在宿主细胞中生成产物的方法

xiaoxiao2020-6-24  4

【专利下载】Tel:18215660330

专利名称:在宿主细胞中生成产物的方法
技术领域
本发明涉及改造宿主细胞的代谢途径,并提供在宿主细胞中生成产物的方法和系统。本发明特别提供在宿主细胞中生成抗坏血酸中间体的方法和系统。
背景技术
在遗传工程宿主细胞中已经利用生物催化生产了许多具有商业利益的产物,例如L-抗坏血酸中间体。L-抗坏血酸(维生素C,ASA)作为维生素和抗氧化剂,应用于医药和食品工业。鉴于作为特殊化学制剂相对较大的市场容量以及较高价值,ASA的合成多年以来颇受关注。
1934年首先公开了Reichstein-Grussner方法,从葡萄糖到ASA的化学合成路线(Helv.Chim.Acta 17311-328)。Lazarus等人(1989,″Vitamin CBioconversion via a Recombinant DNAApproach″,Genetics and Molecular Biology of IndustrialMicroorganisms,American Society for Microbiology,Washington D.C.,由C.L. Hershberger所编)公开了生成ASA中间体2-酮-L-古洛糖酸(2-KLG,KLG)的生物转变方法,该中间体可以化学转变为ASA。将碳源生物转变为KLG涉及多种中间体,是与辅因子依赖性2,5-DKG还原酶活性(2,5-DKGR或DKGR)有关的酶促过程。
已经发现许多细菌品种包含DKGR,特别是棒状细菌(Coryneform)类成员,包括棒杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)和节杆菌属(Arthrobacter)。Grindley等人(1988)Applied and Environmental Microbiology 541770-1775描述了从棒杆菌菌株SHS752001获得的DKGR。Anderson等人的美国专利5,008,193公开了草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)的DKGR。美国专利5,795,761;5,376,544;5,583,025;4,757,012;4,758,514;5,004,690和5,032,514公开了其它的还原酶。
已经描述了涉及糖酵解的酶具有突变的宿主细胞。Harrod等人(1997)J.Ind.Microbiol.Biotechnol.18379-383;Wedlock等人(1989)J.Gen.Microbiol.1352013-2018;以及Walsh等人(1983)J.Bacteriol.1541002-1004描述了具有葡糖激酶突变的酵母。已经描述了葡糖激酶缺陷的细菌。日本专利公开JP4267860描述了葡糖激酶缺陷的片球菌属(Pediococcus sp.)。Russell等人(1989)Appl.Environ.Microbiol.55294-297描述了缺失葡糖激酶的球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)。Barredo等人(1988)Antimicrob.Agents-Chemother 321061-1067描述了缺失葡糖激酶的产黄青霉(Penicillium chrysogenum)。DiMarco等人(1985)Appl.Environ.Microbiol.49151-157描述了葡糖激酶缺陷的运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)突变体。Bouvet等人(1989)International Journal of SystematicBacteriology,61-67页描述了通过恩伯登-梅耶霍夫途径(Embden-Meyerhof pathway)发酵葡萄糖的细菌,例如肠杆菌科(Enterobacteriacea)和弧菌科(Vibrionaceae)成员。Truesdell等人(1991)Journal of Bacteriology,6651-6656页描述了欧文氏菌属(Erwinia sp.)的酮醛糖酸(ketoaldonic acid)代谢途径。
然而,用于生成化合物的大部分现有方法过表达产物。关于用来通过细胞生成目的终产物的底物因新陈代谢(分解代谢)目的而转换的问题仍然存在,降低了效率及其总产量。因此,仍然需要通过与宿主细胞代谢途径有关的途径生成产物的改进方法。本发明即致力于此需要。
此处引用的所有出版物均全文引入以供参考。
发明概述本发明提供制备抗坏血酸中间体的方法,其中包含通过遗传工程改造减少碳底物转向代谢途径从而增加宿主细胞产率的宿主细胞。
在一个实施方案中,本发明提供增强从碳源生成抗坏血酸中间体的方法,其包含,a)获得改变的细菌菌株,其包含失活细菌宿主菌株的染色体基因,b)在适宜条件下培养所述的改变的细菌宿主菌株,以及c)从碳源生成抗坏血酸中间体,其中所述抗坏血酸中间体的生成比未改变的细菌宿主菌株中的抗坏血酸中间体的生成增强。
抗坏血酸中间体可以选自葡糖酸、2-酮-D-葡糖酸、2,5-二酮-D-葡糖酸、2-酮-L-古洛糖酸、L-艾杜糖酸(L-iodonic acid)、异抗坏血酸(erthorbic acid)以及酒石酸。在一个特定实施方案中,所述中间体是2,5-二酮-D-葡糖酸。改变的细菌菌株可以通过失活glk染色体基因获得。改变的细菌菌株也可以通过失活gntk染色体基因获得。改变的细菌菌株还可以通过失活glk和gntk染色体基因获得。所述细菌菌株可以是泛菌(Pantoea),更具体而言是柠檬泛菌(Pantoea citrea)。
在一个实施方案中,该宿主细胞编码在第6位碳磷酸化D-葡萄糖的酶活性的多核苷酸中具有改变,和/或在编码在第6位碳磷酸化D-葡糖酸的酶活性的多核苷酸中具有改变。在碳源存在下培养该宿主细胞,通过直接和/或间接测定,证明产物的产率提高。在本发明某些实施方案中,所述方法包含编码在第6位碳磷酸化D-葡萄糖的酶活性的多核苷酸具有改变、和/或编码在第6位碳磷酸化D-葡糖酸的酶活性的多核苷酸具有改变的宿主细胞。
因此,本发明一方面提供了在重组宿主细胞中生成抗坏血酸中间体的方法,其包含在适于产生所述抗坏血酸中间体的条件下,培养能够在葡萄糖或可由宿主细胞转变为葡萄糖的碳源存在下产生所述抗坏血酸中间体的宿主细胞,其中可以修饰所述宿主细胞,以减少葡萄糖转向生物体的分解代谢途径。所述修饰可以包含至少一种编码使碳源底物转向该分解代谢途径的酶活性的多核苷酸失活或缺失,以致该酶活性的水平在培养过程中受到相应影响。
在本发明的某些实施方案中,所述宿主细胞另外包含至少一种编码在第6位碳磷酸化D-葡糖酸的酶活性的多核苷酸,其中所述多核苷酸已经被修饰,以致在培养期间改变所述酶活性的水平,使其失活、或减少被转运穿过细胞膜和/或磷酸化以供细胞分解代谢途径利用的底物数量。在某些实施方案中,所述方法包含回收所述产物的步骤,在其它实施方案中,所述方法包含将产物转变为另一产物的步骤。
在某些实施方案中,在培养期间调节内源性酶活性的水平,例如通过转录或翻译调节元件。因此,在某些实施方案中,磷酸化D-葡萄糖以供转运穿过细胞膜的酶活性的编码多核苷酸与可调节的启动子可操作性连接。在其它实施方案中,在第6位碳磷酸化D-葡糖酸的酶活性的编码多核苷酸与可调节的启动子可操作性连接。在其它实施方案中,失活所述内源性酶活性,例如通过突变或缺失酶活性编码多核苷酸的部分或全部。
本发明包含生成抗坏血酸中间体,包括葡糖酸、2-酮-D-葡糖酸(2-KDG或KDG);2,5-二酮-D-葡糖酸(2,5DKG或DKG);2-酮-L-古洛糖酸(2KLG或KLG);或L-艾杜糖酸(IA)。在某些实施方案中,所述抗坏血酸中间体是KLG,并将KLG转变为抗坏血酸。在其它实施方案中,所述抗坏血酸中间体是KDG,并将KDG转变为异抗坏血酸。
本发明提供了能够生成ASA中间体的重组宿主细胞,其中该宿主细胞包含编码在第6位碳磷酸化D-葡萄糖的酶活性的多核苷酸,其中该多核苷酸被修饰。本发明也提供另外包含编码在第6位碳磷酸化D-葡糖酸的酶活性的多核苷酸的重组宿主细胞,其中该多核苷酸被修饰。
在某些实施方案中,所述宿主细胞是革兰氏阳性微生物,而在其它实施方案中,所述宿主细胞是革兰氏阴性微生物。在某些实施方案中,所述革兰氏阴性宿主细胞是肠杆菌科(Enterobacteriaceae)宿主细胞,包括欧文氏菌属(Erwinia)、肠杆菌属(Enterobacter)、葡糖杆菌属(Gluconobacter)、醋酸杆菌属(Acetobacter)、棒状杆菌属(Corynebacteria)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)或泛菌属(Pantoea)。
在其它实施方案中,所述宿主细胞可以是天然或经适当遗传修饰以后能够利用一种碳源维持某些细胞功能(例如但不限于,以NAD、FADH2或NADPH的形式产生还原力)、而将另一碳源转变为一种或多种具有商业利益的产物的任何细菌。
在某些实施方案中,在第6位碳磷酸化D-葡萄糖的酶活性包括葡糖激酶、己糖激酶、磷酸转移酶系统(PTS)、或不一定归类于上述三组、却能够具有这种作用的任何其它的酶。例如,一种酶由于其优选底物是果糖而归类为果糖激酶,有可能可以按可测速率磷酸化D-葡萄糖。酶作用于其它类似底物,特别是高水平底物,并不罕见。
在其它实施方案中,在第6位碳磷酸化D-葡糖酸的酶活性包括葡糖酸激酶、脱氧葡糖酸激酶、己糖激酶、磷酸转移酶系统(PTS)、或不一定归类于上述4组、却能够具有这种作用的任何其它的酶。例如,一种酶由于其优选底物是脱氧葡糖酸而归类为脱氧葡糖酸激酶,有可能可以按可测速率磷酸化D-葡糖酸。酶作用于其它类似底物,特别是高水平底物,并不罕见。
本发明也提供用于产生具有改变的水平酶活性的宿主细胞的方法。本发明还提供在第6位碳磷酸化D-葡萄糖的酶活性以及在第6位碳磷酸化D-葡糖酸的酶活性的新的核酸和氨基酸序列。
本发明也提供用于产生宿主细胞的方法,该宿主细胞能够产生来源于葡萄糖和/或果糖的具有工业价值的不同生物分子。
本发明也提供具有改变的水平酶活性的宿主细胞。本发明还提供在第6位碳磷酸化D-葡萄糖第6位碳的酶活性以及在第6位碳磷酸化D-葡糖酸的酶活性的新的核酸和氨基酸序列。
本发明也提供能够产生来源于葡萄糖和/或果糖的具有工业价值的不同生物分子的宿主细胞。
附图简述

图1提供了柠檬泛菌中葡萄糖同化作用涉及的一些代谢途径的示意图。X表示受本发明所述遗传修饰影响的酶促步骤。用T标记的方框代表推定的转运蛋白。
图2.可用于引导葡萄糖进入细胞代谢的某些可能的分解代谢途径。箭头代表至少一个酶促步骤。
图3.描述能够从所示商业途径获得的产物。用于合成左侧所列化合物的大部分碳源能够从分解代谢途径或TCA循环中获得。相反,右侧化合物的大部分碳源来自戊糖途径和/或来自葡萄糖氧化为酮酸。
图4描述柠檬泛菌葡糖激酶(glk)的核酸序列(SEQ ID NO1)。
图5描述柠檬泛菌葡糖激酶(Glk)的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。
图6描述柠檬泛菌葡糖酸激酶(gntk)的核酸序列(SEQ IDNO3)。
图7描述柠檬泛菌葡糖酸激酶(Gntk)的氨基酸序列(SEQ IDNO4)。
图8描述基因glk 30、glk 31、gnt 1、gnt 2、pcgnt 3和pcgnt 4的氨基酸(SEQ ID NO8-13)。
图9描述D-葡萄糖、D-葡糖酸及其某些衍生物。葡萄糖上碳的标准编号由数字1和6所示。2-KDG=2-酮-D-葡糖酸;2,5-DKG=2,5-二酮葡糖酸;2KLG=2-酮-L-古洛糖酸。
图10描述用于破坏柠檬泛菌葡糖酸激酶基因的一般策略。
图11描述用于产生抗坏血酸的氧化途径。E1代表葡萄糖脱氢酶;E2代表葡糖酸脱氢酶;E3代表2-酮-D-葡糖酸脱氢酶;以及E4代表2,5-二酮-D-葡糖酸还原酶。
图12描述能够产生抗坏血酸中间体的宿主细胞发酵过程的净反应(net reaction)。
图13描述野生型生物体接触葡萄糖后发酵的碳放出速率(CER)和氧摄入率(OUR)。
图14描述单缺失(葡糖激酶)发酵的CER和OUR。
图15描述单缺失(葡糖酸激酶)发酵的CER和OUR。
图16描述缺失葡糖激酶和葡糖酸激酶的宿主细胞发酵的CER和OUR。
图17图解说明各个代谢途径(包括糖酵解途径、TCA循环和戊糖途径)与氧化途径的相互关系。Glk=葡糖激酶;Gntk=葡糖酸激酶;IdnO=艾杜糖酸还原酶;IdnD=艾杜糖酸脱氢酶;TKT=转酮醇酶;TAL=转醛醇酶,2KR=2-酮还原酶;2,5DKGR=2,5-二酮葡糖酸还原酶。
图18图解说明各个中央代谢途径与将会增加葡糖酸产生的修饰的相互关系。X表示将要修饰以实现葡糖酸生成所需的增加的酶促途径。
图19图解说明各个中央代谢途径与将会增加异抗坏血酸产生的修饰的相互关系。X表示将要修饰以实现异抗坏血酸生成所需的增加的酶促途径。
图20图解说明各个中央代谢途径与将会增加核糖产生的修饰的相互关系。X表示将要修饰以实现2,5-二酮葡糖酸生成所需的增加的酶促或转运途径。
图21图解说明各个中央代谢途径与将会增加酒石酸产生的修饰的相互关系。X表示将要修饰以实现核糖生成的所需的增加的酶促步骤。IdnO=5-酮-D-葡糖酸5-还原酶;IdnD=1-艾杜糖酸5-脱氢酶。
图22图解说明二羟丙酮磷酸(DHAP)转变为甘油的途径。
图23描述了如实施例7所述用于PCR扩增包含glpK基因的2.9kb DNA片段的引物DNA序列。
图24描述了如实施例7所述柠檬泛菌甘油激酶结构基因的DNA序列。下划线为用于破坏该基因的HpaI位点的序列。
图25描述了如实施例7所述柠檬泛菌甘油激酶的蛋白质序列。
发明详述本发明提供生成抗坏血酸中间体的方法和宿主细胞。已经构建了产生抗坏血酸中间体的重组宿主细胞,以及经遗传改造以减少碳源底物转向分解代谢途径的重组宿主细胞。在一个实施方案中,所述重组宿主细胞产生修饰水平的酶活性,其转运到细胞中,用于分解代谢途径,例如在第6位碳磷酸化D-葡萄糖的酶活性和/或在第6位碳磷酸化D-葡糖酸的酶活性。在葡萄糖或能够由宿主细胞转变为葡萄糖的碳源存在下,培养所述重组细胞时,葡萄糖和/或葡糖酸的胞内代谢减少。
在某些实施方案中,所述宿主细胞是已经遗传改造为生成产物例如抗坏血酸(″ASA″)中间体的柠檬泛菌细胞。在这些实施方案中,本发明提供的特别优点在于,能够利用发酵方法产生ASA中间体。
本发明提供的另一优点在于,使底物的细胞外氧化作用与使用这些氧化产物的代谢途径分开。
本发明提供的另一优点在于,通过直接测定目的产物增加产生、或间接测定耗氧量或CO2废气(CO2产生),证明与野生型的生物转化相比,产生抗坏血酸中间体的效率增加。
本发明提供的另一优点在于,宿主细胞能够同时利用两种不同碳源产生抗坏血酸中间体。
一般技术除非另外说明,实施本发明将使用本领域技术范围内的分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学和生物化学的常规技术。文献中充分阐明了这些技术,例如Molecular CloningALaboratory Manual,第二版(Sambrook等人,1989);CurrentProtocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人编著,1987以及年度更新};Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编著,1984);以及PCRThe Polymerase Chain Reaction,(Mullis等人编著,1994);Manual of Industrial Microbiology andBiotechnology,第二版(A.L.Demain等人编著,1999)。
定义此处所用″宿主细胞氧化途径″是指宿主细胞包含至少一种氧化碳源例如D-葡萄糖和/或其代谢物的氧化酶。宿主细胞中″膜″或″膜结合″葡萄糖氧化途径是指宿主细胞通过至少一种膜结合的氧化酶活性氧化碳源,例如D-葡萄糖和/或其代谢物。在某些实施方案中,宿主细胞氧化途径包含一种酶活性。在其它实施方案中,宿主细胞氧化途径包含两种或多种酶活性。
此处所用″宿主细胞分解代谢途径″是指宿主细胞包含至少一种通过例如磷酸化碳源(例如D-葡萄糖和/或其代谢物)产生ATP或NADPH的酶活性。宿主细胞″胞内″分解代谢途径是指宿主细胞在其细胞质中包含至少一种该酶活性。在某些实施方案中,宿主细胞分解代谢途径包含一种酶活性。在其它实施方案中,宿主细胞分解代谢途径包含两种或多种酶活性。分解代谢途径包括但不限于糖酵解、戊糖途径以及TCA途径(参见图17)。
此处所用短语″酶促转运系统″是指消耗能量(ATP)并一般通过在D-葡萄糖第6位碳上添加磷酸而转运碳底物穿过细胞膜的酶活性,包括葡糖激酶(E.C.-2.7.1.2)和磷酸转移酶系统(PTS)(E.C.-2.7.1.69)的酶活性。
此处所用短语″在第6位碳磷酸化D-葡糖酸的酶活性″是指在其第6位碳磷酸化D-葡糖酸的酶活性,包括葡糖酸激酶(E.C.-2.7.1.12)酶活性。
此处所用短语″在第6位碳磷酸化D-葡萄糖的酶活性″是指在D-葡萄糖第6位碳上添加磷酸的酶活性,包括葡糖激酶(E.C.-2.7.1.2)和磷酸转移酶系统(PTS)(E.C.-2.7.1.69)酶活性。
此处所用短语″在第6位碳磷酸化D-葡糖酸的酶活性″是指在其第6位碳磷酸化D-葡糖酸的酶活性,包括葡糖酸激酶(E.C.-2.7.1.12)酶活性。
此处所用宿主细胞产生的″修饰″水平的酶活性或宿主细胞″修饰水平″的酶活性是指控制在培养期间产生的酶活性水平,使其水平按需增减。酶活性水平的所需变化可能遗传改造,以同时或按任何顺序依次产生一种或两种酶活性。为了控制酶活性水平,遗传改造宿主细胞,使编码酶活性的核酸受转录或翻译控制。
此处所用术语″修饰″在涉及核酸或多核苷酸时,是指该核酸相比野生型核酸已经按某种方式改变,例如通过突变;缺失核酸的部分或全部;或通过与转录控制区可操作性连接。此处所用术语″突变″在涉及核酸时,是指核酸中的任何改变,以致该核酸的产物部分或完全失活或缺失。突变的例子包括但不限于编码酶活性的基因的点突变、移码突变以及部分或全部缺失,例如转运底物穿过细胞膜的酶活性,比如在其第6位碳磷酸化D-葡萄糖或在其第6位碳磷酸化D-葡糖酸的酶活性。
本发明″改变的菌株″是在基本相同的生长条件下,遗传改造的细菌微生物的产生水平相对于相应未改变的细菌宿主菌株中同样终产物的产生水平增加。″未改变细菌菌株″或宿主是其中转向酶促途径的编码序列未失活并保持酶促活性的细菌微生物。产生水平增加是由一种或多种染色体基因的失活引起。在一个实施方案中,表达水平增加是由一种或多种染色体基因的缺失引起。在另一个实施方案中,表达水平增加是由一种或多种染色体基因的插入失活引起。优选地,所述失活基因选自如本申请所述需要失活的酶的编码基因。例如,在一个实施方案中,一种或多种染色体基因选自glk和gntk。
在某些实施方案中,改变的芽胞杆菌菌株可能包含两种失活基因、三种失活基因、四种失活基因、五种失活基因、六种失活基因或更多。所述失活基因可能互相邻接或位于芽胞杆菌染色体的分开的区域。失活的染色体基因可能具有为一定条件下所必需的功能,但该基因不为芽胞杆菌菌株在实验室条件下的存活所必需。优选的实验室条件包括但不限于诸如在发酵罐、振摇的平板或平板培养基等中生长的条件。
此处所用术语″失活″在涉及酶活性时,是指利用任何方法去除活性,包括酶活性编码核酸的突变、或部分或全部缺失。术语″失活″包括防止一种或多种目的染色体基因功能表达的任何方法,其中该基因或基因产物不能发挥其已知功能。所述目的染色体基因取决于意欲失活的酶活性。例如,失活葡糖激酶和/或葡糖酸激酶活性可以通过失活glk和/或gntk染色体基因实现。失活可能包括诸如核酸基因序列缺失、突变、破坏或插入等方法。在一个实施方案中,只要蛋白质的生物活性改变,失活基因的表达产物便可能是截短的蛋白质。生物活性的改变可以是改变的活性,但优选丧失生物活性。在本发明改变的细菌菌株中,一种或多种基因的失活优选稳定、不可逆的失活。
在优选实施方案中,优选通过同源重组缺失基因。例如,如图9所示,如果要缺失glk基因,则将氯霉素抗性基因克隆入葡糖激酶基因中的限制性位点。将CmR基因插入基因结构编码区的Pst I位点。然后使用非复制型R6K载体通过同源重组将修饰转入柠檬泛菌glkA-的染色体中。然后从glk编码区去除CmR基因,在编码区留下中断的间隔区,使编码区失活。在另一实施方案中,通过替换部分编码区而将CmR基因插入编码区中。随后去除CmR基因,而不伴有编码区替换掉部分的重新插入,引起一部分编码区的有效缺失,使该区域失活。
此处所用的基因缺失可能包括缺失整个编码序列、缺失部分编码序列、或缺失包括侧翼区的编码序列。只要留在染色体中的序列对于基因的生物活性而言太短,则该缺失就可能是部分缺失。编码序列的侧翼区可能包括5’和3’端约1-500bp。侧翼区可能大于500bp,但优选在根据发明可能失活或缺失的区域中不包括其它基因。最终的结果是所缺失的基因实际上没有功能。
在另一优选实施方案中,通过插入失活。例如,如果glk是将要失活的基因,则DNA构建体将包含具有由选择性标记中断的glk基因的引入序列。选择性标记两侧与glk编码序列的片段侧接。该DNA构建体与宿主染色体中与glk基因基本相同的序列排列一起,在双交叉事件中,通过插入选择性标记失活glk基因。
在另一实施方案中,以质粒为载体,在单交叉事件中通过插入失活。例如,glk染色体基因与包含基因或部分基因编码序列和选择性标记的质粒排列一起。该选择性标记可能位于基因编码序列内部,或位于与该基因分开的质粒的一部分。该载体整合到芽胞杆菌染色体中,通过载体插入编码序列而使基因失活。
也可能通过基因突变而失活。基因突变的方法为本领域公知,包括但不限于化学诱变、定点突变、产生随机突变以及缺口复制(gapped-duplex)方法。(USP 4,760,025;Moring等人,Biotech.2646(1984);以及Kramer等人,Nucleic Acids Res.129441(1984))。
通过对目的基因组区域的相应启动子区应用上述失活方法,也能发生失活。
″在转录控制下″或″转录控制″是本领域十分理解的术语,表示多核苷酸序列、通常为DNA序列的转录取决于其与起始、或启动转录的元件可操作性(可操作性)连接。″可操作性连接″是指邻接(juxtaposition),其中该元件处于使其发挥功能的排列中。
此处所用术语″可调节性启动子″是指可以调节其活性或功能的启动子元件。能够以多种方式进行调节,最常见的是通过蛋白质相互作用,干扰或增加RNA聚合酶启动转录的能力。
″在翻译控制下″是本领域非常理解的术语,表示在形成mRNA之后发生的调节过程。
此处所用术语″分批(batch)″描述了在运行开始时,最初以固体或浓缩液的形式向其中加入底物的分批细胞培养。分批培养开始于向培养基中接种细胞,但与补料-分批(fed-batch)培养相反,并不后续流加营养物,例如通过浓缩营养进料。与连续培养相反,分批细胞培养并不在培养物中系统性添加或去除培养液或细胞。由于培养基中营养物和代谢物的浓度取决于该批次的起始浓度,所添加营养物的组成随后因发酵作用而改变,因而不能后续向培养基中添加各种分析物。
此处所用术语″补料-分批″描述了在运行期间以固体或浓缩液的形式定时或连续向其中添加底物的批次细胞培养。补料-分批培养与分批培养同样开始于向培养基中接种细胞,但不同之处在于随后流加营养物,例如通过浓缩营养进料。与连续培养不同,补料-分批培养并不系统性去除培养液或细胞,由于培养基中营养物和代谢物的浓度容易控制或容易受改变营养成分补料的影响,因而有利于监控和控制培养基中各种分析物水平的有关应用。输送至补料-分批培养的营养进料一般是包含能源例如碳水化合物的浓缩营养液;输送至补料-分批培养的浓缩营养液可以任选包含氨基酸、脂质前体和/或盐。补料-分批培养中,在补充足够营养物用于连续细胞生长时,一般浓缩营养进料,以使培养体积的增加减到最小。
此处使用术语″连续细胞培养″或仅仅″连续培养″描述以液体营养进料的连续流入以及液体连续流出为特征的培养。营养进料可以但不一定是浓缩营养进料。以大致相同的速率连续补充营养液,通过用过的培养基将细胞冲洗出反应器,使培养物保持稳定增殖和生长状态。在称为恒化器的生物反应器类型中,细胞培养连续加料新鲜的营养培养基,并连续排出用过的培养基、细胞以及分泌的细胞产物。另外,连续培养可能形成″灌流培养″,其中流出液包含基本上不含细胞、或基本上低于生物反应器中细胞浓度的培养基。在灌流培养中,可以通过例如过滤、离心或沉淀保留细胞。
此处所用″培养″是指在反应容器中将碳源底物通过发酵生物转化为目的终产物。此处所用生物转化是指通过微生物接触碳源底物而将碳源底物转化为目的终产物。
此处所用″氧摄入率″或″OUR″是指确定反应容器内氧的比耗(specific consumption)。可以利用各种在线检测确定氧消耗。在一个实施例中,按下式确定OUR(mmol/(升*小时))((空气流量(升/分种)/发酵重量(发酵液按公斤重量))X供O2X培养液密度X(21.1C而标准20.0C空气流量校准的校正常数))-([空气流量/发酵重量]×[废气O2/废气N2]X供N2X培养液密度X常数)。
此处所用″碳放出率″或″CER″是指确定发酵期间反应容器内产生多少CO2。通常由于最初或随后不向反应容器提供CO2,任何CO2都假定为由反应容器内存在的发酵过程产生。″废气CO2″是指通常利用本领域已知的质谱方法在反应容器内测定的CO2数量。
此处所用″产率″是指产物量/底物量。产率可以表示为重量%(产物gm/底物gm)或产物摩尔数/底物摩尔数。例如,可以通过进料速率和添加葡萄糖的浓度确定底物例如葡萄糖的数量。利用各种分光光度法或分析方法确定存在的产物量。其中一种方法是高效液相层析(HPLC)。增加的产率是指与利用野生型生物体的转变产率相比产率增加,例如比野生型产率增加10%、20%或30%。
此处所用短语″生产酶″是指可以催化底物转化为目的产物的酶或酶系统。生产酶包括但不限于氧化酶和还原酶。
此处所用短语″氧化酶″是指可以催化特定氧化态的底物转化为氧化态高于底物的产物的酶或酶系统。此处所用短语″还原酶″是指可以催化特定氧化态的底物转化为氧化态低于底物的产物的酶或酶系统。在此处公开的一个说明性实施例中,已经改造为产生ASA中间体的泛菌细胞中与生物催化D-葡萄糖或其代谢物有关的氧化酶包括D-葡萄糖脱氢酶、D-葡糖酸脱氢酶和2-酮-D-葡糖酸脱氢酶。在此处公开的另一个说明性实施方案中,如此处所述已经改造为产生ASA中间体的泛菌细胞中与生物催化D-葡萄糖或其代谢物有关的还原酶包括2,5-二酮-D-葡糖酸还原酶、2-酮还原酶和5-酮还原酶。上述酶包括宿主菌株天然产生或通过重组方法引入的酶。
此处所用术语″碳源″包含微生物通常使用的合适碳源,例如6碳糖,包括但不限于D或L形式的葡萄糖、古洛糖、山梨糖、果糖、艾杜糖、半乳糖和甘露糖,或6碳糖的组合,例如葡萄糖和果糖,和/或6碳糖酸,包括但不限于2-酮-L-古洛糖酸、艾杜糖酸、葡糖酸、6-磷酸葡糖酸、2-酮-D-葡糖酸、5-酮-D-葡糖酸、2-酮-葡糖酸磷酸、2,5-二酮-L-古洛糖酸、2,3-L-二酮古洛糖酸、脱氢抗坏血酸、异抗坏血酸和D-甘露糖酸或其酶促衍生物。
此处使用的下列缩写用于D-葡萄糖或葡萄糖(G);D-葡糖酸或葡糖酸(GA);2-酮-D-葡糖酸(2KDG);2,5-二酮-D-葡糖酸(2,5DKG或DKG);2-酮-L-古洛糖酸(2KLG或KLG);L-艾杜糖酸(IA);异抗坏血酸(EA);抗坏血酸(ASA);葡糖脱氢酶(GDH);葡糖酸脱氢酶(GADH);2,5-二酮-D-葡糖酸还原酶(DKGR);2-酮-D-葡糖酸还原酶(KDGDH);D-核糖(R);2-酮还原酶(2KR或KR)以及5-酮还原酶(5KR或KR)。
″允许从碳源生成抗坏血酸中间体,其中该抗坏血酸中间体的生成较之未改变的细菌宿主菌株中抗坏血酸中间体的生成增强″是指该改变的细菌菌株接触底物,例如碳源,以产生目的终产物。本发明人发现通过失活基因组表达从而改变某些酶活性,该微生物显示增强的终产物生成。
此处所用″目的终产物″是指碳源底物生物转化成的目的化合物。目的终产物可能是希望的实际化合物或另一途径的中间体。典型的目的终产物列于图3右侧。
此处所用术语细菌是指任何一组原核、即缺少膜结合的核以及细胞器的微小生物体。所有细菌由调节物质进出细胞的脂膜包裹。坚硬的细胞壁完全包裹着细菌,并位于膜外。存在许多不同类型的细菌,其中一些包括而不限于肠杆菌科、芽胞杆菌属、链霉菌属、假单胞菌属以及欧文氏菌属家族的菌株。
此处所用″肠杆菌科″家族是指具有革兰氏阴性的一般特征并且兼性厌氧的细菌菌株,包括大肠杆菌属(Escherichia coli)、志贺氏菌属(Shigella)、爱德华氏菌属(Edwardsiella);沙门氏菌属(Salmonelle)、柠檬酸细菌属(Citrobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、肠杆菌属(Enterobacter)、沙雷氏菌属(Serratia)、变形杆菌属(Proteus)、摩根氏菌属(Morgarella)、普罗威登斯菌属(Providencia)以及耶尔森氏菌属(yersinia)中所包含的属。为了产生ASA中间体,优选的肠杆菌科菌株是能够从D-葡萄糖或可以由该菌株转变为D-葡萄糖的碳源产生2,5-二酮-D-葡糖酸的菌株。能够从D-葡萄糖溶液产生2,5-二酮-D-葡糖酸的肠杆菌科家族包括例如欧文氏菌属、肠杆菌属、葡糖杆菌属以及泛菌属。从碳源到ASA的微生物途径的中间体包括但不限于GA、KDG、DKG、DKG、KLG、IA和EA。本发明用于产生ASA中间体的优选的肠杆菌科发酵菌株是泛菌种,特别是柠檬泛菌。产生ASA中间体的其它肠杆菌科菌株包括但不限于大肠杆菌和葡糖杆菌属。
此处所用″芽胞杆菌属″家族是指具有革兰氏阳性一般特征、能够在某些环境条件下产生孢子的杆状细菌菌株。
此处所用术语″重组体″是指例如通过添加该生物体中非天然存在的核酸,或通过改变该宿主细胞中天然存在的核酸而具有基因组改变的宿主细胞,包括具有通过重组方法引入的另外拷贝的内源性核酸的宿主细胞。此处所用术语″异源性″是指宿主细胞中非天然存在的核酸或氨基酸序列。此处所用术语″内源性″是指宿主中天然存在的核酸。
此处所用术语″分离″或″纯化″是指从与其天然关联的至少一种成分分开的酶、或核酸、或蛋白质、或肽、或辅因子。在本发明中,分离的核酸可以包括包含核酸的载体。
本领域相当理解,糖的酸性衍生物如果在溶液中,或如果为固体形式,处于其所制备的溶液之外,取决于环境介质,有各种电离状态。使用术语例如艾杜糖酸表示上述分子,意在包括所述有机分子的所有电离状态。因而,例如″艾杜糖酸″、其环化形式″艾杜内酯(idonolactone)″和″艾杜糖酯″是指相同的有机部分,并不意在表示特定的电离状态或化学形式。
此处所用术语″载体″是指设计用于转导/转染一种或多种细胞类型的多核苷酸构建体,包括例如设计用于分离、增殖和复制插入核苷酸的″克隆载体″,或者设计用于在宿主细胞例如柠檬泛菌或大肠杆菌宿主细胞中表达核苷酸序列的″表达载体″。
此处可交换使用的术语″多核苷酸″和″核酸″是指任何长度的多聚形式核苷酸,核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸皆可。这些术语包括单链、双链或三链DNA、基因组DNA、cDNA、RNA、DNA-RNA杂交体、或包含嘌呤和嘧啶碱基、或其它天然的、化学的、生物化学修饰的、非天然的、或衍生的核苷酸碱基的多聚体。多核苷酸的主链可以包含糖和磷酸基(如同一般在RNA或DNA中存在的一样)、或修饰的、或取代的糖或磷酸基。另外,多核苷酸的主链可以包含合成的亚基例如氨基磷酸酯的多聚体,因而可以是寡脱氧核苷的氨基磷酸酯(P-NH2)或混合的氨基磷酸酯-磷酸二酯寡聚体。Peyrottes等人(1996)NucleicAcids Res.241841-8;Chaturvedi等人(1996)Nucleic AcidsRes.242318-23;Schultz等人(1996)Nucleic Acids Res.242966-73。可以使用硫代磷酸酯键取代磷酸二酯键。Braun等人(1988)J.Immunol.1412084-9;Latimer等人(1995)Molec.Immunol.321057-1064。此外,通过合成互补链并在合适条件下退火,或者利用DNA聚合酶及合适引物从头合成互补链,可以由化学合成的单链多核苷酸产物获得双链多核苷酸。有关多核苷酸序列(例如有关SEQ ID NO)也包括互补序列。
以下是多核苷酸的非限制性实例基因或基因片段、外显子、内含子、mRNA、tRNA、rRNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离DNA、任何序列的分离RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可能包含修饰的核苷酸(例如甲基化核苷酸和核苷酸类似物)、尿嘧啶(uracyl)、其它糖和连接基团(例如氟化核糖(fluororibose)和thioate)以及核苷酸分支。核苷酸序列可能被非核苷酸成分中断。多核苷酸可能在聚合以后进一步修饰,例如通过缀合标记成分。该定义中包括的其它修饰类型有戴帽、利用类似物替换一种或多种天然存在的核苷酸、以及引入使多核苷酸附着蛋白质、金属离子、标记成分、其它多核苷酸、或固体支持物的方法。优选所述多核苷酸是DNA。此处所用″DNA″不仅包括碱基A、T、C和G,而且包括这些碱基的任何类似物或修饰形式,例如甲基化核苷酸、核苷内部修饰(例如不带电的连接以及thioates),使用糖类似物、以及修饰和/或改变主链结构(例如聚酰胺)。
多核苷酸或多核苷酸区域与另一序列具有某一百分比″的序列一致性″(例如80%、85%、90%、95%、97%或99%),是指在比对时,比较两个序列中的相同碱基的百分比。该比对以及同源性百分比或序列一致性可以利用本领域已知的软件程序确定,例如CurrentProtocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人编著,1987)增刊30,7.7.18节所述的。优选的比对程序为ALIGN Plus(Scientific and Educational Software,Pennsylvania),优选使用如下缺省参数错配=2;开放缺口=0;延伸缺口=2。
SEQ ID NO″描述″的多核苷酸序列是指SEQ ID NO中所示的相同连续序列。该术语包含该SEQ ID NO的部分或区域以及该SEQ ID NO内包含的完整序列。
″表达″包括转录和/或翻译。
此处所用术语″包含″及其同源词使用其包括在内的含义;即相当于术语″包括″及其同源词。
除非上下文清楚规定,否则″一″、″一个″和″该″包括复数含义。
酶活性三糖、四糖、戊糖、己糖和庚糖形成磷酸酯。所有糖代谢的开始步骤是其磷酸化。从而葡萄糖被磷酸化为葡萄糖-6-磷酸。可以代谢葡萄糖的所有细胞均包含催化以下反应的某种形式的己糖激酶图9描述了D-葡萄糖,并图示″第6位碳″。典型的己糖激酶包括己糖激酶(Frohlich等人,1985,Gene 36105-111)和葡糖激酶(Fukuda等人,1983,J.Bacteriol.156922-925)。柠檬泛酸葡糖激酶结构基因的DNA序列如图4所示。限制酶NcoI(CCATGG)和SnaBI(TACGTA)的识别位点显著标出。图5描述了柠檬泛菌葡糖激酶基因的蛋白质序列。多数己糖激酶为某种程度非特异性,显示具有催化形成甘露糖、果糖和半乳糖的6-磷酸酯的某些能力。此外,其它己糖衍生物也可能由己糖激酶磷酸化。例如,葡糖酸(图3)也可能被激酶磷酸化,特别是葡糖酸激酶(引用)。柠檬泛菌葡糖酸激酶结构基因的序列如图6所示。限制酶Pst I的识别位点(CTGCAG)著重标出。柠檬泛菌葡糖酸激酶基因的蛋白质序列如图7所示(SEQ ID NO4)。某些葡糖激酶和葡糖酸激酶的基因(glk,gntk等)如图8所示。
图17显示分解代谢途径和氧化途径之间的相互关系。葡萄糖可以由葡糖激酶(Glk)磷酸化为葡萄糖-6-磷酸,通过糖酵解途径进入分解代谢途径;以及由葡糖酸激酶(Gntk)磷酸化葡糖酸为葡糖酸-6-磷酸,通过戊糖途径进入分解代谢途径。通过修饰其(glk和/或gntk)编码核酸或多肽而失活或修饰葡糖激酶和葡糖酸激酶的水平,引起目的产物例如抗坏血酸中间体的产率增加。利用遗传修饰消除分解代谢功能与合成目的产物所需的酶促反应之间的联系。虽然在一个实施方案中修饰了葡糖激酶和葡糖酸激酶,本发明人关注修饰其它的酶促步骤,以使其与氧化、分解代谢途径分开。
在另一实施方案中,将分解代谢途径与产生途径分开,以增加5-KDG和/或酒石酸的生成。如图21所示,葡萄糖可以通过糖酵解途径、例如通过葡糖-6-磷酸,通过葡糖酸-6-磷酸及其它抗坏血酸副产物、例如艾杜糖酸和2-KLG的戊糖途径,进入分解代谢途径。通过修饰其编码核酸或多肽,失活或修饰葡糖激酶、葡糖酸激酶、2,5-DKG还原酶、5-酮-D-葡糖酸5-还原酶(idnO)和艾杜糖5-脱氢酶(idnD)的水平,引起目的产物例如5-DKG和/或酒石酸的产率增加。
在另一实施方案中,将分解代谢途径与产生途径分开,以增加葡糖酸的生成。如图18所示,葡萄糖可以通过糖酵解途径、例如通过葡糖-6-磷酸,以及通过葡糖酸-6-磷酸的戊糖途径,进入分解代谢途径。通过修饰其编码核酸或多肽而失活或修饰葡糖激酶、葡糖酸激酶以及甘油醛氢化酶的水平,引起目的产物例如葡糖酸的产率增加。
在另一实施方案中,将分解代谢途径与产生途径分开,以增加异抗坏血酸的生成。如图19所示,葡萄糖可以通过糖酵解途径,例如通过葡糖-6-磷酸;通过葡糖酸-6-磷酸的戊糖途径;以及通过酶促转运系统转运2-KDG和2,5-KDG到细胞质,从而进入分解代谢途径。通过修饰其编码核酸或多肽而失活或修饰葡糖激酶、葡糖酸激酶和2-KDG氢化酶的水平;以及2-KDG进入细胞质的转运系统,引起目的产物例如异抗坏血酸的产率增加。
在另一实施方案中,将分解代谢途径与产生途径分开,以增加2,5-DKG的生成。如图20所示,葡萄糖可以通过糖酵解途径,例如通过葡糖-6-磷酸;通过葡糖酸-6-磷酸的戊糖途径;以及通过酶促转运系统转运2-KDG和2,5-KDG到细胞质,从而进入分解代谢途径。通过修饰其编码核酸或多肽而失活或修饰葡糖激酶、葡糖酸激酶和2-KDG氢化酶的水平;以及2-KDG进入细胞质的转运系统,引起目的产物例如2,5-DKG的产率增加。
可获得影响酶在外源宿主中表达的重组技术,使得本发明这一方面可以完成,即预想利用减少碳底物转向分解代谢途径而从易于获得的碳源底物生成抗坏血酸中间体。该方法相当优于现有方法,其特征在于减少底物转为分解代谢途径从而不能转化为目的氧化终产物例如抗坏血酸中间体的数量。由此导致与野生型生物体发酵相比,增加发酵效率和产率。某些野生型生物体可能产生抗坏血酸中间体,例如2-KLG,然而产生水平可能不足以具有经济可行性。已经注意到野生型柠檬泛菌具有自身的细胞质葡糖激酶和葡糖酸激酶,使生物体能够将葡萄糖转换为磷酸化衍生物,用于中央代谢途径,并且其生成必需消耗能量ATP,导致更多碳转到非2-KLG生成途径。如下所述在本申请另外所述的两个中断质粒中,于相同的对照条件下使用本发明方法,可以从柠檬泛菌基因组中缺失葡糖激酶和葡糖酸激酶基因,使得修饰的柠檬泛菌能够从葡萄糖产生比野生型水平增加的DKG,例如从63%到约97-98%的产率水平。[参见实施例6]。
产生本发明中包括的单个生物体转化的方法包含构建上述缺失的激酶的表达载体,通过上述任何基因转移方法,例如转化、转导或缀合,将该载体转移到能够将一般代谢物初始转化为该酶的2,5-DKG底物的细胞中。如以下实施例所述,基因转移产生具有增加抗坏血酸中间体产率特征的生物体。说明书描述了载体构建、基因转移以及使用所得生物体的细节。
另一方法是,从已知包含所述基因的生物体中克隆已知影响葡萄糖或其它一般代谢物转化为2,5-DKG的酶的编码基因,构建包含该克隆基因序列的表达载体,并将该载体转移到正常产生2,5-DKG还原酶的细胞中。影响一般代谢物转化为2,5-DKG的酶的例子有,D-葡萄糖脱氢酶(Adachi,O.等人,Agric.Biol.Chem.,44(2)301-308 Ameyama,M.等人,Agric.Biol.Chem.45[4]851-861 ),D-葡糖酸脱氢酶(McIntire,W.等人,Biochem.J.,231651-654 ;Shinagawa,E.等人,Agric.Biol.Chem.40[3]475-483 ;Shinagawa,E.等人,Agric.Biol.Chem.42[5]1055-1057 ),5-酮-D-葡糖酸脱氢酶和2-酮-D-葡糖酸脱氢酶(Shinagawa,E.等人,Agric.Biol.Chem.,45(5)1079-1085 )。第三种方法是,将包含转化一般代谢物为2-KLG的酶的完整序列转移到中性宿主中。该最后方法的优点在于,可以几乎任意选择宿主生物体,而无论其可能具有任何所需生长特征和营养需求。因此,使用具有适当培养和生长经验的生物体,例如大肠杆菌和芽胞杆菌,作为宿主细胞,在细菌产生酶或底物方面比其它方法具有一致性的优点。
一旦产生了能够进行转化的生物体,便可以根据重组酶表达载体的构建特性以及宿主的生长特征,利用各种方法实现本发明的方法。宿主生物体一般在有利于产生大量细胞的条件下生长。积聚大量细胞时,重组基因序列提供的启动子变成或者已经是活性的,可转录和翻译编码序列。当这些基因适当表达并由此存在所需催化量的酶时,将原料例如葡萄糖按1-500g/L的水平加入培养基中,将培养物维持在约20-40℃、优选约25-37℃ 1-300小时,直至实现转化2-KLG。原料浓度可能通过连续进料控制维持在恒定水平,利用本领域已知方法,从培养基中分批或连续回收产生的2-KLG。
C.本发明涉及的一般方法在下述实施例中,以下一般方法用于有关探针构建、筛选、探针与目的物杂交以及载体构建。
C.1质粒分离、限制酶切割使用在此引入以供参考的Clewell,D.B.和Helinski,Biochemistry 94428(1970)的清亮裂解液方法(clearedlysate method),从所鉴定的培养物中分离质粒,利用Biorad A-50 Agarose柱层析进行纯化。使用Birnboim,H.C.NucleicAcids Research 71513(1979)的方法小量制备(mini-preps)。
利用10-50单位的合适限制酶或系列限制酶,在包含所用限制酶的适当缓冲液或系列缓冲液的约600.mu.l溶液中处理约20.mu.g质粒;每种酶在37℃温育1小时,制备克隆质粒的片段,用于测序。每种酶温育以后,通过酚-氯仿抽提和乙醇沉淀去除蛋白质,回收核酸。
如图1所示,分解代谢、戊糖和三羧酸(TCA)途径存在多种联系。GDH=葡萄糖脱氢酶;GADH=葡糖酸脱氢酶;2-kDGH=2-酮-d-葡糖酸脱氢酶;2-KDG=2-酮-D-葡糖酸;IADH=艾杜糖酸脱氢酶;2,5-DKG=2,5-二酮葡糖酸;2KLG=2-酮-L-古洛糖酸;5-KDG=5-酮-D-葡糖酸;2KR=2-酮还原酶;2,5DKGR=2,5-二酮葡糖酸还原酶;GIkA=葡糖激酶;GntK=葡糖酸激酶;5-KR=5-酮还原酶;2,5-DKGR。可以看到,去除葡糖激酶活性阻断了葡萄糖进入分解代谢途径,而缺失葡糖酸激酶活性不能使葡糖酸进入戊糖同化途径。由此图显而易见,缺少葡糖激酶和/或葡糖酸激酶活性将损害葡萄糖及其氧化产物的代谢。
ASA中间体的产生本发明提供了在宿主细胞中生成抗坏血酸中间体的方法。本发明包含在部分或全部培养期间,降低在第6位碳磷酸化D-葡萄糖的酶活性水平和/或在第6位碳磷酸化D-葡糖酸的酶活性水平的方法。本发明包含在部分或全部培养期间,增加在第6位碳磷酸化D-葡萄糖的酶活性水平和/或在第6位碳磷酸化D-葡糖酸的酶活性水平的方法。本发明还包含一种方法,其中在第6位碳磷酸化D-葡萄糖的酶活性水平和/或在第6位碳磷酸化D-葡糖酸的酶活性水平没有改变,或者在开始培养时增加,以促进生长,即产生细胞生物质,而在培养后期降低,以促进目的产物积累。
本发明提供了使宿主生物体中氧化途径与分解代谢途径分开的改变的核酸或多核苷酸。在一个实施方案中,该改变的核酸或多核苷酸缺少表达目的产物磷酸化的编码,因而失活了磷酸化酶活性。
ASA中间体可能进一步转变为目的终产物,例如ASA或异抗坏血酸。为了产生ASA中间体,可以使用能够将碳源转变为DKG的任何宿主细胞。优选肠杆菌科家族的菌株是可以从D-葡萄糖溶液产生2,5-二酮-D-葡糖酸的菌株,包括泛菌,描述于Kageyama等人(1992)International Journal of Systematic Bacteriology 42卷,203-210页。在优选实施方案中,所述宿主细胞是编码内源性葡糖激酶(由SEQ ID NO1所示核酸编码)的部分或全部多核苷酸缺失以及编码内源性葡糖酸激酶(由SEQ ID NO3所示核酸编码)的部分或全部多核苷酸缺失的柠檬泛菌。
ASA中间体的产生可以在发酵环境、即体内环境,或非发酵环境、即体外环境;或结合体内/体外环境中进行。在以下进一步描述的方法中,所述宿主细胞或体外环境另外包含失活磷酸化活性(例如葡糖激酶序列和葡糖酸激酶序列)编码片段的异源基因组。
A.体内生物催化环境本发明包含编码在第6位碳磷酸化D-葡萄糖的内源性酶活性的多核苷酸包含改变、和/或编码在第6位碳磷酸化D-葡糖酸的酶活性的多核苷酸包含改变的宿主细胞的用途,用于体内产生ASA中间体。在具有一般为肠杆菌科菌株使用的合适碳源(诸如6碳糖(例如葡萄糖)、或6碳糖酸、或6碳糖和/或6碳糖酸的组合物)的环境中培养宿主细胞,开始生物催化。其它碳源包括但不限于半乳糖、乳糖、果糖、或其酶促衍生物。除合适的碳源之外,发酵培养基必须包含为本领域技术人员已知的合适无机物、盐、辅因子、缓冲液及其它成分,用于培养物生长并促进产生目的终产物所需的酶促途径。
在举例说明的泛菌体内途径中,D-葡萄糖经过可能包括D-葡萄糖脱氢酶、D-葡糖酸脱氢酶以及2-酮-D-葡糖酸脱氢酶的一系列酶促转化的膜氧化步骤,产生可能包括但不限于GA、KDG和DKG的中间体,参见图1。这些中间体经过可能包括2,5-二酮-D-葡糖酸还原酶(DKGR)、2-酮还原酶(2-KR)和5-酮还原酶(5-KR)的一系列酶促转化的胞内还原步骤,产生包括但不限于KLG和IA的终产物。在用于产生ASA中间体的体内环境的优选实施方案中,缺失5-KR活性,以避免消耗IA。其它实施方案根据目的产物以及待失活的目的途径,具有其它所需失活的核酸片段。
如果目的中间体是KLG,则将DKGR的编码核酸重组引入泛菌发酵菌株。已经发现许多细菌品种包含DKGR,特别是棒状细菌类成员,包括棒杆菌属、短杆菌属和节杆菌属。
在本发明的某些实施方案中,将棒杆菌属菌株SHS752001(Grindley等人,1988,Applied and Environmental Microbiology541770-1775)的2,5-DKGR重组引入泛菌菌株中。Anderson等人的美国专利5,008,193公开了利用草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)产生重组2,5-DKG还原酶。表I提供了DKG还原酶的其它来源。
可利用分批方法或连续方法进行发酵。在分批方法中,不管加入什么,均同时收集全部发酵液。在连续系统中,定期取出发酵液,进行下游处理,同时加入新鲜底物。可利用多种方法,包括离子交换树脂、吸收或离子阻滞型树脂、活性碳、浓缩-结晶、过膜等,从发酵液中回收所产生的中间体。
B.体外生物催化环境本发明提供了在体外或非发酵环境、例如生物反应器中,从碳源生物催化产生ASA中间体,例如KDG、DKG和KLG。首先培养用于生长的细胞,对于非发酵方法则去除供生长使用的碳源,pH维持约pH4-9,并给氧。
根据所生成的目的中间体,该方法可能需要存在酶促辅因子。在此处公开的优选实施方案中,该酶促辅因子是再生的。在某些实施方案中,KDG是所产生的目的ASA中间体,则生物反应器具备包含通常编码在第6位碳磷酸化D-葡萄糖的内源性酶活性的多核苷酸的改变、和/或编码在第6位碳磷酸化D-葡糖酸的酶活性的多核苷酸的改变的存活或不存活的柠檬泛菌宿主细胞。在该实施方案中,宿主细胞的葡糖激酶(glk)和葡糖酸激酶(gntk)活性编码基因也具有突变。在该实施方案中,碳源通过两个氧化步骤生物催化转变为KDG,减少了底物葡萄糖或葡糖酸到分解代谢途径的损失。在该实施方案中,目的中间体的产率比野生型增加。
当DKG是所产生的目的ASA中间体时,生物反应器具备包含编码在第6位碳磷酸化D-葡萄糖的内源性葡糖激酶和葡糖酸激酶活性的多核苷酸的改变、和/或编码在第6位碳磷酸化D-葡糖酸的酶活性的多核苷酸的改变的存活或不存活的柠檬泛菌宿主细胞,以及可通过三个氧化步骤生物催化转变为DKG的碳源。在该实施方案中,不需要辅因子再生。
当KLG是目的ASA中间体时,生物反应器具备包含缺少或不能编码使葡萄糖转向分解代谢途径的内源性酶活性的多核苷酸的改变、即缺少能够在第6位碳磷酸化D-葡萄糖的能力、和/或缺少或不能编码在第6位碳磷酸化D-葡糖酸的酶活性的多核苷酸的改变的存活或非存活的柠檬泛菌宿主细胞,以及可通过三个氧化步骤和一个还原步骤而生物催化转变为KLG的碳源,例如D-葡萄糖。在该实施方案中,还原酶活性可由柠檬泛菌宿主细胞包含的、或外源提供的核酸编码。在该实施方案中,第一个氧化酶活性需要氧化形式的辅因子,还原酶活性需要还原形式的辅因子。在此处公开的优选实施方案中,改变柠檬泛菌细胞以去除天然存在的GDH活性,将诸如从嗜酸热原体(T.acidophilum)、指甲隐球酵母(Cryptococcus uniguttalatus)或芽胞杆菌品种获得的、具有NADPH+专一性的异源GDH活性引入泛菌细胞,以便提供所需的辅因子再循环系统,并再生辅因子。在该实施方案中,宿主细胞另外包含编码2,5-DKG还原酶活性的核酸,或者将2,5-DKG外源添加到生物反应器中。
在用于制备KLG的另一实施方案中,生物反应器装有包含在第6位碳磷酸化D-葡萄糖的内源性酶活性的编码核酸的改变、和/或在第6位碳磷酸化D-葡糖酸的酶活性的编码核酸的改变的柠檬泛菌细胞,并另外包含膜结合GDH的编码核酸、合适的酶和辅因子,并加入可转变为DKG的D-葡糖酸。然后使反应混合物缺氧,并加入葡萄糖。GDH将葡萄糖转变为GA,还原酶将DKG转变为KLG,同时再生辅因子。这些反应完成时,加入氧,转变GA为DKG,继续循环。
在体外生物催化方法中,碳源及其代谢物经过发生于宿主细胞胞内环境之外、并利用与宿主细胞有关的酶活性的酶促氧化步骤、或酶促氧化和酶促还原步骤,并通过某一途径产生目的ASA中间体。酶促步骤可能在生物反应器内顺序或同时进行,某些需要辅因子,以产生目的ASA中间体。本发明包含体外方法,其中通过有机物质处理宿主细胞,使其不存活,但仍可获得酶,用于在碳源的生物催化中将目的碳源和/或其代谢物氧化和还原为ASA中间体。
可利用分批方法或连续方法运行生物反应器。在分批系统中,不管加入什么,均同时收集全部发酵液。在连续系统中,定期取出发酵液,进行下游处理,同时加入新鲜底物。可利用多种方法,包括离子交换树脂、吸收或离子阻滞型树脂、活性碳、浓缩-结晶、过膜等,从发酵液中回收所产生的中间体。
在某些实施方案中,只要仍可获得用于转变碳源或其衍生物所必需的酶活性,同时减少转向分解代谢途径的碳源或其衍生物部分,宿主细胞可透化或冻干(Izumi等人,J.Ferment.Technol.61(1983)135-142)。生物反应器可利用外源提供的某些酶活性、以及在提供稳定或增强酶活性的溶剂或长聚合物的环境中运行。
C.产生ASA的宿主细胞如果宿主细胞中不天然存在指导宿主细胞碳水化合物途径转变为ASA中间体(诸如KDG、DKG或KLG)所需的任何氧化或还原酶,可以通过本领域技术人员已知的重组DNA技术将其引入。另外,可以通过重组DNA方法,失活妨碍不需要的分解代谢途径的酶。本发明包含重组引入或失活为实现目的途径的所需的任何酶或中间体。
在某些实施方案中,使用由隐性质粒纠正的肠杆菌科菌株产生ASA,参见PCT WO 98/59054。
在某些实施方案中,用于产生ASA中间体的宿主细胞是柠檬泛菌,例如ATCC登录号39140。可用于在泛菌菌种中产生ASA中间体的氧化或还原酶的编码核酸包括下列来源表I酶引用葡萄糖脱氢酶 Smith等人1989,Biochem.
J.261973;Neijssel等人1989,Antonie VanLeauvenhoek 56(1)51-61葡糖酸脱氢酶 Matsushita等1979,J.Biochem.851173;Kulbe等1987,Ann.N.Y.AcadSci 65522-酮-D-葡糖酸脱氢酶 Stroshane1977Biotechnol.BioEng9(4)4592-酮葡糖酸还原酶 J.Gen.Microbiol.1991,13714792,5-二酮-D-葡糖酸还原酶 美国专利5,795,761;5,376,544;5,583,025;4,757,012;4,758,514;5,008,193;5,004,690;5,032,514D.ASA中间体的回收一旦产生,可以利用本领域技术人员已知的任何方法,包括冷冻干燥、结晶、喷雾干燥和电渗析等,回收和/或纯化ASA中间体。例如1998年5月5日颁发的美国专利5747306以及1998年8月30日颁发的美国专利4767870,描述了用于纯化ASA和ASA中间体例如KLG的电渗析法。另外,所述中间体也可以直接从发酵液或生物反应器中配制,并颗粒化或加入液剂中。
利用本领域技术人员已知的方法,可将通过本发明方法产生的KLG进一步转变为抗坏血酸,将KDG转变为异抗坏血酸,例如参见Reichstein和Grussner,Helv.Chim.Acta.,17,311-328(1934)。抗坏血酸可能有4种立体异构体显示维生素C活性的L-抗坏血酸、D-阿拉伯糖型抗坏血酸(异抗坏血酸),L-阿拉伯糖型抗坏血酸和D-木糖型抗坏血酸。
E.分析条件用于检测ASA中间体、ASA和ASA立体异构体的方法包括,使用2,6-二氯靛酚(Burton等人1979,J.Assoc.Pub.Analysts17105)或其它合适试剂的氧化还原滴定;使用阴离子交换(J.Chrom.1980,196163)的高效液相层析(HPLC);以及电氧化还原方法(Pachia,1976,Anal.Chem.48364)。熟练技术人员相当了解使用这些检测方法所用的对照。
发酵培养基本发明的发酵培养基必须包含合适的碳底物,包括但不限于单糖例如葡萄糖、低聚糖例如乳糖或蔗糖、多聚糖例如淀粉或纤维素以及来自可再生原料的未纯化混合物,例如干酪乳清渗透物(cheese wheypermeate)、玉米浸渍液(cornsteep liquor)、糖甜菜糖浆和大麦芽。另外,碳底物也可能是单碳底物,例如碳。虽然预期本发明使用的碳源可包含多种含碳底物,并只受所选生物体的限制,但优选的碳底物包括葡萄糖和/或果糖及其混合物。利用葡萄糖和果糖的混合物连同本申请所述的改变的基因组,将氧化途径与分解代谢途径分开,能通过利用葡萄糖提高产率并转化为目的抗坏血酸中间体,而利用果糖满足宿主细胞代谢需求。
虽然预期所有上述碳底物均适于本发明,但优选碳水化合物葡萄糖、果糖或蔗糖。碳底物的浓度约为55%-75%重量/重量比。优选浓度约为60-70%重量/重量比。本发明人最优选使用60%或67%葡萄糖。
除合适的碳源之外,发酵培养基必须包含适于生长或培养并促进为产生抗坏血酸中间体所需的酶促途径的合适无机物、盐、维生素、辅因子和缓冲液。
培养条件预培养物细胞培养物一般在合适培养基中于25-32℃、优选约28或29℃生长。虽然实施例描述了所用的生长培养基,本发明使用的其它典型的生长培养基有常见的商业制备的培养基,例如Luria Bertani(LB)液体培养基、Sabouraud Dextrose(SD)液体培养基或酵母培养基(YM)液体培养基。也可使用其它成分确定的、或合成的生长培养基,微生物学或发酵科学领域的某些技术人员应当了解用于特定微生物生长的合适培养基。
优选用于发酵的合适pH范围为pH5-8,种子瓶为pH7-7.5,反应容器为pH5-6。
发酵微生物学领域的技术人员应当理解,既然申请人已经证明本发明方法的可行性,影响发酵过程的许多因素可能必需优化和控制,以使抗坏血酸中间体的产生达到最大。这些因素中的许多,例如pH、碳源浓度和溶氧水平,可能根据用于产生抗坏血酸中间体的细胞类型而影响酶促过程。
分批和连续发酵本方法的培养系统使用补料-分批发酵方法。传统的分批发酵是在发酵开始时设定培养基成分、在发酵期间并不进行人为改变的封闭系统。因此,在发酵开始时培养基接种一种或多种目的生物体,发酵不需要在系统中加入任何物质。然而″分批″发酵一般是批次加入碳源,并常常设法控制pH和氧浓度等因素。在分批系统中,直到发酵终止,系统的代谢物和生物质组成经常改变。在分批培养中,细胞从静止的停滞期稳定到达高速生长的对数期,最终到达生长速度减弱或停止的静止期。如果不处理,静止期的细胞最终将会死亡。对数期细胞一般与大量产生终产物或中间体有关。
Fed-Batch系统是标准分批系统的变体。本发明也适用Fed-Batch发酵方法,其包含典型的分批系统,外加在发酵过程中增量加入底物。在分解物阻遏倾向于抑制细胞代谢以及希望培养基中具有限量底物时,使用Fed-Batch系统。难以测定Fed-Batch实际底物浓度,因而根据可测因素的变化,例如pH、溶氧以及废气诸如CO2的分压,进行估计。分批以及Fed-Batch发酵为本领域所常见和公知,实例见Brock,同上。
尽管本发明按分批方式进行,但可以预期该方法应适合于连续发酵方法。连续发酵是开放系统,其中在生物反应器中连续加入确定的发酵培养基,同时移出等量的条件培养基进行处理。连续发酵一般使培养物维持恒定的高密度,其中细胞主要处于对数期生长。
连续发酵能调节影响细胞生长或终产物浓度的一种或多种因素。例如,一种方法维持限制性营养(例如碳源或氮水平)固定,并调节其它所有参数。在其它系统中,可以连续改变影响生长的许多因素,而保持通过培养基浊度测定的细胞浓度恒定。连续系统力求维持稳定状态的生长条件,因此由于排出培养基所致细胞损失必须与发酵中细胞的生长率保持平衡。调节连续发酵过程的营养和生长因子的方法以及使产物形成率最大化的技术,为工业微生物学领域所公知,Brock(同上)详述了多种方法。
预期可使用分批、补料-分批或连续方法以及合适的已知发酵方式实施本发明。另外,预期可将细胞固定化在底物上,作为整体细胞催化剂,在发酵条件下用于产生抗坏血酸中间体。
抗坏血酸中间体的鉴定和纯化从发酵培养基中纯化目的抗坏血酸中间体的方法为本领域已知。
可对培养基进行高压液相层析(HPLC)分析,直接鉴定特定的抗坏血酸中间体。本发明优选方法利用流动相为0.01N硫酸的分析型离子交换柱,以等同方式(isocratic fashion)分析发酵培养基。
实施例一般方法适于维持和生长细菌培养物的材料和方法参见Manual ofMethods for General Bacteriology(Phillipp Gerhardt,R.G.E.Murray,Ralph N.Costilow,Eugene W.Nester,Willis A.Wood,Noel R.Krieg和G.Briggs Phillips编著),210-213页.American Society for Microbiology,Washington,DC.或ThomasD.Brock in BiotechnologyA Textbook of IndustrialMicrobiology,第二版(1989)Sinauer Associates,Inc.,Sunderland,Mass。除非另外说明,用于细菌细胞生长的所有试剂和材料得自Diffco Laboratories(Detroit,Mich.)、AldrichChemicals(Milwaukee,Wis.)或Sigma Chemical Company(St.Louis,Mo.)。
用于预培养物或接种物的生长培养基可以商品化获得,制剂例如Luria Bertani(LB)液体培养基、Sabouraud Dextrose(SD)液体培养基或酵母培养基(YM)液体培养基得自GIBCO/BRL(Gaithersburg,Md.)。LB-50amp是包含50μg/ml氨苄青霉素的Luria-Bertani液体培养基。
发酵培养基制备两种基本的发酵培养基,供以下实施例使用,定为种瓶培养基和发酵培养基。这些基本培养基通过改变碳源或添加其它试剂(例如亚硫酸盐)而改变。可用于各培养基的试剂包括KH2PO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O、Difco Soytone、柠檬酸钠、果糖、(NH4)2SO4、烟酸、FeCl3·6H2O以及微量盐,包括但不限于ZnSO4·7H2O、MnSO4·H2O和Na2MoO4·2H2O);KH2PO4、MgSO4·7H2O、(NH4)2SO4、谷氨酸一钠、ZnSO4·7H2O、MnSO4·H2O、Na2MoO4·2H2O、FeCl3·6H2O、氯化胆碱、MazuDF-204(消泡剂)、烟酸、泛酸钙和HFCS(42DE)。还可以按照要求的葡萄糖与果糖的比例制备HFCS,例如由27.3g/L果糖粉、25.0g/L葡萄糖粉组成的果糖/葡萄糖溶液。
细胞
以下实施例使用的所有商品化细胞得自ATCC,本文按其ATCC号码进行识别。使用重组柠檬泛菌细胞(ATCC39140)作为抗坏血酸中间体产生细胞,如实施例4和5所述进行构建。酶学分析和基因组分析揭示,菌株MDP41和DD6缺少编码葡糖激酶、葡糖酸激酶的基因和这两种酶,而野生型菌株包含编码葡糖激酶和/或葡糖酸激酶的基因。
抗坏血酸中间体分析进行HPLC分析,证实抗坏血酸中间体例如2-KLG的存在。从罐中取出发酵反应器样品,上样连接到Waters 2690分离模块和Waters 410差示折光计(Milford,MA)的Dionex(Sunnyvale,CA,产品号043118)Ion Pac AS 10柱(4mm×250mm)。
分析抗坏血酸中间体产生的方法定义部分前已述及测定产率、OUR和CER的方法。
重组方法载体序列本发明方法使用的表达载体包含至少一个与酶有关的启动子,该启动子宿主细胞中具有功能。在本发明的一个实施方案中,该启动子是所选酶的野生型启动子,在本发明另一实施方案中,该启动子对于酶是异源的,但在宿主细胞中仍具有功能。在本发明的一个实施方案中,将该酶的编码核酸稳定整合到微生物基因组中。
在某些实施方案中,所述表达载体包含多克隆位点盒,其中优选包含对所述载体来说唯一的至少一个限制性内切酶位点,以便于核酸操作。在优选实施方案中,所述载体还包含一种或多种选择性标记。此处所用术语选择性标记是指能够在宿主微生物中表达的基因,使得容易选择包含所述载体的宿主。该选择性标记的实例包括但不限于抗生素,例如红霉素、放线菌素、氯霉素和四环素。
将非天然存在的酶或中间体重组引入肠杆菌科菌株的优选质粒是一种可转移、但不能自我传递的质粒RSF1010,其具有在多种细菌宿主中复制的能力,包括Gram-和Gram+细菌(Frey等人,1989,TheMolecular biology of IncQ plasmids.于Thomas(编),Promiscuous Plasmids of Gram Negative Bacteria.AcademicPress,London,79-94页)。Frey等人(1992,Gene 113101-106)报告,发现3个区域影响RSF1010的转移特性。
转化Current Protocols In Molecular Biology(卷1,Ausubel等人编著,John Wiley & Sons,Inc.1987,第9章)教导了通用的转化方法,包括磷酸钙方法、使用DEAE-葡聚糖转化以及电穿孔。本领域技术人员已知多种转化方法,用于将目的蛋白质的编码核酸引入指定的宿主细胞中。多种宿主细胞可以用于重组产生外源添加的途径酶,包括细菌、真菌、哺乳动物、昆虫和植物细胞。
在该方法的某些实施方案中,所述宿主细胞是肠杆菌科细胞。肠杆菌科包括欧文氏菌属、肠杆菌属、葡糖杆菌属和泛菌种。本发明用于产生ASA中间体的优选肠杆菌科发酵菌株是泛菌种,特别是柠檬泛菌。在某些实施方案中,所述宿主细胞是包含能够转变碳源为KLG的途径酶的柠檬泛菌。
转化子的鉴定无论是否可以通过存在/缺少标志基因的表达而检测转化的宿主细胞,建议不管目的核酸存在与否,都应当证实其表达。例如,如果途径酶的编码核酸插入标志基因序列内部,可以通过缺少标志基因功能的缺失来鉴定包含该插入的重组细胞。另外,可以在单个启动子的控制下,将标志基因与途径酶的编码核酸串联。标志基因响应诱导或选择而表达,通常表明酶也表达。
另外,利用本领域技术人员已知的多种方法,可以鉴定包含途径酶编码序列、并表达该酶的宿主细胞。这些方法包括但不限于DNA-DNA或DNA-RNA杂交以及蛋白质生物学分析或免疫分析技术,其中包括基于膜、溶液或芯片的技术,用于检测和/或定量核酸或蛋白质。
另外,使用探针、该酶多核苷酸序列的部分或片段,通过DNA-DNA或DNA-RNA杂交或扩增,可以检测宿主微生物中酶的多核苷酸序列的存在。
本领域技术人员参照以下实施例,可以更充分理解实现本发明的方式和方法,这些实施例并非意在以任何方式限制本发明或其权利要求书指定的范围。此处涉及的所有参考文献和专利出版物在此引入以供参考。
实施例实施例1柠檬泛菌139-2a基因组文库的构建使用DNA-Pure TM基因组DNA分离试剂盒(CPG,Lincoln Park,NJ)制备柠檬泛菌基因组DNA。根据厂家说明(Roche MolecularBiochemicals,Indianapolis,IN),利用限制酶Sau3A部分消化50μg DNA。利用1%琼脂糖凝胶分离消化产物,使用Qiaquick凝胶提取试剂盒(Qiagen Inc.Valencia,CA),从凝胶中纯化3-5kb的DNA片段。得到的DNA与BamHI线性化的质粒pBK-CMV(Stratagene,La Jolla,CA)连接。由此获得约10xx不同质粒的文库。
实施例2葡糖激酶结构基因的分离为了从柠檬泛菌中选择携带葡糖激酶基因的质粒,将基因组文库(参见上文)转化缺少葡糖激酶基因(glkA)和PTS转运系统的大肠杆菌菌株NF9,glk-(Flores等人,Nat.Biotech.14,620-623)。转化之后,选择在M9培养基中以葡萄糖为唯一碳源生长的细胞。利用该策略选择能够与glk-或pts-突变互补的质粒。
37℃温育48小时以后,出现许多克隆。部分克隆经进一步纯化,分离质粒,限制性分析其特征。发现所有质粒均包含常见的DNA片段。
将这些质粒再转化回NF9,glk-,全部可以在M9-葡萄糖培养基中生长,证实其能够互补NF9,glk-中存在的至少一种突变。
由此分离质粒pMD4,其包含约3.9kb的插入片段。测序该质粒的插入片段,发现在约1010bp的区域中存在一个与大肠杆菌glkA基因具有很强相似性的基因。(SEQ ID 4.)实施例3通过同源重组失活葡糖激酶基因。
先前已经描述了利用自杀载体通过同源重组失活基因的一般策略(Miller和Mekalanos.,J.Bacteriol.170(1988)2575-2583)。为了利用该方法失活柠檬泛菌的glk基因,构建两个质粒pMD5和pMD6。
为构建pMD5,按照厂家说明书,利用NcoI和SnaBI限制酶消化质粒pMD4。(Roche Molecular Biochemicals,Indianapolis,IN)。使用标准技术,利用T4聚合酶将上述酶产生的粘性末端平端化。将该DNA与分离自pLoxCat2 SpeI-EcoRV DNA片段的loxP-Cat-loxP盒连接。(Palmeros等人,Gene(2000)247,255-264.)。该盒编码氯霉素抗性。连接混合物转化TOP10感受态细胞(Invitrogen,Carlsbard CA),在10μg/ml氯霉素中选择生长。37℃温育18小时以后获得若干克隆。纯化某些克隆的质粒,限制性分析其特征。证实存在loxP-Cat-loxP,以及缺失glk基因的NcoI和SnaBI位点之间的DNA区域。具有这些特性的质粒命名为pMD5。
为构建pMD6,利用BamHI和CelII限制酶消化质粒pMD5。包含由loxP-盒中断的glk基因的DNA片段与从质粒pR6Koril分离的EcoRV-BsaI DNA片段连接(未发表结果)。该片段包含R6K复制起点和卡那霉素抗性基因。连接混合物转化菌株SY327(Miller和Mekalanos.,同上),在包含卡那霉素和氯霉素(分别为20和10μg/ml)的平板上选择转化子。37℃温育24小时以后获得若干克隆。纯化某些克隆的质粒,限制性分析其特征。证实存在loxP-Cat-loxP和R6K起点。具有这些特征的质粒命名为pMD6。
一般而言,pMD6和R6K衍生物的特征之一在于,只能在携带质粒R6K的pir基因的菌株中复制(Miller和Mekalanos.,同上)。柠檬泛菌不包含pir基因或维持pMD6的复制。将pMD6转化柠檬泛菌139-2a并选择Cm(R)菌株以后,通过同源重组获得正确的基因置换。使用Fukuda等人(Fukuda Y.,Yamaguchi S.,Shimosaka M.,Murata K.和Kimura A.J.Bacteriol.(1983)156卷922-925页)所述葡糖激酶-葡萄糖-6-磷酸脱氢酶偶联分析,通过分析葡糖激酶活性,证实葡糖激酶基因失活。经证实葡糖激酶失活的柠檬泛菌菌株命名为MDP4。通过比较使用139-2a或MDP4菌株的染色体DNA以及与葡糖激酶结构基因杂交的引物(SEQ.ID.8,SEQ.ID.9)获得PCR产物的大小,进一步证实产生了失活的葡糖激酶基因。按照该方法,PCR产物的大小应反映出loxP-Cat-loxP盒已克隆到葡糖激酶结构基因中。
实施例4去除MDP4的氯霉素抗性标志在YENB培养基(0.75%酵母抽提物、0.8%营养肉汤)中30℃生长过夜以后,利用包含噬菌体P1 Cre重组酶基因(IPTG可诱导型)、温度敏感性pSC101复制子和氨苄青霉素抗性基因的质粒pJW168(Palmeros等人,Gene(2000)247,255-264.),电转化柠檬泛菌MDP40的水悬浮液。于SOC培养基中30℃生长以后,利用补加羧苄青霉素(200μg/ml)和IPTG(1mM)的LB琼脂培养基,于30℃(使pJW168复制的许可温度)选择转化子。利用补加羧苄青霉素和IPTG的新鲜LB琼脂培养基,于35℃连续两次过夜转移混合克隆,以便通过Cre重组酶介导,使染色体氯霉素抗性基因在loxP位点重组而去除(Hoess和Abremski,J.Mol.Biol.,181351-362)。将产生的克隆整板复制(replica-plated)到补加羧苄青霉素和IPTG的LB琼脂培养基和补加氯霉素(12.5μg/ml)的LB琼脂,以便于30℃鉴定羧苄青霉素抗性、氯霉素敏感性(表明去除了标志基因)的克隆。使用上述一个克隆的30℃过夜培养物接种10ml LB培养基。在30℃生长到OD(600nm)为0.6时,将培养物于35℃温育过夜。将若干稀释度铺于预热的LB琼脂培养基,平板于35℃(pJW168复制的非许可温度)温育过夜。将产生的克隆整板复制到LB琼脂培养基和补加羧苄青霉素(200μg/ml)的LB琼脂培养基,以便于30℃鉴定羧苄青霉素敏感性(表明丢失了质粒pJW168)的克隆。使用引物SEQ ID NO5和SEQID NO6,通过基因组PCR进一步分析一个上述的glK突变体MDP41,产生了预期的PCR产物(数据未展示)。
实施例5通过同源重组失活葡糖酸激酶基因。
用于失活柠檬泛菌葡糖酸激酶基因的一般策略如图9所示,与实施例3所述用于失活葡糖激酶基因的策略基本相同。简言之,在分离并测序允许大肠杆菌菌株□gntK□idnK利用葡糖酸为唯一碳源生长的质粒(数据未显示)以后,使用引物SEQ.ID NO10和SEQ.IDNO11,通过PCR产生包含葡糖酸激酶基因结构基因的DNA片段。将约3kb的PCR产物克隆到包含R6K复制起点的多拷贝质粒中。利用位于SEQ.ID NO2所示葡糖酸激酶结构基因的唯一PstI限制性位点插入loxP-Cat-loxP盒。该构建体通过同源重组转入柠檬泛菌菌株MDP41的染色体中。使用引物SEQ ID NO11和SEQ ID NO12,通过PCR确认loxP-Cat-loxP盒准确中断了葡糖酸激酶。
葡萄糖和葡糖酸激酶均失活的新菌株命名为MDP5。该菌株仍包含插入葡糖酸激酶结构基因中的Cat标志。通过重复实施例4所述方法,获得无标志的菌株,命名为DD6。
实施例6下文阐明双缺失的宿主细胞(缺失葡糖激酶和葡糖酸激酶的泛菌宿主细胞)在需求O2方面的优点。
种株储存于液氮中的一管培养物在空气中溶化,将0.75mL加入包含500mL种子培养基的2-L无菌三角瓶中。三角瓶于29℃、250转/分温育12小时。转接标准是OD550大于2.5。
种瓶培养基按下文制备培养基组合物成分 数量KH2PO412.0g/L
K2HPO44.0g/LMgSO4·7H2O2.0g/LDifco Soytone 2.0g/L柠檬酸钠 0.1g/L果糖 5.0g/L(NH4)2SO41.0g/L烟酸 0.02g/LFeCl3·6H2O5mL/L(0.4g/L储液)微量盐5mL/L(下列溶液0.58g/L ZnSO4·7H2O,0.34g/L MnSO4·H2O,0.48g/L Na2MoO4·2H2O)利用20% NaOH调节培养基溶液的pH为7.0±0.1单位。加入盐酸四环素,终浓度为20mg/L(2mL/L的10g/L储液)。利用0.2μ过滤装置将得到的培养基溶液过滤消毒。然后将培养基高压灭菌,在2-L三角瓶中加入已高压灭菌的500mL培养基。
发酵罐生产反应容器灭菌前的添加物成分 浓度KH2PO43.5g/LMgSO4·7H2O 1.0g/L(NH4)2SO40.92g/L谷氨酸一钠 15.0g/LZnSO4·7H2O 5.79mg/LMnSO4·H2O 3.44mg/LNa2MoO4·2H2O 4.70mg/LFeCl3·6H2O 2.20mg/L氯化胆碱 0.112g/LMazu DF-2040.167g/L上述构成的培养基于121℃灭菌45分钟。
罐灭菌之后,在发酵罐中加入下列添加物
成分浓度烟酸16.8mg/L泛酸钙 3.36mg/LHFCS(42DE) 95.5g/L(如果需要,将葡糖酸或葡萄糖作为特定的起始底物)灭菌并加入灭菌后成分以后,终体积为6.0L。在如是准备的罐和培养基中接种按所述制备的全部种瓶内容物,产生6.5L的体积。
生长条件为29℃、pH6.0。按需调节搅拌速率、反压和空气流量,以保持溶氧高于零。
结果抗坏血酸中间体的氧化途径如图10所述。既然CO2的唯一碳源来自碳底物,未向反应容器中供应另外的CO2,因而通过确定二氧化碳产量(CER),可以计算分解代谢途径所利用的碳的数量,从而测定分解代谢和生成(氧化)途径的解偶联。通过CER测定,在发酵过程中使用野生型生物体时,63%葡萄糖转变为抗坏血酸中间体,而37%转变为分解代谢产物(图12)。在本研究的第二阶段,在野生型条件下表达葡糖激酶的编码核酸。如图13A所示,通过CER测定,CO2的释放减少到约18%。因而葡萄糖分解代谢降低,但并未完全解偶联。为了试图确定来源,也就是使碳底物转向分解代谢途径的通路,提供葡糖酸为唯一碳源。如图13B与图13A比较所示,葡糖酸按与葡萄糖作为碳底物大致相同的速率进行分解代谢。(83%葡糖酸转变为抗坏血酸中间体,17%葡糖酸转向分解代谢途径(通过CER测定))。也参见表2表2

对于基因组中缺失葡糖激酶和葡糖酸激酶基因组编码的宿主细胞,通过检测其OUR和CER,进行本研究的最后阶段。图14表明,3%葡萄糖转变为CO2,而对照(野生型)显示出43%葡萄糖产生CO2。因此,野生型显示较高的通过分解代谢途径的葡萄糖分解代谢,导致产率降低以及高氧需求。但是,葡糖激酶和葡糖酸激酶的双缺失使分解代谢失活到初始碳底物的10%以下、5%以下以及特别少于3%或更少。
结论葡糖激酶和葡糖酸激酶的双重突变使几乎所有的葡萄糖(约98%)旁路到2,5-DKG。
实施例7从果糖产生甘油。
为证明柠檬泛菌可用于产生来源于果糖的化合物,利用Empatage等人[Emptage,M.,Haynie,S.,Laffend,L.,Pucci,J.和Whited,G.Process for the biological production of 1,3-propanediolwith high titer.专利WO 0112833-A 41 2001年2月22日;E.I.DU PONT DE NEMOURS AND COMPANY;GENENCOR INTERNATIONAL,INC.]所述方法产生甘油。简言之,该方法使用酵母的两种酶,如图25中描述的反应所示,将二羟丙酮磷酸(DHAP)转变为甘油。
将GPD1和GPP2酶的基因克隆到多拷贝质粒pTrc99中,位于Trc启动子控制下(Empatage等人,2001)。该质粒(pAH48)能够产生高水平的这两种酶。
本发明人认为,为了在柠檬泛菌中产生甘油,希望消除或降低菌株同化甘油的天然能力。许多细菌中共同的甘油分解代谢途径是通过甘油激酶的作用[Lin E.C.Ann.Rev.Microbiol.1976.30535-578.Glycerol dissimilation and its regulation inbacteria]。本发明人发现,柠檬泛菌能够在包含甘油为唯一碳源的培养基中生长。此外,检查柠檬泛菌的基因组序列,表明其具有非常类似于大肠杆菌glkA基因的甘油激酶基因。
因此,为了消除甘油激酶活性而失活了该酶的结构基因(glpK基因)。这是按实施例3和5所述(葡糖激酶和葡糖酸激酶基因的失活)实现的。简言之,使用柠檬泛菌染色体DNA以及SEQ ID.glpK1和SEQ ID.glpK2公开的引物,通过PCR获得包含glpK基因及侧翼序列的2.9kb DNA片段。如实施例3和5所示,将该2.9kb DNA片段克隆到R6K载体。glpK基因的DNA序列如SEQ ID._所示,GlpK的蛋白质序列如SEQ ID._所示。检查glpK的DNA序列,表明存在HpaI位点,选定用于插入loxP-Cat-loxP盒。一旦获得目的质粒构建体,则按实施例3和5所述,通过同源重组将glpK中断转入柠檬泛菌菌株139-2a ps-的染色体中。得到的柠檬泛菌glpK∷Cm菌株命名为MDG1。
一旦证实柠檬泛菌基因组中存在glpK基因的中断,则评价突变的影响。为此目的,将菌株MDG1在包含0.4%甘油为唯一碳源的基本培养基M9中生长。细胞在30℃温育48小时以后,未观察到生长,表明菌株MDG1丢失了利用甘油为碳源的能力。
利用质粒pAH48(Emptage等人,2001)转化菌株MDG1,测试所得菌株MDG2使用果糖为唯一碳源产生甘油的能力。通过在包含2%果糖为唯一碳源的基本培养基中温育该菌株,进行测试。细胞在30℃温育24小时以后,如Emptage等人(2001)所述,收集样品进行HPLC分析。由此发现,菌株MDG1不产生任何甘油,而菌株MDG2产生1.36g/L的甘油。这些结果证明,柠檬泛菌能够转变大部分果糖,形成甘油。
本领域技术人员在阅读本公开内容后,显而易见上述说明书和实施例的其它各种实例和改变,而不背离本发明的实质和范围,并意味着所有这类实例和改变均包括在所附权利要求书的范围内。此处参考的所有出版物和专利在此全文引入供参考。
权利要求
1.在重组宿主细胞中生成抗坏血酸中间体的方法,其包含在适宜生成所述抗坏血酸中间体的条件下,培养能够在葡萄糖存在下生成所述抗坏血酸中间体的宿主细胞,其中所述宿主细胞包含至少一个编码激酶的多核苷酸的缺失,所述激酶选自葡糖激酶和葡糖酸激酶。
2.权利要求1的方法,其中所述宿主细胞进一步包含选自葡糖激酶和葡糖酸激酶的激酶的编码残基的两种缺失。
3.权利要求1的方法,其进一步包含所述产物回收步骤。
4.权利要求1的方法,其进一步包含将抗坏血酸中间体转变为另一种产物的步骤。
5.增强从碳源生成抗坏血酸中间体的方法,其包含,d)获得改变的泛菌菌株,其包含失活细菌宿主菌株中的染色体基因,e)在适宜条件下培养该改变的细菌宿主菌株,以及f)从碳源生成抗坏血酸中间体,其中所述抗坏血酸中间体的生成较之在未改变的细菌宿主菌株中抗坏血酸中间体的生成增强。
6.权利要求5的方法,其中所述抗坏血酸中间体选自葡糖酸、2-酮-D-葡糖酸、2,5-二酮-D-葡糖酸、2-酮-L-古洛糖酸、L-艾杜糖酸、异抗坏血酸以及酒石酸。
7.权利要求6的方法,其中所述抗坏血酸中间体是2,5-二酮-D-葡糖酸。
8.权利要求5的方法,其中所述改变的细菌菌株通过灭活glk染色体基因获得。
9.权利要求5的方法,其中所述改变的细菌菌株通过灭活gntk染色体基因获得。
10.权利要求5的方法,其中所述改变的细菌菌株通过灭活glk和gntk染色体基因获得。
11.权利要求5的方法,其中所述细菌菌株是泛菌。
12.权利要求11的方法,其中所述细菌菌株是柠檬泛菌。
全文摘要
本发明提供生成抗坏血酸中间体的方法和宿主细胞。本发明也提供在多核苷酸中具有改变的宿主细胞,该多核苷酸通过缺失在第6位碳磷酸化D-葡萄糖的内源性酶活性的编码,而使分解代谢途径与氧化途径分开,和/或该多核苷酸缺失在第6位碳磷酸化D-葡糖酸的内源性酶活性的编码。该宿主细胞用于生成产物,例如抗坏血酸中间体。本发明提供核苷酸和氨基酸序列,其中在第6位碳磷酸化D-葡萄糖的酶活性以及在第6位碳磷酸化D-葡糖酸的酶活性失活。
文档编号C12P7/58GK1500148SQ02807696
公开日2004年5月26日 申请日期2002年4月4日 优先权日2001年4月4日
发明者T·C·道奇, F·瓦勒, T C 道奇 申请人:金克克国际有限公司

最新回复(0)