生产3-o-钝化-4'-单磷酰基脂a(3d-mla)的方法

xiaoxiao2020-6-24  7

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专利名称:生产3-o-钝化-4'-单磷酰基脂a(3d-mla)的方法
相关申请的引用本申请是2001年3月30日申请的U.S.临时申请No.60/280,089的非临时申请,其要求U.S.临时申请No.60/280,089的利益。
关于在联邦政府资助的研究和开发下所取得的发明之权利的声明是不适用的发明背景1.发明领域本发明主要涉及3-O-脱酰基化单磷酰基脂A(3D-MLA)的生物合成生产领域。更特别地,其涉及改善所期望的3D-MLA同系物的收率或者将纯化3D-MLA的脂多糖(LPS)前体的成本减到最少的方法。
2.相关领域描述很久以前就已经认识到肠细菌脂多糖(LPS)是免疫系统的有效刺激物。亚微克数量的LPS能够引起多种反应,包括有益的和有害的。这些反应中的一些是有害的,其中一些可以是致命的,这一事实阻碍了LPS本身的临床应用。已经观察到负责内毒素活性的最主要原因的LPS成分是脂A。
因此,已经作了许多努力来减弱LPS或脂A的毒性而不减少这些化合物的免疫刺激益处。这些成果中著名的为Edgar Ribi和其同事的成果,该成果导致生产出脂A衍生物3-O-脱酰基化-4’-单磷酰基脂A(3D-MLA;含有3D-MLA的组合物以商品名MPL从Corixa公司(Seattle,WA)商购可得)。3D-MLA显示出具有与脂A基本上同样的免疫刺激特性,但是具有较低的内毒性(Myers等人,U.S.Pat.No.4,912,094)。Myers等人还报道了生产3D-MLA的方法,该方法如下。首先,将从革兰氏阴性细菌(例如明尼苏达沙门氏菌(Salmonella minnesota)R595)深度粗糙突变体菌株获得的LPS或脂A在中等强度的无机酸溶液(例如0.1N HCl)中回流大约30分钟。这导致在脂A还原性末端葡糖胺的1位上的去磷酸化和在脂A非还原性葡糖胺的6′位上的去糖基化(decarbohydrate)。其次,将去磷酸化并去糖基化的脂A(亦称为单磷酰基脂A或MLA)进行碱水解,例如通过将其溶解在有机溶剂如氯仿∶甲醇(CM)2∶1(v/v)中,并用pH10.5的0.5M Na2CO3水溶液使该溶液饱和,然后快速蒸发溶剂。这导致选择性地去除在脂A的3位上的β-羟基肉豆蔻酸部分,从而获得3-O-脱酰基化-4’-单磷酰基脂A(3D-MLA)。
通过上述方法生产所得的3D-MLA的质量高度依赖于从革兰氏阴性细菌获得的LPS的纯度和组成。例如,LPS的脂A成分为含有大约5-7个脂肪酸部分的紧密相关种类的混和物。从上面的讨论中清楚的看出,在3D-MLA的形成中除去了1个脂肪酸部分,从而得到具有大约4-6个脂肪酸部分的3D-MLA。一般认为,根据保留的或增强的免疫刺激益处、减低的毒性和其他所期望的特性(Qureshi和Takayama,“The Bacteria”,Vol.XI(Iglewski和Clark编),AcademicPress,1990,pp.319-338)的组合,具有至少6个脂肪酸部分的3D-MLA是优选的。
又例如,从革兰氏阴性细菌中LPS进行商业规模的提取一般包括Chen方法(Chen等人,J.Infect.Dis.128543(1973));即用CM提取,这导致形成富含LPS和磷脂的CM相,从中随后能够纯化出LPS。可是,从富含LPS和磷脂的CM相中纯化LPS一般需要多重沉淀步骤来获得对于在免疫刺激应用中的使用(例如用作疫苗佐剂)足够纯的LPS。
因此,期望获得方便地制备高纯度LPS组合物的方法。此外,期望获得产生LPS组合物的方法,该组合物含有具有增加的己酰基同系物水平的3D-MLA。
已知的发酵技术已用于制备含有能够容易纯化的LPS的革兰氏阴性细菌培养物。这些已知的技术一般包括在稳定期的早期收获细菌培养物,这与标准细菌学准则一致。可是发现根据已知条件所产生的LPS的酰基化程度是可变的。例如,明尼苏达沙门氏菌R595的脂A中庚酰基种类的含量依赖于批次而可以在20%-80%之间变化(Rietschel等人,Rev.Infect.Dis.9S527(1987))。这种庚酰基同系物含量的可变性将导致从这些LPS批次中制备的3D-MLA中己酰基同系物含量的显著差异。
发明概述在一个实施方案中,本发明涉及生产脂多糖(LPS)的方法,其包括(a)在培养基中培育深度粗糙突变体细菌菌株的培养物;(b)将该培养物在稳定期保持至少大约2小时;(c)从培养物中收获细胞;和(d)从细胞中提取LPS。
该方法允许LPS的生产,其中该LPS可生产出具有相对高比例的(即至少大约20mol%)含有6个脂肪酸部分的同系物的3D-MLA。
在另一个实施方案中,本发明涉及从深度粗糙突变体细菌菌株细胞的培养物中提取脂多糖(LPS)的方法,其包括(a)用基本上由至少大约75wt%的具有1-4个碳原子的脂族醇和平衡水所组成的溶液提取细胞,从而产生出具有减少的磷脂含量的细胞;(b)用含有氯仿和甲醇的溶液(CM)提取具有减少的磷脂含量的细胞,从而获得LPS的CM溶液。
该方法提供了LPS的CM溶液,其具有减少的磷脂含量,并因此适合于进行进一步的修饰和纯化而得到3D-MLA。该方法包括相对简单和不贵的步骤。
附图简述下面的附图形成本说明的一部分,并被包括在本发明之中来进一步证明本发明的某些方面。通过参考一个或多个这些附图并结合此处给出的特定实施方案的详细描述可以更好地理解本发明。


图1显示了在乙醇提取期间用不同温度获得的乙醇提取物和LPS样品的TLC板。左边的平板从左至右显示了于22℃、37℃和50℃的温度时的乙醇提取物。该平板最右边的样品为真正的LPS样品。右边的平板显示了从各个制备物中获得的LPS。道3、4和5中的样品分别相应于从经过在22℃、37℃和50℃用乙醇预提取的细胞中获得的LPS。在Rf~0.6的浓重的带相应于磷脂和脂肪酸杂质。这些杂质的水平通过增加乙醇提取的温度而减少,其在于50℃预提取的样品中是非常低的。
说明性实施方案的描述在一个实施方案中,本发明涉及生产脂多糖(LPS)的方法,其包括(a)在培养基中培育深度粗糙突变体细菌菌株的培养物;(b)将该培养物在稳定期保持至少大约2小时;(c)从培养物中收获细胞;和(d)从细胞中提取LPS。
脂多糖是革兰氏阴性细菌外膜的外小叶中主要的脂类组分。除了其他成分之外,革兰氏阴性细菌的脂多糖部分还含有脂A。正如已经描述的,脂A能够进行去糖基化和部分去磷酸化从而生产单磷酰基脂A(MLA),MLA能够在3位选择性地进行脱酰基化从而产生3-O-脱酰基化-4’-单磷酰基脂A(3D-MLA)。
可是,通过革兰氏阴性细菌产生的脂A一般含有许多具有相同的总的脂A结构但在它们含有的脂肪酸部分的数量上不同的种类。具有相同脂肪酸数量的脂A种类的群体此处被称为“同系物”。通过革兰氏阴性细菌如明尼苏达沙门氏菌R595的标准商业规模培养可生产出具有4-7个脂肪酸部分的脂A同系物。因此,从例如明尼苏达沙门氏菌R595脂A中生产出的3D-MLA具有一般为3-6个脂肪酸部分的同系物组成(因为3D-MLA经历了1个脂肪酸部分的损失)。
3D-MLA(通过脂A和MLA)同系物组成中的异质性可归因于两个原因(1)在脂A装配中生物合成的可变性和(2)在加工成3D-MLA期间从脂A主链上脂肪酸部分的损失。虽然不想受制于理论,但是除了其他解释之外相信是由于参与脂A生物合成最终步骤的酰基转移酶的非完全底物特异性,所以生物合成的可变性才会发生。在一般于3D-MLA产生中使用的酸和碱水解期间也可能发生从脂A主链上脂肪酸部分的损失。
令人惊讶地发现通过改变培养产生脂A的深度粗糙突变体细菌菌株的过程的参数能够改变3D-MLA同系物组成。特别是发现在收获之前将深度粗糙突变体细菌菌株的培养物在稳定期保持至少大约5小时可导致如此生产的脂A同系物比例的改变,以致一般地至少大约20mol%的随后从脂A生产出的3D-MLA含有6个脂肪酸。优选地,至少大约50mol%的3D-MLA含有6个脂肪酸。已经发现在稳定期大约5.5小时的保持时间是特别有效的。这有别于本领域中已知的一般的培养程序,在一般的培养程序中收获几乎在培养进入稳定期之后立即进行;在已知的程序中,LPS的同系物含量是高度可变的,并导致具有可变己酰基同系物含量的3D-MLA。
“深度粗糙突变体细菌菌株”表示具有深度粗糙表型的革兰氏阴性细菌。“深度粗糙”表型表示连接到脂A上的多糖部分只由大约2-3个2-酮-3-脱氧-D-甘露辛酮糖酸(mannooctulonic acid)(KDO)残基组成。优选地,深度粗糙突变体细菌菌株选自沙门氏菌(Salmonella)属。如果深度粗糙突变体细菌菌株属于沙门氏菌属,则更优选地其属于明尼苏达沙门氏菌种,更加优选地其为明尼苏达沙门氏菌R595菌株。可以使用其他深度粗糙突变体细菌菌株,除了别的以外例如奇异变形菌(Proteus mirabilis)菌株。
可以使用任何适合于培养深度粗糙突变体细菌菌株的技术。一般地,这将包括至少一种商业规模生物反应器的使用。在一个实施方案中,技术包括将深度粗糙突变体细菌菌株的细胞接种入相对小的(例如15L)生物反应器中,培养深度粗糙突变体细菌菌株直至稳定期,随后将15L细胞培养液无菌转移到大的(例如750L)生物反应器中。
该培养可以在任何已知或发现能够让深度粗糙突变体细菌菌株生长的培养基上进行。在一个优选的实施方案中,培养基为M9,其为补充了葡萄糖和酪蛋白氨基酸的无机盐混和物。M9的组成对于本领域的普通技术人员是熟知的。
将深度粗糙突变体细菌菌株在稳定期保持至少大约5小时之后,可以从培养物中收获细胞并从细胞中提取LPS。虽然下面描述了用于从细胞中提取LPS的优选的技术,但是可以使用已知的技术来从培养物中收获细胞和从细胞中提取LPS。
收获可以通过任何已知的技术来进行。在一个优选的实施方案中,将细胞培养物在稳定期保持至少大约5小时之后,将生物反应器的内含物抽至切向过滤装置以分离开用过的培养基和细胞。
然后通过任何适当的技术从细胞中提取LPS。已知的技术包括Galanos方法,其包括用苯酚、氯仿和石油醚的混和物(PCP)提取LPS,随后蒸发掉氯仿和石油醚,添加丙酮和水以沉淀LPS,和通过离心或过滤回收LPS(Galanos等人,Eur.J.Biochem.9245(1969));和上面引用的Chen方法,其包括用氯仿和甲醇(CM)的混和物提取LPS,随后进行一系列的甲醇沉淀步骤。
Chen方法的改进描述于下,其对于用于商业应用的LPS及其衍生物的生产是优选的。
不管提取技术,结果是基本上纯的干燥LPS,其可以通过顺次的酸水解和碱水解进一步进行加工从而形成3D-MLA,Ribi(U.S.Pat.No.4,436,727)和Myers等人(U.S.Pat.No.4,912,094)教导了这一点,因此于此处引用这些文献作为参考。概括这些参考文献的技术为用于形成3D-MLA的优选实施方案,将LPS与有机或无机酸反应,然后经过冻干而生产出MLA。无机酸优选地为盐酸、硫酸或磷酸。有机酸优选地为甲苯磺酸或三氯乙酸。反应可以在大约90℃至大约130℃的温度进行足够的时间以完全水解,通常进行大约15分钟至大约60分钟。MLA可以用溶剂(优选的为丙酮)处理以溶解脂肪酸和其他杂质,然后除去富含杂质的脂肪酸溶剂。
此后将MLA经历温和的碱处理以选择性地从MLA的3位上去除β-羟基肉豆蔻酸(在温和的碱性条件下,只有在3位上的β-羟基肉豆蔻酸是不稳定的)。温和的碱处理可以在含水的或有机的介质中进行。除了别的以外,合适的有机溶剂还包括甲醇或其他醇、二甲亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、氯仿、二氯甲烷或者其混和物。也可以使用水和与水易混和的有机溶剂的联合物。
用于进行水解的碱优选地选自氢氧化物、碳酸盐、磷酸盐或胺。除了别的以外,举例说明的无机碱还包括氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸氢钾、碳酸氢钠和碳酸氢钾。除了别的以外,举例说明的有机碱还包括烷基胺(除了别的以外,例如二乙胺和三乙胺)。
在含水的介质中,pH一般为大约10至大约14,优选地为大约10至大约12。水解反应一般在大约20℃至大约80℃进行,优选地在大约50℃至大约60℃进行,该反应进行大约10分钟至大约48小时的时间。
用于碱水解的一个优选技术包括将MLA溶解在CM 2∶1(v/v)中,用pH10.5的0.5M Na2CO3缓冲水溶液使该溶液饱和,然后在真空抽吸装置(大约100mmHg)下于45-50℃快速蒸发溶剂。
在另一个实施方案中,本发明涉及从深度粗糙突变体细菌菌株细胞的培养物中提取脂多糖(LPS)的方法,其包括(a)用基本上由至少大约75wt%的具有1-4个碳原子的脂族醇和平衡水所组成的溶液提取细胞,从而产生出具有减少的磷脂含量的细胞;(b)用含有氯仿和甲醇的溶液提取具有减少的磷脂含量的细胞,从而获得LPS的氯仿和甲醇溶液。
深度粗糙突变体细菌菌株细胞、其培养物和制备培养物的方法如上所述。优选地,深度粗糙突变体细菌菌株选自沙门氏菌属或埃希氏菌(Escherichia)属。如果深度粗糙突变体细菌菌株属于沙门氏菌属,则更优选地其属于明尼苏达沙门氏菌种,更加优选地其为明尼苏达沙门氏菌R595菌株。如果深度粗糙突变体细菌菌株属于埃希氏菌属,则更优选地其属于大肠杆菌(Escherichia coli)种,更加优选地其为大肠杆菌D31m4菌株。
第一个提取步骤可以用任何短链脂族醇来进行。脂族醇可以是线性的、分枝的或环状的。优选地,脂族醇具有2-4个碳原子并易于和水混和。更优选地,脂族醇为乙醇。
含有脂族醇的溶液可以含有任何比例的75wt%或更高的脂族醇。优选地,溶液含有大约85wt%至大约95wt%的脂族醇。溶液的平衡基本上是水。作为脂族醇和溶液的水成分的不完全纯或其他污染的结果,可以存在微量的其他化合物。
进行第一个提取步骤的温度可以是任何对于从培养细胞中充分提取磷脂有效的温度。优选地,温度为大约35℃至大约65℃。更优选地,温度为大约45℃至大约55℃。
第一个提取步骤的其他参数(除了别的以外)为例如脂族醇溶液的添加速率、溶液和细胞的接触持续时间以及搅拌或不搅拌,这些参数可由本领域的一般技术人员按常规进行改变。
第一个提取步骤导致形成(i)富含磷脂的脂族醇溶液相和(ii)具有减少的磷脂含量的细胞。细胞膜的LPS成分基本上完全和具有减少的磷脂含量的细胞分离开。
第二个提取步骤包括用氯仿∶甲醇(CM)的溶液提取具有减少的磷脂含量的细胞。
在第二个提取步骤中可以使用已知适合用于从细胞膜提取LPS(例如在Chen方法中)的任何比例的氯仿和甲醇。一般地,氯仿和甲醇的比例为大约2∶1至大约9∶1。具有和CM相等特性的溶剂混和物也可以用于从具有减少的磷脂含量的细胞中获得LPS。
本方法超过Chen方法的优点为在第一个提取步骤中除去了磷脂。本发明的第二个提取步骤对于具有减少的磷脂含量的细胞来进行,从而导致形成基本上无磷脂的富含LPS的溶液,然而Chen方法的CM提取导致形成含有相当高水平的磷脂的LPS溶液。产生相对无磷脂的LPS制备物的其他可选择的方法如Galanos的方法(见上)就不那么令人期望,因为它们不适宜于大规模产生,它们使用引起健康和安全担忧的溶剂混和物(例如苯酚∶氯仿∶石油醚),或者两者都有。
由于LPS溶液中磷脂的明显缺乏,根据本方法的LPS的进一步纯化一般比Chen方法更简单和更便宜。已经发现通过将氯仿和甲醇从LPS溶液中蒸发能够形成足够纯度的干燥LPS剩余物。
可选择地,可以例如通过上述的酸水解和碱水解来进一步加工LPS,从而产生MLA或3D-MLA。
按照上述方法所生产出的3D-MLA可用于多种用途。一个优选的用途为作为用于药物组合物的免疫刺激剂或佐剂,该药物组合物含有免疫原性的多核苷酸、多肽、抗体、T-细胞或抗原呈递细胞(APC)。免疫刺激剂或佐剂本质上是指任何能够提高或增强对于外源抗原的免疫反应(抗体和/或细胞介导的)的物质。
根据本发明生产出的MLA或3D-MLA可以刺激的一种免疫反应是Th1类型的。
已经观察到单磷酰基脂A(MLA)(优选的为3-O-脱酰基化单磷酰基脂A(3D-MLA))与铝盐的联合物作为用于引起主要Th1型反应的佐剂是有效的。高水平的Th1型细胞因子(例如IFN-γ、TNFα、IL-2和IL-12)倾向于促进诱导针对所施用抗原的细胞介导的免疫反应。相反地,高水平的Th2型细胞因子(例如IL-4、IL-5、IL-6和IL-10)倾向于促进诱导体液的免疫反应。在应用含有MLA或3D-MLA的药物组合物之后,患者将支持包括Th1和Th2型反应的免疫反应。当反应主要为Th1型时,Th1型细胞因子的水平将增长至比Th2型细胞因子的水平更高的程度。这些细胞因子的水平可以容易地用标准的测定法进行评定。为了了解细胞因子的家族,可见Mosmann和Coffman,Ann.Rev.Immunol.7145-173,1989。
在一个优选的实施方案中,佐剂系统包括单磷酰基脂A(MLA)(优选的为3D-MLA)和皂苷衍生物(如Quil A或其衍生物,包括QS21和QS7(Aquila Biopharmaceuticals公司,Framingham,MA);七叶皂苷;毛地黄皂苷;或者石头花(Gypsophila)或昆诺藜(Chenopodium quinoa)皂苷)的联合物,例如WO 94/00153中所描述的QS21和3D-MLA佐剂的联合物,或者WO 96/33739中所描述的其中QS21用胆固醇淬灭的具有较少反应原性的组合物。其他优选的配剂含有水包油的乳状液和生育酚。WO 95/17210中描述了另一个特别优选的佐剂配剂,其使用水包油乳状液中的QS21、3D-MLA和生育酚。
将下面的实施例包括在内以说明本发明的优选实施方案。本领域的技术人员应当意识到,下面的实施例中所公开的技术代表了由发明者发现能够在本发明的实施中很好地起作用的技术,因此可以认为这些技术构成了用于其实施的优选模式。可是,根据本公开内容,本领域的技术人员应当意识到在公开的特定实施方案中可以作出许多改变,并且仍获得同样或相似的结果,但并不离开本发明的精神和范围。
实施例1-一般方法A.培养基的制备细胞生长在M9培养基上进行,M9培养基可通过将无机盐的无菌溶液、酪蛋白氨基酸和葡萄糖组合在一起来制备。M9盐溶液一般在发酵罐中制备,其含有下列盐2.0g/L NaCl、0.2g/L MgSO4·7H2O、3.0g/L KH2PO4、6.0g/L Na2HPO4和1.0g/L NH4Cl。然后向发酵罐中无菌地加入20%(w/v)酪蛋白氨基酸(20ml/L)和50%(w/v)葡萄糖(32ml/L)的无菌溶液,从而获得完全的培养基。
B.种子生长一般地,一个无菌的250ml锥形瓶中装入50ml无菌的M9培养基。将一个种子瓶的明尼苏达沙门氏菌R595(大约108cfu)解冻并加入锥形瓶中,然后用纱布塞子塞住瓶口。将培养物于37℃培养6-8小时,直至明显出现旺盛的生长。
C.细胞生长明尼苏达沙门氏菌R595的培养物在装备了2.5L玻璃容器的BioFlo III发酵罐(New Brunswich Scientific公司)中生长。在一般的运作中,容器装入2.0L的M9盐溶液并经过高压灭菌,然后无菌地加入酪蛋白氨基酸和葡萄糖的无菌溶液。发酵罐装备有用于防沫剂(0.1%SAG-471,Witco公司)和NH4OH(30%)的给料管以及用于pH、dO2和泡沫的探针。通过NH4OH给料将培养基调节至pH 6.9。然后将发酵罐用全部的种子培养物进行接种,并在空气喷射(一般为2.0Lpm)和搅拌(一般为50rpm)的同时于37℃进行培养。通过于590nm测量光密度监测培养的生长期。通过离心或切向流过滤(tangential flow filtration)收获细胞,并用水洗涤,然后冻干。
D.脂多糖(LPS)的提取根据经过较小修改的Qureshi等人(1986)的程序分离出LPS。在一般的运作中,首先将干燥的细胞在90%乙醇(v/v)中以20mg/ml的浓度于室温搅拌1小时,然后通过真空过滤进行回收。将细胞经过第二次乙醇提取,随后顺次用丙酮和乙醚(每次15分钟,都为40mg/ml,基于起始重量)进行提取,然后让结果所得的醚粉末空气干燥过夜。其间,制备苯酚(89%)∶氯仿∶石油醚19∶45∶72(v/v/v,缩写为PCP)的溶液并让其静置过夜。将醚粉末以70mg/ml的浓度悬浮在PCP(倾去过量的水)中。将溶液搅拌30分钟,然后离心(3000g,15分钟,0-5℃)。将上清液部分倒入圆底烧瓶中,然后用PCP再次提取细胞沉淀。合并上清液部分,然后在40℃旋转蒸发直至所有的挥发性溶剂大部分被除去。然后测量剩下的体积。逐滴加入水直至明显出现持续的混浊,然后在迅速搅拌的同时向苯酚溶液中加入5体积的丙酮并随后加入1体积的乙醚(都在冰浴中冷冻)。将溶液置于冰浴中30分钟,然后通过离心(5000g,15分钟,0-5℃)回收沉淀出的LPS。重力过滤上清液部分以回收任何没有剩余在沉淀中的LPS一般来说是必需的。用最小体积的冷丙酮洗涤一次LPS,并通过离心/过滤进行回收,然后在真空中干燥。基于初始的细胞干重,一般的收率为4-5%。
E.4′-单磷酰基脂A(MLA)的制备将LPS以10mg/ml的浓度悬浮在水中,并于45-55℃用水浴超声处理(bath-sonication)以帮助分散固体物质。结果所得的溶液应当是轻微混浊的,但无肉眼可见的固体。向该溶液中加入1体积的0.2N HCl,然后将其置于沸水浴中15分钟。在冰浴中淬灭反应,然后用5体积(相对于起始的LPS溶液)的氯仿∶甲醇2∶1(v/v)提取。将二相溶液涡旋振荡,并通过低速离心(500-1000g)分离两相。回收较低的相并在氮气中蒸发,从而收获粗制的MLA。
F.3-O-脱酰基化-4’-单磷酰基脂A(3D-MLA)的制备将粗制的MLA以大约1-5mg/ml的浓度溶解在氯仿∶甲醇2∶1(v/v)中,并将3.0ml的该溶液转移至16×100mm的试管中。将附加的0.4ml甲醇加入试管中,然后将其置于50℃的水浴中10分钟。通过加入40μl的0.5M KHCO3(pH10.5)来起始反应,并将溶液于50℃温育20分钟。在这段时间的最后,将试管从水浴中取出,并通过在添加2.0ml 0.1N HCl(冷冻的)之后进行涡旋振荡来淬灭反应。通过下列步骤来回收3D-MLA加入1.0ml甲醇,涡旋振荡,离心(500-1000g),和在氮气中将较低(有机)相蒸发至干。
实施例2-分析方法A.MLA和相关样品的薄层层析法(TLC)所有的TLC分析用覆盖有Silica Gel 60(E Merck)的5×10cm平板来进行。样品一般以10mg/ml的氯仿∶甲醇4∶1(v/v)溶液应用于TLC平板,在操作时通过用毛细吸管将3μl溶液(30μg样品)以小点的方式列成5mm的线来进行应用。用含有氯仿/甲醇/水/氢氧化铵50∶31∶6∶2(v/v)的溶剂系统来展开平板。展开的平板上的条带通过下列步骤来显现喷洒10%(w/v)磷钼酸的乙醇溶液,随后于150-160℃进行焦化。在一些情况下,点的相对强度可通过于520nm的扫描波长用Shimadzu CS9000U Dual Wavelength FlyingSpot Scanner(Shimadzu公司)进行扫描光密度分析法来定量。
B.MLA/3D-MLA的高效液相色谱法(HPLC)分析首先将需要分析的样品转变成游离酸形式,这是通过用2ml的0.1N HCl洗涤3-5mg样品于5ml氯仿∶甲醇(2∶1 v/v)中所形成的溶液来实现的。将二相系统涡旋振荡,离心,然后将较低(有机)相转移至试管中并在氮气流中蒸发。然后将剩余物通过用重氮甲烷处理进行甲基化。简要地说,重氮甲烷的醚溶液通过下列步骤来制备将60-100mg1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍(MNNG,Aldrich)置于2英钱的小瓶中,每毫克MNNG加入60μl乙醚,然后每毫克MNNG加入9μl的5N NaOH,同时于<-10℃搅拌溶液。在反应完全之后,通过下列步骤将柠檬黄色的醚相干燥将其转移到含有几颗NaOH的第二个小瓶中,然后将其涡旋振荡,这都在<-10℃进行。将经酸洗涤的样品溶解在1ml氯仿∶甲醇4∶1(v/v)中,并置于<-10℃的浴中,然后在搅拌的同时逐滴加入重氮甲烷溶液直至暗黄色的色调持续出现。然后将溶剂在氮气流中于环境温度蒸发,并进一步在真空中干燥至少30分钟。
色谱分析在C18反相柱(Nova-Pak,4μm的颗粒直径,8mm×10cm[Waters])上进行。将甲基化的样品以100μg/ml的浓度溶解在氯仿∶甲醇4∶1(v/v)中,并通过0.45μm的PTFE注射器过滤器。一般使用20-25μl的注射体积,随后以2ml/分钟的流速用20-80%异丙醇的乙腈溶液的线性梯度洗脱60分钟,同时在210nm进行监测。
C.LPS同系物含量的HPLC分析LPS倾向于为高度异质的物质,这是由于下列部分中的可变性1)O-抗原和核心区域中糖残基的数量;2)在核心区域中和在脂A中的磷酸酯上的极性取代;和3)连接到脂A主链上的脂肪酸的数量和位置。正是该后面的可变性来源对于3D-MLA(MPL)的同系物含量具有影响。LPS水解成MLA和3D-MLA消除了O-抗原和核心区域中的可变性,可是由于O-联接的脂肪酸不可控的损失其也引入了附加的异质性。这妨碍了准确获知完整的LPS中的酰基化模式。作为避开这一点的办法,开发出了一种方法,即在不会导致O-联接的脂肪酸损失的温和条件下去除磷酸酯和核心区域。然后可以用HPLC分析结果所得的去磷酸化脂A(零磷酰基脂A,或ZPL),从而获得亲本LPS中酰基化模式的准确反映。
该方法一般按照下述进行。将0.5-5.0mg的LPS样品于27℃在200μl浓缩的氢氟酸中水解3-4小时。该反应必须在紧紧盖住的特氟隆管中并在有良好通风的通风橱内进行。通过在氮气流中于环境温度蒸发来除去HF,然后将水解产物溶解在氯仿∶甲醇4∶1(v/v)中并转移到16×100mm的玻璃试管中,随后在氮气流中蒸发溶剂。使用水浴超声处理将剩余物悬浮在1.0ml 0.1%三乙胺中,加入1.0ml 40mMNaOAc,然后将试管悬浮在沸水浴中30-45分钟。通过在冰浴中冷却来淬灭反应,并通过用5ml氯仿∶甲醇2∶1(v/v)提取来回收ZPL。将有机相转移至小的螺口瓶中,然后在氮气中蒸发溶剂。ZPL通过加入200μl的10mg/ml盐酸O-(3,5-二硝基苄基)羟胺(RegisTechnologies公司)的吡啶溶液进行衍生化,紧紧盖住小瓶,然后于60℃温育3小时。在氮气中蒸发除去吡啶,剩余物进一步在真空中干燥>30分钟。然后将剩余物悬浮在500μl氯仿∶甲醇2∶1(v/v)中,并上载至0.5-1.0ml已经在同样的溶剂中预平衡的Accell-QMA(乙酸盐形式;Waters)床上。用总共5.0ml的氯仿∶甲醇2∶1(v/v)以分成几个小部分的方式漂洗柱,并收集洗脱液至16×100mm的试管中。向洗脱液中加入2.0ml的0.1N HCl,将二相系统涡旋振荡,于500-1000g简短离心,然后将较低(有机)相转移至另一个试管中并在氮气中蒸发。将剩余物溶解在100-300μl氯仿∶甲醇4∶1(v/v)中,然后通过0.45μm的PTFE注射器过滤器进行过滤。用氯仿∶甲醇4∶1(v/v)漂洗过滤器两次,并将滤液在氮气中蒸发。滤液最后溶解在50-150μl氯仿∶甲醇4∶1(v/v)中,并转移至自动注射器小瓶中以用于HPLC分析。HPLC条件如下C18反相柱(例如Waters);10μl注射体积;20-80%异丙醇的乙腈溶液的线性梯度,经过60分钟,流速为2ml/分钟;于254nm进行监测。
实施例3-来自不同时间收获的培养物中的MLA/3D-MLA的同系物组成的比较用下列参数进行一系列发酵罐的运行2.0L M9培养基(起始pH6.84-6.87),2Lpm的空气流量,于50rpm进行搅拌,37℃,无pH控制。通过于590nm测量光密度监测培养,并在获得所期望的生长阶段时终止培养。按照上述方法处理和提取细胞以获得LPS样品,然后将该样品水解成MLA和3D-MLA,并用HPLC进行分析(见实施例1和2)。结果概括在表1中。
表1.来自不同年龄收获的细胞中的MLA和3D-MLA的同系物组成
这些数据表明明尼苏达沙门氏菌R595的培养物在稳定期期间改变了它们的LPS的酰基化模式,结果导致源自该LPS的MLA中3-O-脱酰基化己酰基加上庚酰基种类的全部含量的增加,并顺次引起从该MLA制备的3D-MLA中3-O-脱酰基化己酰基种类的含量增加。
实施例4-来自不同时间收获的培养物中的LPS的同系物组成的比较用下列参数进行一系列发酵罐的运行2.0L M9培养基(起始pH6.84-6.87),2Lpm的空气流量,于225rpm进行搅拌,37℃,无pH控制。通过于590nm测量光密度监测培养物的生长阶段。按照实施例1中描述的方法处理和提取细胞以获得LPS样品。按照实施例2中描述的方法将LPS样品水解成ZPL并用HPLC进行分析。结果概括在表2中。
表2.来自不同年龄收获的细胞中的LPS的同系物组成
在来自稳定期早期细胞的LPS中没有检测到3-O-脱酰基化己酰基成分(运行A)。因此,从该LPS制备的3D-MLA中己酰基化同系物的唯一来源为庚酰基化的物质(24%)。相反地,来自在稳定期晚期收获的细胞的LPS含有庚酰基和3-O-脱酰基化己酰基种类(分别为19%和17%)。这些种类都对于从该LPS制备的3D-MLA(MPL)中的己酰基含量有所贡献。想不到的是发现细胞在某些条件下产生3-O-脱酰基化己酰基LPS种类。
实施例5-预提取温度对于明尼苏达沙门氏菌R595 LPS的纯度的影响明尼苏达沙门氏菌R595的细胞用与实施例1中概述的基本上相同的条件在80L发酵罐(New Brunswick Scientific)中生长。细胞通过切向流过滤进行浓缩而不是离心,所得的浆状物含有51.5mg干细胞质量/ml。制备三种溶液,在这些溶液中150ml细胞悬浮液的等分试样各与600ml乙醇混和。将乙醇溶液于22℃、37℃和50℃搅拌1小时,并过滤。将细胞在相同条件(除了使用95%乙醇之外)下进行第二次乙醇提取。通过抽吸过滤回收细胞,然后于50℃在氯仿∶甲醇4∶1(v/v)中提取过夜。将溶液过滤,然后将滤液旋转蒸发至干,从而得到LPS制备物。将于各个温度所获得的第一和第二次乙醇提取滤液的样品以及从预提取的细胞中获得的LPS根据实施例2中的方法用薄层层析法进行分析。TLC板的图象显示在图1中。
图1显示了在乙醇提取期间用不同温度获得的乙醇提取物和LPS样品的TLC板。左边的平板从左至右显示了于22℃、37℃和50℃的温度时的乙醇提取物。该平板最右边的样品为真正的LPS样品。右边的平板显示了从各个制备物中获得的LPS。道3、4和5中的样品分别相应于从经过在22℃、37℃和50℃用乙醇预提取的细胞中获得的LPS。在Rf~0.6的浓重的带相应于磷脂和脂肪酸杂质。这些杂质的水平通过增加乙醇提取的温度而减少,其在于50℃预提取的样品中是非常低的。
从图1的TLC板中可以明显地看出在升高的温度下用乙醇进行预提取对于去除杂质是有效的,否则这些杂质会被氯仿∶甲醇4∶1(v/v)共提取。于50℃的预提取导致形成基本上无这些杂质的LPS。
实施例6-有和没有经过乙醇提取而获得的LPS的比较三批明尼苏达沙门氏菌R595的细胞用与实施例1中概述的基本上相同的条件在750L发酵罐(B.Braun)中生长。通过切向流过滤收获细胞,从每批中获得细胞悬浮液的样品并冻干。细胞块经过两次1小时的于50℃用90%乙醇进行的预提取。在两次提取之间用切向流过滤回收细胞。然后细胞在回流的同时用氯仿∶甲醇4∶1(v/v)提取过夜。通过切向流过滤回收提取物并蒸发至干。将冻干的细胞样品在回流的氯仿∶甲醇4∶1(v/v)中提取过夜,然后将溶液过滤并将滤液蒸发至干。有和没有经过乙醇预提取而获得的LPS样品基本上按照实施例2中描述的方法用TLC进行分析。于大约Rf=0.01-0.90扫描TLC板,并对于每个样品计算出LPS区域(Rf=0.01-0.020)中的强度与总强度的比率。结果给出在表3中。
表3.来自有和没有用乙醇预提取的细胞的LPS纯度
注1LPS区域中总强度的百分数=[(Rf=0.01-0.20中的强度)/(Rf=0.01-0.90中的强度)]×100表3中的结果证明,在于50℃用90%乙醇预提取明尼苏达沙门氏菌R595细胞之后获得的LPS显著比从没有预提取的细胞中获得的材料更纯。
此处公开和要求的所有方法可以根据本公开内容进行和实行,而不需要不适当的试验。虽然本发明的组合物和方法已经用优选的实施方案进行了描述,但是对于本领域的技术人员来说显而易见的是可以对此处描述的方法的步骤或步骤顺序施行改变而不会离开本发明的理念、精神和范围。更明确地,明显的是可以用某些化学和生理学相关的试剂替代此处描述的试剂,而同时可获得相同或相似的结果。所有这些对于本领域的技术人员来说明显的类似替代和修改可认为处于附加的权利要求所定义的本发明的精神、范围和理念之中。
权利要求
1.生产脂多糖组合物(LPS)的方法,其包括(a)在培养基中培育深度粗糙突变体细菌菌株的培养物;(b)将该培养物在稳定期保持至少大约5小时;(c)从培养物中收获细胞;和(d)从细胞中提取LPS。
2.权利要求1的方法,其中深度粗糙突变体细菌菌株属于沙门氏菌属。
3.权利要求2的方法,其中沙门氏菌属的深度粗糙突变体细菌菌株属于明尼苏达沙门氏菌种。
4.权利要求3的方法,其中明尼苏达沙门氏菌种的深度粗糙突变体细菌菌株为明尼苏达沙门氏菌R595菌株。
5.权利要求1的方法,其中培养基为M9。
6.权利要求1的方法,其中保持进行大约5至大约6小时。
7.权利要求1的方法,其中LPS可用于生产具有至少大约20mol%己酰基同系物基团的3D-MLA。
8.权利要求1的方法,其进一步包含将LPS经过顺次的酸水解和碱水解从而形成3D-MLA。
9.由权利要求1的方法生产出的LPS。
10.由权利要求8的方法生产出的3D-MLA。
11.从深度粗糙突变体细菌菌株细胞的培养物中提取脂多糖(LPS)的方法,其包括(a)用基本上由至少大约75wt%的具有1-4个碳原子的脂族醇和平衡水所组成的溶液提取细胞,从而产生出具有减少的磷脂含量的细胞;(b)用含有氯仿和甲醇的溶液提取具有减少的磷脂含量的细胞,从而获得LPS的氯仿和甲醇溶液。
12.权利要求11的方法,其中深度粗糙突变体细菌菌株属于沙门氏菌属或埃希氏菌属。
13.权利要求12的方法,其中沙门氏菌属的深度粗糙突变体细菌菌株属于明尼苏达沙门氏菌种。
14.权利要求13的方法,其中明尼苏达沙门氏菌种的深度粗糙突变体细菌菌株为明尼苏达沙门氏菌R595菌株。
15.权利要求12的方法,其中埃希氏菌属的深度粗糙突变体细菌菌株属于大肠杆菌种。
16.权利要求15的方法,其中大肠杆菌种的深度粗糙突变体细菌菌株属于大肠杆菌D31m4菌株。
17.权利要求11的方法,其中脂族醇具有2-4个碳原子。
18.权利要求17的方法,其中脂族醇为乙醇。
19.权利要求11的方法,其中含有脂族醇的溶液含有大约85wt%至大约95wt%的脂族醇。
20.权利要求11的方法,其中用脂族醇的提取在大约35℃至大约65℃的温度进行。
21.权利要求20的方法,其中温度为大约45℃至大约55℃。
22.权利要求11的方法,其进一步包含从LPS溶液中蒸发氯仿和甲醇,从而获得干燥的LPS剩余物。
23.权利要求22的方法,其进一步包含将干燥的LPS剩余物经过顺次的酸水解和碱水解从而形成3D-MLA。
24.根据权利要求22的方法形成的LPS。
25.根据权利要求23的方法形成的3D-MLA。
全文摘要
此处公开了生产脂多糖(LPS)的方法,其包括(a)在培养基中培育深度粗糙突变体细菌菌株的培养物;(b)将该培养物在稳定期保持至少大约5小时;(c)从培养物中收获细胞;和(d)从细胞中提取LPS。该方法允许LPS的生产,其中该LPS可用于生产具有至少大约20mol%己酰基同系物基团的3-O-脱酰基化单磷酰基脂A(3D-MLA)。此处还公开了从深度粗糙突变体细菌菌株细胞的培养物中提取脂多糖(LPS)的方法,其包括(a)用基本上由至少大约75wt%的具有1-4个碳原子的脂族醇和平衡水所组成的溶液提取细胞,从而产生出具有减少的磷脂含量的细胞;和(b)用含有氯仿和甲醇的溶液提取具有减少的磷脂含量的细胞,从而获得LPS的氯仿和甲醇溶液(CM)。该方法提供了LPS的CM溶液,其具有减少的磷脂含量,并通过相对简单和不贵的加工步骤来生产。
文档编号C12N1/21GK1608127SQ02807697
公开日2005年4月20日 申请日期2002年3月28日 优先权日2001年3月30日
发明者K·R·米尔斯, D·S·斯尼德 申请人:科里克萨有限公司

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