使用嵌合性嗅觉受体产生cAMP的方法

xiaoxiao2020-6-24  4

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专利名称:使用嵌合性嗅觉受体产生cAMP的方法
技术领域
本发明涉及使用嵌合性嗅觉受体产生cAMP的方法。
背景技术
嗅觉受体是三聚体G蛋白偶联受体(GPCR),更具体地说是三聚体G蛋白偶联七跨膜型受体的I种。图1表示将气味分子对细胞膜的刺激转换成电信号的机制。嗅觉受体是在细胞膜上表达的膜蛋白。该细胞膜主要由脂质双层膜构成。脂质双层膜具有各层由高密度排列的磷脂分子构成的双层结构。该脂质双层膜示意性地示于图1的中央。图1中,脂质双层膜的上侧为细胞外侧,而脂质双层膜的下侧为细胞内侧。在该嗅觉受体的附近配置有三聚体G蛋白。该三聚体G蛋白是由α亚基(Ga olf)、β亚基(G0)及Y亚基(Gy)所构成的异三聚体。细胞含有腺苷酸环化酶。图1中,腺苷酸环化酶用符号“AC”表述。腺苷酸环化酶准确地说是跨膜型蛋白质。蛋白质RTPlS (序列号42)具有辅助嗅觉受体在细胞膜上表达的功能。另外,该蛋白质RTPlS与上述机制并不直接有关系。接着说明上述机制。气味分子结合在该嗅觉受体上。该结合将三聚体G蛋白分离为a亚基(Ga olf)和β y复合体。该β γ复合体由亚基G0及Gy构成。分离出的G a olf将腺苷酸环化酶(AC)活化。活化后的腺苷酸环化酶(AC)将三磷酸腺苷(ATP)转换成环状腺苷一磷酸(cAMP)。环状腺苷一磷酸(cAMP)将离子通道(具体地说,例如环核苷酸门控型离子通道(CNG))活化。该活化引起离子由细胞内被输送至细胞外、或者由细胞外被输送至细胞内。该离子的输送程度可以以电信号的形式被测定。当然,环状腺苷一磷酸(cAMP)的产生量越多,则可获得越多的电信号。该更多的电信号使测定的精度提高。另外,已知对β I肾上腺素能受体的刺激会使细胞内的cAMP的产生量增加。可以预见组装了 β I肾上腺素能受体的一部分的多个嗅觉受体会使cAMP增加、由此使测定精度提高。这种嗅觉受体、即组装了其他受体(这种情况下为β I肾上腺素能受体)的一部分的嗅觉受体被称作“嵌合性嗅觉受体”。(现有技术文献的公开内容)非专利文献I公开了肾上腺素能受体的细胞内结构域IC3及IC4是对于与三聚体G蛋白的相互作用重要的区域。非专利文献2公开了通过对IC3结构域导入点突变、对IC4结构域导入点突变、IC4结构域的缺损、或者用视紫红质(Rhodop sin)的IC4结构域将IC4结构域置换,cAMP的产生量会急剧降低。非专利文献3公开了在RhoiOREG的N末端附加有Flag标签的Flag-Rho mOREG比Rho-mOREG更为迅速地向细胞膜表面移动,由此提高了嗅觉受体的应答。
现有技术文献非专利文献非专利文献1:Noel M.Delos Santos, Lidia A.G a rdner, Stephenff.White, Suleiman ff.Bahouth (2006) J.Biol.Chem.,281,12896-12907非专利文献2:Kato A., Katada S.,Touhara Κ.( 2008 )J.Neurochem.,107,1261-1270非专利文献3 ;Katada S.,Tanaka Μ.,Touhara Κ.( 2004)J.Neurochem.,90,1453-146
发明内容
发明要解决的技术问题但是,本发明人等发现了,与上述期待不同,绝大多数的嵌合性嗅觉受体会导致cAMP的产生量减少。本发明的 目的在于提供使cAMP的产生量增加的嵌合性嗅觉受体。用于解决技术问题的手段以下的方法Al C6、嵌合性嗅觉受体Dl D4、脂质双层膜El E5或者反应体系Fl F5解决上述技术问题:Al.一种使用嵌合性嗅觉受体产生cAMP的方法,其具备以下的工序:准备具备第I层、脂质双层膜及第2层的反应体系的工序(a),这里,所述脂质双层膜被所述第I层及所述第2层夹持,所述脂质双层膜具备所述嵌合性嗅觉受体及腺苷酸环化酶,所述嵌合性嗅觉受体贯穿所述脂质双层膜,所述腺苷酸环化酶贯穿所述脂质双层膜,所述第2层含有ATP及G蛋白、所述G蛋白配置在所述嵌合性嗅觉受体的一端附近,所述嵌合性嗅觉受体来自于由(N末端)_EC1结构域-TMl结构域-1Cl结构域-TM2结构域-EC2结构域-TM3结构域-1C2结构域-TM4结构域-EC3结构域-TM5结构域-1C3结构域-TM6结构域-EC4结构域-TM7结构域-1C4结构域-(C末端)的氨基酸序列所构成的小鼠来源的嗅觉受体,所述嵌合性嗅觉受体的N末端被Rho标签(序列号01 )_myc附加表位(序列号04)的氨基酸序列修饰,并且所述IC4结构域被置换成β I肾上腺素能受体的IC4结构域;以及将刺激所述嵌合性嗅觉受体的化学物质供至所述第I层以由所述ATP产生cAMP的工序(b)。A2.根据Al所记载的方法,其中,所述小鼠来源的嗅觉受体为小鼠来源的丁子香酚识别嗅觉受体,所述化学物质为丁子香酚。A2-1.根据Al所记载的方法,其中,所述小鼠来源的嗅觉受体为小鼠来源的嗅觉受体01frl68,所述化学物质为2-戊酮。A2-2.根据Al所记载的方法,其中,所述小鼠来源的嗅觉受体为小鼠来源的嗅觉受体01frl5,所述化学物质为环己酮。A2-3.根据Al所记载的方法,其中,所述小鼠来源的嗅觉受体为小鼠来源的嗅觉受体01fr609,所述化学物质为香草酸。A3.根据A2所记载的方法,其中,所述嵌合性嗅觉受体由序列号36所表示的氨基酸序列构成。A3-1.根据A2-1所记载的方法,其中,所述嵌合性嗅觉受体由序列号51所表示的氨基酸序列构成。A3-2.根据A2-2所记载的方法,其中,所述嵌合性嗅觉受体由序列号60所表示的氨基酸序列构成。A3-3.根据A2-3所记载的方法,其中,所述嵌合性嗅觉受体由序列号69所表示的氨基酸序列构成。A4.根据Al所记载的方法,其中,所述G蛋白具备Ga0lf、GP及Gy ,在所述工序(b)中,所述G蛋白分离为所述Ga olf及复合体,所述复合体由所述GP及所述G Y构成,并且所述G a olf将所述腺苷 酸环化酶活化。A5.根据Al所记载的方法,其中,所述脂质双层膜还具备离子通道,所述离子通道贯穿所述脂质双层膜,并且所述工序(b)中产生的所述cAMP将所述离子通道活化。A6.根据A5所记载的方法,其中,所述离子通道为钙离子通道。B1.一种判定试样溶液是否含有刺激嵌合性嗅觉受体的分子的方法,其具备以下的工序:准备具备第I层、脂质双层膜及第2层的反应体系的工序(a),这里,所述脂质双层膜被所述第I层及所述第2层夹持,所述第I层及所述第2层中的至少任一层含有离子,所述脂质双层膜具备所述嵌合性嗅觉受体、离子通道及腺苷酸环化酶,所述嵌合性嗅觉受体贯穿所述脂质双层膜,所述腺苷酸环化酶贯穿所述脂质双层膜,所述离子通道贯穿所述脂质双层膜,所述第2层含有ATP及G蛋白,所述G蛋白配置在所述嵌合性嗅觉受体的一端附近,所述嵌合性嗅觉受体来自于由(N末端)_EC1结构域-TMl结构域-1Cl结构域-TM2结构域-EC2结构域-TM3结构域-1C2结构域-TM4结构域-EC3结构域-TM5结构域-1C3结构域-TM6结构域-EC4结构域-TM7结构域-1C4结构域-(C末端)的氨基酸序列所构成的小鼠来源的嗅觉受体,所述嵌合性嗅觉受体的N末端被Rho标签(序列号01 )_myc附加表位(序列号04)的氨基酸序列修饰,并且所述IC4结构域被置换成β I肾上腺素能受体的IC4结构域;将所述试样溶液供至所述第I层并对所述第I层及所述第2层中的至少任一层所含有的所述离子的浓度进行测定的工序(b);以及
在所述测定得到的离子的浓度发生变化时判定所述试样溶液含有所述刺激嵌合性嗅觉受体的分子的工序(C)。B2.根据BI所记载的方法,其中,所述小鼠来源的嗅觉受体为小鼠来源的丁子香酚识别嗅觉受体,所述化学物质为丁子香酚。B2-1.根据BI所记载的方法,其中,所述小鼠来源的嗅觉受体为小鼠来源的嗅觉受体01frl68,所述化学物质为2-戊酮。B2-2.根据BI所记载的方法,其中,所述小鼠来源的嗅觉受体为小鼠来源的嗅觉受体01frl5,所述化学物质为环己酮。B2-3.根据BI所记载的方法,其中,所述小鼠来源的嗅觉受体为小鼠来源的嗅觉受体01fr609,所述化学物质为香草酸。B3.根据B2所记载的方法,其中,所述嵌合性嗅觉受体由序列号36所表示的氨基酸序列构成。B3-1.根据B2-1所记载的方法,其中,所述嵌合性嗅觉受体由序列号51所表示的氨基酸序列构成。B3-2.根据B2-2所记载的方法,其中,所述嵌合性嗅觉受体由序列号60所表示的氨基酸序列构成。B3-3.根据B2-3所记载的方法,其中,所述嵌合性嗅觉受体由序列号69所表示的氨基酸序列构成。B4.根据BI所记载的方法,其中,所述G蛋白具备Ga 0lf、[email protected]及Gy ,在所述工序(b)中,所述G蛋白分离成所述Ga olf及复合体,所述复合体由所述G β及所述G Y构成,并且所述G a olf将所述腺苷酸环化酶活化。B5.根据BI所记载的方法,其中,所述脂质双层膜还具备离子通道,所述离子通道贯穿所述脂质双层膜,并且所述工序(b)中产生的所述cAMP将所述离子通道活化。B6.根据B5所记载的方法,其中,所述离子通道为钙离子通道。Cl.一种对含有在试样溶液中且刺激嵌合性嗅觉受体的化学物质进行定量的方法,其具备以下的工序(a) 工序(c):准备具备第I层、脂质双层膜及第2层的反应体系的工序(a),这里,所述脂质双层膜被所述第I层及所述第2层夹持,所述第I层及所述第2层中的至少任一层含有离子,所述脂质双层膜具备所述嵌合性嗅觉受体、离子通道及腺苷酸环化酶,所述嵌合性嗅觉受体贯穿所述脂质双层膜,所述腺苷酸环化酶贯穿所述脂质双层膜,所述离子通道贯穿所述脂质双层膜,

所述第2层含有ATP及G蛋白,所述G蛋白配置在所述嵌合性嗅觉受体的一端附近,所述嵌合性嗅觉受体来自于由(N末端)_EC1结构域-TMl结构域-1Cl结构域-TM2结构域-EC2结构域-TM3结构域-1C2结构域-TM4结构域-EC3结构域-TM5结构域-1C3结构域-TM6结构域-EC4结构域-TM7结构域-1C4结构域-(C末端)的氨基酸序列所构成的小鼠来源的嗅觉受体,所述嵌合性嗅觉受体的N末端被Rho标签(序列号01 )_myc附加表位(序列号04)的氨基酸序列修饰,并且所述IC4结构域被置换成β I肾上腺素能受体的IC4结构域;将所述试样溶液供至所述第I层并对所述第I层及所述第2层中的至少任一层的所述离子的浓度进行测定的工序(b);以及根据所述测定得到的离子的浓度的变化量对含有在所述试样溶液中的所述化学物质进行定量的工序(c )。C2.根据Cl所记载的方法,其中,所述小鼠来源的嗅觉受体为小鼠来源的丁子香酚识别嗅觉受体,所述化学物质为丁子香酚。C2-1.根据Cl所记载的方法,其中,所述小鼠来源的嗅觉受体为小鼠来源的嗅觉受体01frl68,所述化学物质为2-戊酮。C2-2.根据Cl所记载的方法,其中,所述小鼠来源的嗅觉受体为小鼠来源的嗅觉受体01frl5,所述化学物质为环己酮。C2-3.根据Cl所记载的方法,其中,所述小鼠来源的嗅觉受体为小鼠来源的嗅觉受体01fr609,所述化学物质为香草酸。C3.根据C2所记载的方法,其中,所述嵌合性嗅觉受体由序列号36所表示的氨基酸序列构成。C3-1.根据C2-1所记载的方法,其中,所述嵌合性嗅觉受体由序列号51所表示的氨基酸序列构成。C3-2.根据C2-2所记载的方法,其中,所述嵌合性嗅觉受体由序列号60所表示的氨基酸序列构成。C3-3.根据C2-3所记载的方法,其中,所述嵌合性嗅觉受体由序列号69所表示的氨基酸序列构成。C4.根据Cl所记载的方法,其中,所述G蛋白具备Ga 0lf、GP及Gy ,在所述工序(b)中,所述G蛋白分离为所述Ga olf及复合体,所述复合体由所述GP及所述G Y构成,并且所述G a olf将所述腺苷酸环化酶活化。C5.根据Cl所记载的方法,其中,所述脂质双层膜还具备离子通道,所述离子通道贯穿所述脂质双层膜,并且所述工序(b)中产生的所述cAMP将所述离子通道活化。C6.根据C5所记载的方法,其中,所述离子通道为钙离子通道。Dl.由序列号36表示的嵌合性嗅觉受体。D2.由序列号51表不的嵌合性嗅觉受体。D3.由序列号60表不的嵌合性嗅觉受体。 D4.由序列号69表示的嵌合性嗅觉受体。El.一种脂质双层膜,其为用于对试样溶液中含有的化学物质进行检测或定量所使用的反应体系中具备的脂质双层膜,其中,
所述脂质双层膜具备所述嵌合性嗅觉受体、离子通道及腺苷酸环化酶,所述嵌合性嗅觉受体贯穿所述脂质双层膜,所述腺苷酸环化酶贯穿所述脂质双层膜,所述离子通道贯穿所述脂质双层膜,所述嵌合性嗅觉受体来自于由(N末端)_EC1结构域-TMl结构域-1Cl结构域-TM2结构域-EC2结构域-TM3结构域-1C2结构域-TM4结构域-EC3结构域-TM5结构域-1C3结构域-TM6结构域-EC4结构域-TM7结构域-1C4结构域-(C末端)的氨基酸序列所构成的小鼠来源的嗅觉受体,所述嵌合性嗅觉受体的N末端被Rho (序列号01) -myc (序列号04)的氨基酸序列修饰,并且所述IC4被置换成β I肾上腺素能受体的IC4。Ε2.根据El所记载的脂质双层膜,其中,所述嵌合性嗅觉受体由序列号36所表示的氨基酸序列构成。Ε3.根据El所记载的脂质双层膜,其中,所述嵌合性嗅觉受体由序列号51所表示的氨基酸序列构成。Ε4.根据El所记载的脂质双层膜,其中,所述嵌合性嗅觉受体由序列号60所表示的氨基酸序列构成。Ε5.根据El所记载的 脂质双层膜,其中,所述嵌合性嗅觉受体由序列号69所表示的氨基酸序列构成。Fl.一种用于对试样溶液中含有的化学物质进行检测或定量所使用的反应体系,其中,所述反应体系具备第I层、脂质双层膜及第2层,这里,所述脂质双层膜被所述第I层及所述第2层夹持,所述第I层及所述第2层中的至少任一层含有离子,所述脂质双层膜具备所述嵌合性嗅觉受体、离子通道及腺苷酸环化酶,所述嵌合性嗅觉受体贯穿所述脂质双层膜,所述腺苷酸环化酶贯穿所述脂质双层膜,所述离子通道贯穿所述脂质双层膜,所述第2层含有ATP及G蛋白,所述G蛋白配置在所述嵌合性嗅觉受体的一端附近,所述嵌合性嗅觉受体来自于由(N末端)_EC1结构域-TMl结构域-1Cl结构域-TM2结构域-EC2结构域-TM3结构域-1C2结构域-TM4结构域-EC3结构域-TM5结构域-1C3结构域-TM6结构域-EC4结构域-TM7结构域-1C4结构域-(C末端)的氨基酸序列所构成的小鼠来源的嗅觉受体,所述嵌合性嗅觉受体的N末端被Rho标签(序列号01)_myc附加表位(序列号04)的氨基酸序列修饰,并且所述IC4被置换成β I肾上腺素能受体的IC4。F2.根据Fl所记载的反应体系,其中,所述嵌合性嗅觉受体由序列号36所表示的氨基酸序列构成。
F3.根据Fl所记载的反应体系,其中,所述嵌合性嗅觉受体由序列号51所表示的氨基酸序列构成。F4.根据Fl所记载的反应体系,其中,所述嵌合性嗅觉受体由序列号60所表示的氨基酸序列构成。F5.根据Fl所记载的反应体系,其中,所述嵌合性嗅觉受体由序列号69所表示的氨基酸序列构成。发明效果本发明提供使cAMP的产生量增加的嵌合性嗅觉受体。


图1表示将气味分子对细胞膜的刺激转换成电信号的机制。图2表示具有被Rho标签(Rho-tag)修饰过的N末端的嗅觉受体。图3表示具有被Rho标签及myc附加表位修饰过的N末端的嗅觉受体。图4表示IC4结构域被置换成β I肾上腺素能受体的IC4结构域、且N末端被Rho标签及myc附加表位修饰的嵌合性嗅觉受体。图5表示ECl结构域 ICl结构域及IC4结构域被置换成β I肾上腺素能受体的ECl结构域 ICl结构域及IC4结构域的嵌合性嗅觉受体。图6表示ECl结构域 ICl结构域及IC4结构域被置换成β I肾上腺素能受体的ECl结构域 ICl结构域及IC4结构域、且N末端被Rho标签及myc附加表位修饰的嵌合性嗅觉受体。 图7表示TM7结构域及IC4结构域被置换成β I肾上腺素能受体的ΤΜ7结构域及IC4结构域、且N末端被Rho标签及myc附加表位修饰的嵌合性嗅觉受体。图8表示IC3结构域被置换成β I肾上腺素能受体的IC3结构域、且N末端被Rho标签及myc附加表位修饰的嵌合性嗅觉受体。图9表示IC3结构域及IC4结构域被置换成β I肾上腺素能受体的IC3结构域及IC4结构域、且N末端被Rho标签及myc附加表位修饰的嵌合性嗅觉受体。图10表示制备质粒(β I肾上腺素能受体)的步骤。图11表示制备质粒(Rho-mOREG)的步骤。图12表示制备质粒(Rho-myc-mOREG)的步骤。图13表示制备质粒(chimeral)的步骤。图14表示制备质粒(chimera2)的步骤。图15表示导入有β I肾上腺素能受体时的cAMP产生量及未导入β I肾上腺素能受体时的cAMP产生量。图16为表示实施例1-1及比较例1-1 比较例1-7的细胞内cAMP浓度增加量的曲线图。图17为表不Rho-mOREG、Rho-myc-mOREG及chimeral的相对于丁子香酌■的浓度-应答曲线的曲线图。图18表示制备质粒(Rho_myc01frl68)的步骤。图19表示制备质粒(Rho_myc01frl5)的步骤。
图20表示制备质粒(Rho_myc01fr609)的步骤。图21表示制备质粒(chimera3)的步骤。
具体实施例方式(用语的定义)本说明书中使用的用语如下定义。GPCR:G蛋白偶联受体IC结构域:细胞内结构域EC结构域:细胞外结构域TM结构域:跨膜结构域Ga0If:在嗅上皮中特异性表达的G蛋白a亚基G β:G蛋白β亚基G Y:G蛋白Y亚基AC:腺苷酸环化酶ATP:三磷酸腺苷cAMP:环状腺苷一 磷酸Rho标签:牛视紫红质的N末端侧开始至第20个的氨基酸。更详细地请参见序列号01 (牛视神经视紫红质来源)。β IAR: β I肾上腺素能受体RTPlS JfRTPl (受体转运蛋白I)的N末端开始至第36个的氨基酸序列删除后的受体转运蛋白。详细地请参见序列号42及Matsunami et al., J.Biol.Chem.,2007,282,15284。CNG:环核苷酸门控型离子通道质粒(XX):含有编码蛋白质XX的基因的质粒基因片段(XX):含有编码蛋白质XX的基因的基因片段mOREG:小鼠来源的丁子香酚识别嗅觉受体(GenBank注册号:AB061228.1)01fr73:小鼠来源的丁子香酚识别嗅觉受体,与mOERG同样01frl68:小鼠来源的2_戊酮识别嗅觉受体(请参见序列号43)01frl5:小鼠来源的环己酮识别嗅觉受体(请参见序列号44)01fr609:小鼠来源的香草酸识别嗅觉受体(请参见序列号45)小鼠来源的嗅觉受体的例子为小鼠来源的丁子香酚识别嗅觉受体mOREG、小鼠来源的嗅觉受体01frl68、小鼠来源的嗅觉受体01frl5或小鼠来源的嗅觉受体01fr609。小鼠来源的丁子香酚识别嗅觉受体mOREG识别丁子香酚。换而言之,小鼠来源的丁子香酚识别嗅觉受体mOREG被丁子香酚刺激。丁子香酚作为针对小鼠来源的丁子香酚识别嗅觉受体mOREG的气味分子发挥功能。小鼠来源的丁子香酚识别嗅觉受体mOREG被称作小鼠来源的嗅觉受体01fr73。小鼠来源的嗅觉受体01frl68识别2-戊酮。换而言之,小鼠来源的嗅觉受体01frl68被2-戊酮刺激。2-戊酮作为针对小鼠来源的嗅觉受体01frl68的气味分子发挥功能。
小鼠来源的嗅觉受体01frl5识别环己酮。换而言之,小鼠来源的嗅觉受体01frl5被环己酮刺激。环己酮作为针对小鼠来源的嗅觉受体01frl5的气味分子发挥功能。小鼠来源的嗅觉受体01fr609识别香草酸。换而言之,小鼠来源的嗅觉受体01fr609被香草刺激。香草酸作为针对小鼠来源的嗅觉受体01fr609的气味分子发挥功能。小鼠来源的嗅觉受体由7个跨膜结构域(TM1_TM7)、4个细胞外结构域(EC1-EC4)及4个细胞内结构域(IC1-1C4)构成。S卩,小鼠来源的嗅觉受体的氨基酸序列由(N末端)-ECl结构域-TMl结构域-1Cl结构域-TM2结构域-EC2结构域-TM3结构域-1C2结构域-TM4结构域-EC3结构域-TM5结构域-1C3结构域-TM6结构域-EC4结构域-TM7结构域-1C4结构域-(C末端)的氨基酸序列构成。如图2所示,细胞外ECl结构域的N末端用Rho标签进行修饰。该Rho标签由MNGTEGPNFYVPFSNKTGVV (序列号OI)所表示的氨基酸序列构成。Rho标签已知会促进小鼠来源的嗅觉受体在细胞膜上的表达(Krautwust D., Yau K.ff., Reed R.R.,(1999),Cell,95,917-925)。小鼠来源的丁子香酚识别嗅觉受体(mOREG)由序列号02所表示的氨基酸序列(小鼠嗅球来源)构成。小鼠来源的丁子香酚识别嗅觉受体(mOREG)的各区域的氨基酸序列如下所示。氨基酸序列以从N末端向C末端的方向来记载。ECl:MTLSDGNHSG A VFTLLGFSDYTMl:PELTIPLFLIFLTIYSITVVGNIGMIVIIRIICl:NPKLHI TM2:PMYFFLSHLSFVDFCYSSIVAPKMLVNLVTEC2:MNRGTM3:ISFVGCLVQFFFFCTFVVTESFLLGVMAYDRFVAIIC2:RNPLLYTVAMSTM4: QRLCAMLVLGSYAWGVVCSLILTCEC3:SALNLSFYGFNMINHFFCEFSSLLSLSRSDTSTM5: VSQLLLFVFATFNEISTLL11LLSYVLIIC3:VVTILKMKSASGRTM6:RKAFSTCASHLTAITIFHGTILFLYCVPNSKNEC4:SRHTTM7:VKVASVFYTVVIPMLNPLIYSLRNKDIC4:VKDTVKKIIGTKVYSS小鼠来源的嗅觉受体01frl68由序列号43所表示的氨基酸序列构成。小鼠来源的嗅觉受体Olfr的各区域的氨基酸序列如下所示。氨基酸序列以从N末端向C末端的方向来记载。ECl =MEKffNQSSSDFILLGLLPQTMl:NQTGLLLMMLIILVFFLALFGNSAMIHLIRVICl =DPRLHTTM2:PMYFLLSQLSLMDLMYISTTVPKMAFNFLS
EC2:GQKNTM3:ISFLGCGVQSFFFLTMAGSEGLLLASMAYDRFIC2:VAICHPLHYPIRMSTM4:KIMCLKMIIGSffILGSINSLAHSIEC3:YALHIPYCHSRSINHFFCDVPAMLPLACMDTWTM5: VYEYMVFVSTSLFLLLPFLGITASYGRVIC3:LFAVFHMRSKEGKTM6:KKAFTTCSTHLTVVTFYYAPFVYTYLRPRSLREC4:SPTTM7: EDKILTVFYTILTPMLNP11YSLRNKIC4:EVLGAMTRVLGTFSSMKP小鼠来源的嗅觉受体Olfr 15由序列号44所表示的氨基酸序列构成。小鼠来源的嗅觉受体01frl5的各区域的氨基酸序列如下所示。氨基酸序列以从N末端向C末端的方向来记载。ECl:MEVDSNSSSGSFILMGVSDHTMl:PHLEIIFFAVILASYLLTLVGNLTIILLSRLICl:DARLHTTM2:PMYFFLSNLSSLDLAFTTSSVPQMLKNLWGEC2:PDKTTM3 JSYGGCVTQLYVFLffLG A TECILLVVMAFDRYIC2:VAVCRPLHYMTVMNTM4:PRLCWGLAAISWLGGLGNSVIQSTEC3:FTLQLPFCGHRKVDNFLCEVPAMIKLACGDTSTM5:LNEAVLNGVCTFFTVVPVSVILVSYCFIIC3:AQAVMKIRSVEGRTM6:RKAF·NTCVSHLVVVFLFYGSAIYGYLLPAKSSEC4:NQSTM7:QGKFISLFYSVVTPMVNPLIYTLRNKIC4: EVKG A LGRLLGKGRG A S小鼠来源的嗅觉受体01fr609由序列号45所表示的氨基酸序列构成。小鼠来源的嗅觉受体01fr609的各区域的氨基酸序列如下所示。氨基酸序列以从N末端向C末端的方向来记载。ECl:MSYSNHSSTSFFLTGLPGLTMl:ETVYLWLSIPLCTMYIASLAGNGLILWVVKSICl:EPSLHQTM2:PMYYFLSMLAVTDLGLSVSTLPTMLTIYMMGEC2:VSETM3:VALDMCLAQLFFIHTFSIMESSVLLTMAFDRVVAIIC2:SSPLHYATILT
TM4:NPRVASLGMVILVRSIGLHIPAPIEC3:MLKKLPYCQKRHLSHSYCLHPDVMKLACTDTRTM5: INSAYGLFVVLSTLGVDSVLIVLSYGLIIC3:LYTVLSIASKTERTM6:LKALNTCVSHICSVLLFYTPMIGLSMIHRFGEC4 =KffASPCTM7:SRVLLSYLHFLTPPVLNPVVYTIKTKIC4 =QlRQRIffRIFRCGGRSIGHIQGHβ I肾上腺素能受体(β 1AR)由序列号3所表示的氨基酸序列构成。与小鼠来源的嗅觉受体同样,β I肾上腺素能受体(β 1AR)也由7个跨膜区域(ΤΜ1-ΤΜ7)、4个细胞外区域(EC1-EC4)及4个细胞内区域(IC1-1C4)构成。β I肾上腺素能受体(β 1AR)的各区域的氨基酸序列如下所示。 ECl:MGAGA LALG A SEPCNLSSAAPLPDG A ATAARLLVLASPPASLLPPASEGSAPLSTMl:QQWTAGMGLLLALIVLLIVVGNVLVIVAIAKICl:TPRLQTLTM2:TNLFIMSLASADLVMGLLVVPFG A TIVVffEC2 =GRffEYGTM3:SFFCELWTSVDVLCVTASIETLCVIALDRYLAITIC2:LPFRYQSLLTM4: TRARARALVCTVffAISALVSFLPILMEC3:HWWRAESDEARRCYNDPKCCDFVTNTM5:RAYAIASSVVSFYVPLCIMAFVYLRVFREAQ IC3:KQVKKIDSCERRFLTGPPRPPSPAPSPSPGPPRPADSLANGRSSKRRPSRLVALRETM6:QKALKTLGIIMGVFTLCffLPFFLANVVKAFEC4: HRDLVTM7:PDRLFVFFNWLGYANSAFNPIIYCRSPDIC4:FRKAFQRLLCCARRAACRRRAAHGDRPRASGCLARAGPPPSPGAPSDDDDDDAGATPPARLLEPWAGCNGGTTTVDSDSSLDEPGRQGFSSESKV与小鼠来源的嗅觉受体及β IAR同样,嵌合性嗅觉受体也由ECl IC4的15个结构域构成。嵌合性嗅觉受体的各结构域从小鼠来源的嗅觉受体所含的相对应的结构域或者β IAR所含的相对应的结构域的任一者中选择。例如,嵌合性嗅觉受体的ECl结构域从小鼠来源的嗅觉受体所含的ECl结构域或β IAR所含的ECl结构域的任一者中选择。同样,嵌合性嗅觉受体的 TMl、IC1、ΤΜ2、EC2、ΤΜ3、IC2、ΤΜ4、EC3、ΤΜ5、IC3、ΤΜ6, EC4、ΤΜ7 及 IC4 结构域从小鼠来源的嗅觉受 体所含的ΤΜ1、ICU ΤΜ2、EC2、ΤΜ3、IC2、ΤΜ4、EC3、ΤΜ5、IC3、ΤΜ6,EC4、ΤΜ7 及 IC4 结构域或者 β I AR 所含的 TMl、IC1、ΤΜ2、EC2、ΤΜ3、IC2、ΤΜ4、EC3、ΤΜ5、IC3、ΤΜ6,EC4、ΤΜ7及IC4结构域的任一者中分别选择。因此,嵌合性嗅觉受体的理论上的个数为2八15 (2的15次方、32768)。已知β I肾上腺素能受体(β 1AR)会使环状腺苷一磷酸(cAMP)的产生量增加。因此,期待如上获得的嵌合性嗅觉受体使cAMP的产生量增加。但是,本发明人等发现,与上述期待不同,绝大多数的嵌合性嗅觉受体会减少cAMP的产生量。本发明人等发现,只有满足了以下(I)和(2)条件的嵌合性嗅觉受体才会使环状腺苷一磷酸(cAMP)的产生量增加。(I)在Rho标签和ECl结构域之间插入EQKLISEEDL (序列号04,以下称作“myc附加表位”)的氨基酸序列;和(2)将小鼠来源的嗅觉受体的IC4结构域置换成β I肾上腺素能受体(β 1AR)的IC4结构域。请参见图4。由图4可知,嵌合性嗅觉受体的IC4结构域含有β I肾上腺素能受体的氨基酸序列的C末端。(实验例)以下说明支持上述事项的实验例。表I及表2表示实验例中使用的引物。表I
权利要求
1.一种使用嵌合性嗅觉受体产生CAMP的方法,其具备以下的工序: 准备具备第I层、脂质双层膜及第2层的反应体系的工序(a), 这里,所述脂质双层膜被所述第I层及所述第2层夹持, 所述脂质双层膜具备所述嵌合性嗅觉受体及腺苷酸环化酶, 所述嵌合性嗅觉受体贯穿所述脂质双层膜, 所述腺苷酸环化酶贯穿所述脂质双层膜, 所述第2层含有ATP及G蛋白, 所述G蛋白配置在所述嵌合性嗅觉受体的一端附近, 所述嵌合性嗅觉受体来自于由(N末端)-ECl结构域-TMl结构域-1Cl结构域-TM2结构域-EC2结构域-TM3结 构域-1C2结构域-TM4结构域-EC3结构域-TM5结构域-1C3结构域-TM6结构域-EC4结构域-TM7结构域-1C4结构域-(C末端)的氨基酸序列所构成的小鼠来源的嗅觉受体, 所述嵌合性嗅觉受体的N末端被Rho标签(序列号01)-myc附加表位(序列号04)的氨基酸序列修饰,并且 所述IC4结构域被置换成β I肾上腺素能受体的IC4结构域;以及将刺激所述嵌合性嗅觉受体的化学物质供至所述第I层以由所述ATP产生cAMP的工序(b)。
2.根据权利要求1所述的方法,其中,所述小鼠来源的嗅觉受体为小鼠来源的丁子香酚识别嗅觉受体,所述化学物质为丁子香酚。
3.根据权利要求1所述的方法,其中,所述小鼠来源的嗅觉受体为小鼠来源的嗅觉受体01frl68,所述化学物质为2-戊酮。
4.根据权利要求1所述的方法,其中,所述小鼠来源的嗅觉受体为小鼠来源的嗅觉受体01frl5,所述化学物质为环己酮。
5.根据权利要求1所述的方法,其中,所述小鼠来源的嗅觉受体为小鼠来源的嗅觉受体01fr609,所述化学物质为香草酸。
6.根据权利要求2所述的方法,其中,所述嵌合性嗅觉受体由序列号36所表示的氨基酸序列构成。
7.根据权利要求3所述的方法,其中,所述嵌合性嗅觉受体由序列号51所表示的氨基酸序列构成。
8.根据权利要求4所述的方法,其中,所述嵌合性嗅觉受体由序列号60所表示的氨基酸序列构成。
9.根据权利要求5所述的方法,其中,所述嵌合性嗅觉受体由序列号69所表示的氨基酸序列构成。
10.根据权利要求1所述的方法,其中, 所述G蛋白具备G a olf、G β及Gy, 在所述工序(b)中,所述G蛋白分离为所述Ga olf及复合体, 所述复合体由所述Gβ及所述GY构成,并且 所述G a olf将所述腺苷酸环化酶活化。
11.根据权利要求1所述的方法,其中,所述脂质双层膜还具备离子通道, 所述离子通道贯穿所述脂质双层膜,并且 所述工序(b)中产生的所述cAMP将所述离子通道活化。
12.根据权利要求11所述的方法,其中,所述离子通道为钙离子通道。
13.一种判定试样溶液中是否含有刺激嵌合性嗅觉受体的分子的方法,其具备以下的工序: 准备具备第I层、脂质双层膜及第2层的反应体系的工序(a), 这里,所述脂质双层膜被所述第I层及所述第2层夹持, 所述第I层及所述第2层中的至少任一层含有离子, 所述脂质双层膜具备所述嵌合性嗅觉受体、离子通道及腺苷酸环化酶, 所述嵌合性嗅觉受体贯穿所述脂质双层膜, 所述腺苷酸环化酶贯穿所述脂质双层膜, 所述离子通道贯穿所述脂质双层膜, 所述第2层含有ATP及G蛋白, 所述G蛋白配置在所述嵌 合性嗅觉受体的一端附近, 所述嵌合性嗅觉受体来自于由(N末端)-ECl结构域-TMl结构域-1Cl结构域-TM2结构域-EC2结构域-TM3结构域-1C2结构域-TM4结构域-EC3结构域-TM5结构域-1C3结构域-TM6结构域-EC4结构域-TM7结构域-1C4结构域-(C末端)的氨基酸序列所构成的小鼠来源的嗅觉受体, 所述嵌合性嗅觉受体的N末端被Rho标签(序列号01)-myc附加表位(序列号04)的氨基酸序列修饰,并且 所述IC4结构域被置换成β I肾上腺素能受体的IC4结构域; 将所述试样溶液供至所述第I层并对所述第I层及所述第2层中的至少任一层所含有的所述离子的浓度进行测定的工序(b);以及 在所述测定得到的离子的浓度发生变化时判定所述试样溶液含有所述刺激嵌合性嗅觉受体的分子的工序(C)。
14.根据权利要求13所述的方法,其中,所述小鼠来源的嗅觉受体为小鼠来源的丁子香酚识别嗅觉受体,所述化学物质为丁子香酚。
15.根据权利要求13所述的方法,其中,所述小鼠来源的嗅觉受体为小鼠来源的嗅觉受体01frl68,所述化学物质为2-戊酮。
16.根据权利要求13所述的方法,其中,所述小鼠来源的嗅觉受体为小鼠来源的嗅觉受体01frl5,所述化学物质为环己酮。
17.根据权利要求13所述的方法,其中,所述小鼠来源的嗅觉受体为小鼠来源的嗅觉受体01fr609,所述化学物质为香草酸。
18.根据权利要求14所述的方法,其中,所述嵌合性嗅觉受体由序列号36所表示的氨基酸序列构成。
19.根据权利要求15所述的方法,其中,所述嵌合性嗅觉受体由序列号51所表示的氨基酸序列构成。
20.根据权利要求16所述的方法,其中,所述嵌合性嗅觉受体由序列号60所表示的氨基酸序列构成。
21.根据权利要求17所述的方法,其中,所述嵌合性嗅觉受体由序列号69所表示的氨基酸序列构成。
22.根据权利要求13所述的方法,其中, 所述G蛋白具备G a olf、G β及Gy, 在所述工序(b)中,所述G蛋白分离成所述Ga olf及复合体, 所述复合体由所述Gβ及所述GY构成,并且 所述G a olf将所述腺苷酸环化酶活化。
23.根据权利要求13所述的方法,其中, 所述脂质双层膜还具备离子通道, 所述离子通道贯穿所述脂质双层膜,并且 所述工序(b)中产生的所述cAMP将所述离子通道活化。
24.根据权利要求23所述的方法,其中,所述离子通道为钙离子通道。
25.一种对含有在试样溶液中且刺激嵌合性嗅觉受体的化学物质进行定量的方法,其具备以下的工序(a) 工序(c): 准备具备第I层、脂质双层膜及第2层的反应体系的工序(a), 这里,所述脂质双层膜被所述第I层及所述第2层夹持, 所述第I层及所述第2层中的至少任一层含有离子, 所述脂质双层膜具备所述嵌合性嗅觉受体、离子通道及腺苷酸环化酶, 所述嵌合性嗅觉受体贯穿所述脂质双层膜, 所述腺苷酸环化酶贯穿所述脂质双层膜, 所述离子通道贯穿所述脂质双层膜, 所述第2层含有ATP及G蛋白, 所述G蛋白配置在所述嵌合性嗅觉受体的一端附近, 所述嵌合性嗅觉受体来自于由(N末端)-ECl结构域-TMl结构域-1Cl结构域-TM2结构域-EC2结构域-TM3结构域-1C2结构域-TM4结构域-EC3结构域-TM5结构域-1C3结构域-TM6结构域-EC4结构域-TM7结构域-1C4结构域-(C末端)的氨基酸序列所构成的小鼠来源的嗅觉受体, 所述嵌合性嗅觉受体的N末端被Rho标签(序列号01)-myc附加表位(序列号04)的氨基酸序列修饰,并且 所述IC4结构域被置换成β I肾上腺素能受体的IC4结构域; 将所述试样溶液供至所述第I层并对所述第I层及所述第2层中的至少任一层所含有的所述离子的浓度进行测定的工序(b);以及 根据所述测定得到的离子的浓度的变化量对所述试样溶液中含有的所述化学物质进行定量的工序(C)。
26.根据权利要求25所述的方法,其中,所述小鼠来源的嗅觉受体为小鼠来源的丁子香酚识别嗅觉受体,所述化学物质为丁子香酚。
27.根据权利要求25所述的方法,其中,所述小鼠来源的嗅觉受体为小鼠来源的嗅觉受体01frl68,所述化学物质为2-戊酮。
28.根据权利要求25所述的方法,其中,所述小鼠来源的嗅觉受体为小鼠来源的嗅觉受体01frl5,所述化学物质为环己酮。
29.根据权利要求25所述的方法,其中,所述小鼠来源的嗅觉受体为小鼠来源的嗅觉受体01fr609,所述化学物质为香草酸。
30.根据权利要求26所述的方法,其中,所述嵌合性嗅觉受体由序列号36所表示的氨基酸序列构成。
31.根据权利要求27所述的方法,其中,所述嵌合性嗅觉受体由序列号51所表示的氨基酸序列构成。
32.根据权利要求28所述的方法,其中,所述嵌合性嗅觉受体由序列号60所表示的氨基酸序列构成。
33.根据权利要求29所述的方法,其中所述嵌合性嗅觉受体由序列号69所表示的氨基酸序列构成。
34.根据权利要求25所述的方法,其中, 所述G蛋白具备G a olf、G β及Gy, 在所述工序(b)中,所述G蛋白分离为所述Ga olf及复合体, 所述复合体由所述Gβ及所述GY构成,并且 所述G a olf将所述腺苷酸环化酶活化。
35.根据权利要求25所述的方法,其中, 所述脂质双层膜还具备离子通道, 所述离子通道贯穿所述脂质双层膜,并且 所述工序(b)中产生的所述cAMP将所述离子通道活化。
36.根据权利要求35所述的方法,其中,所述离子通道为钙离子通道。
37.序列号36表不的嵌合性嗅觉受体。
38.序列号51表不的嵌合性嗅觉受体。
39.序列号60表不的嵌合性嗅觉受体。
40.序列号69表不的嵌合性嗅觉受体。
41.一种脂质双层膜,其是在用于对试样溶液中含有的化学物质进行检测或定量所使用的反应体系中具备的脂质双层膜,其中, 所述脂质双层膜具备所述嵌合性嗅觉受体、离子通道及腺苷酸环化酶, 所述嵌合性嗅觉受体贯穿所述脂质双层膜, 所述腺苷酸环化酶贯穿所述脂质双层膜, 所述离子通道贯穿所述脂质双层膜, 所述嵌合性嗅觉受体来自于由(N末端)-ECl结构域-TMl结构域-1Cl结构域-TM2结构域-EC2结构域-TM3结构域-1C2结构域-TM4结构域-EC3结构域-TM5结构域-1C3结构域-TM6结构域-EC4结构域-TM7结构域-1C4结构域-(C末端)的氨基酸序列所构成的小鼠来源的嗅觉受体, 所述嵌合性嗅觉受体的N末端被Rho (序列号01) -myc (序列号04)的氨基酸序列修饰,并且 所述IC4被置换成β I肾上腺素能受体的IC4。
42.根据权利要求41所述的脂质双层膜,其中,所述嵌合性嗅觉受体由序列号36所表示的氨基酸序列构成。
43.根据权利要求41所述的脂质双层膜,其中,所述嵌合性嗅觉受体由序列号51所表示的氨基酸序列构成。
44.根据权利要求41所述的脂质双层膜,其中,所述嵌合性嗅觉受体由序列号60所表示的氨基酸序列构成。
45.根据权利要求41所述的脂质双层膜,其中,所述嵌合性嗅觉受体由序列号69所表示的氨基酸序列构成。
46.一种用于对试样溶液中含有的化学物质进行检测或定量所使用的反应体系,其中, 所述反应体系具备第I层、脂质双层膜及第2层, 这里,所述脂质双层膜被所述第I层及所述第2层夹持, 所述第I层及所述第2层中的至少任一层含有离子, 所述脂质双层膜具备所述嵌合性嗅觉受体、离子通道及腺苷酸环化酶, 所述嵌合性嗅觉受体贯穿所述脂质双层膜, 所述腺苷酸环化酶贯穿所述脂质双层膜, 所述离子通道贯穿所述脂质双层膜, 所述第2层含有ATP及G蛋白, 所述G蛋白配置在所述嵌合性嗅觉受体的一端附近, 所述嵌合性嗅觉受体来自于由(N末端)-ECl结构域-TMl结构域-1Cl结构域-TM2结构域-EC2结构域-TM3结构域-1C2结构域-TM4结构域-EC3结构域-TM5结构域-1C3结构域-TM6结构域-EC4结构域-TM7结构域-1C4结构域-(C末端)的氨基酸序列所构成的小鼠来源的嗅觉受体, 所述嵌合性嗅觉受体的N末端被Rho标签(序列号01)-myc附加表位(序列号04)的氨基酸序列修饰,并且 所述IC4被置换成β I肾上腺素能受体的IC4。
47.根据权利要求46所述的反应体系,其中,所述嵌合性嗅觉受体由序列号36所表示的氨基酸序列构成。
48.根据权利要求46所述的反应体系,其中,所述嵌合性嗅觉受体由序列号51所表示的氨基酸序列构成。
49.根据权利要求46所述的反应体系,其中,所述嵌合性嗅觉受体由序列号60所表示的氨基酸序列构成。
50.根据权利要求46所述的反应体系,其中,所述嵌合性嗅觉受体由序列号69所表示的氨基酸序列构成。
全文摘要
本发明提供使用嵌合性嗅觉受体产生cAMP的方法,其具备以下的工序准备具备第1层、脂质双层膜及第2层的反应体系的工序(a),这里,脂质双层膜被第1层及第2层夹持,脂质双层膜具备嵌合性嗅觉受体及腺苷酸环化酶,嵌合性嗅觉受体贯穿脂质双层膜,腺苷酸环化酶贯穿脂质双层膜,第2层含有ATP及G蛋白,G蛋白配置在嵌合性嗅觉受体的一端附近,嵌合性嗅觉受体的N末端被Rho标签(序列号01)-myc附加表位(序列号04)的氨基酸序列修饰,并且IC4结构域被置换成β1肾上腺素能受体的IC4结构域;以及将刺激嵌合性嗅觉受体的化学物质供至第1层以由ATP产生cAMP的工序(b)。
文档编号C12N15/09GK103097408SQ20118004066
公开日2013年5月8日 申请日期2011年10月24日 优先权日2010年10月25日
发明者铃木雅登, 冈弘章, 清中茂树, 森泰生 申请人:松下电器产业株式会社

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