退火和/或扩展温度上升到能有效地关闭更丰富的模板的扩增。
选择具有三个或更多不同Tm(例如,Tm1>Tm2>Tm3)的三个或更多套PCR引物套可以用于扩增在逐步的方法中改变丰度的序列,只要Tm的差异是足够大的,允许优选地扩增基本排除不需要的序列的需要的序列要求数目的循环。在一个方法中,在第一个时期扩增最低丰度的序列预定数目的循环。其次,在第二个时期扩增最低丰度和较少丰度的序列预定数目的循环。最后,在第三个时期扩增所有序列。正如上面所述的两时期反应,各个时期的退火步骤可以根据各个多重反应的扩增反应的相对效率而改变。应该认识到,两个或多个扩增物可以具有基本相同的Tm,允许在扩增方法的任何时期具有相同丰度的一个以上的种类的扩增。正如双时期反应,三时期反应也可以逐步进行,从最大丰度的核酸种类在最低的退火温度下扩增到最小丰度的种类在最高退火温度时的扩增。
通过这一连续的扩增方法,除了匹配Tm和利用限制量的一个或多个PCR引物套,提供了“平衡”多重PCR反应的其他工具。在连续加入其他引物套的一些情况中,将具有不同Tm的PCR引物套的开发中文连续扩增不同扩增子的方法可能是优选的。但是,多重PCR反应的依赖温度的测序方法的利用可以与在单个的反应混合物中连续物理加入引物套相结合。
同时提供了内部的阳性对照,证实一个特殊的扩增反应的操作方法有一个阴性的结果。内部阳性对照(IPC)是具有与靶基因(CEA或胰蛋白酶)相同的引物序列但具有不同的内部探针序列的DNA寡聚核苷酸。IPC中的选择位点可以选择性地用尿嘧啶而不是胸腺嘧啶来合成使需要时高度浓缩的模拟物的污染可以利用尿嘧啶DNA糖基化酶来控制。IPC可以加入到任何PCR反应的主混合物中,加入的量可以由经验来确定,能够得到通常大于内源引物套靶的Ct值的Ct值。然后根据标准的方法来进行PCR实验,甚至当没有引物套的内源靶时也可以进行,IPC进行扩增后,证实扩增目标内源DNA的衰退不是主混合物中的PCR试剂的衰退。在这一实施方案中,IPC探针的荧光发生不同于内源序列的探针。在RT-PCR反应中其利用的变化是IPC是RNA,该RNA包括一个RT引物序列。在这一实施方案中,IPC证实了RT和PCR反应的功能。RNA和DNA IPC(对应的探针不同)也可以用于区别RT和PCR反应中的难度。
本文所述的方法通常可以用于定量PCR和RT-PCR方法。本文所述的和附录的手稿中的是检测癌胚抗原(CEA)和预后食管的腺癌。本文所述的方法是同等地可用于其他微转移酶,包括其他许多肿瘤类型中的隐藏的微转移酶的鉴定。本文所述的快速的方案可以在约20分钟内进行。这一短时间允许实验在手术内进行,使外科大夫可以决定单个手术过程中的外科手术方法,而不需要第二个手术手术,或需要外科大夫进行不需要的或过分宽泛的预防过程。例如,在一些癌症包括胸癌和黑素瘤的外科评估中,岗哨淋巴结可以在第一个手术中除去。对于微转移酶,岗哨结是后来评估的,并且当在患者的岗哨淋巴结中检测微转移酶时,患者需要第二个手术,增加了患者的外科手术的危险,并且患者在多个手术中将会不舒服。在肺和食管癌的情况中,手术内分析淋巴结可以用于确定需要的再切除的程度和/或是否需要新的辅助化学治疗。具备了在小于30分钟内,准确率提高下确定一些特异于肿瘤的标记如不限制地可以是CEA,MUC-1,CK-19,胰蛋白酶和MART-1的表达水平的能力,外科大夫可以马上决定怎样来进行手术。快速的试验可应用于医生办公室进行的针活体检查。患者不需要等几天就可以得到活体检查的结果(如肿瘤或淋巴结的针活体检查),但现在可以在非常短的时间内得到更准确的结果。本文所述的方法可应用于检查,不限制地可以是各种正常或不正常表达的RNA,DNA重排或其他的或不正常的核酸的存在,如病毒核酸。
在上面所述的多重和非多重的QRT-PCR和/或QPCR的方法的市场化中,一些检查特异的核酸的试剂盒将是特别有用的。这样的试剂盒的一个例子将包括上面所述的一个试管的QRT-PCR方法需要的试剂。在一个实施例中,试剂盒将包括上面所述的试剂,包括逆转录酶,逆转录酶引物,对应的PCR引物套,热稳定DNA聚合酶,如Taq聚合酶,适当的荧光报道物如不限制地可以是荧光5’核酸酶试验的探针,分子光探针,单个染料引物或特异于双链DNA的荧光染料如溴化乙锭。引物可以存在的量将产生上面所述的高浓度。热稳定DNA聚合酶是常见的和可以从各个制造商那里购买的。在试剂盒中的其他材料可以包括适当的反应试管或小瓶,屏障组合物,通常是蜡珠,可选择地包括镁;逆转录酶和PCR时期的反应混合物(通常10X),包括需要的缓冲液和试剂如dNTP,无核酸酶或RNA酶的水;RNA酶抑制剂;对照核酸和/或任何其他缓冲液,化合物,协同因子,离子成分,蛋白质和酶,聚合物,等等,可以用于逆转录酶和/或QRT-PCR反应的PCR时期。
第二个试剂盒是特异于上面所述的多重PCR方法的。试剂盒可以包括,不限制地可以是具有第一个Tm的低丰度的核酸的第一个引物套,和具有第二个Tm的高丰度的核酸的第二个引物套。根据本文所述的方法,选择引物套的相对Tm的平衡多重PCR反应的能力。在QRT-PCR的试剂盒中,试剂盒也可以包括任何适当的逆转录酶,特异于待扩增的核酸的逆转录酶引物,屏障组合物如蜡珠,热稳定DNA聚合酶和/或适当的荧光报道物,如不限制地可以是荧光5’核酸酶试验的探针,分子光探针,单一的染料引物或特异于双链DNA的荧光染料如溴化乙锭。试剂盒可以包括用于检查低丰度RNA的敏感逆转录酶。如上所述,试剂盒中的其他材料包括适当的反应试管或小瓶,屏障,通常是蜡珠,或者包括了镁;逆转录酶和PCR时期的反应化合物(通常10X),包括需要的缓冲液和试剂如dNTP;无核酸酶或RNA酶的水;RNA酶抑制剂;对照核酸和/或任何其他缓冲液,化合物,协同因子,离子成分,蛋白质和酶,聚合物等等,可以用于QRT-PCR反应的逆转录酶和/或PCR时期。
上面所述的试剂盒和柱体也包括适用于手动或自动从组织样品萃取核酸的试剂和机械成分。这些试剂通常是本领域技术人员已知的,通常是设计选择的材料。例如,在自动方法中,组织可以试剂或柱体中提供的适当的溶解液中超声波裂解。然后过滤得到的溶解液,并且RNA与同样是试剂盒或柱体中提供的RNA结合磁性珠结合。可以洗涤珠/RNA,并且在逆转录酶反应之前洗脱RNA。在自动的核酸萃取的情况中,通常推荐通过物理构成机械的呵液体的特异萃取系统,如Cepheid’s GenXpet原型系统来选择试剂和他们的包装方式(例如可任意处理的一次使用的柱体)。
试剂盒的成分可以一起或分开包装,各个成分可以存在于一个或几个试管或小瓶中,或是柱体形式(含有用于自动设备中的一个或多个试剂的调节单元)。独立的或一起的成分可以包装在各种状态中,包括不限制地可以是冻干的,玻璃化的,水溶液或其他形式。
图1是用于上面所述的自动方法中的柱体10的横断面图。柱体10包括小包装20,其中可以储存使用的任何需要的试剂。舱20由墙25分开。柱体10包括由液体与普通的通道40连接的多重通道30。阀50在普通通道40内。阀50控制了试剂从单个小舱20流到普通通道40。普通通道40由液体与反应容器(没有显示)连接,其中转移了来自舱20的试剂。舱20中含有的试剂可以包括,不限制地可以是细胞溶解试剂,用于核酸纯化,用于逆转录或PCR反应。图1显示了用于自动分子纯化和试验的柱体设备的许多可能的变化设备中的一个。柱体和舱可以具有任何需要的形状和大小,可以根据经验以及设计者的推荐。液体通道和阀的选择和构成也是设计选择的问题,可以有很多变化。
实施例实施例1 一个试管的ORT-PCR引入了实时的,基于荧光的5’核酸酶PCR(Gibson,U.E.,C.A.Heid and P.M.Williams.1996.实时定量RT-PCR的一个新方法,Genome Res.6995-1001;Heid,C.A.,J.Stevens,K.J.Livak and P.M.Williams.1996.实时定量PCR。Genome Res.6986-994)和仪器如ABI PRISMTM7700(Taq Man)序列检测仪(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA),定量RT-PCR现在是广泛接受的检测基因表达水平的方法。定量RT-PCR是敏感的技术,并且特别有用于分析含有有限量的核酸的样品,如临床组织(Collins,C.,J.M.Rommens,D.Kowbel,T.Godrey,M.Tanner,S.I.Hwang,D.Polikoff,G.Nonet et al.1998.Positional cloning of ZNF217 andNABC1在20q13.2扩增和在胸癌中过度表达。Proc.Natl.Acad.Sci.USA 958703-8708)。当定量这些小量的RNA和/或非常低丰度的mRNA种类时,从定量RT-PCR获得最大敏感度是非常重要的。当连续循环嵌套PCR经常性地用于达到最大敏感度时,达到和维持准确的定量是困难的。另外,PCR的多重循环增加的污染的危险,这是在要求敏感度水平的工作中的严重问题。一个试管的RT-PCR(利用RT的反向PCR引物在同一试管中的RT和PCR)降低了利用ABI PRISM7700时的污染的危险,引物反应试管从不打开。
在理论上,一个试管的方法应该具有与两步骤的途径相同的敏感度(分开RT接着PCR),但在实际上不是这样的(Battaglia,M.,P.Pedrazzoli,B.Palermo,A.Lanza,F.Bertolini,N.Gibelli,G.A.Da Prada.A.Zambelli et al.1998.上皮肿瘤细胞检测和嵌套RT-PCR的未解决的问题没有假阳性结果的新的敏感的一步方法。骨髓移植22693-698)。已经发现,一个试管的RT-PCR的敏感性是受到RT步骤的相对非特异性的限制的。这一非特异性是RT是在相对低的温度和没有热开始状态下进行的事实产生的,所以允许需要的RT“反向”引物和“正向”PCR引物额非特异引导。由于输入的RNA样品中的靶的量减少,来自冷开始的RT过程的引导人工制品可以竞争和降低需要的靶序列的PCR扩增和降低其效率。所以,当一个试管的方法中RNA输入降低,非特异侧反应最后与需要的反应外竞争,并且产生了非特异产物。在两步的或嵌套的RT-PCR方法中,利用热开始的PCR和RT引物的5’上游的引物套可以获得特异性。但是,这不是一个试管的方法中的情况,除非希望打开反应管加入新的引物(从而使反应在一个试管中但两个步骤)。已经有人假设,利用外部RT引物和保持RT和PCR引物在RT步骤中分开,一个试管的RT-PCR中的PCR特异性和由此的敏感性应该是可维持的。这里,大大增强敏感度和可以用于ABI PRISM7700上的定量RT-PCR的修饰的一个管RT-PCR是存在的。
标准的一个试管的反应是为β-葡糖醛酸酶(β-gus)mRNA设立的,在50μL体积中最后的浓度如下10nM β-gus RT引物(5’-TTTGGTTGTCTCTGCCGAGT-3’)(SEQ ID NO2),100nM的各个β-gus PCR引物(GUS-F,5’-C-CATTTGGAATTTTGCCGATT-3’)(SEQ ID NO3);GUS-R,(5’-CCGAGTGAAGATCCC-CTTTTTA-3’)(SEQ ID NO4),100nM β-gus探针(5’-6-fam-TGAACAGTCACCGACG-AGAGTGCTGG-tamra-3’)(SEQ ID NO5),1X TaqMan反应缓冲液(Applied Biosystems),5.5mM MgCl2,300μM各个dNTP,20U Rnase抑制剂,62.5 U SUPERSCRIPT IITM逆转录酶(生命技术公司,Rockville,MD,USA)和1.25 U AmpliTaq Gold(Applied Biosystems)。
在修改过的方法中,利用AmpliWaxPCR gem 50(AppliedBiosystems)完成了RT反应混合物和PCR引物之间的物理分离。首先,将β-gus PCR引物滴到PCR平板上,最后体积是5.0uL。在每个孔中放入一个PCR gem 50,将孔盖帽,简单地离心平板,避免试剂与试管壁在蜡屏障上黏连。然后,加热平板到80℃2分钟,冷却到4℃产生蜡屏障。然后将45uL的上层吸到每个孔中。这一混合物含有β-gus RT引物,RNA,Rnase抑制剂和SUPERSCRIPT II逆转录酶。配制双层以便含有所有的其余的反应成分(缓冲液,核苷酸,MgCl2),浓度如上所述。在RT层中存在AmpliTaq Gold是无关重要的,因为这一酶直到加热到95℃时是无活性的。
所有反应是在ABI PRISM 7700上进行的,热循环仪条件如下48℃持续30分钟,95℃持续12分钟,接着40个循环的95℃20秒和60℃1分钟。在48℃的RT步骤时蜡层保持完整,但在12分钟95℃的AmpliTaq Gold活化步骤时期熔化,所以允许两层在PCR开始时混合。用Applied Biosystem序列检测软件分析数据。
首先,评估TaqMan试验中的荧光检测上的蜡层的效率,确定蜡的荧光淬灭的程度。利用来自肺腺癌细胞系(A549)的任意引导的cDNA,进行有和没有蜡层的重复20次的β-gus的PCR。结果显示整体荧光没有降低(p=0.55),并且当与独立的样品t-试验比较,在两个步骤之间的循环阈值中没有变化(p=0.55)。
为了比较有和没有蜡层的一个试管的RT-PCR的敏感性,利用了系列稀释脾的总RNA(Clontech实验室,Palo Alto,CA,USA)。没有蜡层的RT-PCR的结果显示,甚至在5ngRNA加入时荧光(ΔRn)是弱的,并且每次稀释进一步降低平均75%(图2A)。作为结果,200pg样品下降到检测的阈值下。但是,利用蜡层,ΔRn基本保留在与40pg稀释时相同,只有10pg的ΔRn是60%的下降(图2B)。所以,这一修饰过程导致了敏感度至少增加了20倍。RT-PCR的效率(E)(如公式E=10(1/-s)-1,其中“s”是稀释的标准曲线的斜率)(PE Applied Biosystems User Bulletin#2.1997.基因表达的相对定量。Applied Biosystems,Foster City,CA.)也利用蜡来提高了(没有蜡67%,有蜡77%)。在10%的非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳各个反应的10ul的等分试样,并且用溴化乙锭染色(图3)。在有啦层的情况中,在所有稀释液中除了10pg RNA稀释液可以观察对应于期望大小的81bp的产物(证明了TaqMan检测对溴化乙锭的特别的敏感度)。但是,在没有蜡的反应液中,没有反应液在81bp产生清楚的信号。但是,在所有RNA浓度都有非特异产物的污染。
利用Sensiscript RT(Qiagen,Valencia,CA,USA)进行相同的实验。在这一酶作用的情况中,甚至在没有蜡层时,PCR产物可以检测到40pg稀释度。但是,每个连续的稀释度总的荧光连续下降。加入蜡层,ΔRn保持恒定,检测容易地达到10pg。显然,这一一个试管的反应的效率接近100%(用上面所述的方法检测)。所以,明显地利用AmpliWax PCR gem 50可以增强ABI PRISM7700中用于5’荧光原实验的一个试管的RT-PCR的敏感度。PCRgem最初是为了简化热开始的PCR而设计的,但对于自动的热开始不再需要新的酶。这里显示,这些相同的AmpliWAX PCRgem在一个步骤的定量RT-PCR中是有利的。另外,由于不需要打开PCR试管,消除了cDNA或PCR产物的污染。最后,PCR的防腐特异地简化了需要的产物的扩增,并且甚至在非定量的终点实验中也是相关的。
实施例2 在不到20分钟内的定量RT-PCR下面是定量逆转录的一个试管的两步骤实验,接着是聚合酶链式反应(QRT-PCR),可以利用Cepheid’s Smart Cycler在不到20分钟内完成。在Applied Biosystem’s 7700中的5’荧光原实验的QRT-PCR的现有方法需要2个小时以上。通过改变引物和探针浓度和利用Smart Cycler的快速斜面能力,逆转录酶反应的时间降低到2分钟,并且PCR时间利用1秒变性和6秒扩展的40个循环降低到16分钟。
各在25ul中设计β葡糖醛酸酶(β-gus)和癌胚抗原(CEA)cDNA的PCR反应,最后浓度如下400nM各个β-gus PCR引物(GUS-F,5’-CTC ATT TGG AAT TTT GCC GAT T-3’)(SEQ IDNO3);(GUS-R,5‘-CCG AGT GAA GAT CCC CTT TTT A-3’)(SEQ ID NO4)或CEA引物(CEA-F,5’-AGA CAA TCA CAGTCT CTG CGG A-3’)(SEQ ID NO6);(CEA-R,5’-ATC CTT GTCCTC CAC GGG TT-3’)(SEQ ID NO7),200nM β-gus探针(5’-6-fam-TGAACAGTCACCGACGAGAGTGCTGG-tamra-3)(SEQ ID NO5)或200nMCEA探针(5’-6-fam-CAA GCC CTC CATCTC CAG CAA CAA CT-tamra-3)(SEQ ID NO8),1X Platinum Taq反应缓冲液,4.5mMMgCl2,300uM各个dNTP,0.06U/ul PlatinumTaq DNA聚合酶(GIBCO BRL)。
利用1.5,2.5,3.5和4.5mM浓度的MgCl2进行实验,确定4.5mM对于这一实验是最适当的。这些反应的cDNA是利用加入250ng来自A549细胞系(GUS)的RNA和CEA阳性的新鲜的淋巴结RNA,从GUS和CEA的基因特异逆转录酶反应中产生的。
在25ul体积中设计β-gus mRNA和CEA mRNA的RT-PCR反应,PCR浓度如上,逆转录酶浓度如下60nM β-gus逆转录酶引物(5’-TTTGGTTGTCTCTGCCGAGT-3’)(SEQ ID NO2)或CEA逆转录酶引物(5’-GTG AAG GCC ACA GCA T-3’)(SEQ IDNO9),1ul的Sensiscript和0.8U/ulRnase抑制剂。RT-PCR的RNA加入量是A549 400ng A549和淋巴结25ng。
首先通过结合30秒的扩展步骤比较40个循环中95℃时的1,2,5,7和10秒的变性步骤使变性步骤最佳化。在95℃,30秒进行Platinum Taq激活。这一实验的结果显示,在1秒的变性到10秒的变性中基因都没有明显丢失敏感性。其次,结合15秒的变性,在40个循环中比较64℃时3,5,7,10,13,15和30秒的扩展来使扩展步骤最佳化。在95℃,30秒进行Platinum Taq激活。
这一实验的结果显示,对于GUS,在30秒到3秒的扩展中约1个半循环丢失的敏感性最小。对于CEA,30秒到3秒的扩展步骤中没有看到明显的敏感性的丢失。
其次,通过比较1/3的第二个PCR和2/15地第二个的PCR的40个循环来评估改变变性/扩展时间的结合效果,结果显示对于GUS和CEA各丢连续2.2和1.1个循环的敏感性。2/15的第二个PCR需要22分钟,而1/3的第二个PCR需要16分钟,这一不明显的敏感性的丢失是值得将反应时间切掉6分钟。
在试图降低变性到扩展的斜面时间中,评估了从95℃到90℃到85℃地降低变性温度的效果。对于GUS,当变性在95℃或85℃进行时没有明显的敏感性的丢失。对于CEA,当变性在85℃进行时是不能反应的,但在95℃到90℃进行是没有看到明显的敏感性的丢失。进行90℃对95℃的变性得到的时间量在40个循环中约是1.5分钟。
对Taq激活时间进行评估,每个基因的敏感性在Taq激活从30秒降低到10秒时没有发现明显的丢失。
在将PCR条件最佳化后,将逆转录酶反应最佳化。在总体积15ul中进行逆转录酶反应。在完成反应后,混合物保持在70℃,在这时,加入PCR成分(总体积,10ul)。比较2,3,5,7和10分钟的逆转录酶反应时间。将逆转录酶反应结合PCR条件,包括对两个基因的40个循环都是1秒95℃变性,和5秒64℃扩展。
这些逆转录酶反应时间的实验的结果显示,从10分钟的逆转录酶反应到2分钟的逆转录酶反应,对于GUS,1.1个循环和对于CEA,1.81个循环有敏感性的丢失。其次,通过比较如下的RT-PCR条件,评估降低RT-PCR时间对实验的敏感性的总效果1)一个“金标准”,10分钟的逆转录酶反应,接着10秒的变性和15秒的扩展,40个循环,总的进行时间是38分钟,2)5分钟的逆转录酶反应,接着最佳化的PCR条件,即1秒的变性和5秒的扩展,40个循环,总的进行时间是20分钟,3)2分钟的逆转录酶反应,接着最佳化的PCR条件,即总的进行时间17分钟,和4)一个“快”的RT-PCR,2分钟的逆转录酶反应,接着1秒的变性和3秒的扩展,40个循环。总的进行时间是15分钟。对于GUS,“金标准”RT-PCR具有Ct(达到预定的阈值,参考的荧光水平需要的循环数),25.88±0.78而2分钟的逆转录酶反应,最佳化的PCR条件是具有的Ct是29.42±0.7,表现出总的循环有3.54的差异。对于CEA,“金标准”RT-PCR具有的Ct是29.94±2.2,而2分钟的RT,最佳化的PCR条件中Ct是34.92±0.5,表现出总的循环有4.95的差异。
在增加更短的方案中的敏感性的试图中,评估了增加Gus和CEA的引物浓度的效果。重复如上所述的实验,其中RT引物的浓度从60nM增加到100nM和F/R PCR引物的浓度从400nM增加到800nM。这一实验的结果显示对于CEA,金标准对2分钟的最佳方案有2.3个循环的差异(4.98是低的引物浓度),对于Gus是1.63(3.54是低的引物浓度)的循环差异。这一敏感性的小小的丢失可以认为,总的RT-PCR时间是从38分钟降低到17分钟。
利用最佳的条件,即1秒变性和6秒扩展,40个循环,对新鲜的淋巴结cDNA的稀释系列进行CEA的PCR效率的评估。这一实验的相关系数是0.9974,显示了良好的再生性。PCR效率可以如下计算E=10(1/-s)-1,其中S等于模板的系列稀释的标准曲线的斜率,Ct是针对对数DNA浓度划的。所以,这一实验的PCR效率是96.7%。
其次,利用2分钟的逆转录酶反应接着40个循环的最佳条件的PCR来评估实验的RT-PCR效率。将新鲜淋巴结RNA的2X稀释系列制备成400ng的脾RNA。进行CEA和GUS的RT-PCR。平均GUS Ct是28.39±1.36。这一实验的效率大于100%。利用Superscript II和Sensiscript而不只是Sensiscript进行相同的实验。这一实验的效率接近100%。
实施例3 快速ORT-PCR多量实验目前,Smart Cycler能够进行4色荧光检测,所以允许多重的QRT-PCR反应。一个目的是重复RT-PCR的内部对照,一个内源的参考基因对照来校准RNA输入,并且靶基因(例如CEA)都在一个试管中。在适中的CEA mRNA水平时最初的重复β-GUS和CEA的实验很好,但当CEA存在的水平非常低是却不能进行。所以,这一反应的敏感性对于未转移的检测是不适当的。克服这一问题是一个方法是限制用于内源对照基因的PCR引物的量。在理论上,这允许了稀少的CEA mRNA种类能够更有效地竞争PCR试剂,特别是在后来的循环中。用β-GUS或第二个内源对照基因(18s核糖体RNA)来做都不能得到适当的敏感度。
有人假设,当在两个PCR反应之间竞争是最关键时,问题存在于最初的循环中。为了克服这一点,但仍然在一个试管中进行实验而没有特别的操作,必须再设计18s r RNA(和β-GUS)内源对照引物,使退火温度在CEA引物(所有用于本文所述的QRT-PCR反应的引物列在下面的表1)以下10℃。然后,在2个20循环的步骤中进行PCR,首先退火/延长温度64℃,第二退火/扩展温度53℃。多重的反应的试剂浓度是与用于单个的反应的相同的,但修改如下。靶基因引物浓度是400nM,而内源对照的浓度是100nM,逆转录酶浓度是各60nM,循环条件的修改如前面所述。理论上,18s rRNA引物将不能在第一个20循环中起作用,CEA扩增不能在没有竞争时进行。在第二个20循环中,CEA PCR产物已经提升到它能够有效地竞争18S rRNA PCR的点。这一实验的结果表示在图4中。组A和C表示了当利用最佳条件在单倍中进行时18s rRNA和CEA各自的结果。组B和D表示了多重的18s rRNA和CEA。注意,当这些反应在同一试管中重复时,荧光染料不同时,软件不能使两种染料在同一图上划出。在单倍的反应中,在10个循环中18SrRNA跨过30个荧光单位阈值(组A)。利用新的PCR引物,和修改的方案,18S rRNA PCR反应没有跨过阈值直到26个循环(组B),6个循环是在退火/扩展温度下降到53℃后的。这一反应可期望在30个循环(20+10)时跨过阈值,所以,似乎有一些18S rRNA PCR扩增是在开始的20个循环时发生的,甚至是64℃的情况中。在CEA反应中,单倍反应在33.5个循环时达到阈值(组C),而多倍的CEA在34.5个循环时达到阈值。所以,在这一反应中只有丢失一个循环的敏感度。
表1
注意,设计上面所述的CEA引物是要增加跨越到CEA mRNA的外显子6和7之间的接合处。引物也扩增跨越CEA mRNA的外显子2-3之间的接合处的序列。选择这一引物套以便产生对一些过去所述的引物套的更高的敏感性。在CEA引物的5’或3’末端加入一个或几个CEA序列的侧接核苷酸(图5,GenBank登记号,XM 012777)将令人满意地影响上面所述的实验,除非引物套的Tm有预期的变化。可以从相同的普通区(外显子2-3和6-7接合处)选择其他CEA特异引物,使选择上面所述的CEA正向和反向引物有和上面所述的CEA引物相同或相似的效果。优选地,任何选择的引物套将产生少于100个碱基的扩增子,这增加了进行快速QRT-PCR实验的能力。
实施例4 在结阴性食管癌患者中定量逆转录聚合酶链式反应的预后价值引言食管的腺癌正在以超过任何其他固体肿瘤的吃惊的速度在增加。有50%的患者有已发展的疾病,其中10到13%可生存5年。正如其他肿瘤类型,淋巴结包括在内的组织学证据正很大程度上预测食管癌患者的生存。虽然现有的淋巴结时期性组织学方法提供了可靠的关于患者群体的信息,他们还不能预测群体中个别患者最后结果。例如,30-50%的组织学结阴性食管癌患者在5年内有疾病再发生,尽管已经进行了治愈性的切除。存在偶然的有最初的治疗失败的情况的人体是由于肿瘤微转移的速度没有倍常规组织学评估所检测的。所以,显然需要更敏感的对淋巴结微转移酶的检测,允许更个别化的预后和为食管癌患者设计的治疗。
现有的淋巴结评估的主要问题是取样误差,和检测个别的肿瘤细胞或小的病灶的敏感性小。组织学检测只取非常小百分比额淋巴结的样品,已有计算,病理学家检测到三个肿瘤细胞直径的微转移病灶的机率只有1%。当结合系列的切片时,肿瘤标记的免疫组织化学染色提高了微转移检测的敏感度,降低了取样的误差,导致了明显数目的患者的出现。这一技术已经用于食管癌症中,17%的组织学阴性结发现含有微转移疾病。在这个报告中,IHC3阳性淋巴结与疾病的再发生相关,但这些发现在后来的研究中被提出了问题,其中IHC不具有任何预后价值。其他研究已经利用了分子方法如RT-PCR检测微转移酶。RT-PCR能够检测肿瘤标记如各种组织包括无组织癌症的血液,骨髓,和淋巴结中的CEA,细胞角蛋白19,细胞角蛋白20和其他的mRNA。在食管癌中,RT-PCR已经用于几个小系列的患者,但RT-PCR阳性结的临床意义没有显示,因为小的临床跟踪已经有报道。在其他肿瘤类型中,研究已经显示,RT-PCR能提高敏感性,但在没有癌症的患者的对照淋巴结中的特异性小和假阳性结果已经使这一信息的临床应用变得困难。假阳性至少部分上是由于前面所述的异位基因表达,导致所有组织类型中的大多数基因的表达的背景水平非常低。所以,虽然前面的研究已经利用了定性的,基于凝胶的RT-PCR方法,这一简单的正/负方法在检测肿瘤标记时是否总是可靠的微转移酶的信号还不明显。在引入的荧光5’核酸酶实验后,QRT-PCR现在是一个相当简单的技术。所以,假设,定量分析在基于凝胶的RT-PCR基础上提供了明显的优点,并且将允许组织学结阴性的食管癌患者中准确地预测疾病的再发生。现有的目的有3个a)确定QRT-PCR准确区别淋巴结的CEA背景基因表达和诊断真正的微转移的临床相关水平;b)利用实时QRT-PCR分析来自30个结阴性的食管癌患者的淋巴结,并且将结果与疾病的再发生相关;和c)比较QRT-PCR与相同样品上的标准的基于凝胶的RT-PCR。发现,QRT-PCR可以容易地区别背景表达和真正的转移疾病,QRT-PCR对于检测结阴性的食管癌患者中的疾病的再发生的是敏感的和特异的,并且QRT-PCR具有比基于凝胶的RT-PCR更大的特异性。从这些结果,可以相信,定量的方法报道的所有的问题,已经阻止RT-PCR成为微转移疾病的有用的临床测试方法。
材料和方法患者研究了来自进行了组织学淋巴结阴性食管癌治愈性切除的30个患者的含有387个淋巴结的140个石蜡块的组织。在1991到1998年Pittsburgh大学的药学中心的胸外科部进行了所有的外科手术。从医学记录综述,和与最初的护理人员的个人联系和死亡证书中得到了病毒状态和再发生的信息。到2001年8月证实了所有患者的跟踪数据。生存患者的平均跟踪时间是49个月(范围,28-91个月)。收集了人口统计和临床特征(表2)。得到了10个初级肿瘤(8个腺癌和2个扁平细胞癌)和4个组织学阳性淋巴结的组织快作为阳性对照。从进行与癌症不相关的原因进行食管外科手术(疝修复和抗回流方法)并且淋巴结附带移除的患者得到阴性对照(良性)淋巴结。
表2研究群体的临床特征QRT-PCR结果
*四个接受化学治疗的患者在外科手术时没有肿瘤。
组织和RNA分离用于该研究的所有组织是从病理组织库中得到的甲醛固定的,石蜡包埋的档案中的样本。同样重新得到每个组织块的H&E染色的玻片,检测证实原始结阴性的诊断。在切片机上安放组织块,切5-155.0cm的切片,放置于2.0ml的无Rnase的试管中。在同时,切2个5.0uM的切片(第一个和最后一切),安放在显微镜玻片上,用抗CEA抗体进行免疫组织化学染色。利用前面所述的方法分离RNA(Godfrey,T.E.,Kim,S.-H.,Chavira,M.,Ruff,D.W.,Warren,R.S.,Gray,J.W.,and vJensen,R.H.从甲醛固定的,石蜡包埋的组织,利用5’核酸酶定量RT-PCR进行定量的mRNA表达分析,J.Mol.Diagn.,284-91,2000),储存在RNA安全的再悬浮溶液中(Ambion,Austin,TX)。RNA是用无DNA的试剂盒(Ambion)进行Dnase处理,并且进行色谱定量。
QRT-PCR利用5’核酸酶实验和Applied Biosystems 7700序列检测仪器(TaqMan)进行QRT-PCR。利用前面所述的比较CT方法,测量相对于内源的对照基因,β-Gus,的CEA表达(Godfrey,T.E.,Kim,S.-H.,Chavira,M.,Ruff,D.W.,Warren,R.S.,Gray,J.W.,and Jensen,R.H.利用5’核酸酶定量RT-PCR对来自甲醛固定的,石蜡包埋的组织进行定量的mRNA表达分析。J.Mol.Diagn.,284-91,2000.;Tassone,F.,Hagerman,R.J.,Taylor,A.K.,Gane,LW.,Godfrey,T.E.,and Hagerman,P.J.在携带者男性中FMR1mRNA的水平提高在脆弱-X综合症中包括的新机制.Am.J.Hum.Genet.,666-15,2000)。在力加入两个RNA,400和100ng时进行QRT-PCR实验,设置各个浓度的双倍反应。所以,报道的CEA表达水平是四个独立的QRT-PCR反应的平均值。利用400ngRNA但删除了逆转录酶,对所有样品进行RT-阴性对照的实验。对各个PCR平板也进行模板阴性对照的实验。对所有平板平行扩增校准RNA样品,允许比较不同时间进行的样品实验(Godfrey,T.E.,Kim,S.-H.,Chavira,M.,Ruff,D.W.,Warren,R.S.,Gray,J.W.,and Jensen,R.H.利用5’核酸酶定量RT-PCR从甲醛固定的,石蜡包埋的组织进行定量的mRNA表达分析。J.Mol.Diagn.,284-91,2000.;PE Applied Biosystems user bulletin#2.相对定量ofgene表达,Perkin-Elimer,Corp.,Norwalk,CT,1997.)。
为了最大的敏感性和为了消除交叉污染的危险,利用了前面所述的一个试管的QRT-PCR方法(Raja,S.,Luketich,J.D.,Ruff,D.W.,Kelly,LA.,and Godfrey,T.E.一个步骤的定量RT-PCR的敏感性增加的方法。Biotechiques,29702-705,2000)。在这一方法中,利用蜡层物理分离逆转录反应混合物(RT)和PCR引物导致更特异的和更敏感的RT-PCR。在PCR平板中滴PCR引物,体积10ul。然后,在各个孔中放置一个Ampliwax PCR gem 50(AppliedBiosystems),将平板加热到80℃2分钟,冷却到4℃产生蜡屏障。然后,在每个孔中滴40ul的上层。反应成分的最后浓度如下1XPCR缓冲液A,300nM各个脱氧核苷酸三磷酸,3.5mM MgCl2,0.4单位/ulRnase抑制剂,1.25单位/ul的Superscript II逆转录酶(Life Technologies,Inc.Gaithersburg,MD),0.06单位/ul AmplitaqGold(Applied Biosystems),20nM逆转录酶引物,200nM各个PCR引物,200nM的探针(β-gus引物,和探针是100nM),和100或400ng总RNA。利用的寡聚核苷酸序列表示在表3。在ABI 7700进行所有的RT-PCR反应,热循环仪的条件如下48℃保持40分钟,95℃保持12分钟,接着45个循环的95℃15秒,64℃(β-gus60℃)1分钟。利用序列检测软件(Applied Biosystems)分析数据,对于CEA阈值设定在0.03,对于β-gus设定在0.045。
表3对CEA和Gus RT-PCR利用寡聚核苷酸序列
*Taq Man探针是用5’6-羧基荧光素和3’6-羧基四甲基罗丹明基于凝胶的RT-PCR分析为了避免PCR产物污染的可能性,不打开储存进行QRT-PCR反应的所有PCR平板直到定量分析完成。然后,在4%的琼脂糖凝胶上分开两个400ng的RNA加入的反应和400ng No-RT对照的PCR产物,用溴化乙锭染色,在凝胶文档系统中观察。如果在两个双倍的反应但不是在No-RT对照中观察到准确大小的带,可以将患者鉴定成RT-PCR阳性。
统计分析用Mann-Whitney U实验进行对照组织样品中CEA水平的比较(图6)。对于来自食管癌症患者的病理阴性的淋巴结,最初的终点是从外科手术时间到诊断再发生或跟踪的最后日期测量到的疾病的再发生。利用来自各个患者的组织块的最高CEA水平构建利用再发生作为金标准的ROC曲线。鉴定CEA表达水平截止值产生最准确的鉴定,该水平用于鉴定患者是否为再发生危险的QRT-PCR阳性或阴性。因为第二系列的患者对于截止的前景无效性是不可得的,可以通过交叉无效性来统计评估截止选择方法,并且通过鞋襻计算ROC曲线统计的SD(Davison,A.C.,andHinkley,D.V.鞋襻方法和它们的应用,Cambridge,英国剑桥大学出版社,1997)。对临床和病理因子包括标准RT-PCR和QRT-PCR结果划出Kaplan-Meier无疾病和整个生存曲线。无疾病生存的分析是通过log-rank实验来进行的,通过构建Cox成比例的危险模型进行多变量的分析。预测者的列表中包括了类目因素性别,肿瘤病理,RT-PCR和QRT-PCR的鉴定,预操作的化学治疗和/或放射治疗,和病理T时期,以及CEA表达水平的定量因素,年龄,从检测种除去的结的数目。所有模型之间的比较是基于嵌套的模型的可能性比例实验之间的差异的。比例假设的适当性的检测有两个方法在对数时间划对数累积的危险曲线,和划Schoenfeld残余,并且估计回归系数和时间之间的相关性。
结果-结阴性患者的特征TNM鉴定有结阴性食管癌的30个患者包括T1N0M0(n=10),T2N0M0(n=5),和T3N0M0(n=10)。有活体检查诊断癌症的一个患者没有再切除样本癌症的证据,接受新辅助治疗的四个患者在切除时间没有可检测肿瘤残余。最初的肿瘤的定位包括25个较低的第三个,5个中间的,和0个上面的食管位点。有26个腺的和4个扁平细胞癌。有22个男性和8个女性,诊断的患者的中间年龄是70岁。30个患者中17个已经死亡,10个由于癌症,7个由于其他原因对于生存的患者,跟踪的平均时间是49个月(范围,28-91个月)。整个生存患者的平均时间是36个月。患者特征的完全分类提供在下面的表4中。
定量分析CEA表达从三个与结阴性的研究组不同的来源分离和分析RNA,包括初级的食管肿瘤,转移酶组织学阳性的淋巴结(N1),和来自没有癌症的患者的良性淋巴结。在所有的肿瘤,和N1结和50%的良性淋巴结中检测CEA的表达(图6)。来源Mann-Whitney U实验进行个别的,成对的比较,在肿瘤和N1结中的表达水平分析是明显比在良性淋巴结中的更高(各为p=0.002,和0.0021)。肿瘤样品中的CEA表达稍微比N1淋巴结中高,但统计学上不明显(p=0.171)。
分析来自该研究组的组织学阴性(N0)淋巴结证明了有大范围的CEA表达。表达的范围从检测不到到一个结的CEA表达相当于组织学阳性的淋巴结中看到的。利用EOC曲线分析来分析来自每个患者的最高表达的结的数据和疾病的再发生信息。从这一分析,确定最准确预测的再发生的表达水平截止(图7)。在ROC曲线下的面积是0.88,95%的置信度为0.71到0.97,表明鉴定准确率明显比单个的机会好。在分析的140个组织块中,12个(9%)具有截止点以上的CEA表达水平,总共11个患者(34%)具有表达水平在截止以上的一个或多个块。这11个患者鉴定为具有隐藏的微转移酶的QRT-PCR证据。来自所有除了一个(患者第28)“最阳性”组织块的切片是用抗CEA的抗体没有组织化学染色阴性的。
CEA表达的基于凝胶的分析利用基于凝胶的实验,总共有25个(18%)的组织块是CEA表达阳性的,15个(50%)的患者至少在这一分析中有一个阳性块。在来自良性紊乱的患者的10个淋巴结的2个中,基于凝胶的实验中存在CEA PCR产物。定量的和基于凝胶的实验的比较显示,所有凝胶上的阳性样品在TaqMan实验中得到信号。
隐藏的转移酶和再发生在研究的30个患者中,10个有疾病再发生,在研究结束是死亡。其余20个患者中,7个死于其他原因,13个仍然活着,没有再发生的证据。一个患者有早期的联结再发生,可以用光动力治疗和放射治疗来治疗。这一患者是后来诊断的,有并且死于小细胞肺癌。利用最准确的定量实验的截止,总共11个患者鉴定为QRT-PCR阳性,9个有再发生。同样这9个患者利用基于凝胶的实验鉴定为RT-PCR阳性,其他6个患者没有再发生。利用QRT-PCR实验预测疾病再发生的敏感性和特异性是90和90%,阳性预测值是82%。利用基于凝胶的实验,敏感性和特异性是90和70%,阳性预测值是60%。图8显示了RT-PCR(A)和QRT-PCR(C)股鉴定为无疾病生存的患者完全生存(B和D)。当利用各个实验死,RT-PCR阴性的无疾病生存的患者是94%。通过各个方法,阳性特征的患者的预后更少。Log-rank实验表明,QRT-PCR(0001)和基于凝胶的RT-PCR(p=0038)在结阴性食管癌患者中明显预测了再发生。在QRT-PCR-或RT-PCR阳性患者中完全生存也更糟(P=0.0006和0.106)。
除了QRT-PCR和RT-PCR,在这一股中唯一发现能预测疾病再发生的其他临床,病理或治疗因素是病理T时期(log-rank实验,P=0.0777),和预操作化学治疗和/或放射性治疗(log rank实验,P=0.0307)。在多变量分析中,来自Cox回归模型的可能的比例统计显示,与病理T时期和与操作化学治疗或放射性治疗相比,CEA作为二元可变的,QRT-PCR阳性或阴性的特征是再发生明显的不起独立的预测指示。
讨论在许多固体肿瘤中,淋巴结的参与是最强的预后因素,在最近的文献中,检测淋巴结微转移酶已经受到了关注。现有的淋巴结评估包括显微镜检测H&E染色的组织切片,并且受到两个主要的限制(a)单个肿瘤细胞或小的细胞病灶是容易错过的;和(b)只研究一个或两个组织切片,所有每个结的大部分仍然没检测。系列切片可以克服组织的取样误差,IHC可以鉴定各个肿瘤细胞。但是,结合这些方法对于常规分析太耗价耗时,并且是局限于特别的情况如岗哨淋巴结的检测。RT-PCR克服了取样误差的问题,因为可以分析更大量的组织,并且有几个报告表明,RT-PCR能比IHC鉴定更多阳性的淋巴结。这也是目前的研究中的情况,而IHC分析中只有一个QRT-PCR阳性淋巴结块是阳性的。
最近的研究也显示,非-QRT-PCR阳性率与疾病再发生相关,但在这些研究中报道的特异性是低的。在Liefers et al.的一个研究中(13.Liefers,G.J.,Cleton-Jansen,A.M.,van de Velde,C.J.,Hermans,J.,van Krieken,J.H.,Cornelisse,C.J.,and Tollenaar,R.A.在第二时期的结肠癌中的微转移酶和生存[参见评论].N.Engl.J.Med.,339223-228,1998.),26个组织学N0直肠癌患者在利用RT-PCR检测时14个有微转移疾病的证据,其余12个是RT-PCR阴性。在12个RT-PCR N0患者中,只有1个在6年的跟踪期中有再发生,而14个RT-PCR N1患者中有7个再发生。所以,利用再发生作为终点,这一研究达到了88%的敏感性。但是,特异性只有61%,因为RT-PCR阳性结的7个患者没有再发生。其他研究已经显示,在黑素瘤患者中有相似的第特异性的非QRT-PCR。Shivers et al.(Shivers,S.C.,Wang,X.,Li,W.,Joseph,E.,Messina,J.,Glass,L.F.,DeConti,R.,Cruse,C.W.,Berman,C.,Fenske,N.A.,Lyman,G.H.,and Reintagen,D.S.恶性黑素瘤的分子时期有临床结果的相关性。JAMA,2801410-1415,1998)获得了86%的敏感性和51%的特异性,Bostick et al.(Bostick,P.J.,Morton,D.L.,Turner,R.R.,Huynh,K.T.,Wang,H.J.,Elashoff,R.,Essner,R.,and Hoon,D.S.在早期的黑素瘤患者中通过岗哨lymphadenectomy和逆转录酶聚合酶链式反应检测检测隐藏转移酶的预后明显性。J.Clin.Oncol.,173238-3244,1999)报道了100%的敏感性和67%的特异性。这一低特异性以及不能准确控制inter-run可变性已经限制了RT-PCR在临床上的潜力。
在本研究中,评估了在组织学N0食管癌患者的淋巴结中利用TaqMan RT-PCR定量测试CEA表达和检测隐藏的微转移酶。这一定量分析导致了确定临床相关的CEA表达水平截止和克服了与背景或其他报道的异位的CEA表达相关的问题。利用这一途径,30个患者中11个鉴定为QRT-PCR阳性,9个有疾病再发生。19个患者中只有一个是QRT-PCR阴性的,在这一研究过程中有再发生。有趣的是,在没有再发生的20个患者中,11个具有比对照淋巴结(比背景水平高)中看到的更高的可检测CEA表达,两个是在截止水平以上,预测了疾病有再发生。在一些情况中,这可以指示存在有限的结节疾病,可以通过外科治愈,因为甚至pN1患者也可以有约20%预期有5年的生存期。在其余的样品中的CEA表达可能是不能生存并且可能进行细胞程序死亡的的个别弥散性肿瘤细胞,作为初级位点的肿瘤细胞程序死亡的结果的淋巴系统中的无细胞RNA或外科手术无意中介入的污染细胞的结果。
与QRT-PCR阳性患者比较,在QRT-PCR阴性患者中无疾病生存和完全生存明显更高。另外,在QRT-PCR阳性组中无疾病生存在3年中只有27%,表明微转移疾病可能与组织学N1疾病在临床上一样明显。除了一个患者,每个患者只鉴定出一个阳性组织块,表明疾病扩散有限。所有阳性淋巴结是区域性的,并且所以是N1状态状态而不是M1a,如腹腔或颈淋巴结参与所确定的。在这些组织学N0患者中包括有限的结节强调了,需要在分时期的方法中,从不同的结节位置取适当的淋巴结。
虽然过去,有结阴性疾病的患者已经相当少,但是食管癌的戏剧性增多已经导致产生了正在更快地鉴定有早期疾病的患者的监视方法。所以,这些患者的准确的分时期方法变得更重要。本文的定量数据与相同样品的基于凝胶的分析的比较显示,QRT-PCR在保持同样高的敏感性下提高了实验的特异性。QRT-PCR也给出了目的性结果,这些结果是经得起自动的,无手分析的检验的,其PCR产物交叉污染的危险最小。如果QRT-PCR变成常规的临床测试方法,这样的自动化是必须的。
另外,定量方法允许利用严格的控制来证明测试方法一次次的准确率和可依赖性。例如,在所述的实验中,在所有PCR平板上跑校准样品校准每天的变化率。利用这一方法,再生产力实验表明,测量方法的95%的置信度限制是0.511个循环(数据没有表示)。如果RT-PCR是用于临床的,准确评估定量测试方法的再生性的能力是必须的。在基于凝胶的测试中,这一水平的测试证实是达不到的。已知,通过QRT-PCR确定的CEA水平来鉴定患者的预测能力是最佳的,因为截止值是在同一患者中评估的。似乎如果最准确的截止的相同方法应用于第二套患者中,鉴定将不太成功。这时,将通过交叉证实来进行敏感性,特异性,和鉴定准确率的再分析(n=10000)。特异性的交叉证实估计值是0.82,准确率是0.82(与在原始样品中0.90和0.90比较)。所以,原始样品的鉴定成功是稍微夸大了,但甚至在与这一最佳化相关后,QRT-PCR来鉴定仍然比基于凝胶的测试有改良。
结论是,这些数据证明,QRT-PCR可以在高特异性下检测食管癌患者的组织学阴性淋巴结中的微转移疾病。同样也已经显示,微转移疾病的存在是癌症再发生的强而独立的预示,并且其定量是超过标准RT-PCR测试的。定量的RT-PCR应该能够鉴定哪个有早期食管癌的患者是有高的再发生危险的,和哪个可能受益于其他治疗。最后,这一定量途径应该在其他肿瘤类型中产生相同的优点。
表4个别患者的生存和RT-PCR数据
aNED,没有疾病证据b有扁平细胞癌的患者c在化学治疗后没有残留肿瘤的患者d在生物活体检测样本中有癌症,但在切除后没有癌症的患者实施例5 手术内定量RT-PCR检测有食管癌的患者中的结转移引言食管癌和其他恶性肿瘤的外科切除经常是基于手术内的淋巴结的冷冻切片分析的。有食管癌的患者的5年的生存仍然很少,只有5-10%,因为许多患者在开始出现时疾病就发展了。但是如果位置和区域淋巴结是组织学阴性的,5年的生存就有很大的提高。然而,30-50%的组织学结阴性患者有疾病的再发生。这最可能是由于检测微转移酶中现有的分时期技术的限制。作为结果,其他技术如免疫组织化学或逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)已经用于检测组织隐藏微转移酶的尝试中。
对食管,结肠,黑素瘤和胸癌的研究已经显示,RT-PCR可以检测组织学隐藏的微转移酶,并且可以预测再发生。但是,这些数据已经被批评,因为在对照样品中有假阳性结果,并且RT-PCR随后的特异性低,和有阳性预测值。已经显示,定量RT-PCR(QRT-PCR)允许将背景,异位的基因表达与真正的微转移酶区别,并且所以可以避免假阳性,和提高预测疾病再发生的特异性。另一个目的是能够在重要的外科切除手术内进行时提供外科大夫这一关键的信息。
在这一实施例中所述的是可以在不到30分钟内进行的特别快速的QRT-PCR实验的发展和操作。为了使这一快速测试方法合法化,将它与标准的QRT-PCR和有食管癌的患者中的临床结果比较。
材料和方法患者追溯以往的分析,从进行治愈性切除组织学淋巴结阴性食管癌的30个患者(表6)研究淋巴结。所有外科手术是在1991年到1998年在Pittsburgh大学医学中心的胸外科分部进行的。从医护记录中得到临床的跟踪记录,并且如2001年8月证实是对所有患者的。所有患者的医学临床跟踪时间是36个月,对生存患者是49个月(范围18-91月)。
表6研究群体的临床特征
*4接受化学治疗的患者在外科手术时间没有肿瘤+1在生物活体检查有但切除后没有癌症的患者为了进行前景分析,从1999到2000年在Pittsburgh医学中心的胸外科进行鉴定的食管癌分时期或切除的12个患者中得到淋巴结样品(表7)。从进行抗回流过程的腹外科手术的患者偶然得到没有癌症的患者的对照结。在切除时,为了分析,将每个淋巴结的一半冷冻在液氮中,其余送去做常规病理分析。在我们研究所,切除的组织是常规临床过程的一部分,不起没有其他组织除去是用于任何纯粹的研究目的。在Pittsburgh大学,所有组织收集是作为正在进行的,IRB同意的,食管癌危险登记方案的一部分。
表7在新鲜的冷冻淋巴结上进行的快速QRT-PCR研究中的患者的肿瘤时期和组织学
组织和RNA分离用于后前景研究的所有组织是用甲醛固定,石蜡包埋的档案中的样本,是从病理组织库中得到的。每个组织块也得到了苏木精和曙红染色的玻片,检查证明了原始的结阴性诊断。组织块被安放在切片机上,切5到15,5.oum的切片,放置于2.0ml的无RNA酶的试管中。同时,切2,5.0uM的切片(第一和最后的切片),放置于显微镜的玻片上,进行H & E染色,以及用抗CEA的抗体进行免疫组织化学染色。利用前面所述的方法分离RNA(GodfreyTE,Kim S-H,Chavira M,Ruff DW,Warren RS,Gray JW et a1.,从甲醛固定的,石蜡包埋的组织,利用5’核酸酶定量RT-PCR进行定量mRNA表达分析。Journal of Molecular Diagnostics 2000;2(2)84-91.)和进行光谱定量。
在OCT化合物中包埋新鲜的冷冻的淋巴结组织,切10-15,4.0uM的切片。同时,切2,4.0uM的切片(第一和最后的切片),安放于显微镜的玻片上进行H&E染色。其余的切片安放在1.5ml的无RNA酶的试管中,试管中有来自Rneasy Mini试剂盒的溶解缓冲液(Qiagen,Valencia,CA)。利用有下面的修改处的制造商推荐的方案萃取RNA。将离心时间超过1分钟降低到1分钟,在60ul的RNA安全再悬浮溶液(Ambion,Austin,TX)中再构成RNA。虽然大多数样品是一起加工的,有5个样品分别加工,以确定每个样品的平均萃取时间。为了质量控制,光谱确定RNA的产量和纯度。
定量逆转录PCR利用5’核酸酶实验进行QRT-PCR。在Cepheid SmartCycler(CSC)上实时扩增和利用如下所述的检测系统进行快速QRT-PCR。在Applied Biosystems 7700序列检测仪器(TaqMan)上,利用如本文所述的一个试管的QRT-PCR方法进行标准的QRT-PCR。
快速QRT-PCR利用前面所述的比较CT方法测量与内源控制基因,β-葡糖醛酸酶(β-GUS)相关的CEA表达(Godfrey TE,Kim S-H,Chavira M,Ruff D W,Warren RS,Gray JW et al.从甲醛固定的,石蜡包埋的组织,利用5‘核酸酶定量RT-PCR进行定量的mRNA表达分析,Journal of Molecular Diagnostics 2000;2(2)84-91.;Tassone F,Hagerman RJ,Taylor AK,Gane LW,Godfrey TE,Hagerman PJ,在携带者男性中FMR1 mRNA的水平升高包括在fragile-X综合症中的新机制,Am.J.Hum.Genet.2000;66(1)6-15.)。对三份400ng的总RNA进行QRT-PCR实验。设计CEA和β-GUS PCR引物,但不扩增基因组DNA。但是,仍然利用RNA进行对照反应,但没有逆转录(No-RT对照),并且水(没有模板对照)替代了cDNA作为PCR模板。这些对照反应一起排除了信号是从RNA的基因DNA污染或试剂的PCR产物污染中产生的可能性。另外,在所有实验中平行扩增了校准RNA样品,允许比较不同时间的样品实验(Godfrey et al.(2000);PE Applied Biosystems使用手册#2。ABI Prism 7700序列检测系统基因表达的相对定量。1997.Norwalk,CT,Perkin Elmer Corp.),并且确定了实验的再生性。
反应成分的最后浓度如下1xPCR Platinum Taq缓冲液,300nM各dNTP,4.5mMMgCl2,0.8U/ul Rnase抑制剂,1.25U/ulSensiscript逆转录酶(Qiagen,Valencia,CA),0.06U/ulPlatinum Taq(Gibco,Gaithersburg,MD),60nM RT引物,400nM各个PCR引物,200nM探针和400ng总RNA。新鲜组织分析加入的总RNA是5ul的样品。对于固定的组织分析,利用了5ul的80ng/ul的RNA贮备液的稀释液。在快速的实验中,进行RT反应,其中没有PCR引物或探针,然后,打开试管,加入引物和探针。这是必须的,引物标准的一步QRT-PCR缺乏检测稀少信息的敏感度。利用的寡聚核苷酸序列如下β-GUS RT引物5’TGG TTG TCT CTG CCG A3’(SEQ ID NO15),β-GUS正向PCR引物,5’CTC ATT TGG AAT TTT GCC GAT T3’(SEQ IDNO3),β-GUS反向引物5’CCG AGT GAA GAT CCC CTT TTT A3’(SEQ ID NO4),β-GUS探针5’-Vic TGA ACA GTC ACC GACGAG AGT GCT GG3’(SEQ ID NO5),CEA RT引物5’GTG AAGGCC ACA GCA T3’(SEQ ID NO9),CEA正向PCR引物5’AGACAA TCA CAG TCT CTG CGG A3’(SEQ ID NO6),CEA反向PCR引物5’ATC CTT GTC GTC CAC GGG TT 3’(SEQ ID NO6),CEA反向PCR引物5’ATC CTT GTC CTC CAC GGG TT3’(SEQID NO7)和CEA探针5’-Fam CAA GCC CTC CAT CTC CAGCAA CAA CT3’(SEQ ID NO8)。在CSC上进行快速QRT-PCR反应,热循环条件如下48℃持续5分钟,70℃持续60秒(加入PCR引物和探针,95℃持续30秒(Platinum Taq激活),接着45个循环的,95℃2秒,64℃15秒。用Smartcycler软件分析(1.o版),利用第二个派生方法分析数据,确定阈值。对于固定的组织分析,需要30分钟的RT反应,因为在固定的组织的RNA样品中与内在的降解相关的敏感度降低。
统计分析通过无疾病生存的成比例的危险回归评估快速QRT-PCR确定CEA表达水平的预测的真实性。从外科手术时间到诊断食管癌再发生的时间确定无疾病生存。2001年8月1日审查了由于其他原因的死亡和活着没有疾病的患者。CEA表达水平也用于鉴定QRT-PCR阳性或阴性的患者。ROC曲线分析鉴定的截止水平(DeLong ER,Delong DM,Clarke-Pearson DL.比较在两个或多个相关的接受者手术特征曲线下的面积非参数途径。Biometrics1988;44(3)837-845;Heagerty PJ,Lumley T,Pepe MS.审查的生存数据和一个诊断北京的依赖时间的ROC曲线。Biometrics 2000;56(2)337-344),被确定为利用疾病再发生作为标准的最准确的分类的CEA表达水平。QRT-PCR结果的敏感性和特异性是为诊断隐藏转移而计算的。用log-rank实验测试根据鉴定的方法分类为QRT-PCR阳性或阴性的患者中无疾病生存的差异。
结果归档的组织分析分析了来自有食管癌的30个患者的初级的,归档的组织学阴性(N0)淋巴结(图9)。在30个分析的组织块中,13个具有比ROC曲线确定的截止更高的CEA表达(CEA表达高于0.183)。在这一组中,9个患者有疾病的再发生,在研究结束时死亡,2个患者死于其他原因,2个活着没有疾病。在其余的17个QRT-PCR阴性患者中,1个在5个月时有疾病的再发生,在研究结束时死亡,5个死于其他原因,11个仍然活着,无疾病(表8)。利用快速QRT-PCR测试方法,预测疾病再发生的敏感性和特异性各为90%和80%,在这股中83%的患者的鉴定是准确的。图10显示了QRT-PCR阳性和阴性患者的Kaplan-Meier无疾病生存曲线。QRT-PCR阴性和阳性的患者的生存在5年中分别是94%和20%。这两个组的生存功能是明显不同的(p=0.001,log-rank实验)。
表8利用0.183的CEA表达截止的30个pN0食管癌患者的快速QRT-PCR结果。敏感性是90%(9/10)特异性是80%。
利用无疾病生存的成比例危险模型,一个单位的CEA表达的增加的相对危险(RR)是1.52(1.11-2.09,p=0.027),并且与CEA表达小于或等于0.183相比,CEA表达大于0.183的是3.78(1.34-10.7,p=0.0007)。
新鲜组织分析分析了来自进行食管癌或良性食管紊乱最小的侵入分期的患者的淋巴结的新鲜冷冻切片。在来自良性情况的11个淋巴结中,只在2个淋巴结中快速QRT-PCR检测到了非常低水平的CEA表达(患者8和11,图11)。在良性情况中,这一低水平代表了背景的异位CEA表达。在任何良性结中的CEA表达的最高水平比最低的表达的阳性结低34倍(图11),只有小的包括肿瘤的病灶。
在来自食管癌的12个患者的26个淋巴结中,12个(6个患者)最后显示最后病理是阳性的。但是,在这些淋巴结中的2个(2个患者),手术内的冷冻切片分析是阴性的,N1状态确定是操作后的。在这两个结中,快速QRT-PCR显示CEA表达水平是在组织学阳性结的范围中的(患者18和19,图11)。在有组织学结阴性食管癌的6个患者中,只有一个在快速QRT-PCR中有CEA表达提高的单一的结(患者15,图11)。这一患者在跟踪的16.5个月中食管癌有临床的再发生。
对每个实验的校准样品进行的分析发现,在13个独立的实验中,delta Ct值的标准偏差是0.14个循环(相对表达测量值的~10%标准偏差)。另外,QRT-PCR需要约25分钟进行所有40个循环实验。在RNA分离时间7分钟时,整个实验需要约30分钟。所以,这是一个非常快的可再生的实验。
讨论在许多恶性肿瘤中,如在食管癌中,TNM分期产生了最好的预后信息。没有结参与是与定位更好的病灶有关的,表明单独通过外科手术切除可以达到治愈。但是,结转移是肿瘤传播到初级肿瘤以外的位置的指示,并且需要系统治疗。虽然在食管癌中化学治疗的作用仍然是有争论的,但是一些实验已经显示了手术前的化学治疗有优势的趋势。这一途径的一个优点是有比在非常可怕的外科手术治疗后接受治疗更多的患者能够完成化学治疗方案。正在进行的有前景的,随机的临床实验应该能解决手术前的化学治疗在最近的将来的食管癌患者中的用途。随着分时期的最小侵入性外科途径的出现,在切除之前存在分时期的潜在性,并且提供适当的手术前的化学治疗。所以,在尝试治愈性切除之前准确确定结的时期在有食管癌的患者中进行切除的方法中非常重要。
目前,通过冷冻切片和H&E染色进行手术内的结分时期。当这一方法学与甲醛固定,H&E染色的组织检测的金标准至少有93%的相关性时,两个方法都是有明显限制的。具体地说,尽管潜在有治愈性切除,30-50%的组织学结阴性食管癌患者有疾病的再发生。这一发现最可能是由于取样的误差,这是常规方法所内在的问题,以及由于缺乏检测微转移的敏感性。单一的肿瘤细胞,或小的细胞病灶是容易错过的,因为只有一个或两个4uM的切片被研究,并且各个结节的大部分没有检查。系列切片淋巴结可以降低取样的误差,所以可以使这一限制性最小。例如,在对胸癌的研究中,系列切片淋巴结结合免疫组织化学导致其他常规组织病理评估中阴性的结的10-23%处于劣势。但是,由于各种情况中许多淋巴结的系列切片中包括的大量的时间和劳动,这一方法不是经常使用的。
在最后十年,在尝试提高微转移检测的敏感性中,许多研究已经利用RT-PCR检测淋巴结中与肿瘤相关的mRNA。对几个癌症类型的研究已经报道,RT-PCR是合理的预后指示,但尽管如此,RT-PCR在临床实践还没有利用。主要的原因是特异性小(40-60%),和来自没有癌症的患者的对照结的假阳性结果,并且缺乏多中心实验的标准化实验。在其他工作中,已经显示,因为背景或异位基因表达,RT-PCR(QRT-PCR)的定量途径可以克服假阳性,并且增强预测疾病再发生的特异性,Godfrey TE,Raja S,Finkelstein SD,Kelly LA,Gooding W,Luketich JD.在淋巴结阴性食管癌患者中定量RT-PCR预测疾病再发生。美国癌症研究协会2001年度会议进程,42,3-1-2001。但是,由于研究中利用的技术,RNA分离和RT-PCR测试需要4-6小时完成。结果是该方法只能在手术后使用。手术中的QRT-PCR只有如果进行得足够快,在与手术中冷冻切片分析可比较的时间框架内(约20-30分钟)产生结果才能成为事实。伴随着快速RNA分离和逆转录方案,需要非常快的PCR取样时间,如Roche Light Cycler或CepheidSmart Cycler可以达到的。由于容易使用,独立控制各个反应位点,可获得四色多重倍和自动样品制备和QRT-PCR的潜力,此处利用了Cepheid仪器(没有玻璃毛细现象)。利用这一仪器,已经显示,QRT-PCR实验可以在RNA萃取到结果的30分钟内在OCT包埋组织切片上进行。带着本文报告的方案的修改,QRT-PCR可以在18.5分钟内进行(数据未显示)。利用快速的实验,可以进行跟踪期平均36个月的患者的归当的组织的RNA回顾分析。数据显示,快速实验预测了疾病的再发生,敏感度和特异性分别为90%和80%。这一数据是可以与更慢的,和更传统的,Taq Man基础的分析比较的(90%和90%)。在新鲜的组织分析中,在30分钟内区别所有的组织阳性结和良性对照结是可能的。利用CEA表达水平,由于具有相似于良性或病理阳性结的表达方式,鉴定病理阴性结也是可能的。
从这一数据可见,似乎快速QRT-PCR至少与被固定的组织的检测一样敏感,并且比手术中的冷冻切片的检测更敏感。这一点被两个在手术中的检测过程中延迟或漏诊的阳性结证实了。为了证实这一数据,计划了更大数目的新鲜淋巴结的研究,目的是将结果与病理分期相关联。当该数据设置完成后,QRT-PCR就与再发生相关了。这将能允许在新鲜组织的数据设置中确定最佳的CEA表达截止值,因为这可能与档案中的组织的截止值不同。由于新鲜组织的数据是初步的和档案中的组织的分析中的内在的问题,特异性和阳性预测值随着新鲜组织的分析而提高是可能的。
另外,为了将手术中的QRT-PCR从手术床转移到手术床以外,发展这一技术是必须的。在临床设备中,QRT-PCR测试必须实验简单的和自动的过程,其中的手动过程必须是最少的。最后的目的是发展一个基于柱体的自动分析信息处理仪。有人预想,最终的产品将是一个单一用途的,可任意处理的能够进行RNA分离和定量RT-PCR的柱体。当与快速循环,实时定量热循环仪结合时,这一系统将在不到25分钟内从冷冻切片得到QRT-PCR结果。在发展和新的和准确的标记得到鉴定的基础上,这项技术也可以用于外科范围的分子分析以及作为细针抽吸细胞学的辅助。这样,第一次外科大夫可以在手术中得到关于微转移酶的分子信息和完成切除。另外,可以进行自动的和可再生的QRT-PCR方式允许在标准化的多中心实验中评估QRT-PCR的真正分子诊断值。
实施例6多重聚合酶链式反应的新方法的描述引言尽管聚合酶链式反应(PCR)具有巨大的功能并且可变通,这项技术在临床诊断实验室中应用的速度是慢的。很大程度上,这是由于PCR过程(从样品的加工到进行反应和数据分析)是劳动强度大的,趋于污染的和技术要求高的方法。结果是,假阳性和假阴性结果频率高,并且构成了临床应用中的主要问题。所以,大多数临床诊断实验室仍然进行少数的内部合法的,基于PCR的测试方法用于各种应用中,如病毒检测和白血病患者中的最小残留疾病检测。简化的并且如果可能,使PCR过程自动的技术发展将能大大增强这些测试方法的可再生性和可依赖性。
一项这样的技术的发展,引入快速循环的,定量PCR仪器,打开了新的分子测试方法的潜在用途。在不到30分钟内完成PCR测试方法的能力现在可以是进行依赖时间的护理分子诊断的点成为可能,如测试怀孕的妇女中B组链球菌和无免疫应答的患者中的医院感染因子。在癌症诊断中,这样的快速测试使当患者在外科手术时间仍然在临床的肿瘤状态中时在核心活体检查或细针抽吸(FNA)的基础上进行初级癌症诊断以确定对化学治疗的应答和手术中测试淋巴结和外科范围确定疾病的程度和选择治疗成为可能。例如,逆转录PCR(RT-PCR)已经显示,在许多研究中,可以提高出现结阴性时期的癌症患者的淋巴结中进行癌症细胞检测的敏感度。这些患者的疾病再发生危险很高,可以受益于更攻击性的治疗。有纵隔淋巴结参与的患者可以受益于新的辅助化学治疗,但淋巴结状态仍然需要在主要的外科手术干预之前确定。这可以提高最小的侵入性外科手术活着超声波指导的FNA来完成。准确的手术中淋巴结诊断将允许阴性患者进行完全的肿瘤切除,而在结阳性患者中外科手术将停止允许给予化学治疗。同样的方案存在于胸癌或黑素瘤患者中。在两种疾病中,岗哨淋巴结阳性率导致进行完全的淋巴结解剖。
因为目前的手术中的淋巴结分析方法不是非常敏感的(胸癌中-70%(Weiser MR,Montgomery LL,Susnik B,Tan LK,BorgenPI,Cody RS,胸癌中的岗哨淋巴结的常规手术中的冷冻切片检测,Ann Surg Oncol.2000;7651-5)和黑素瘤中47%(FitzgeraldRC,Triadafilopoulos G.当前Barrett食管中的分子鉴定的进展,Dig.Dis.1998;1663-80.))。许多患者没有诊断为淋巴结阳性,直到在外科手术后。然后,这些患者不得不进行第二次外科手术完成淋巴结的解剖。更敏感的,手术中的淋巴结评估将显然对这些患者有益。这一例子说明了,除了其他,基于快速PCR测试方法只有一个潜在的用途可能在不远的将来是即将可用的。但是,又一次,PCR技术需要发展使这些令人激动的可能用途在临床诊断实验室得到实践。
由于不需要PCR后的加工和凝胶电泳,最近介入的基于荧光的PCR,和RT-PCR已经大大地简化了数据分析。这一技术的其他优点包括降低测试的污染(因为PCR试管从不打开),和得到高度准确和可再生的定量结果的能力。定量不仅增强了许多潜在的诊断的测试方法的临床用途,而且提供了利用外部定性对照标准从一个测试到一个测试方法中证实测试方法的敏感度和可再生性。内部质量对照也是需要的,包括扩增内源对照序列,检测模板DNA或RNA的质和量,和扩增内部阳性对照证实测试方法在阴性结果的情况中能进行。当这些“内部”对照可以真正在分开的试管中进行时,如果所有测试可以在同一PCR试管中进行(多重),利用不同色的荧光原探针区别PCR产物,将是十分有利的。不幸的是,当扩增的靶在反应开始时不是以相似的丰度存在时,标准的多重PCR将不能很好地进行,并且在大范围的靶浓度中维持准确的定量是特别困难的。通过严重限制PCR反应中的跟丰富的基于的PCR引物浓度,可以将定量多重反应的动力学范围提高到一定的程度。当标准RT-PCR测试方法中这一途径可以合理地进行时,引物限制与快速PCR测试方法的要求相抵触,快速PCR测试中维持扩增必须更高的引物浓度。此处,对与单倍的PCR相同的敏感性和定量动力学范围的多重PCR叙述的一个方法,该方法也可以在快速RT-PCR反应中进行。此处证实,这一方法可以用于多个不同的扩增靶,并且在加入了合成的寡聚核苷酸模拟物后,它提供了内部控制的,快速的多重QRT-PCR。此处,通过检测食管癌和黑素瘤患者的淋巴结中的肿瘤细胞证实了癌症诊断中这一方法的价值。这一快速的,手术中的QRT-PCR最终可以用于更准确的手术中的癌症分时期,并且所以导致了更适当的和更有时间性的癌症患者的治疗。
材料和方法通过Pittsburgh大学IRB同意的方案得到所有患者的组织样品。在液氮中快速冷冻来自有食管癌的患者的淋巴结和良性淋巴结(偶然从进行抗回流手术的患者中得到),并且根据制造商的方案利用Rneasy Mini试剂盒(Qiagan,Valencia CA)萃取RNA。从黑素瘤患者得到组织学阳性和阴性淋巴结作为甲醛固定的和石蜡包埋的归档样品,利用前面所述的方案萃取RNA(Godfrey TE,Kim SH,Chavira M,Ruff DM,Warren RS,Gray JW,Jensen RH,利用5’核酸酶定量逆转录聚合酶链式反应从甲醛固定的,石蜡包埋的组织进行定量的mRNA表达分析,J.Mol.Diagn.2000284-91)。
快速PCR测试方法的发展最初利用来自从人结肠总RNA作为模板合成的cDNA测试快速PCR。用大小81和77个碱基对的扩增子将β-葡糖醛酸酶(β-gus)和癌胚抗原(CEA)的PCR引物和探针设计成cDNA特异的。避免了CEA的已知假基因,并且对200ng的基因组DNA的对照PCR是阴性的。在含有800nmol/L的各个引物,200nmol/L的各个探针的25uL反应物中(引物和探针序列表示在表9)和PCR主混合物中(1Xplatinum Taq反应缓冲液,4.5mmol/L MgCl2,300umol/L各个dNTP和0.09U/uL PlatinumTaq DNA聚合酶(Invitrogen,Carlsbad CA)中进行PCR。在CepheidSmartcyclerTM(Cepheid,Sunnyvale,CA)上进行测试,并且用Smartcycler软件1.2b版进行分析。最初,在单一加入cDNA的基础上测试PCR变性(95℃),时间10,7,5,2和1秒,和退火/延长(64℃),时间30,15,10,7,5和3秒。然后,利用最佳的快速PCR循环条件(1秒变性接着6秒退火/延长)比较快速PCR方案和更常规的循环时间,10秒变性和30秒退火/延长。这是针对系列稀释的CEA标准曲线进行的,以便确定快速PCR方案的任何对大范围的CEA加入的影响。在β-gus模板(纯化的β-gusPCR产物)的恒定背景中,以经验确定得到19到20个循环之间的β-gus循环阈值(Ct)的量系列稀释(8X)CEA cDNA。进行相同的实验使酪氨酸酶测试最佳化和合理化。
表9引物和探针序列
*C和U改变到它们的丙炔嘧啶部分。
快速逆转录测试方法的发展。RT-PCR中加入的RNA是从A549肺腺癌细胞系得到的400ngRNA和从有转移食管腺癌的淋巴结得到的25ngRNA的混合物。在含有如上所述的PCR主混合物,和60nmol/Lβ-gus和CEA RT引物, 1uLSensiScript逆转录酶(Qiagen)和0.8U/ul Rnase抑制剂的25uL体积中对β-gus和CEAmRNA进行RT-PCR反应。在48℃,20.5uL体积中进行RT-PCR反应,在4.5uL体积的反应混合物中,在保持70℃的过程中加入PCR引物和探针,接着进行RT。这是为了维持PCR特异性和敏感性进行的。利用30,10,7,5,3和2分钟进行RT测试确定最快的RT,尽可能不损失敏感性。
多重PCR测试方法在温度控制的多重反应中,在反应混合物中加入CEA和β-gus的引物和探针系列。但是,在这种情况中,再设计β-gus引物(β-gus-80,400nmol/L),使具有与CEA引物Tm 60℃比较,Tm为50℃。用1秒的变性,4秒保持在53℃退火和6秒保持在64℃延长进行PCR,并且进行光学读数(总的退火/延长时间10秒)。在β-gus扩增图线达到阈值后(在分开的单倍反应中确定)消除一个循环的53℃退火步骤,随后如在最佳的快速PCR单倍测试中进行循环只有64℃退火/延长。对两个基因利用800nM的引物进行简单的多重反应,并且利用我们的标准β-gus-81(Tm 60℃)引物系列。利用300nmol/L β-gus-81引物进行常规引物限制多重反应,引物,这一浓度是不导致快速PCR中β-gus Ct值明显增加(>1个循环)的最低浓度。利用常规方法的开始20个PCR循环进行时,退火/延长时间为10秒,64℃,接着其余的循环改变到6秒。这是为了更好地刺激用于温度控制的多重反应的条件而进行的,并且允许直接比较该方法。为了确定与单倍反应可比的准确度和动力范围,对CEA cDNA(如上所述)测试所有三个多重反应的方法。
内部阳性对照。内部阳性对照(IPC)是具有与靶基因(CEA或酪氨酸酶)相同的引物序列但具有不同的内部探针序列的DNA寡聚核苷酸(表10)。在IPC中的选择位点是用脲嘧啶取代胸腺嘧啶而合成的,使高度浓缩的模拟物的污染如果需要可以用脲嘧啶DNA糖基化酶控制。在反应主混合物中加入IPC,加入的量是根据经验确定得到Ct值36-27个循环的量。然后,如上所述进行快速三倍测试实验,以便进行有引物限制的多重反应(两倍),并且加入内部对照探针(IC),浓度为200nmol/L。
表10CEA和酪氨酸酶内部阳性对照模拟物 斜体=基因特异引物位点,黑体=来自细菌β-葡萄糖苷酶基因的探针序列。
淋巴结检测为了证明这一技术的用途,利用快速的多重QRT-PCR测试来自食管癌和黑素瘤患者的组织学阳性和阴性淋巴结。利用三重QRT-PCR(β-gus,CEA或酪氨酸酶和适当的模拟物)分析淋巴结RNA,其中利用了温度控制的引物限制技术。如上所述用5分钟的RT进行逆转录,接着将加入的PCR引物在70℃保持30秒。在一个预先的单重进行的实验中确定β-gus的循环阈值,使温度变化可以在多重反应中的适当的循环中开始。结果快速PCR发展在多重反应中利用之前,在多重的实验中对所有基因分开进行快速的PCR实验。为了发展快速PCR实验,评估了减少变性时间(10,7,5,2,1秒,95℃)和退火/延长时间(30,15,13,10,7,6,3秒,64℃)的影响,以便确定Ct值中的任何可观察到的变化。对于变性时间实验,退火/延长时间保持恒定30秒,对于退火/延长时间实验,变性时间保持恒定10秒。发现,将变性时间降低到1秒对CEA或β-gus基因的Ct值没有影响(图12,组A)。同样,降低退火/延长时间到5秒对于两个基因的Ct值的影响最小(约0.5个循环),而3秒退火/延长时间导致CEA1.1个循环额Ct的增加和β-gus 1.8个循环的增加,相比之下对照是30秒的退火/延长(图12,组B)。所以,对于进一步的实验,选择1秒的变性和6秒的退火延长。为了评估快速PCR实验在大范围的CEA输入量时对敏感性和定量的影响,产生了在β-gusPCR靶的恒定背景中的一系列的CEA cDNA稀释标准曲线。利用这一标准曲线,将快速实验与更常规的10秒变性和30秒退火/延长的PCR比较(图13)。快速实验导致CEA的Ct值平均增加1.6个循环,β-gus平均增加0.2个循环。这些增加在点到点之间是一致的,作为结果,快速实验的定量能力是与较慢的PCR相同的。利用快速实验进行40个循环的总PCR时间是15分钟,而较慢的PCR方案是48分钟。
快速逆转录利用RT-PCR进行快速的基因表达分析要求实验的逆转录和PCR是快的。由于这一原因,评估了将逆转录时间从30分钟降低到10,7,5,3和2分钟的效果(图12,组C)。在这一实验中,PCR时间保持恒定的2秒变性和15秒退火/延长。结果显示,对于β-gus Ct值仅1.1和0.6个循环,逆转录是5分钟,对于CEA,Ct仅1.1和1.8个循环,2分钟的逆转录,这一增加是与30分钟比较而言的,而这些差异中没有一个在个别时间点的比较中是明显的,没有明显的期望的趋势如增加Ct值而时间减少。利用4个不同的RT和PCR参数可以评估RT和PCR时间对实验的敏感性的影响(图14)。再次观察到有这样的趋势,更高的Ct和更短的RT-PCR方案,但在20分钟的总RT-PCR时间中(5分钟RT 1/6个PCR),对于两个基因Ct的差异只有1.4个循环,而总RT-PCR有38分钟(10分钟RT,10/15个PCR)。
对不同的多重实验的方法的测试是在相同的CEA稀释系列中进行的,其中β-gus的背景是恒定的,这一背景也用于发展快速PCR方法。这一稀释系列跨越了约12个循环,相对应的,在曲线的第一和最后的点之间起始CEA丰度有4.096倍的差异(图15,组A)。利用稀释系列比较各个基因的单倍反应和简单的多重PCR反应(图15,组C),常规引物限制多重PCR(组15,组D)和我们的温度控制,引物限制多重PCR(图15,组B)。当对CEA和β-gus进行简单的多重反应时,系列的5个点中只有开始的3个达到CEA的阈值,而更大丰度的β-gus的反应的扩增一致(没有显示)。对于常规引物限制反应观察到了相同的结果,而温度控制引物限制产生的结果差不多与单倍的反应的相同。
或许,在用不同技术可以达到的delta Ct的范围比CEA浓度的范围关系更大(在更大丰度的β-gus基因和CEA靶基因之间的Ct值是有差异的)。在这些实验中,β-gus Ct在所有实验中恒定在19到20个循环之间,所以单倍实验的稀释系列中,最大的deltaCt差不多是15个循环(在丰度上约32,000倍的不同)。图16显示,delta Ct的图是针对三个多重反应方法以及单倍反应的数据的每一个的。在简单的多重反应中,系列中的三个点具有38.5个循环的Ct值,相比之下在单倍反应中的相同的点是29.0,而随后的点不能完全扩增。所以,简单的多重反应证明,没有delta真正Ct值约8个循环的量,并且动力范围非常有限。常规引物限制多重反应进行得稍微好些(三个稀释点的deltaCt是4.0个循环,比单倍反应更高),但又一次,稀释点4和5不能扩增。所以,似乎尽管标准PCR反应中有灵活性,常规引物限制还是不能补充快速实验方法,因为其中要求引物浓度增高。在比较中,温度控制多重反应扩增了所有稀释系列中的点,deltaCt值直到最后的点都没有观察到差异。这些结果明显证明了,在快速QPCR实验中,温度控制引物限制是可以与单倍反应比较的,而所有其他多重反应途径仍然是不合适的。另外,这一技术已经在其他靶上如酪氨酸酶中利用,该方法似乎是容易适应新的靶的。
利用快速,多重RT-PCR进行淋巴结分析对于淋巴结分析,多重反应中包括CEA和酪氨酸酶的内部阳性对照模拟物。这一内部控制的,快速RT-PCR多重反应用于评估来自食管癌患者和黑素瘤患者的淋巴结,以及来自没有癌症的患者的良性淋巴结。在三个组织阳性食管癌淋巴结中,检测了高水平的CEA表达。在来自非癌症患者的淋巴结中,5个结中有2个没有可检测水平的CEA表达,其余三个有低水平的CEA表达(图17)。另外,在检测CEA信号的情况中,内部阳性对照没有扩增(图18,组A)。但是,在CEA阴性样品中,由于没有CEA表达和不是失败的CEA PCR,存在确实是阴性结果的CEA内部阳性对照的扩增(图18,组B)。利用酪氨酸酶mRNA作为癌症标记,黑素瘤结中得到了相似的结果。测试了黑素瘤中的5个组织学阳性的淋巴结和没有任何癌症迹象的5个淋巴结。在所有组织学阳性结中检测到高水平的酪氨酸酶,在5个阴性结中只有一个有非常低水平的酪氨酸酶(数据没有显示)。在阳性结中,酪氨酸酶的表达比β-gus更高,并且作为结果只有酪氨酸酶基因扩增是可以看到的。在所有5个阴性结中,都看到了β-gus和IPC的扩增(图18,组C和D)。
讨论能够实时根据荧光进行定量的快速循环PCR的仪器的引入已经打开了分子诊断实验在临床状况中的应用,其中时间是限定的,或其中的快速结果对患者是有心理或物理的益处的。快速分子实验可能有优势的一种情况是恶性肿瘤,如黑素瘤,胸癌和肺癌的情况下在手术中将淋巴结分时期。冷冻组织切片的常规分析是非常快的(在大多数情况中约20分钟),但这一技术的敏感性在检测小的肿瘤病灶时是非常低的。另外,许多组织学检测分为淋巴结阴性时期的患者有疾病的再发生,这可能是隐藏肿瘤细胞被常规检测遗漏的结果。有许多迹象表明,RT-PCR和特定的定量RT-PCR可以检测这些隐藏细胞,并且可以鉴定有高危险再发生的患者。如果这一信息可以在手术中发现,外科大夫将能够作出信息更详细的关于辅助治疗和切除范围的要求的治疗决定。
已经表明,在手术中时间框架内进行QRT-PCR是易行的,并且这项技术可以比冷冻切片更优异,并且至少可以与甲醛固定的组织学比较。在现有的实施例中,这些快速QRT-PCR方案被测试了,并且有显示,这一整个测试过程可以在20分钟内进行。这一时间框架是适于手术中的测试过程的,但在确认快速QRT-PCR可以在临床诊断中应用之前仍然有几个实践和技术上的障碍需要解决。相信,测试方法必须标准化,从而允许在多中心实验的位点之间进行数据比较,必须自动化(包括RNA分离)来消除依赖手术人的可变性和污染,并且必须控制实验的所有方面包括内部的内源和外源阳性对照。
这些要求中较迟的质量控制必须在快速QRT-PCR中加入多重反应。至少需要两个对照反应,证实RNA的存在,适当的量和质的内源对照基因和证实在阴性靶基因表达的样品中以适当敏感度起作用的靶QRT-PCR的外部阳性对照。这两个对照一起保证了阴性结果是真阴性而不是失败的RT-PCR的结果。所以,至少需要三重的PCR反应。不幸的是,甚至在标准的慢的PCR实验中,维持多重PCR中的量也是不容易的。这是因为积累一个PCR产物(来自最丰富的靶基因)抑制了其他靶的扩增。
最初,这一抑制可以看作与单重反应比较时,循环阈值向更高的循环数的转变和总荧光的下降(图15,组A,C和D)。但是,如果两个基因的丰度的差异太大,较小丰度的基因将不能完全扩增。所以,典型的多重反应没有量,动力范围很小。抑制较少丰度的靶序列可能是几个因素的结果,包括DNA合成过程中核苷酸的加入释放的焦磷酸,和积累PCR产物对Taq酶的抑制/扣留。克服这一抑制的一个方法是在已经检测到信号后不久和焦磷酸和PCR产物积累足够引起抑制之前,一定程度地终止较大丰度的基因的扩增。为此,常规的方法是依赖对更大丰度的靶基因的引物浓度加以限制使引物利用起来的同时,这一特异靶的PCR在抑制发生之前终止。虽然PCR测试实验中,这一方法应用得相当好,但在快速实验中降低引物浓度导致PCR效率较低,甚至PCR完全失败。在我们的研究中,不改变β-gus的循环阈值的最低引物浓度被确定了,并且利用快速PCR方法,在常规引物限制实验中进行了测试。一方面证明了这比没有引物限制的多重反应稍微进步,但另一方面与单重反应比较,定量和动力学范围仍然不佳。这本文所述的方法中,设计了比靶基因(CEA或酪氨酸酶)更低的温度时起作用的更大丰度的基因类型(β-gus)的引物的熔化温度(Tm)。PCR本身是分两个时期进行的。PCR的第一时期的退火步骤是在相当低的退火温度下进行的(在这一实施例中是53℃),直到更大丰度的基因类型的扩增曲线达到检测阈值。在这之后,PCR的第二时期在至少比低温引物的Tm高10℃的退火温度下进行的(这一实施例中是64℃)。第二时期的较高的温度使低温β-gus PCR引物的结合状态向有利于单链的状态转变,有效地终止了β-gus的扩增,而CEA靶的扩增仍然是不受抑制的。所以,维持较大丰度的对照基因的快速PCR需要的高引物浓度,并且仍然维持靶基因的大动力范围下的量是可能的。
除了发展快速多重反应技术,加入了可以用于证明靶基因表达阴性的样品中达到了适当的RT-PCR敏感度的内部阳性对照模拟物。这一模拟物利用了与靶基因相同的引物,从而控制了这些寡聚核苷酸的功能。DNA模拟物可以用也包括逆转录引物位点的RNA模拟物来替代。然后,这样将控制靶基因扩增的RT和PCR步骤。通过在样品中以足够低至产生大于35个循环的Ct值的浓度加入这一模拟物,可以保证,RNA分离和RT-PCR反应不仅可以进行而且进行得足够好到能检测到存在的非常低丰度的靶基因。在靶基因高度表达的情况中,内部模拟物可能不能扩增。这是可以接受的,因为模拟物只是打算作为阴性反应的对照的。
所以,在癌症患者的淋巴结中检测转移肿瘤细胞的快速QRT-PCR的潜在用途已经显示出来。虽然这是一个特别激动人的快速分子诊断用途,但它仅仅是一个潜在的应用。由于新的癌症标记的发现,也将快速QRT-PCR用于手术中分析外科边缘,临床中分析活体检测样本,或细针抽吸或分析初级肿瘤预测对化学治疗或新的活体治疗如酪氨酸激酶抑制剂的应答也是可能的。虽然双重温度PCR循环需要温度控制的多重反应,并且在整个反应时间中加了约2分钟,但完全的多重的QRT-PCR实验仍然可以在22分钟内进行。在SmartCyclerTM,或它将来的新生代中加入内部冷却步骤,可以相信能另外节省3-4分钟。同样,在现有的工作中,需要开始温度变化的循环数是预定的。最终,在仪器的软件中,小小的修改将自动增加内源对照基因荧光达到阈值后的PCR退火温度。因为所有的PCR位点是分别控制的,这将允许同时进行多重翻译,而开始RNA模板的量是未知的。最后,快速QRT-PCR现在在临床设备中已经变得可利用了。利用目前正在发展的技术,RNA分离也可以在自动的方法中非常快地进行。最后,根据一系列的程序化步骤,完全整合的RNA分离,逆转录和定量PCR仪器,如Cepheid’s GenXpertTM将自动化,所有这些在30分钟内发展和提供了一个QRT-PCR结果。快速的,内部控制的多重技术与自动化样品加工平台的结合将允许在封闭的环境中进行准确的和仍然加速的测试过程。这一整合系统的简单和敏感性应该能使癌症诊断中应用许多新的分子测试。
本说明书中的专门利用的各种范围中的许多值,除非特别说明,都是近似值,尽管所述范围的最小和最大值都有“大约”在前。这样的方式下,在所述范围或上或下的轻微变化可以用于获得与范围内的值基本相同的结果。同样,公开这些范围是打算作为连续的范围,包括最小和最大值之间的每个值。
序列表<110>匹兹堡大学托尼·E·戈德弗里詹姆斯·D·卢克蒂奇西瓦·拉杰洛瑞·A·凯利西德内·D·芬凯利斯特因<120>PCR方法<130>010211<150>60/273.277<151>2001-03-02<160>25<170>专利版本3.1<210>1<211>2975<212>DNA<213>人工序列<400>1ctcagggcag agggaggaag gacagcagac cagacagtca cagcagcctt gacaaaacgt60tcctggaact caagctcttc tccacagagg aggacagagc agacagcaga gaccatggag120tctccctcgg cccctcccca cagatggtgc atcccctggc agaggctcct gctcacagcc180tcacttctaa ccttctggaa cccgcccacc actgccaagc tcactattga atccacgccg240ttcaatgtcg cagaggggaa ggaggtgctt ctacttgtcc acaatctgcc ccagcatctt300tttggctaca gctggtacaa aggtgaaaga gtggatggca accgtcaaat tataggatat360gtaataggaa ctcaacaagc taccccaggg cccgcataca gtggtcgaga gataatatac420cccaatgcat ccctgctgat ccagaacatc atccagaatg acacaggatt ctacacccta480
cacgtcataa agtcagatct tgtgaatgaa gaagcaactg gccagttccg ggtatacccg 540gagctgccca agccctccat ctccagcaac aactccaaac ccgtggagga caaggatgct 600gtggccttca cctgtgaacc tgagactcag gacgcaacct acctgtggtg ggtaaacaat 660cagagcctcc cggtcagtcc caggctgcag ctgtccaatg gcaacaggac cctcactcta 720ttcaatgtca caagaaatga cacagcaagc tacaaatgtg aaacccagaa cccagtgagt 780gccaggcgca gtgattcagt catcctgaat gtcctctatg gcccggatgc ccccaccatt 840tcccctctaa acacatctta cagatcaggg gaaaatctga acctctcctg ccacgcagcc 900tctaacccac ctgcacagta ctcttggttt gtcaatggga ctttccagca atccacccaa 960gagctcttta tccccaacat cactgtgaat aatagtggat cctatacgtg ccaagcccat 1020aactcagaca ctggcctcaa taggaccaca gtcacgacga tcacagtcta tgcagagcca 1080cccaaaccct tcatcaccag caacaactcc aaccccgtgg aggatgagga tgctgtagcc 1140ttaacctgtg aacctgagat tcagaacaca acctacctgt ggtgggtaaa taatcagagc 1200ctcccggtca gtcccaggct gcagctgtcc aatgacaaca ggaccctcac tctactcagt 1260gtcacaagga atgatgtagg accctatgag tgtggaatcc agaacaaatt aagtgttgac 1320cacagcgacc cagtcatcct gaatgtcctc tatggcccag acgaccccac catttccccc 1380tcatacacct attaccgtcc aggggtgaac ctcagcctct cctgccatgc agcctctaac 1440ccacctgcac agtattcttg gctgattgat gggaacatcc agcaacacac acaagagctc 1500tttatctcca acatcactga gaagaacagc ggactctata cctgccaggc caataactca 1560gccagtggcc acagcaggac tacagtcaag acaatcacag tctctgcgga gctgcccaag 1620ccctccatct ccagcaacaa ctccaaaccc gtggaggaca aggatgctgt ggccttcacc 1680tgtgaacctg aggctcagaa cacaacctac ctgtggtggg taaatggtca gagcctccca 1740gtcagtccca ggctgcagct gtccaatggc aacaggaccc tcactctatt caatgtcaca 1800agaaatgacg caagagccta tgtatgtgga atccagaact cagtgagtgc aaaccgcagt 1860gacccagtca ccctggatgt cctctatggg ccggacaccc ccatcatttc ccccccagac 1920tcgtcttacc tttcgggagc gaacctcaac ctctcctgcc actcggcctc taacccatcc 1980
ccgcagtatt cttggcgtat caatgggata ccgcagcaac acacacaagt tctctttatc 2040gccaaaatca cgccaaataa taacgggacc tatgcctgtt ttgtctctaa cttggctact 2100ggccgcaata attccatagt caagagcatc acagtctctg catctggaac ttctcctggt 2160ctctcagctg gggccactgt cggcatcatg attggagtgc tggttggggt tgctctgata 2220tagcagccct ggtgtagttt cttcatttca ggaagactga cagttgtttt gcttcttcct 2280taaagcattt gcaacagcta cagtctaaaa ttgcttcttt accaaggata tttacagaaa 2340agactctgac cagagatcga gaccatccta gccaacatcg tgaaacccca tctctactaa 2400aaatacaaaa atgagctggg cttggtggcg cgcacctgta gtcccagtta ctcgggaggc 2460tgaggcagga gaatcgcttg aacccgggag gtggagattg cagtgagccc agatcgcacc 2520actgcactcc agtctggcaa cagagcaaga ctccatctca aaaagaaaag aaaagaagac 2580tctgacctgt actcttgaat acaagtttct gataccactg cactgtctga gaatttccaa 2640aactttaatg aactaactga cagcttcatg aaactgtcca ccaagatcaa gcagagaaaa 2700taattaattt catgggacta aatgaactaa tgaggattgc tgattcttta aatgtcttgt 2760ttcccagatt tcaggaaact ttttttcttt taagctatcc acagcttaca gcaatttgat 2820aaaatatact tttgtgaaca aaaattgaga catttacatt ttctccctat gtggtcgctc 2880cagacttggg aaactattca tgaatattta tattgtatgg taatatagtt attgcacaag 2940ttcaataaaa atctgctctt tgtatgacag aatac 2975<210>2<211>20<212>DNA<213>Artificial Sequenc e<220>
<223>β-gus RT引物<400>2tttggttgtc tctgccgagt 20
<210>3<211>22<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>β-dus正向PCR引物<400>3ctcatttgga attttgccga tt 22<210>4<211>22<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>β-gus反向引物<400>4ccgagtgaag atcccctttt ta 22<210>5<211>26<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>β-gus taqman探针<400>5tgaacagtca ccgacgagag tgctgg 26<210>6<211>22<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>β-dus正向PCR引物
<400>6agacaatcac agtctctgcg ga 22<210>7<211>20<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>CEA反向PCR引物<400>7atccttgtcc tccacgggtt20<210>8<211>26<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>CEATaqman探针<400>8caagccctcc atctccagca acaact 26<210>9<211>16<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>CEA RT引物<400>9gtgaaggcca cagcat16
<210>10<211>22<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>18SrRNS Taqman探针<400>10tgctggcacc agacttgccc tc 22<210>11<211>23<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>18SrRNA正向PCR引物<400>11ccctgtaatt ggaatgagtc cac23<210>12<211>18<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>18SrRNA反向PCR引物<400>12gctggaatta ccgcggct 18<210>13<211>19<212>DNA<213>Artificial Sequence
<220>
<223>18SrRNA正向-低温-PCR引物<400>13ccctgtaatt ggaatgagt 19<210>14<211>15<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>18SrRNA反向-低温PCR引物<400>14gctggaatta ccgcg 15<210>15<211>16<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>B-gus RT引物<400>15tggttgtctc tgccga16<210>16<211>18<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>B-gus正向PCR引物-低温<400>16ctcatttgga attttgcc 18
<210>17<211>17<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>B-gus反向引物-低温<400>17cgagtgaaga tcccctt 17<210>18<211>15<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>CEAtaqman探针<220>
<221>misc_特征<222>(15)..(15)<223>脲嘧啶残基<220>
<221>misc_特征<222>(4)..(4)<223>脲嘧啶残基<400>18agcngcccaa gcccn 15<210>19<211>23<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>酪氨酸酶正向PCR引物<400>19acttactcag cccagcatca ttc23<210>20<211>23<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>酪氨酸酶反向PCR引物<400>20actgatggct gttgtactcc tcc23<210>21<211>29<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>酪氨酸酶Taqman探针<400>21tctcctcttg gcagattgtc tgtagccga 29<210>22<211>17<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>酪氨酸酶RT引物<400>22cgttccattg cataaag 17
<210>23<211>28<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Internal control probe<400>23agcatcatcc tctgcatggt caggtcat 28<210>24<211>77<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>CEA mimic-Intemal Control<400>24agacaatcac agtctctgcg gaagcatcat cctctgcatg gtcaggtcat aactccaaac60ccgtggagga caaggat 77<210>25<211>77<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Iyrosinase mimic-Internal Control Probe<220>
<221>misc_特征<222>(7)..(7)<223>脲嘧啶残基
<220>
<221>misc_特征<222>(18)..(18)<223>脲嘧啶残基<220>
<221>misc_特征<222>(62)..(62)<223>脲嘧啶残基<220>
<221>misc_特征<222>(73)..(73)<223>脲嘧啶残基<400>25acttacncag cccagcanca ttctagcatc atcctctgca tggtcaggtc atttggagga60gnacaacagc cancagt 77
权利要求书(按照条约第19条的修改)66.权利要求65所述的方法,其中逆转录反应是在约2分钟中进行的。
67.包括SEQ ID NOS6,7,13,14,16,17,19,20和23-35的寡聚核苷酸和其衍生物。
68.一种手术中的PCR诊断方法,包括步骤(a)从手术中的病人得到组织样品;(b)根据权利要求1的方法分析样品;(c)如果指示转录物的表达超过阈值水平,进行测定;和(d)根据分析步骤的结果推断的方法进行手术。
69.一种手术中的PCR诊断方法,包括步骤(a)从手术中的病人得到组织样品;(b)根据权利要求60的方法分析样品;(c)如果指示转录物的表达超过阈值水平,进行测定;和(d)根据分析步骤的结果推断的方法继续手术。
70.一种手术中的PCR诊断方法,包括步骤(a)从手术中的病人得到组织样品;(b)根据权利要求30所述的方法分析样品;(c)如果指示转录物的表达超过阈值水平,进行测定;和(d)根据分析步骤推断的方法继续手术。
71.一种快速检测恶性肿瘤的方法,包括步骤a)从肿瘤活体检测样本样本得到核酸;b)根据权利要求1所述的方法,对核酸进行特异于指示转录物的PCR方法;和c)如果指示转录物的表达超过阈值水平,进行测定,指示恶性肿瘤。
72.权利要求71所述的方法,其中指示转录物是CEA。
73.一种用于自动PCR系统的柱体,包括含有第一个PCR引物套和第二个PCR引物套的一个或多个舱,第一个PCR引物套和第二个PCR引物套是在相同或不同的舱中。
74.权利要求73所述的柱体,包括含有第一个PCR引物套的第一个舱和包括第二个PCR引物套的第二个舱。
75.权利要求73的柱体,其中第一个PCR引物套具有第一个有效的Tm,第二个PCR引物套具有与第一个有效的Tm不同的有效Tm。
76.权利要求73所述的柱体,进一步包括第三个舱,其中含有逆转录试剂,细胞溶解试剂和RNA纯化试剂中的一个。
77.一种快速检测转移的食管腺癌的方法,包括步骤(a)从岗哨淋巴结得到RNA;(b)对RNA进行特异于CEA的定量RT-PCR方法;和(c)如果CEA的表达超过阈值水平,进行测定。
权利要求
1.一种多重PCR反应的方法,包括在PCR反应混合物中,在DNA样品上进行PCR扩增的步骤,潜在PCR扩增是在开始的扩增时期和第二个扩增时期进行的,各个扩增时期包括一个或多个PCR循环,各个PCR循环包括变性步骤,退火步骤和延长步骤,这些步骤可以在与退火步骤相同的温度下进行,其中第二个扩增时期的PCR扩增是在与第一个扩增时期不同的反应条件下进行的,可以调节第一个引物套的第一个扩增子和第二个引物套的第二个扩增子在第一个和第二个扩增时期的生产。
2.权利要求1所述的方法,其中第二个引物套在开始第二个扩增时期加入到反应混合物中。
3.权利要求1所述的方法,其中第一个PCR引物套和第二个PCR引物套中的一个产生了特异于β-gus特异扩增子,和18SrRNA特异扩增子,CEA特异扩增子和酪氨酸酶特异扩增子中的一个。
4.权利要求3所述的方法,其中第一个PCR引物套和第二个PCR引物套中的一个包括SEQ ID NOS3,4,6,7,11,12,13,14,16,17,19,和20或其他衍生物中的一个序列。
5.权利要求3的方法,其中第一个PCR引物套和第二个PCR引物套中的一个包括SEQ ID NOS3,4,6,7,11,12,13,14,16,17,19和20或它们的衍生物中的一个引物。
6.权利要求3的方法,其中第一个PCR引物套和第二个PCR引物套中的一个包括SEQ ID NO3,4,6,7,11,12,13,14,16,17,19和20中的一个引物。
7.权利要求1所述的方法,其中反应混合物包括DNA样品,第一个引物套具有第一个有效Tm,第二个引物套具有与第一个有效Tm不同的第二个有效Tm,其中第一个扩增时期的退火步骤是在与第二个扩增时期不同的温度下进行的。
8.权利要求7所述的方法,其中第一个扩增时期和第二个扩增时期中至少一个时期的PCR循环的退火步骤和延长步骤是在相同的温度下进行的。
9.权利要求7所述的方法,其中第一个扩增时期和第二个扩增时期中至少一个时期的PCR循环中的退火和延长步骤是在不同的温度下进行的。
10.权利要求7所述的方法,其中第一个引物套产生β-GUS特异扩增子,第二个引物套产生CEA特异扩增子,第一个引物套的Tm约比第二个引物套低10℃,第一个扩增时期的PCR扩增的退火温度约比第二个扩增时期的PCR扩增的退火温度低10℃。
11.权利要求10所述的方法,其中第一个PCR引物套包括SEQID NOS16和17,第二个引物套包括SEQ ID NOS6和7,第一个扩增时期的PCR扩增的退火温度约等于53℃,第二个扩增时期的PCR扩增的退火温度约等于64℃,根据是两个PCR引物套的最初引物浓度约400nM/L,第一个PCR引物套的有效Tm约50℃,第二个PCR引物套的有效Tm约60℃。
12.权利要求1所述的方法,其中各个循环的变性步骤约1秒。
13.权利要求1所述的方法,其中各个循环的变性步骤小于1秒。
14.权利要求1所述的方法,进一步包括在第一个扩增时期增强和在反应混合物中加入PCR引物之前对RNA样品进行逆转录反应,产生反应混合物的DNA样品的DNA。
15.权利要求14所述的方法,其中逆转录反应是在不到10分钟内进行的。
16.权利要求14所述的方法,其中逆转录反应是在约2分钟内进行的。
17.权利要求14所述的方法,其中内部阳性对照RNA和内部阳性对照DNA中的一个加入到逆转录反应中。
18.权利要求1所述的方法,其中内部阳性对照DNA加入到PCR反应混合物中。
19.权利要求18所述的方法,其中内部阳性对照DNA包括SEQID NOS23-25或它的衍生物中的一个序列。
20.权利要求18所述的方法,其中内部阳性对照DNA含有一个或多个脲嘧啶残基。
21.权利要求1所述的方法,其中扩增时期包括利用荧光报道物进行定量PCR反应,指示了特异扩增子的积累。
22.权利要求21所述的方法,其中定量PCR反应是荧光5’核酸酶测试方法。
23.权利要求21所述的方法,其中荧光报道物是分子光束。
24.权利要求1所述的方法,其中提供一个或多个反应混合物的试剂用于适当构成的柱体中的反应混合物中,用于自动系统中。
25.权利要求24所述的方法,其中柱体是在一次使用中可任意处理的。
26.权利要求24所述的方法,其中柱体含有其他试剂或可独立舱化的机械成分和反应混合物的试剂,加入的试剂和机械成分适于一个细胞或组织的溶解,RNA纯化和逆转录。
27.权利要求24所述的方法,其中扩增步骤包括利用荧光报道物定量PCR反应,显示特异扩增子的积累,该自动系统自动将PCR从第一个扩增时期转移到第二个扩增时期,此时荧光报道物在反应混合物中积累到阈值水平。
28.权利要求1所述的方法,其中第一和第二个时期是在相同的反应容器中按顺序进行的。
29.权利要求1所述的方法,其中预期,DNA样品的第一个引物套和第二个引物套的靶序列数目至少有30-100倍的差异。
30.一种多重PCR反应的方法,包括在第一个时期和第二个时期,对PCR反应混合物进行PCR扩增,反应混合物包括DNA样品,第一个引物套具有第一个有效Tm,第二个引物套具有与第一个有效Tm不同的有效Tm,各个扩增时期包括一个或多个PCR循环,各个PCR循环包括变性步骤,退火步骤和延长步骤,这些步骤可以在相同的温度下进行,如退火步骤,其中第一个扩增时期的退火步骤是在与第二个扩增时期不同的温度下进行的,可以调节在第一个和第二个扩增时期中的第一个引物套的第一个扩增子和第二个引物套的第二个扩增子的产生速度。
31.权利要求30的方法,其中第一个扩增时期和第二个扩增时期中至少一个时期的PCR循环中的退火步骤和延长步骤是在相同的温度下进行的。
32.权利要求30的方法,其中第一个扩增时期和第二个扩增时期中至少一个的PCR循环中的退火和延长步骤是在不同的温度下进行的。
33.权利要求30的方法,其中第一个引物套的有效Tm和第二个引物套的有效Tm之间的区别至少约5℃。
34.权利要求30的方法,其中第一个PCR引物套和第二个PCR引物套中的一个产生β-GUS特异扩增子,和18SrRNA特异扩增子,CEA特异扩增子和酪氨酸酶特异扩增子中的一个。
35.权利要求34所述的方法,其中第一个引物套和第二个引物套中的一个包括SEQ ID NOS3,4,6,7,11,12,13,14,16,17,19和20或其衍生物中的一个序列的引物。
36.权利要求34所述的方法,其中第一个PCR引物套和第二个PCR引物套中的一个包括SEQ ID NOS3,4,6,7,11,12,13,14,16,17,19和20或其衍生物中的一个引物。
37.权利要求34所述的方法,其中第一个PCR引物套和第二个PCR引物套中的一个包括SEQ ID NOS3,4,6,7,11,12,13,14,16,17,19和20或其衍生物中的一个引物。
38.权利要求30所述的方法,其中第一个扩增时期的退火步骤是在比第二个扩增时期的退火步骤更高的温度下进行的。
39.权利要求38所述的方法,其中第一个和第一个引物套中的一个产生β-GUS特异扩增子,CEA特异扩增子,18SrRNA扩增子和酪氨酸酶扩增子中的一个。
40.权利要求38所述的方法,其中第一个引物套产生β-GUS特异扩增子,第二个引物套产生CEA特异扩增子。
41.权利要求30所述的方法,其中第一个扩增时期的退火步骤是在不第二个扩增时期的退火步骤更低的温度下进行的。
42.权利要求30所述的方法,进一步包括在第一个扩增时期之前和在反应混合物中加入PCR引物或热稳定DNA聚合酶之前对RNA样品进行逆转录反应的步骤,可以在反应混合物的DNA样品中产生DNA。
43.权利要求42所述的方法,其中逆转录反应是在不到10分钟的时间中进行的。
44.权利要求42所述的方法,其中逆转录反应是在约2分钟中进行的。
45.权利要求42所述的方法,其中内部阳性对照RNA和内部阳性对照DNA中的一个是加入到逆转录反应中的。
46.权利要求30所述的方法,其中内部阳性对照DNA是加入到PCR反应混合物中的。
47.权利要求46所述的方法,其中内部阳性对照RNA包括SEQID NOS23-25的一个序列。
48.权利要求30所述的方法,其中反应混合物中的一个或多个试剂是提供用于适当构型,在自动系统中使用的柱体中的反应混合物的。
49.权利要求48所述的方法,其中柱体是在一次使用后可任意处理的。
50.权利要求48所述的方法,其中柱体含有其他试剂或独立舱化的机械成分,或与反应混合物的试剂一起,其他试剂或机械成分适于一个细胞或组织溶解,RNA纯化和逆转录。
51.权利要求30所述的方法,其中扩增时期包括利用荧光报道物进行定量PCR反应,显示特异扩增子的积累。
52.权利要求51所述的方法,其中定量PCR反应是荧光5’核酸酶测试方法。
53.权利要求51所述的方法,其中荧光报道物是分子光束。
54.一种PCR方法,包括步骤,进行PCR扩增,PCR扩增包括多个PCR循环,PCR反应混合物中包括核酸样品,引物套,其中各个引物套的引物的浓度至少约400nM,各个PCR循环包括变性步骤,退火步骤和延长步骤,可以与退火步骤同时进行,其中PCR扩增产生了β-GUS特异扩增子,18SrRNA特异扩增子,酪氨酸酶特异扩增子,和CEA特异扩增子中的一个。
55.权利要求54所述的方法,其中引物套包括SEQ ID NOS3,4,6,7,11-14,16,17,19和20的一个引物。
56.权利要求54所述的方法,其中PCR方法是定量的PCR方法,利用了荧光报道物显示特异扩增子的积累。
57.权利要求56所述的方法,其中PCR方法是荧光5’核酸酶测试方法。
58.权利要求56所述的方法,其中荧光报道物是分子光束。
59.一种RT-PCR方法,包括步骤(a)在不到10分钟内对反应混合物中的RNA样品进行逆转录反应,产生DNA样品;(b)在反应混合物中加入具有第一个有效Tm的第一个引物套和具有与第一个有效Tm不同的第二个有效Tm的第二个引物套和热稳定DNA聚合酶;和(c)在第一个扩增时期和第二个扩增时期中进行反应混合物的PCR扩增,各个扩增时期包括一个或多个PCR循环,各个PCR循环包括约1秒或更少的变性步骤,少于约10秒的退火步骤,少于约10秒的延长步骤,可以在相同的温度下进行,如退火步骤,其中第一个扩增时期的退火步骤是比第二个扩增时期的退火步骤更低的温度下进行的,可以调节第一个引物套的第一个靶序列和第二个引物套的第二个靶序列在第一个和第二个扩增时期的扩增速度,其中第一个靶序列预期在DNA样品中的丰度比第二个靶序列的至少约高30倍。
60.一种增加一个管RT-PCR方法的敏感性和特异性的方法,包括步骤(a)在反应混合物中对RNA样品进行逆转录反应,产生DNA样品;(b)在反应混合物中加入含有PCR引物套和热稳定DNA聚合酶的PCR试剂;和(c)在反应混合物中进行PCR扩增。
61.权利要求60所述的方法,其中在PCR扩增之前,通过物理屏障将PCR试剂组合物从反应混合物中分开,物理屏障是在PCR反应之前或在第一个循环过程中除去的,从而在反应混合物中加入PCR试剂组合物。
62.权利要求60的方法,其中逆转录反应是在不到10分钟内进行的。
63.权利要求60所述的方法,其中逆转录反应是在约2分钟内进行的。
64.权利要求60所述的方法,其中RT-PCR方法是在自动系统中进行的,RT-PCR方法的试剂存储在具有多个舱的柱体中,其中试剂是在用于RT-PCR方法之前存储的,其中自动系统在根据程序化的序列在柱体的反应容器中加入试剂。
65.一种RT-PCR方法,包括步骤(a)在反应混合物中,对RNA样品,在不到10分钟的时间内进行逆转录反应;和(b)对反应混合物进行PCR反应。
66.权利要求65中的方法,其中逆转录反应进行了约2分钟。
67.一种包括SEQ ID NOS6,7,13,14,16,17,19,20和23-35之一的寡聚核苷酸,和其衍生物。
68.一种手术中的PCR诊断方法,包括步骤(a)从手术中的病人获取组织样品;(b)通过权利要求A的方法分析样品;(c)如果指示转录物的表达超过了阈值水平,进行测定;和(d)根据分析步骤的结果继续进行手术。
69.一种手术中的PCR诊断方法,包括步骤(a)从手术中的病人身上得到组织样品;(b)通过权利要求E的方法分析样品;(c)如果指示转录物的表达超过阈值水平,进行测定;和(d)根据分析步骤的结果推断的方法继续手术。
70.一种手术中的PCR诊断方法,包括步骤(a)从手术中的病人获取组织样品;(b)根据权利要求B的方法分析样品;(c)如果指示转录物的表达超过的阈值水平,进行测定;和(d)根据分析步骤的结果推断的方法继续手术。
71.一种快速检测恶性肿瘤的方法,包括步骤(a)从肿瘤活体检测样本得到核酸;(b)根据权利要求A的方法,对该核酸进行特异于指示转录物的PCR反应;和(c)如果指示转录物的表达超过阈值水平,进行测定,从而指示恶性肿瘤。
72.权利要求71所述的方法,其中指示转录物是CEA。
73.一种用于自动PCR系统的柱体,包括含有第一个PCR引物套和第二个PCR引物套的一个或多个舱,第一个PCR引物套和第二个PCR引物套可以在相同的舱中或在不同的舱中。
74.权利要求73所述的柱体,包括第一个含有第一个PCR引物套的舱和第二个含有第二个PCR引物套的舱。
75.权利要求73所述的柱体,其中第一个PCR引物套具有第一个有效Tm,第二个PCR引物套具有与第一个有效Tm的第二个有效Tm。
76.权利要求73的柱体,另外具有第三个舱,包括逆转录试剂,细胞溶解试剂和RNA纯化试剂中的一个。
77.一种快速检测转移的食管腺癌的方法,包括步骤(a)从岗哨淋巴结得到RNA;(b)对RNA进行特异于CEA的定量RT-PCR方法;和(c)如果CEA的表达超过阈值水平,进行测定。
全文摘要
提供了平衡的增倍PCR方法的方法。在该方法中,当在第一和第二个扩增时期当引物的或选物限制地调节第一个引物套的第一个扩增子和第二个引物套的第二个扩增子生成的相对速度时,在单个试管中利用两个或多个成顺序的暂时PCR时期有效地分开两个或多个PCR反应。同时提供了在手术内诊断和预后中发现特殊用途的快速RT-PCR方法,例如通过确定在岗哨淋巴结中的瘤胚抗原(CEA)的表达水平,在诊断恶性食管腺癌中发现的。
文档编号C12P19/34GK1500151SQ02807671
公开日2004年5月26日 申请日期2002年3月4日 优先权日2001年3月2日
发明者托尼·E·戈德弗里, 托尼 E 戈德弗里, D 卢克蒂奇, 詹姆斯·D·卢克蒂奇, 拉杰, 西瓦·拉杰, A 凯利, 洛瑞·A·凯利, D 芬凯利斯特因, 西德内·D·芬凯利斯特因 申请人:匹兹堡大学

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