环介导等温扩增(lamp)的序列特异性实时监测的制作方法

xiaoxiao2020-6-24  3

【专利下载】Tel:18215660330

专利名称:环介导等温扩增(lamp)的序列特异性实时监测的制作方法
环介导等温扩增(LAMP)的序列特异性实时监测相关申请的交叉引用本申请要求于2010年6月22日提交的标题为“用于环介导等温扩增(LAMP)的序列特异性实时监测的系统和方法(SYSTEMS AND METHODS FOR SEQUENCE SPECIFICREALTIME MONITORING OF LOOP-MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION (LAMP))”的美国临时专利申请号61/357,428的优先权,该专利申请的全部内容作为参考并入本文并且应认为是本说明书的一部分。有关联邦政府资助的研究开发的声明本发明是通过批准号2006-55605-16683和07-55605-17843的政府资助以及美国农业部(USDA-NRI)授予的项目HAW00559-04G进行的。政府对本发明具有一定的权利。
背景技术
病原菌是可以在植物、动物和人类中导致疾病的那些细菌。由于病原菌的多样性,存在大量病原菌和伴随的疾病。这些疾病的实例可以包括植物中的萎蔫病、软腐病和枯萎病,狗中的细小病毒、贾弟虫和洛基山斑疹热,和人类中的肺结核、肺炎和破伤风。由细菌性病原体所引起的疾病可以导致财产和生命的巨大损害。例如,青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)是在超过200种植物种中导致萎蔫病的细菌性病原体。据估计主要影响马铃薯产量的该病原体中的一个种(小种3变种2 (race3biovar2))每年造成超过约9. 5亿美元的损失。减缓并防止细菌性疾病传播首先包括鉴别病原菌的存在。然而,用于病原菌检测的技术可能相对缓慢。此外, 这些技术可能不能将所选的细菌性病原体种与其它种相区别。由于不能正确鉴别生物病原体,因此阻止并消除爆发的举措可能会被过度延迟。因此,对开发能够快速检测所选病原体株并且将所选病原体株的亚群与相同种内的其它种群相区别的检测技术具有浓厚兴趣。

发明内容
在一个方面,提供了监测革E DNA的环介导等温扩增(LOOP-mediated isothermalamplification) (LAMP)的方法。所述方法通常包括提供LAMP反应混合物,所述反应混合物包含靶DNA和能够扩增所述靶DNA的一种或多种LAMP引物。可以将同化探针(assimilating probe)加入到LAMP反应混合物中,其中所述同化探针包含两条寡核苷酸链(oligonucleotide strands),其中第一寡核苷酸链包含位于3’端的粹灭探针(粹灭剂探针,quencher probe)并且其中所述同化探针的第二寡核苷酸链包含结合(conjugated)在5’端的荧光团。加入到LAMP反应混合物中的所述第二寡核苷酸链的量与所述第一寡核苷酸链的量的比率可以小于1:1。还可以将DNA聚合酶加入到包含所述同化探针的LAMP反应混合物中。可以测量包含所述同化探针和DNA聚合酶的LAMP反应混合物所发射的荧光。在另一个方面,提供了用于监测靶DNA的环介导等温扩增(LAMP)的同化探针。所述探针通常包含第一寡核苷酸链,所述第一寡核苷酸链包含位于所述链的3’端的猝灭探针。在一些实施方式中,所述探针包含第二寡核苷酸链,所述第二寡核苷酸链包含结合在所述链的5’端的荧光团。另外,在一些实施方式中,所述第二寡核苷酸链与所述第一寡核苷酸链的量的比率可以小于1:1。


图1是用于温度控制的激光驱动器和用于监测杂交探针的荧光计的电路示意图;图2是基于⑶的平台中辐射源的示意图;图3A是本发明的实施方式的定制荧光计和激光驱动器的电路板布局的示意图;图3B是图3A的定制荧光计和激光驱动器的组装电路板的光学照片。在聚碳酸酯⑶上方还显示了高温计头部;图4是在ABS中具有多种尺寸的反应孔(反应容器,reaction well)的印刷⑶的光学照片;

图5是与通过热电偶测量的真实孔温度相比,通过非接触式热电偶(例如,高温计)估计的修正孔温度的图。在插图中显示了用于估计通过孔的辐射透射和来自孔表面的环境辐射的反射的系数的校准数据;图6是显示从大致环境温度至约65°C的设定点的反应孔中温度控制的温度测量图;图7是相对荧光相对于具有约O. 4 μ M分子拉链的rsfliC LAMP的时间的图;图8是相对荧光相对于时间的图,其显示了通过在形成分子拉链结构之前在LAMP反应混合物中直接加入突光链和粹灭链(quencher strand)对rsfliC LAMP反应的实时监测;图9是相对荧光相对于rsfliC LAMP和具有靶向rsfliC的同化探针(O. 08 μ M荧光链和O. 16 μ M猝灭链)的λ噬菌体LAMP的时间的图;图10是相对荧光相对于时间的图,其显示使用了用于rsfliC LAMP扩增终点检测的分子信标以及rsfliC LAMP反应的速度观察;图11是相对荧光相对于时间的图,其显示了当使用rk2208.1和rsfliC引物组结合升高浓度的Bst DNA聚合酶时所测量的荧光;图12是相对荧光相对于时间的图,其显示了使用rk2208.1引物组和升高浓度的Bst DNA聚合酶所获得的可观察到的荧光增加;图13是达到检测阈值的时间相对于来自图12的数据中Bst DNA聚合酶含量的图;图14是相对荧光相对于通过同化探针监测的具有引物组rk2208.1,不具有环F(IoopF)引物的LAMP反应的时间的图。以约O. 08 μ Μ、约O. 4 μ M和约O. 8 μ M的浓度提供荧光链,并且以约O. 16 μ M、约O. 8 μ M和约1. 6 μ M的浓度提供猝灭链;图15是相对荧光相对于通过具有不同浓度的同化探针荧光链和猝灭链的环F(IoopF)引物的rk2208.1LAMP反应的时间的图。猝灭链的浓度为荧光链的约两倍;图16是相对突光相对于使用本发明所述的同化探针和插入染料(EvaGreen)的实施方式的LAMP反应的时间的图;图17是相对荧光对相对于肠沙门氏菌(Salmonella enterica)和细菌噬菌体λ(噬菌体λ,bacteriophage lambda)基因组DNA的多路LAMP反应的时间的图。图18是使用用于荧光素的光谱设定所观察到的相对荧光相对于使用荧光素标记的肠沙门氏菌(Salmonella enterica)同化探针扩增肠沙门氏菌(Salmonella enterica)和/或细菌噬菌体λ基因组DNA的多路LAMP反应的时间的图;和图19是使用用于cy3的光谱设定所观察到的相对荧光相对于使用cy3标记的λ噬菌体同化探针扩增肠沙门氏菌(Salmonella enterica)和/或细菌噬菌体λ基因组DNA的多路LAMP反应的时间的图。
具体实施例方式
如本文所使用的术语“约”、“大约”和“基本上”表示与所说明的量接近的量,其仍执行所需功能或者实现所需结果。例如,术语“约”、“大约”和“基本上”可以指在所说明的量的小于10%之内、小于5%之内、小于1%之内、小于O. 1%之内或小于O. 01%之内的量。本发明公开的实施方式提供了能够快速区分所选病原体的所选株与相同种内的其它种群的基于基因的诊断法。实例可以包括,但不限于,细菌噬菌体λ (噬菌体 λ , bacteriophage lambda)、青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)的小种 3 变种 2 株(race3biovar2strains)、青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)、肠沙门氏菌(Salmonella enterica)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。可以通过将特定寡核苷酸探针(本文中称为“同化探针”)加入到包含LAMP引物和靶DNA的混合物中来完成靶DNA的环介导等温扩增(LAMP)的序列特异性实时监测。同化探针本身可以包含两条不同的寡核苷酸链。第一寡核苷酸链可以包含猝灭剂(称为猝灭探针),而第二寡核苷酸链可以包含荧光团(称为荧光探针)。在LAMP反应期间,当所述两条链互相替换时,产生荧光信号。通过监测发射的荧光,可以检测LAMP反应。此外,实施方式的所 述同化探针当扩增的所选定的靶DNA发生时,可以包含经历显著的移位的链。因此,当不发生靶DNA的扩增时,所述同化探针可以基本上不发荧光,而当存在靶DNA的扩增时,可以基本上发荧光。因此,靶DNA扩增的检测可以是序列特异的。如本文所使用的,术语同化探针可以采用本领域技术人员所理解的它的惯常含义,并且当互相不杂交且还当荧光探针与猝灭探针杂交在一起时可以进一步指荧光探针和猝灭探针。如以下更详细地讨论的,LAMP反应混合物中同化探针的存在可以减缓进行LAMP反应的速率。然而,已鉴别了由于存在同化探针而降低同化探针对LAMP反应速率的影响的同化探针参数。这些参数包括,但不限于,突光探针与粹灭探针的比率、混合所述链(突光探针和猝灭探针)以产生同化探针的方式以及同化探针的总量。通过降低同化探针对LAMP反应速率的影响,有利于LAMP反应的实时监测。还可以在所选范围内改变这些参数以减少检测LAMP反应所需的时间,从而进一步有利于实时检测。设计用于独立的LAMP反应的同化探针的实施方式还可以用于多于一个单一基因序列的实时检测(多路检测)。为了实时进行LAMP反应的多路检测,每个同化探针可以使用可以单独监测的光谱学唯一的荧光团。本发明的其它实施方式提供了有利于这些基于基因的诊断法的实时应用的基于基底的硬件平台。在一些实施方式中,所述平台包括由孔组成图案以用于进行LAMP反应的光盘(CD)或其它基底。在一些实施方式中,可以将高温计用作非接触温度传感器以监测基于基底的平台的反应孔内的温度。高温计可以根据对反应孔所发出的热辐射的测量来估计所述基底的反应孔内的温度。还开发了校准程序以修正由于存在水和密封反应孔的透明薄膜所导致的通过高温计测量的温度误差。这些温度测量还可以用于控制热源。以这种方式,可以将所述反应孔内的温度对在其中发生的LAMP反应保持大致恒定。有利地,这些工具可以有利于病原体的准确区分,并且例如使得能够对疾病引入的响应做出及时的管理决定。可以理解所公开的实施方式还可以在多种其它背景中是有用的,其包括,但不限于,临床诊断学,如在低来源环境中和军队以及国家安保人员对生物制剂的鉴定。在一个实施方式中,提供了通过LAMP对所选DNA序列实时检测的方法。所述方法可以包括在所选基底(例如,CD)中形成图案以形成反应孔。所述方法还可以包括将如本文所述的LAMP反应混合物和同化探针加入到所述反应孔中。所述方法另外可以包括密封所述孔并将靶DNA加入至孔中。所述方法另外可以包括用热源(例如,激光)将所述孔的内容物加热至足以诱导荧光的温度。所述方法还可以包括检测所述荧光。硬件设计可以在包含用于单独LAMP反应的多个孔的基底上进行LAMP过程。所述基底可以是本领域中已知的任何材料,如塑料、金属或复合材料。在一些实施方式中,可以将光盘(⑶)平台用于进行用于DNA扩增和检测的环介导等温扩增(LAMP)过程。⑶平台允许样品制备和反应步骤的自动化,并且提供了良好的密封度(containment)。尽管在本文中一般是就CD基底而言进行描述的,但是可以使用提供多个反应孔的其它基底。在包含在⑶或其它基底内的反应孔内进行LAMP反应。在某些实施方式中,可以通过图案化来制造所述反应孔。可以通过机械装置(mechanisms)在基底如⑶中产生图案,所述机械装置包括,但不限于,用于快速原型设计的激光和/或印刷、用于批量生产的注塑成型以及用于使光盘或本 领域中已知的其它基成图案化的其它机械装置。例如,在一个实施方式中,可以使用激光雕刻机(例如,Venus-30, GCCSystems, Taipei Hsien, Taiwan)在黑色聚碳酸酯(例如,Lexan)盘上形成图案。在另一个实施方式中,可以使用计算机数字控制(CNC)机器使聚碳酸酯空白盘图案化。在其它实施方式中,可以使用3D打印机(例如,SST1200, Dimension Inc, Eden Prairie MN)作为整体产生图案化的丙烯腈丁二烯苯乙烯(ABS)盘。可以根据所需应用制造所述盘的横截面形状。例如,在某些实施方式中,可以将所述孔制备成具有一般圆形截面的圆柱体结构。在一些实施方式中,用于LAMP监测的基底厚度可以在约1. 2mm至约1. 8mm的范围内。然而,可以理解,所述基底的实施方式可以由材料(如本领域中已知的其它聚合物)无限制地形成。根据需要,所述反应孔的横截面积也可以是不同的。例如,在具有一般圆形截面的圆柱体结构的孔的实施方式中,所述反应孔的直径可以根据在所述孔中进行的特定反应而无限制地改变。在一些实施方式中,所述孔直径的值可以从约3_至约4_,或者可以是它们中间的任何值。在其它非限制性实例中,所述反应孔中的一个或多个可以被一个或多个壁和通道围绕。有利地,所述壁和/或通道的存在可以改善反应孔周围的隔热性。在某些实施方式中,可以在约O. 5mm至5_的范围内选择所述壁厚度值。在某些实施方式中,可以选择具有约O. 5至约5_范围内的值的所述通道厚度值。然而,可以理解,根据需要可以选择所述壁厚度和通道厚度以采用适合于LAMP监测的任何值。除非另作说明,否则在以下所讨论的实例中使用的所述反应孔厚度和通道厚度分别为约Imm和约2_。在一些实施方式中,可以选择所述反应孔和通道的深度以在所述反应孔和/或通道下方保留5mm、4mm、3mm、2mm、1mm、0. 5mm、0. 3mm或更小的基底材料。在以下的实例中,选择所述反应孔和通道的深度以在所述反应孔下方保留约O. 3mm厚的盘材料。可以使用非接触温度传感器记录CD或其它基底的温度。在一个实施方式中,所述非接触温度传感器可以包括包含光源和检测器的高温计。例如,可以将具有微型光头的商业化高温计连接到柔性电缆(例如,MID20LTCB3, Raytek, Santa Cruz, CA)。可替换地,可以将单片型(例如,MLX90614ESF-BAA, Melexis, leper Belgium)直接安装在邻近于反应孔位置的电路板上。为了校准,可以使用热电偶(例如,由细热电偶丝制成的K型热电偶,例如Omega Engineering, Stamford, CT),记录标准温度。可以将所述热电偶丝连接到软件补偿的万用表(例如,Flukel86, Everett, WA)上。如以下更详细地说明的,为了有利于非接触温度传感器的校准,可以用蒸馏水(或其它不反应的液体)将所述孔基本上充满并用具有粘合底布的透明薄膜(例如,Microseal’B’粘合封口,Bio-Rad, Hercules CA)覆盖。有利地,通过校准所述非接触温度传感器以补偿所述反应孔中非发射性液体和薄膜的影响,可以更精确地控制所述反应孔中的温度。还可以通过热源来实施所述反应孔的加热。热源可以包括但不限于,如本领域中已知的接触和非接触源。在一个实施方式中,所述热源可以包含光学加热装置。例如,所述光学装置可以包含对准所述反应孔下侧的散焦激光。例如,可以通过使用以约150mW大致对准所述孔下侧的条件操作的808nm红外线激光二极管组件(例如,icetec_UK)来实现加热。所述激光可以大致是散焦的以抑制所述盘的灼烧并且将热量均匀地分布在孔中。可以通过由来自微控制器(例如,Fox LP3500, Rabbit Semiconductor, Davis, CA)的脉冲宽度调制(PWM)信号驱动的逻辑光耦 合器门控的η沟道功率MOSFET (参见图1)控制激光功率。为了提供温度控制,可以使用来自高温计的反馈通过修改的比例积分控制程序对控制器编程。如下所述,可以在应用校准修正后通过微控制器接收高温计反馈。要实施光学温度检测,可以例如通过具有所选波长的高强度光源倾斜照射样品。在一个实施方式中,所述光源可以包含发射约450nm至约475nm之间(例如,约470nm)范围内所选波长的光的蓝光发射二极管(LED)。能够具有这种光照的LED光源的实例为Agilent Technologies, SantaClara, CA 生产的 HLMP CB28STD00。可以通过检测器检测从反应孔中发出的热辐射。在一个实施方式中,所述检测器可以包含邻近光源布置的光电二极管。可以安装检测器以收集穿过水和所述透明薄膜的来自所述孔表面的热辐射。如图1中所示,可以使用在约101(ιν/Α-1012ν/Α之间的范围内运行的高增益光电放大电路(例如,T-5系列,Intor Inc. , Socorro匪)来运行所述检测器。可以使用窄带通干涉滤光片(例如,Intor)调谐通过检测器测量的激发和发射光谱。然而,可以理解,在可替换的实施方式中,可以代替上述光电二极管检测器或与之结合使用接触温度传感器。
非接触温度传感器的校准可以在所述系统中选择非接触温度传感器以用于温度测量从而防止污染,如在一次性CD平台中。例如,可以将高温计用作非接触温度传感器。然而,所述检测器测量从所述反应孔的表面发出的热辐射以便确定所探测区域中的温度(例如,单个孔的温度或所选的孔组的平均温度)。这种热辐射穿过反应液体(例如,水)和用于密封所述孔的材料(例如,透明薄膜,存在薄膜)。不受理论的限制,据信由于这些材料具有低发射率,所以它们可以在来源于所述孔内部的辐射以及来自环境的热辐射中引入反射。因此,这些材料可能会在由通过高温计测量的热辐射计算的温度中引入误差。可以校准高温计以修正这些误差。如以下所讨论的,作为来自处于稳态的热源的不同光功率的函数,可以使用高温计和与反应孔接触的热电偶测量所述反应孔内的温度。可以将这些测量放入到基于高温计所测量的温度计算反应孔正确温度的校准模型中。在图2中示意性地显示了基于⑶的检测系统200以及辐射源。系统200包括具有一个或多个反应孔204的基底202 (例如,塑料盘,如聚碳酸酯、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯(ABS)或者另一种适合的塑料材料)。可以将透明薄膜206放置在反应孔204的上方以抑制污染物进入反应孔204中。可以将检测器210定位在基底202的上方以测量从基底202发出的热辐射。在一些实施方式中,检测器210可以包括高温计。可以使用校准模型来修正由于通过反应孔内材料(例如,LAMP反应混合物、覆盖所述孔的保护性薄膜)的热辐射传播和基底本身对入射荧光的吸收所造成的检测器210的温度测量误差。如图1所示,Ec是从热源吸收到基底202中以控制反应孔204的温度的热辐射。Et是从反应孔204表面发出的热辐射。Et是传输通过反应孔204和透明薄膜206到达检测器210的来自反应孔204表面的热辐射部分。Eamb是从紧密接触(碰撞)透明薄膜206的环境中发出的热辐射。民是反射到检测器210中的环境热能部分。在一个实施方式中,校准模型可以认为基本上所有辐射均来源于反应孔204的表面或来自环境并且在穿过反应孔204中的水和透明薄膜206后或者在从这些表面反射后在检测器210检测 。在这些情况下马克斯韦尔方程的解产生了与在其各自边界上的多种材料的归一化波阻抗有关的反射和透射系数。反过来,这些波阻抗与所述波通过的材料各自的电容率和磁导率有关。最终结果是来源于反应孔204的总热辐射的一部分a到达检测器210,并且来源于环境的总热辐射的一部分b反射离开反应孔204以到达检测器210。从适用于灰体的斯蒂芬-玻尔兹曼定律(Stefan-Boltzmann’s law)来看,根据方程1,体所发出的总热能E与材料的发射率ε和透明薄膜206表面的绝对温度T有关E= ε σ T4(I)其中σ是斯蒂芬-玻尔兹曼常数。基于到达高温计210的检测器的热辐射,采用所选的材料发射率,检测器210可以估计透明薄膜206表面的温度。根据方程2,到达高温计210检测器的总热能E可以用来计算指示温度Ti Ei = Et+Er(2)Et是在传输通过反应孔204内的反应材料体积和透明薄膜206后到达检测器高温计210的来源于反应孔204的热辐射。民是在从透明薄膜206表面反射后到达检测器210的检测器的来源于环境的热能(参见,例如,图2)。
将斯蒂芬-玻尔兹曼定律和从以上获得的经验系数a和b应用于以上方程中的每一项,可以获得方程3:
_]
权利要求
1.一种监测靶DNA的环介导等温扩增(LAMP)的方法,包括 提供LAMP反应混合物,所述反应混合物包含靶DNA和能够扩增所述靶DNA的一种或多种LAMP引物; 将同化探针加入到所述LAMP反应混合物中,所述同化探针包含第一寡核苷酸链和第二寡核苷酸链,其中所述第一寡核苷酸链包含位于3’端的猝灭探针并且其中所述同化探针的所述第二寡核苷酸链包含结合在5’端的荧光团; 其中加入至所述LAMP反应混合物中的所述第二寡核苷酸链的量与所述第一寡核苷酸链的量的比率小于1:1; 将DNA聚合酶加入到包含所述同化探针的所述LAMP反应混合物中;以及 测量包含所述同化探针和所述DNA聚合酶的所述LAMP反应混合物所发射的荧光。
2.根据权利要求1所述的方法,其中,所述第一寡核苷酸链包含DABCYL、TAMRA和黑洞猝灭剂中的一种。
3.根据权利要求1所述的方法,其中,所述荧光团包括荧光素、cy3、cy5和一个或多个量子点中的一种。
4.根据权利要求1所述的方法,其中,将所述第一寡核苷酸链和所述第二寡核苷酸链以相对于彼此的未杂交状态加入到所述LAMP反应混合物中。
5.根据权利要求1所述的方法,其中,所述DNA聚合酶的浓度大于或等于8U。
6.根据权利要求1所述的方法,其中,加入到所述反应混合物中的所述第一寡核苷酸链的量在O. 02至O. 8μ M之间的范围内。
7.根据权利要求1所述的方法,其中,加入到所述LAMP反应混合物中的所述第二寡核苷酸链的量在O. 01μ M至O. 4μ M之间的范围内。
8.根据权利要求1所述的方法,其中,所述LAMP引物包括rsfIiC、rkl249.1、rk2208. K rk2403.1、λ 噬菌体、SeOl 和 Spal 中的一种。
9.根据权利要求8所述的方法,其中,所述靶DNA包括细菌噬菌体λ、青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)的小种 3变种 2 株、青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)、肠沙门氏菌(Salmonella enterica)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)中的一种。
10.一种用于监测靶DNA的环介导等温扩增(LAMP)的同化探针,包括 第一寡核苷酸链,所述第一寡核苷酸链包含位于所述链的3’端的猝灭探针;和 第二寡核苷酸链,所述第二寡核苷酸链包含结合于所述链的5’端的荧光团; 其中,所述第二寡核苷酸链与所述第一寡核苷酸链的量的比率小于1:1。
11.根据权利要求10所述的探针,其中,所述荧光团包括荧光素、cy3、cy5和一个或多个量子点中的一种。
12.根据权利要求10所述的探针,其中,所述第一寡核苷酸链包含DABCYL、TAMRA和黑洞猝灭剂中的一种。
13.根据权利要求10中任一项所述的探针,其中,所述第一寡核苷酸链和所述第二寡核苷酸链在与包含一种或多种LAMP引物和靶DNA的溶液接触之前处于相对于彼此的未杂交状态。
14.根据权利要求10中任一项所述的探针,其中,所述第一寡核苷酸链的量在O.02至O. 8μ M之间的范围内。
15.根据权利要求10中任一项所述的探针,其中,所述第二寡核苷酸链的量在O. 01μ M至O. 4μ M之间的范围内。
16.根据权利要求10中任一项所述的探针,其中,除了遍及所述第二寡核苷酸链的突出不相配部分以外,所述第一寡核苷酸和第二寡核苷酸是互补的。
全文摘要
公开了能够快速区分所选择病原体的所选择株与相同种内其它种群的基于基因的诊断法。可以通过使用寡核苷酸探针,称为“同化探针”,来完成DNA的LAMP的序列特异性实时监测。同化探针包含两条寡核苷酸链,其中一条包含猝灭剂(称为猝灭探针)而另一条包含荧光团(称为荧光探针)。在LAMP反应期间,当所述两条链互相替换时,产生荧光信号。通过监测发射的荧光,可以检测序列特异性扩增。
文档编号C12Q1/68GK103069009SQ201180040896
公开日2013年4月24日 申请日期2011年6月22日 优先权日2010年6月22日
发明者久保田 亮, 丹尼尔·M·詹金斯 申请人:夏威夷大学

最新回复(0)