异源蛋白质的植物基制备的制作方法
专利名称：异源蛋白质的植物基制备的制作方法
技术领域：
本公开总体而言涉及异源蛋白质的植物基制备，更具体而言，涉及异源蛋白质的在植物体中制备。2.相关技术的说明
诸如乙醇之类的生物燃料是由葡萄糖发酵得到的，并且生物质中的纤维素是这种糖的潜在来源。然而，需要一组协同作用的酶来将纤维素降解为葡萄糖。通常，这些酶是通过真菌细胞培养制备的，这种真菌细胞培养需要高的资金成本以及大量的生物反应器。因此，需要更有效的酶制备系统，该系统需要较少的资金成本、消耗较少的能量，并释放较少的二氧化碳。发明概述本公开的组合物和方法通过促进异源蛋白质的高产率、低成本的在植物体中制备(例如纤维素酶)而解决了这种需要。在植物体中制备细胞壁降解酶可以减轻对昂贵且能量密集型的制备生物质发酵所用的纯化纤维素酶的需要，并由此帮助降低制备成本且改善生物燃料制造方法的能量平衡。具体而言，本公开提供了植物病毒基系统，其能够瞬时在植物体中表达异源蛋白质，例如纤维素酶。本公开进一步提供了使用此类植物病毒基表达系统来在植物中制备高产率异源蛋白质的方法。本公开的一个方面提供了能够表达异源蛋白质的植物细胞，其中所述的植物细胞包括被多于I种质粒编码的完整的病毒扩增子。扩增子包括多个扩增子节段。扩增子能够扩增编码所关注的异源蛋白质的核酸序列的转录。扩增子包括至少2种质粒，其中第一质粒不同于第二质粒。第一质粒包括至少一个含有核酸序列的扩增子节段，其中所述的核酸序列编码了异源蛋白质，并且第二质粒包括至少一个扩增子节段。在一些实施方案中，病毒扩增子为黄瓜花叶病毒组扩增子，并且在具体的实施方案中，扩增子为黄瓜花叶病毒(CMV)扩增子。
在一些实施方案在红，病毒扩增子为通过2种质粒编码的二份系统。在优选的实施方案中，第一质粒包括CMV RNA3扩增子节段，其中RNA3包括编码异源蛋白质的核酸序列。在另一个优选的实施方案中，第二质粒包括CMV RNAl和RNA2扩增子节段。在一些具体的实施方案中，第二质粒包括启动子序列，该启动子序列响应于化学诱导剂并且可操作地与编码病毒蛋白质的核酸序列连接。在一些具体的实施方案中，化学诱导剂为雌二醇或甲氧虫酰肼。在一些具体的实施方案中，病毒蛋白质为复制酶或复制酶亚单元。在一些具体的实施方案中，第二质粒包括卡那霉素选择标志物，并且第一质粒不包括卡那霉素选择标志物。在一些实施方案中，病毒扩增子为通过3种质粒编码的三份系统。在优选的实施方案中，第一质粒包括CMV RNA3扩增子节段，其中RNA3包括编码异源蛋白质的核酸序列。在另一个优选的实施方案中，第二质粒包括CMV RNAl扩增子节段，并且第三质粒包括CMVRNA2扩增子节段。本公开的另一个方面提供了能够表达异源蛋白质的植物细胞，其中所述的植物细胞包括完整的病毒扩增子 ，该完整的病毒扩增子包括得自多于一个的病毒亚组的扩增子节段。在优选的实施方案中，病毒扩增子为CMV扩增子，扩增子节段RNA3得自CMV亚组II的菌株，并且扩增子节段RNAl和RNA2得自CMV亚组I的菌株，例如California亚组I的菌株。在一些实施方案中，CMV RNA3扩增子节段包括RNA4节段，该RNA4节段具有经修饰的5’-引导序列，与相应的野生型RNA5’-引导序列相比，经修饰的5’-引导序列包含更多的限制性酶切位点。在一些实施方案中，异源蛋白质为分泌的蛋白质。在其他实施方案中，异源蛋白质为GFP或RFP。在其他实施方案中，异源蛋白质为能够修饰、降解或分解植物细胞壁的酶。在一些具体的实施方案中，所述的酶在> 30°C的温度下具有最佳的活性。在一些具体的实施方案中，所述的酶为纤维素酶。在一些具体的实施方案中，纤维素酶为内切葡聚糖酶、夕卜切葡聚糖酶、β -葡糖苷酶或木聚糖酶。在优选的实施方案中，内切葡聚糖酶为得自解纤维热酸菌(Acidothermus cellulolyticus)的El β-1,4-内切葡聚糖酶。在一些实施方案中，包括编码异源蛋白质的核酸序列的扩增子节段进一步包括与编码异源蛋白质的核酸序列可操作地连接的CaM35S启动子。植物细胞可以形成细胞培养物、切除的植物组织或完整植物的一部分。在一些实施方案中，植物细胞为烟草、柳枝稷、芒草、向日葵、糖南瓜或南瓜小果的植物细胞。在具体的实施方案中，植物细胞为烟草本塞姆氏(Nicotiana benthamiana)的细胞。在一些实施方案中，植物细胞还包括编码基因沉默抑制子的cDNA。在一些实施方案中，基因沉默抑制子为RNA-沉默抑制子(RSS)。在一些实施方案中，RSS为辅助成分蛋白酶HC-Pix)。在一些实施方案中，基因沉默抑制子得自番茄茂密矮小病毒(TBSV)或烟草蚀刻病毒(TEV)。在一些实施方案中，与野生型植物细胞相比，所述的植物细胞为表达高水平的基因沉默抑制子的转基因植物细胞。在一些实施方案中，病毒扩增子可以在植物体中复制并系统性地移动。在一些具体的实施方案中，植物包括包括编码突变形式的CMV 3a移动蛋白的cDNA。在优选的实施方案中，突变形式的CMV3a移动蛋白包括C-末端33个氨基酸的删除。本公开的另一个方面提供了通过以下过程制备异源蛋白质的方法:i)将植物细胞、植物或切除的植物组织与细菌细胞相接触，这种细菌细胞包括完整的病毒扩增子，其中扩增子包括多个扩增子节段，并且扩增子能够扩增编码异源蛋白质的核酸序列的转录；ii)在植物细胞中允许足够的时间来制备异源蛋白质；以及iii)收获至少0.5毫克异源蛋白质/千克鲜重的植物细胞、植物或切除的植物组织。在一些实施方案中，至少0.5毫克为至少
1.0毫克。在一些实施方案中，至少1.0毫克为至少1.5毫克。在一些实施方案中，至少1.5毫克为至少2.0毫克。在一些实施方案中，至少2.0毫克为至少3.0毫克。在一些实施方案中，至少3.0毫克为至少4.0毫克。本公开的另一个方面提供了通过以下过程制备异源蛋白质的方法:i)将植物细胞与至少一种植物激素相接触；ii)将植物细胞与细菌细胞相接触，该细菌细胞包括完整的病毒扩增子，其中扩增子包括多个扩增子节段，并且该扩增子能够扩增编码异源蛋白质的核酸序列的转录；iii)在植物细胞中允许足够的时间来制备异源蛋白质；以及iv)收获由植物细胞制备的异源蛋白质。在一些实施方案中，至少一种植物激素为至少两种植物激素。在一些实施方案中，至少一种植物激素选自茉莉酸、赤霉素A3、吲哚乙酸、2，4_ 二氯苯氧乙酸、激动素和水杨酸。本公开的另一个方面提供了通过以下过程制备异源蛋白质的方法:i)以机械方式创伤植物或切除的植物组织；ii)将植物或切除的植物组织与细菌细胞相接触，该细菌细胞包括完整的病毒扩增子，其中扩增子包括多个扩增子节段，其中该扩增子能够扩增编码异源蛋白质的核酸序列的转录；iii`)在植物细胞中允许足够的时间来制备异源蛋白质；以及iv)收获由植物细胞制备的异源蛋白质。在一些实施方案中，植物或切除的植物组织通过使用刷子压制植物或切除的植物组织而以机械方式受到创伤。本公开的另一个方面提供了通过以下过程制备异源蛋白质的方法:i)在第一温度下将植物细胞与细菌细胞相接触，其中细菌细胞包括完整的病毒扩增子，并且该扩增子包括多个扩增子节段并且能够扩增编码异源蛋白质的核酸序列的转录；ii)在第二温度下将植物细胞温育足够的时间，从而在植物细胞中制备异源蛋白质；以及iii)收获由植物细胞制备的异源蛋白质。在一些实施方案中，第一温度为20°C，并且第二温度为26°C或30°C。在一些实施方案中，异源蛋白质在植物细胞、植物或切除的植物组织中瞬时制备。在一些实施方案中，接触植物细胞、植物或切除的植物组织是通过加压过滤或真空过滤实施的。在一些实施方案中，4天为在植物细胞、植物或切除的植物组织中制备异源蛋白质的足够的时间。在其他实施方案中，6天为足够的时间。在优选的实施方案中，第一和第二细菌细胞为根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)细胞。在一些实施方案中，所述的方法包括将细菌细胞与化学诱导剂相接触的额外步骤。在一些实施方案中，所述的方法包括将植物细胞、植物或切除的植物组织与第二种细菌细胞相接触的额外步骤，其中所述的细菌细胞包括编码基因沉默抑制子或病毒外壳蛋白质的重组核酸序列。在一些实施方案中，所述的方法包括原位活化异源蛋白质的额外步骤，其中蛋白质的活化使得植物细胞壁被降解。在一些实施方案中，所述的方法包括通过离质体洗涤来除去植物或切除的植物组织离质体的可溶性成分的额外步骤。
附图简述
图1描绘了通过DNA 2.0，Inc合成的基因的示意图。RAMY 3D SP编码了得自大米α淀粉酶的信号肽。El为得自解纤维热酸菌的β-1，4-内切葡聚糖酶El。El_cd编码了 El催化结构域。El-1ink编码了 El连接体结构域。El_cbd编码了 El纤维素结合结构域。PFT-6His编码了肽融合标记，6个聚组氨酸标签。终止密码子和限制性酶切位点(Xhol，PstI, HindIII和SpeI)已经加入到侧翼区域。图2描绘了得自β -1,4-内切葡聚糖酶翻译产物的所预计的氨基酸序列。图3描绘了 pDP0701载体的图谱。图4描绘了 pDP07.0202a 二元载体的图谱。图5描绘了在得自烟草植物(烟草本塞姆氏)的各种组织样品中制备的内切葡聚糖酶的量。对照#1和#2为使用缓冲液但不含细菌渗透的两种不同的烟草植物。试验#1和#2为使用悬浮在缓冲液中的土壤杆菌渗透的两种不同的烟草植物。检测同一叶片的不同区域之间和试验植物#1的叶片之间的变化性。检测试验植物#1和#2之间的植物与植物的变化性。图6描绘了在烟草植物中内切葡聚糖酶的瞬时表达。在一定时间内，监测在渗透的完整植物以及储存在不同环境下的所收获的叶片中的内切葡聚糖酶的量。热是指最大温度> 30°C。冷是指最大温度< 30°C。光是指16/8h的光/暗循环。暗是指24h黑暗。
图7描绘了得自的内切葡聚糖酶的经修饰的基因。得自花椰菜花叶病毒的35S启动子有助于构成性转录。图8描绘了将其Ti质粒的特定节段转移至植物细胞中的土壤杆菌属。图9描绘了水解纤维素链中的β -1，4_糖苷键(箭头)的内切葡聚糖酶。图10描绘了内切葡聚糖酶活性的最佳条件。图11描绘了真空渗透如何将土壤杆菌和植物细胞结合在一起。将叶片组织浸溃在土壤杆菌的悬浮液中，并将真空推入到室中。气泡由叶组织中出现，并升至表面。释放真空，并且包含土壤杆菌的液体淹没了组织，从而使细菌与植物细胞直接接触。图12描绘了用于渗透完整植物(左侧)或者分离的叶片(右侧)的实验室-级
的真空室。图13描绘了在使用土壤杆菌渗透之后分离叶片的第4天(左侧)、第6天(中间)和第9天(右侧)。图14描绘了包括RNAl、RNA2、RNA3和RNA4的CMV va表达系统。图15A和15B描绘了两份可诱导系统载体:(A)pDUR2XLRl和(B)pB301_RNA3的载体图谱。图16A、16B 和 16C 描绘了三份复制系统载体:(A) pCB301_RNAl、(B) pCB301-RNA2和(C)pCB301-RNA3的载体图谱。图17描绘了经修饰的RNA4前导序列。使用经修饰的RNA4前导序列来增强CMV外壳蛋白质和其他插入序列(GFP，内切葡聚糖酶)的表达。图18A、18B和18C描绘了在用于三份复制的植物中的症状。(A)描绘了烟草本塞姆氏；(B)描绘了小糖南瓜；和(C)描绘了美洲南瓜小果。图19描绘了解纤维热酸菌内切葡聚糖酶(El)的特征。
图20描绘了使用缺乏基因沉默抑制子的二份和三份载体系统的内切葡聚糖酶(El)表达对照(RT-PCR)。示出了用于酶活性测试的结果(以mg/kg计)。W是指野生型，2、6和8是指特定的前导序列。结果是使用非转基因烟草本塞姆氏植物但使用非共表达的沉默抑制子蛋白质而获得的。图21描绘了使用RT-PCR，在HcPro-烟草本塞姆氏中使用二份和三份载体系统的内切葡聚糖酶(El)的表达。结果是使用通过转基因烟草本塞姆氏植物表达的HC-Pix)沉默抑制子而获得的。图22描绘了改善El表达的其他方法。图23以概略的方式描绘了在具有反式CP或RNA4的渗透和上部叶中三份复制El表达。图24描绘了经修饰的前导序列(A)以及它们的二级结构(B)。(A)与野生型RNA4前导序列相比，经修饰的前导序列包含额外的序列，该序列包括额外的限制性酶切位点。(B)示出了野生型和经修饰的RNA4构建体的二级结构。共有的结构茎和环元件被突出。图25描绘了用于复制三份扩增子的结果，其影响了糖南瓜、南瓜小果和烟草本塞姆氏植物。植物受到系统性的影响，并在渗透之后的2周时，在上方系统叶片中，显示出退氯斑症状。图26描绘了 El催化的反应。底物MUC被切割成纤维二糖和荧光团MU，可以监测一定时间内它们的浓度。当在65°C和135μΜ MUC下运行时，该反应用作用于植物提取物和酵母培养物的El活性测定。图27描绘了在不同的反应温度(50，65，80和93 °C )下用于El活性的Lineweaver-Burke图。活性的单位(V)为μ M MU/min,并且底物浓度的单位为μ M MUC0图28描绘了针对底物浓度绘制的活性数据。线条表示具有根据试验衍生的参数的 Michaelis-Menten 等式。图29描绘了 JA(茉莉酸)对El表达的影响。如图所示，与不具有JA的对照叶片相比，在渗透溶液中加入250 μ M JA在第6天会将El的表达水平增大3.5倍。图30描绘了 2种不同植物激素的组合的影响，所述的植物激素包括茉莉酸(JA)、赤霉素A3 (GA)、吲哚乙酸(IAA)、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4_D)、激动素(CK)和水杨酸(SA)。图31描绘了在叶片温育过程中不同温度概况的影响。在渗透之后，在不同的天数，将叶片温育的温度由20°C变为30°C，并保持2天。与对照相比，温度4或温度5概况得到了最高的表达情况。在温育的后期阶段增加温育的温度会增加El的制备。图32描绘了叶片温育温度的两相最优组合。每个柱都表达单独的叶片。温育温度在第2天由20°C升至26°C，并在26°C下保持接下来的4天。图33描绘了机械创伤处理对向日葵叶片的效力。使用刷子对植物叶片多次压制，然后经过真空渗透。示出了在具有创伤处理和不具有创伤处理之间的直接比较。图34描绘了在由3种无关的烟草本塞姆氏叶片(经渗透从而瞬时表达El)得到的匀化产物提取物(HE ;蓝柱)和离质体洗液(AWF ;紫柱)中A)纯度、B)浓度和C)产率的值的比较。各值仅用于第一次得到的AWF。图下方的表表示AWF的值除以HE的值的比值。图35描绘了 通过离质体洗涤5种不同蛋白质而得到的重组蛋白质回收物与通过匀化产物提取所获得物质的效力的比较。如在美国专利N0.7034128中所报道的那样，在烟草(N.tabacum)中生长的且大规模回收的3种重组蛋白质的Large Scale Biology Corp.(LSB)结果显示与作为独立的试验系列的一部分所得到的小试规模的结果相近。在该系列中，每个样品5次收集离质体洗液(AWF)，这与LSB数据的仅收集I次相反，并将数据取平均值或者总计在一起。由独立的试验系列所提供的数据是所得到的最好结果的代表。图36描绘了在经历5次连续的离质体洗涤从而除去分泌的El之后瞬时表达内切葡聚糖酶El的烟草本塞姆氏叶片。由于AWF体积不够，所以不能对第二次获得的AWF进行活性测试。图37描绘了在每mg总可溶性蛋白质(TSP)的离质体洗液(AWF)和匀化产物提取物(HE)中，El和MDH活性的相关级份。将各级份的最高活性任意地设定为100%以用于各次比较。使用PH5.5的El收获缓冲液(0.1M NaCl，0.05M乙酸，0.1 % Tween 80或0.01%Silwet L77)作为渗透缓冲液从而回收离质体洗液，或者用于获得匀化产物提取物。测定各样品中El以及苹果酸酶(MDH)(细胞内标志物)的活性。各样品为合并的AWF，其是通过由同一叶片上切除的4块叶盘离心而收集得到的。图38描绘了通过匀化作用和离子体洗液回收而回收的El内切葡聚糖酶的比较。发明详述以下说明列出了多个示例性的构造、参数等。但是，应该意识到此类说明无意于限定本发明的范围，而是作为示例性实施方案的说明而提供的。1.异源蛋白质的选择解纤维热酸菌为生活在高温、酸性环境(例如黄石国家公园的热泉)下的嗜热细菌。由嗜热有机体得到的酶通常在>30°C的温度下具有最佳活性。由这种有机体选择β-1，4-内切葡聚糖酶El作为异源蛋白质的优选实施方案，因为所述的酶水解纤维素的能力在环境温度下被抑制，这样该基因的在植物体中表达不会改变植物的显型。所述的酶在高温及低PH下活性最强。El内切葡聚糖酶在大约80°C和pH5.5下具有最佳的活性，其中所述的PH为植物细胞离质体的大致pH。El的序列得自NIH Entrez跨数据库检索(编号P54583)。成熟蛋白质(不具有天然分泌信号肽)由521个氨基酸构成，其估测分子量为56477Da。所述的蛋白质由催化结构域(El_cd， 40.3kDa)和纤维素结合结构域(El-cbd, 10.8kDa)构成,它们通过连接体区域连接(El-link, 5.4kDa)。41个氨基酸的信号肽被得自水稻α-淀粉酶(Ramy3D SP)的25个氨基酸的信号肽替代，从而有利于蛋白质由植物细胞分泌到离质体中。2.密码子优化，基因合成使用得自KEGG数据库的针对所述这种植物的密码子使用表来对纤维热酸菌β-1,4-内切葡聚糖酶El的基因进行密码子优化，以用于在烟草本塞姆氏中表达。将聚组氨酸标签加入到蛋白质的C-末端，从而允许通过金属亲和层析而快速纯化。加入合适的限制性酶切位点，从而允许插入我们其他的表达盒。整体1566bp DNA片段是通过外部公司(DNA 2.0, Inc.，Menlo Park, CA)化学合成的(图1)。3.克隆到二元表达载体中编码了得自解纤维热酸菌的β- 1，4_内切葡聚糖酶El的化学合成El基因由DNA
2.0在载体pj 210:11772中提供。图2所示的552aa蛋白质的编码区域包含与N-末端融合的25aa Ramy3D信号肽以及在C-末端的6aa组氨酸标签。
4.克隆到35S表达载体中(用于构成性表达)使用限制性内切核酸酶XhoI和HindIII分别在位置1198和2872处消化包含El的载体PJ 210:11772，从而产生1674bp片段，该片段被定向克隆到穿梭载体pDEO0.0113中，由此建立质粒PDP0701。在35S启动子的下游且在ocs3’调节序列的上游克隆El编码区域，从而建立E135S表 达盒。pDP0701(图3)中的El表达盒通过使用内切核酸酶AscI消化而被切除，并插入到二元载体PDU97.1005中，从而建立载体消化的pDP07.0202a (图4)。5.包含35S表达盒的重组土壤杆菌属菌株的建立将二元质粒pDP07.0202a电穿孔进入到以下两种土壤杆菌属菌株(EHA105pCH32和C58C1)中，从而得到可以在植物系统中用于瞬时表达El蛋白质的两种重组根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)菌株。 6.在烟草本塞姆氏中使用瞬时农杆菌真空渗透法来制备重组纤维素酶在瞬时表达研究中，使用了具有构成性CaMV35S启动子的重组EHA105pCH32 土壤杆囷I的囷株。在该表达系统中，在强35S构成性启动子的控制下制备El转录物。将所述的细菌菌株在实验室中培养，并用于感染4周大的烟草(烟草本塞姆氏)植物。感染可以在基因沉默抑制子的存在或缺乏下发生。将4周大的烟草本塞姆氏植物的叶片进行真空渗透。4周后，收获植物组织，匀化，提取并进行酶活性的测试。结果概括于图5中。4天后表达的酶的最少量为大约Img纤维素酶/kg植物细胞鲜重。在pH5.5及65°C下，与图5中所示的酶量相应的活性为40000至52000nmolMU/min/kg植物组织鲜重。本试验证实了一个原理的证明，S卩，根癌土壤杆菌可以用于瞬时(且快速)在植物组织内制备功能性内切葡聚糖酶。在不同的组织以及不同的植物之间观察变化性，但是通常产率为Img酶/kg植物鲜重。使用这种方法，在使用这种用于制备不同蛋白质(人AAT)的构成性启动子的情况下观察到相似的结果(Sudarshana et al.Plant Biotech J.4:551-559 (2006))。但是，当使用病毒扩增的表达系统来表达AAT时，产率增大70倍，这样可预计的是当使用病毒扩增子表达系统时，可以观察到制备率制备率大幅改善。此外，活性测试用于显示根癌土壤杆菌本身不会制备所述的酶，植物组织可以。此外，证明在C-末端的组氨酸标签的rEl不会消除活性。因此，本文所述的方法的一个实施方案为通过瞬时农杆菌真空渗透法到植物组织中来功能性地制备rEl。此外，证明可以在切除的植物组织(例如收获的烟草本塞姆氏叶片)中以甚至稍微高的表达水平来制备功能性重组El (图6)。在这些瞬时表达的研究中，EHA 105pCH32 土壤杆菌I菌株与构成性CaMV 35S启动子一起使用。在实验室中培养这些细菌菌株，并用于感染4周大的烟草(烟草本塞姆氏)植物。对4周大的烟草本塞姆氏植物的叶片进行真空渗透。4天后，收获植物组织，匀化，提取并测试酶活性。将经渗透的植物和叶片储存在各种条件下，以确定它们对酶产率的影响。将完整的植物储存在热的温室(每日高温> 30°C，每日14小时光照)。为了保持收获的叶片存活，将它们储存在恒温22°C的潮湿的容器中，并防止光照。为了对植物和叶片之间进行有效的比较，在 25°C下，在每日光照16小时的条件下，将一些植物和叶片在室内彼此相邻储存。将叶片储存在具有透明覆盖物的潮湿的容器中，从而允许照明。在4天和6天温育之后，测试完整植物和收获叶片的酶活性。在6天后所表达的平均酶量为大约2.6mg纤维素酶/kg植物细胞鲜重。根据所报道的天然El的特异活性，将活性测试转化为表达水平(mg El/kg植物组织鲜重)。
在另一个实施方案中，纤维素酶的在植物体中活化允许在叶片组织内原位降解纤维素。在具体的实施方案中，纤维素的活化可以包括将温度升高至30°C以上。在另一个具体的实施方案中，纤维素酶的活化可以包括将温度升高至纤维素酶具有最佳酶活性的大致温度。尽管这种El实施方案涉及在使用构成性表达系统(CaMV 35S启动子)的烟草本塞姆氏中，rEl的瞬时农杆菌真空渗透法的具体实例，但是所述的方法可以用于制备任何异源蛋白质。通常，本公开的异源蛋白质可以包括非酶类的蛋白质，例如绿色或红色荧光蛋白质GFP或RFP ;或者病毒外壳蛋白质，例如CMV外壳蛋白质(CP)。备选地，异源蛋白质可以包括酶，例如能够修饰、降解或分解植物细胞壁的酶。例如，酶可以包括纤维素降解酶，包括但不限于其他内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、葡糖苷酶和木聚糖酶。此外，多种酶可以在使用共渗透的同一宿主植物中表达，不同的宿主植物可以用于蛋白质的制备，并且可以使用不同的启动子、质粒和表达系统。异源蛋白质可以选自多种有机体，包括但不限于解纤维热酸菌。通常，编码本发明的异源蛋白质的核酸序列可以进行密码子优化。短语“密码子优化”是指适于在结构基因或其片段中使用的DNA核苷酸的选择，其中所述的结构基因或其片段接近于所关注的植物中的密码子使用情况。因此，优化的基因或核酸序列是指这样的基因，其中天然的或天然形成的基因的核苷酸序列已经被修饰，以便在植物中使用统计学优选的或统计学有利的密码子。通常在DNA水平下检测核苷酸序列，并使用任何合适的方法(例如在 Sardana et al 中所述,Plant Cell Reports 15,677-81 (1996))测定为了在植物物种中进行表达而优化的编码区域。7.用于制备异源蛋白质的病毒扩增子基表达系统就本公开的目的而言，术语“病毒扩增子”用于描述在宿主细胞中扩增核酸序列的转录所需的最少的非宿主细胞的基因材料，其中所述的核酸序列编码了异源蛋白质，并启动其在宿主细胞中的表达。病毒扩增子可以由多个节段构成，例如染色体的黄瓜花叶病毒组RNA节段RNAl、RNA2或RNA3。可以在单一质粒或多质粒(例如2种或种3质粒)上编码病毒扩增子。在任何给定的病毒扩增子中，可以选择单个的扩增子节段，并与不同的病毒家族或亚组再结合，例如黄瓜花叶病毒(CMV)的亚组I和II。可以由任何植物病毒选择病毒扩增子，包括植物病毒的雀麦花叶病毒科及其6个属:苜猜花叶病毒属，例如紫花苜猜镶嵌病毒(Alfalfa Mosaic Virus) ;Anulavirus,例如天竺葵曲叶病毒(Pelargonium Zonate Spot Virus) ;Bromovirus,例如花叶病毒(BromeMosaic Virus);黄瓜病毒，例如黄瓜花叶病毒；Ilarvirus,例如烟草条纹病毒(TobaccoStreak Virus);以及油橄榄潜隐病毒,例如橄榄潜隐病毒(Olive Latent Virus) 2。
包含得自一个CMV亚组的扩增子节段的重组CMV扩增子用于增加CMV外壳蛋白质和异源基因(蛋白质)在CMV病毒扩增子(CMVva)系统中表达(图14)。通过使用用于CMV分离物Q的特定CMV基因组节段来研发原始的CMVva系统，其中所述的CMV分离物Q命名为分类学CMV亚组II。CMV的文献显示CMV亚组I分离物更普通，并且在植物中通常更具有攻击性，表明它们复制达到较高的水平。由于CMV具有3个染色体节段(RNA1、RNA2和RNA3)，并且由于这些节段在某些情况下可以混合从而建立新的重配株CMV毒株，所以CaliforniaCMV亚组I毒株用于建立与所有3个染色体节段相应的完整的cDNA。因此，通过将CMV亚组I扩增子节段RNAl和RNA2与CMV亚组II扩增子节段RNA3混合在一起来建立重组病毒扩增子。节段RNAl和RNA2编码了复制相关的蛋白质和宿主防御蛋白质2b (沉默抑制子)。扩增子节段RNA3编码了 3a移动蛋白和衣壳蛋白。但是，亚组II RNA3节段经修饰用于异源基因(蛋白质)的插入和表达。当重组CMV扩增子在烟草本塞姆氏植物中用于农杆菌真空渗透法和蛋白质的表达时，迄今为止重组CMV扩增子得到了更高水平的3种蛋白质。它们为CMV外壳蛋白质、GFP和内切葡聚糖酶El (内切葡聚糖酶El通过免疫印迹分析来评估并就酶活性进行评估)。特别就本文所述的编码CMV的质粒和RNA而言，在PCT公开W02008/036424 (2008年3月27日公开)中描述了使用单份表达系统(基于编码CMV扩增子的单一质粒)的早先的著作，所述的文献以引用方式并入本文。备选地，可以使用二份或三份表达系统来编码病毒扩增子，例如CMV扩增子。在二份系统中，在2种不同的质粒上编码了扩增子节段，例如CMVRNA1、RNA2和RNA3，在三份系统中，在3种不同的质粒上编码了所述的阶段(图15和16)。在单、二或三份表达系统中的扩增子节段可以被修饰。例如，扩增子节段可以包括响应于化学诱导剂的启动子序列，其中所述的化学诱导剂例如为雌二醇或甲氧虫酰肼。诸如CMV RNA3片段RNA4之类的扩增子节段在它们与野生型序列相关的前导序列中可以进一步包括额外的限制性酶切位点(图17和35)。诸如CMV RNA3之类的扩增子节段可以通过使用包含异源蛋白质的核酸序列替代编码病毒蛋白质(例如CMV外壳蛋白质)的核酸序列而进一步被修饰。此外，病毒扩增子序列可以编码病毒蛋白质突变体，例如移动蛋白(MP)的突变体。具体而言，CMV3a移动蛋白的删除33个氨基酸的突变体用于帮助扩增子复制和病毒扩增子在烟草本塞姆氏植物中的系统性细胞与细胞间的移动，并使蛋白质表达的产率增加(图22)。使用病毒扩增子基表达系统来制备异源蛋白质的方法总体而言，使用 病毒扩增子基表达系统使异源蛋白质在植物细胞中表达包括以下步骤:i)使植物细胞与包含人工病毒扩增子的细菌细胞(例如根癌土壤杆菌)相接触；ii)允许足够的时间(例如2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13或14天)来在植物细胞中制备异源蛋白质；以及iii)收获所述的蛋白质。根据标准的农杆菌真空渗透法方案(例如加压渗透或真空渗透)，可以将植物细胞与细菌细胞相接触。植物细胞可以选自植物，包括烟草(例如烟草本塞姆氏)、柳枝稷、芒草、向日葵、糖南瓜或南瓜小果。所述的植物细胞可以为得自部分植物细胞培养物的分离的细胞，或者它们可以形成完整植物的一部分或者切除的植物组织，例如植物叶片。本公开描述了使用病毒扩增子基表达系统来增加异源蛋白质的表达的方法。这些方法可以包括抑制异源基因沉默，有利于扩增子复制和细胞与细胞间的移动，植物组织的机械创伤，植物激素处理，以及叶片温育温度的优化(图20-22、25和29-37)。例如，解纤维热酸菌内切葡聚糖酶El与基因沉默抑制子HC-Pix)共表达显示出会显著促进El在烟草本塞姆氏细胞中的表达(图23和24)。为了进行细胞与细胞间的移动以及系统性的蛋白质的表达，CMV需要MP (3a移动蛋白)和CP (衣壳蛋白)，这二者均由RNA3编码。当MP缺乏C-末端的33个氨基酸时，CMV感染甚至可以在不具有CP的情况下在植物中进行细胞与细胞间的移动。因此，异源蛋白质与病毒外壳蛋白质或移动蛋白删除突变体共表达可以通过有利于扩增子的复制、细胞与细胞间的移动、以及异源蛋白质的系统性表达来促进异源蛋白质的表达(图22)。通常，诸如HC-PioXP或MP突变体之类的蛋白质与异源蛋白质共表达可以通过使用包含质粒的细菌细胞对制备异源蛋白质的植物细胞进行农杆菌真空渗透法而取得，其中所述的质粒编码HC-Pio、CP或MP突变体蛋白质。备选地，制备异源蛋白质的植物细胞可以为构成性表达HC-Pio、CP或MP的转基因植物细胞。通过使用刷子在农杆菌真空渗透法之前即刻重复地压制所述的组织来以机械方式创伤烟草本塞姆氏组织显示出内切葡聚糖酶El的表达增加的结果(图29)。其他试验显示使用植物激素在农杆菌真空渗透法之前即刻处理植物或切除的植物组织会增加El的表达(图30)。诸如茉莉酸(JA)、赤霉素A3 (GA)、吲哚乙酸(IAA)、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、激动素(CK)和水杨酸(SA)之类的植物激素可以单独施加，或者至少两种植物激素结合施加(图30-35)。优化叶片温育温度显示出El内切葡聚糖酶的表达增加的结果(图31-32)。可以将温育时期分为土壤杆菌属感染阶段和蛋白质制备阶段，并且可以对这两个阶段分别优化温育温度。土壤杆菌属感染阶段可以为在将土壤杆菌属与叶片相接触之后的1、2、3、4或5天的时期。在土壤杆菌属感染阶段的温育温度可以为15，16，17，18，19，20，21，22，23，24或25°C。蛋白质制备阶段可以为在土壤杆菌属感染阶段之后的1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12或13天的时期。蛋白质制备温度可以为26，27，28，29，30，31，32，33，34或35°C。通常，本文所述的CMV扩增子基表达系统显示出蛋白质产率为大约0.5，1.0, 1.5，
2.0，2.5，3.0，3.5 和 4.0mg El/kg 植物组织鲜重(图 20-21 和 34-35)。如本文所用，术语“大约”是指所述值在可接受范围内的近似值。优选的是，所述的范围为所述值+/-10%。图14-39公开了多种病毒扩增子系统、RNA种类和上文所述的结果。示出El构建体的结果的图显示包含未经修饰的前导序列的El构建体与高的表达水平一致，特别是在三份复制系统中。该结果可 能是由于CMV优选被复制酶络合物识别的其本身的野生型RNA3。此外，包含亚组I复制酶络合物的重组的CMV扩增子得到了比亚组II复制酶络合物更好的El的表达。
实施例下文所述的实施例使用了以下材料和方法:材料和方法植物和照片:烟草(烟草本塞姆氏)种子在堆肥中发芽并在温室中生长。在试验中使用3周大的植物。使用装配有Tiffen Deep Yellow 15滤光镜的Cannon G6数码相机对植物进行拍照。使用手持式长波UV灯来照明植物。植物的感染:对9天大的南瓜小果(Cucurbita pepo L.cv.Green Bush)、小糖南瓜和烟草本塞姆氏的完全发育的子叶进行测试，观察其是否可以系统性地移动。首先，使用研杵在50mM NaH2PO4(pH 7.0)中研磨感染的烟草本塞姆氏叶片，并通过使用金刚砂粉末(Carborandum grit 300,BDH,UK)作为研磨料温和地摩擦子叶的上表面而对植物进行机械接种。农杆菌真空渗透法:使用电穿孔仪(BIO-RAD)将由E.coli培养物纯化得到的二元质粒转化到根癌土壤杆菌菌株GV3101和EHA105中。当使用GV3101时，将转化的细胞平板接种到包含正大霉素(25^/πι1)、卡那霉素(SOyg/ml)和利福平(lOyg/ml)的Luria-Bertani平板中，或者当使用EHA105时，将转化的细胞平板接种到包含利福平(10 μ g/ml),正大霉素(20yg/ml)和四环素(10yg/ml)的Luria-Bertani平板中。就农杆菌真空渗透法而言，将单个菌落接种与5ml L-MESA 10培养基(100ml LB培养液，2ml0.5MMES (pH5.7), 20 μ I 0.1M乙酰丁香酮)中，并生长至0D600为大约L O。通过在3500xg下离心10分钟来收获细胞，并再次悬浮于农杆菌注射培养基(50ml无菌dH20，0.5mllM MgCl2,Iml IM MES (pH5.7)，50 μ I 0.1M乙酰丁香酮)中，将所得物在室温下平衡，以用于超过3hr的预渗透。当混合的土壤杆菌培养物渗透到植物中时，在诱导培养基中单独制备细菌培养物，并在渗透之前即刻结合在一起。包含经修饰的前导序列的表达载体的制备，其中所述的经修饰的前导序列用于CP、E1和GFP基因:用于表达3个CMV基因组RNA(用于复制)的土壤杆菌属基基因传递系统以及所有4个CMV编码的蛋白质被研发。pQA表达载体包含EcoR1-Pst 1-Eco R1-HindIII限制性酶切位点。所述的前导序列通过PCR引物标签而被修饰，从而包括额外的限制性位点，并且所述的表达系统通过Pfu聚合酶扩增产物的平端连接而被插入到微型二元载体PCB301 (Xiang 1999)的Sma I限制性位点中。该表达系统包括RK2复制起点，赋予细菌以卡那霉素抗性的nptIII基因，以及右侧和左侧的T-DNA边界。所有的构建体都是经证实的序列并通过使用特异抗体的免疫印迹在植物中被测定表达了外壳蛋白质。表达克隆子2、6和8都是根据它们优异的蛋白质表达特征来选择的，并且选择野生型前导序列构建体作为对照。包含GFP和El但不包含外壳蛋白质(CP)序列的RNA3表达构建体按照以下方式制备。简言之，使用引物对载体的骨架进行PCR扩增，其中所述的引物被设计用于分别与CPORF正向引物(载体骨架的5’末端)的正向下游序列以及CP ORF反向引物(骨架的3’末端)的正向上游退火。载体骨架和Pfu聚合酶扩增的GFP和El片段通过平端连接而连接。此外，二元表达系 统的亚组I和II RNAl和RNA2构建体通过载体骨架和插入物的平端连接而制备。使用35ST正向和35SP反向引物组来制备载体骨架。接着，将亚组I和II RNAl和RNA2进行pfu聚合酶扩增和连接。所有构建体的序列都被证实。二级结构预测:使用Zuker的网络基程序来预测RNA的二级结构(Zuker 2000)。RNA提取和实时RT-PCR:在渗透后的第5天，由渗透的叶片以及非渗透的叶片收获用于RNA和蛋白质提取的样品。使用RNeasy试剂盒(Qiagen)，根据制造商提供的说明书来提取RNA，并在37°C下使用不含RNase的DNaseI处理20min。在DNaseI钝化后，使用随机六聚体和Superscript II逆转录酶,按照制造商提供的手册所述(Invitrogen),使用总计500ng的RNA进行逆转录。使用7500 ABI程序，使用针对各种RNA的基因特异引物组来进行实时 PCR，并进行分析。25 μ I PCR 包括 5μ I RT 产物，2XSYBR PCR Master Mix (AppliedBiosystems), 400nM基因特异引物。在标准的扩增条件下，在ABI Prism 7500 SequenceDetection系统(Applied Biosystems)中进行实时PCR。对各种基因进行解链曲线分析。使用Tukey-Kramer检验,进行统计学分析,P = 0.05。在95°C下,将反应物在96孔板中温育5min，然后在95°C、15s以及60°C、Imin下进行40个循环。所有的反应都运行3个重复。阈值循环(Ct)被定义为荧光通过固定的阈值时的分级循环数。蛋白质的提取和免疫印迹:通过两次施加30s的珠磨式组织研磨器，将蛋白质由叶片提取到蛋白质提取缓冲液(IOOmM Tris-HCKpH 8.0), IOmM EDTA, 5mM DTT, 150mMNaCl，0.1% Triton X-100，IX蛋白酶抑制剂(Roche))中。在将细胞提取物在12000rpm下离心20min而除去所有的细胞碎片之后,使用Bradford Protein Assay试剂盒(BIO-RAD,USA)以牛血清白蛋白作为标准品测定上清液中蛋白质的浓度。由叶片提取蛋白质，并进行SDS-PAGE分析(12%聚丙烯酰胺凝胶)。将分级的蛋白质转移至硝酸纤维素薄膜(Hybond-C ；Amersham Pharmacia Biotech)上，以 1: 2500 稀释与兔抗-CP 多克隆抗体、然后与山羊抗兔IgG-碱性磷酸酶缀合物(I ；2500)温育。洗涤后，加入紫色底物溶液(BIO-RAD)，并使用蒸馏水使所述的反应猝灭。内切葡聚糖酶的活性测试:内切葡聚糖酶(El)切割甲基伞形酮标记的纤维二糖苷(MUC)，从而释放甲基伞形酮(MU)。可以测量MU荧光来确定El的活性。使用相对荧光读数为0.024至3.0 μ M的MU溶液来建立线性标准曲线。稀释包含El的样品，使得所释放的MU的浓度落入标准曲线内。60 μ I等分的稀释上清液加入到540 μ I乙酸盐缓冲液(200mM乙酸盐，pH 5.5，IOOmM NaCl)和200 μ I底物(500 μ M MUC)中。在时间零点和30分钟之后取样200 μ I反应物，并加入到800 μ I终止缓冲液(150mM甘氨酸，pH 10)。使用VersaFluor荧光计(Bio-Rad)测量一定时间内荧光的变化。荧光被转变为活性，并且文献中所报道的特异活性用于接近毕赤酵母上清液的浓度。实施例1用于在植物体中蛋白质表达的二份和三份黄瓜花叶病毒(CMV)基表达载体本实施例描述了用于在植物中瞬时高产率地制备异源蛋白质的农杆菌真空渗透法基方法。通过使用CMV扩增子基表达系统得到异源蛋白质的表达。该CMV扩增子是通过2个或3质粒编码的，并且包含得自I个或2个病毒亚组的扩增子节段。高效表达GFP、RFP和外壳蛋白质的二份`和三份系统首先，制备二份和三份构建体来在植物中制得CMV基异源蛋白质的表达系统。在二份和三份系统中测定RFP和GFP的表达，从而证实三份系统可以用于在植物中制备多种异源蛋白质。所有这3个基因组节段均包括35S启动子，并且扩增终止子序列，然后使用平端连接而连接到PCB301中，证实所述的序列。对于二份系统而言，将包含RNA3的二元载体与PDU97XLR1R2混合在一起，并使用混合物来渗透烟草本塞姆氏。就GFP的表达而言，使用恰好由ORF的下游起始的正向引物和恰好在ORF之前起始的反向引物由RNA3除去外壳蛋白质区域。使用特异引物扩增GFP序列，并将其与RNA3载体产物连接。就RFP而言，使用相同的克隆方法。使用包含所有3种RNA1、RNA2和RNA3构建体的混合物转染土壤杆菌。在二份表达系统的情况下，在渗透后16小时，使用卷棉子施加雌二醇。渗透后5天，收获渗透的叶片，并提取总蛋白质。在GFP和RFP的情况下，二份和三份系统都良好地工作。如通过使用RFP滤波器组在显微镜下观察到的红色所示，RFP极好地进行在植物体中表达。在UV光下检测GFP表达。三份系统显示出即使不高于二份系统的蛋白质表达，也与其相似。在渗透后5天分析所有的叶片组织。经修饰的RNAl的前导序列会增加外壳蛋白质的表达水平和RNA的水平为了简化扩增子的克隆，将3种CMV扩增子节段RNA1、RNA2和RNA3分离到不同的质粒中，并在外壳蛋白质(即，被其他所关注的基因替代的外壳蛋白质基因)的上游区域和前导序列的下游区域引入多个额外的限制性序列(图24)。然后，制备多个构建体，其包含用于外壳蛋白质表达的RNA4的不同前导序列。图24不出了构建体的多个前导序列，包括野生型前导序列。与野生型前导序列相比，经修饰的序列具有额外的序列，包含有利于将异源基因插入到RNA4亚基因组启动子的下游区域的限制性酶切位点(图24A，斜体和下划线表示)。根据RNAfold计算机程序，经修饰的前导序列仍包含二级茎和环的结构(图24B)。然后，将这些构建体用于农杆菌真空渗透法。在多个不同植物中测定蛋白质的表达，包括烟草(烟草本塞姆氏)、小糖南瓜和美洲南瓜小果。已知南瓜对CMV感染敏感。因为所述的植物富含营养，所以预计会支持高水平的表达。最后，使用渗透的叶片的汁液接种难关子叶，并经常检查CMV感染的症状，例如叶片上的斑点的形成。当使用三份表达系统(包含所有3种扩增子节段RNA1、RNA2和RNA3)时，在接种后的第7天在系统叶片上观察到特征性的症状(图25)。与三份系统相反，包含删除的RNAl的5’ 46bp的二份系统不能在南瓜中进行系统性地移动，或者在南瓜叶片上引起症状斑点的形成。这些结果证明三份系统可以在植物体中复制，并在其宿主中系统性地移动和展开。这些是三分系统超过任何其他系统的重要有优点，包括CMViva单份系统。CMViva单份系统的最大优点在于所有3种RNA成分均由同一质粒编码，并在农杆菌感染后将在同一细胞中定位并表达。但是，CMViva单份系统包含RNAl删除，病毒粒子不能复制并且蛋白质的表达取决于雌二醇的诱导。总之，所公开的三份系统高 效地在植物中表达异源蛋白质，包括CMV外壳蛋白质、GFP和RFP。此夕卜，三份系统在南瓜中会系统性地移动。qPCR和免疫印迹分析证明包含经修饰的前导序列的RNA4构建体表达了比野生型RNA4更高水平的外壳蛋白质。在二份或三份表达系统中，表达概况是相似的。与二份或三份系统相比，包括CMViva和Q123的单份系统在植物体中制备了稍高的外壳蛋白质。为了确定前导序列对RNA水平的影响，实施实时RT-PCR来定量渗透植物中RNA的水平。使用对于健康对照的相对Ct值，相对野生型RNA4前导序列构建体来评估RNA1、RNA2、RNA3以及包括RNA4的RNA3的水平。在二份系统中，发现包含经修饰的前导序列的构建体与相应的野生型构建体相比，RNA3和RNA4的水平更高，因此解释了较高的蛋白质表达。有趣的是，就RNAl和RNA2表达的相对水平而言，与其中缺乏RNA3的试验相比，包含所有3种成分RNA1、RNA2和RNA3的试验都产生了较高的RNA水平。这种趋势在三份系统中是特别明显的。不管是使用突变体还是使用野生型前导序列，RNA3的表达水平均高于RNAl或RNA2的表达水平。在三份系统中，与由包含经修饰的前导序列的RNA构建体所产生的外壳蛋白质RNA水平相比，包含所有3种RNA的野生型构建体均产生了较高的外壳蛋白质RNA水平。该结果由蛋白质的表达水平所反映。为了估测除了外壳蛋白质以外的蛋白质的表达情况，制备GFP克隆子，其包含与之前外壳蛋白质表达所用的相同的前导序列。使用与之前所述的相同的方法，使用GFP构建体渗透植物，并在渗透后的第6天和第10天在UV光下检测荧光。通过经修饰的前导序列驱动的GFP的表达产生了比野生型前导构建体稍高的荧光强度。相比之下，三份系统表达了与二份系统相似或者甚至稍高水平的GFP。使用二份和三份表达系统的在植物体中内切葡聚糖酶(El)的表达接着，使用所述的蛋白质表达系统来制备内切葡聚糖酶E1，其为纤维素降解酶。所选择的特定的内切葡聚糖酶是由嗜热细菌解纤维热酸菌天然制备的。该细菌在例如黄石国家公园的热泉中发现。所述细菌的酶在高温和低PH下活性最高。成熟的蛋白质包含521个氨基酸，分子量为56.5，并且等电点为5.5。最初的359个氨基酸形成了催化结构域。存在大约57个氨基酸的连接体区域，其将催化结构域与碳水化合物结合结构域连接，并且其本身跨越了 C-末端105个氨基酸。由于内切葡聚糖酶通过其碳水化合物结构域附着在植物组织上，所以在蛋白质提取和纯化过程中所述的酶不能由细胞碎片完全回收。El内切葡聚糖酶在二份和三份蛋白质表达系统中表达。在这两种情况下，使用沉默抑制子HC-Pro共渗透二份和三份表达构建体。通常，在二份和三份表达系统中，El构建体的经修饰的前导序列在酶活性方面增加了产率(图20-21)。增强CMVva的复制能力CMV具有极广泛的宿主范围；它感染超过1000种植物，并且CMV分离物已经由全世界回收得到。将CMV毒株分为两个亚组I和II。之前所述的CMV表达系统是基于亚组II毒株。亚组I毒株更普通，并且通常显示出比亚组II毒株更严重的症状，可能是由于病毒复制的水平更高。此外，与亚组II相比，亚组I毒株编码了更强版本的2b沉默抑制子蛋白质。由于这种特点，研发了亚组I CMVva三份系统。首先，测定亚组I RNAl和RNA2是否有利于之前研发的亚组II RNA3的表达。估测GFP的表达情况，并使用亚组I与亚组II复制酶成分观察到GFP的表达高很多。然后，测定内切葡聚糖酶的表达情况，并发现与亚组II复制酶系统相比，亚组I复制酶使得蛋白质的表达高很多。病毒二份和三份扩增子系统(使用了重新排布的亚组I和II节段)的示例性结果示于图20和21中。在典型的试验中，与编码亚组II复制酶的病毒扩增子系统相比，编码亚组I复制酶的重新排布的病毒扩增子系统产生了更高的蛋白质表达和酶活性水平。具有细胞与细胞间的移动能力的CMVva
就细胞与细胞间的移动而言，CMV需要MP (3a移动蛋白)和CP (衣壳蛋白)，它们二者均由RNA3编码。当MP缺少C-末端的33个氨基酸时，CMV感染甚至可以在不具有CP的条件下在植物中进行细胞与细胞间的移动。之前所述的CMVa表达系统缺乏细胞与细胞间的移动(这是由于CP基因被所关注的产物基因取代)，因此所需的蛋白质仅在初始感染的细胞中表达。为了重建细胞与细胞间的移动能力，生成删除33aa的MP突变体，该突变体仍通过CP编码区域表达内切葡聚糖酶。当使用三份CMVva表达系统渗透这些构建体时，得到了较高水平表达的内切葡聚糖酶，这可通过免疫印迹和酶活性测试确定。接着，针对删除33个氨基酸的MP突变体会促进在在植物体中蛋白质表达中产率额外增加的能力来测定该突变体。在亚组I复制酶存在下进行表达时，包含野生型前导序列的GFP构建体在UV光下会制备强的荧光信号。当与MP删除突变体结合时，与野生型MP结合的情况相比，包含经修饰的前导序列的构建体#6在亚组I复制酶的存在下会产生水平高很多的GFP的表达。此外，使用亚组I复制酶和MP删除突变体还会强烈地增加植物中El的表达，这可通过酶活性测量确定。当将亚组I复制酶络合物26与删除33个氨基酸的MP突变体结合使用时，在植物体中取得了最高的El活性水平。发现当野生型MP与亚组I复制酶结合使用时，其不会良好地表达。相反，发现MP删除突变体与亚组I或II复制酶相结合会良好地表达。综上，本实施例证明了 CMV扩增子基蛋白质表达系统可以高效地制备多种异源蛋白质，包括解纤维热酸菌内切葡聚糖酶El。CMV扩增子可以分为二份或三份表达系统，其中CMV扩增子节段RNA1、RNA2和RNA3分布在2个或3个不同的质粒上。CMV亚组I节段RNAl和RNA2与CMV亚组节段RNA3使得蛋白质表达的产率增加。在一些情况下，RNA4前导序列的优化使得蛋白质和RNA的表达水平得到改善。重要的是，CMV3a移动蛋白删除突变体的表达有利于复制、CMV扩增子的细胞与细胞间的移动以及异源蛋白质(例如GFP或El)的系统性表达。显示CMV扩增子基的表达系统会使异源蛋白质的产率为至多大约4mg蛋白质/kg植物组织鲜重。实施例2内切葡聚糖酶(El)蛋白质在毕赤酵母(Pichia pastoris)用作标准品的制备和表征本实施例证明毕赤酵母制备的El可以用作用于估测植物制备的El的特异活性和产率的标准品。确定经纯化的内切葡聚糖酶的Michaelis-Menten动力学参数。在毕赤酵母中制备E1，并通过IMAC (固定化金属亲和层析)纯化。针对图26所示的特异反应确定参数。El将底物(MUC)切割成纤维二糖和荧光团(MU)，可以在一定时间内监测其浓度。当在65°C和135 μ M底物下运行时，这为用于在植物提取物和酵母培养物中针对El进行活性测试的反应。在这组试验中，改变底物的浓度来确定在不同温度下的动力学参数。用于展示Michaelis-Menten动力学的反应的速率示于等式I中。速率取决于催化速率(kcat)，酶的总浓度(ET)，归并为Michaelis-Menten常数的吸附/解吸附速率(Km)以及底物浓度(S)。在高底物浓度下(S > > Km)，所述的速率接近最大，并且kcatET通常写为Vmax。
权利要求
1.一种能够表达异源蛋白质的植物细胞，该植物细胞包含: 病毒扩增子，其中所述的扩增子包含多个扩增子节段，该扩增子能够扩增编码所述的异源蛋白质的核酸序列的转录，所述的扩增子包含: 1.包含至少一个扩增子节段的第一质粒，其中所述的至少一个节段包含编码所述的异源蛋白质的核酸序列；以及 .包含至少一个扩增子节段的第二质粒； 其中所述的第一质粒不同于所述的第二质粒。
2.权利要求1所述的细胞，其中所述的扩增子包含第三质粒，所述的质粒包含至少一个扩增子节段，其中所述的第三质粒不同于所述的第一质粒和所述的第二质粒。
3.权利要求1所述的细胞，其中所述的第一质粒包含至少一个不被所述的第二质粒所包含的扩增子节段。
4.权利要求1所述的细胞，其中所述的第二质粒包含至少一个不被所述的第二质粒所包含的扩增子节段。
5.权利要求1所述的细胞，其中所述的第一质粒包含卡那霉素选择标志物基因，并且所述的第二质粒不包含所述的卡那霉素选择标志物基因。
6.权利要求1所述的细胞，其中所述的病毒扩增子为黄瓜花叶病毒组扩增子。
7.权利要求6所述的细胞，其中所述的黄瓜花叶病毒组扩增子为CMV扩增子。
8.权利要求1所述的细胞 ，其中所述的第一质粒的至少一个扩增子节段为CMVRNA3。
9.权利要求8所述的细胞，其中所述的CMVRNA3包含片段RNA4，其中所述的RNA4包含经修饰的5’ -前导序列，与野生型RNA4 5’ -前导序列相比，所述的经修饰的5’ -前导序列具有更多的限制性酶切位点。
10.权利要求8所述的细胞，其中所述的第二质粒的至少一个扩增子节段为CMVRNAI,并且所述的第三质粒的至少一个扩增子节段为CMVRNA2。
11.权利要求1所述的细胞，其中所述的第二质粒的至少一个扩增子节段为2个扩增子节段。
12.权利要求11所述的细胞，其中所述的2个扩增子节段为CMVRNAl和CMV RNA2。
13.权利要求1所述的细胞， 其中所述的第一质粒的所述的至少一个扩增子节段得自第一个病毒亚组；以及 其中所述的第二质粒的所述的至少一个扩增子节段得自第二个病毒亚组。
14.权利要求1所述的细胞， 其中在所述的第二质粒上的至少一个扩增子节段包含响应于化学诱导剂的启动子序列；以及 其中所述的启动子序列与编码病毒蛋白质的核酸序列可操作地连接。
15.权利要求14所述的细胞，其中所述的化学诱导剂为雌二醇或甲氧虫酰肼。
16.权利要求14所述的细胞，其中所述的病毒蛋白质为复制酶或复制酶亚单元。
17.权利要求1所述的细胞，其中编码所述的异源蛋白质的核酸序列经密码子优化。
18.权利要求1所述的细胞，其中所述的异源蛋白质为分泌蛋白质。
19.权利要求1所述的细胞，其中所述的异源蛋白质为GFP或RFP。
20.权利要求1所述的细胞，其中所述的异源蛋白质为能够修饰、降解或分解植物细胞壁的酶。
21.权利要求20所述的细胞，其中所述的酶在>30°C的温度下具有最佳的活性。
22.权利要求20所述的细胞，其中所述的酶为纤维素酶。
23.权利要求22所述的细胞，其中所述的纤维素酶为内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β -葡糖苷酶或木聚糖酶。
24.权利要求23所述的细胞，其中所述的内切葡聚糖酶为得自解纤维热酸菌的ΕΙβ-1,4-内切葡聚糖酶。
25.权利要求23所述的细胞，其中所述的木聚糖酶得自解纤维热酸菌。
26.权利要求1所述的细胞，其中所述的扩增子节段包含编码所述的异源蛋白质的核酸序列，所述的扩增子节段进一步包含与编码所述的异源蛋白质的核酸序列可操作地连接的CaM 35S启动子。
27.权利要求1所述的细胞，进一步包含编码基因沉默抑制子的cDNA。
28.权利要求27所述的细胞，其中所述的基因沉默抑制子为Hc-Ρι 。
29.权利要求1所述的细胞，进一步包含编码病毒外壳蛋白质的cDNA。
30.权利要求1所述的细胞，进一步包含编码突变体形式的所述的CMV3a移动蛋白的cDNA。
31.权利要求 30所述的细胞，其中所述的突变体形式的所述的CMV3a移动蛋白包含C-末端33个氨基酸的删除。
32.权利要求1所述的细胞，其中所述的第一质粒和所述的第二质粒为T-DNA质粒。
33.一种能够表达异源蛋白质的植物细胞，该植物细胞包含: 病毒扩增子，其中所述的扩增子包含多个扩增子节段，该扩增子能够扩增编码所述的异源蛋白质的核酸序列的转录，所述的扩增子包含: 1.得自第一病毒亚组的第一扩增子节段；以及 .得自第二病毒亚组的第二扩增子节段； 其中所述的第一或第二扩增子节段包含编码所述的异源蛋白质的核酸序列。
34.权利要求33所述的细胞，其中所述的病毒扩增子进一步包含第三扩增子节段，其中所述的第三扩增子节段得自所述的第一或第二病毒亚组。
35.权利要求33所述的细胞，其中所述的病毒扩增子在单一质粒上编码。
36.权利要求33所述的细胞，其中所述的病毒扩增子由两种质粒编码，其中所述的第一质粒包含得自第一病毒亚组的两个扩增子节段，并且所述的第二质粒包含得自第二病毒亚组的一个扩增子节段。
37.权利要求33所述的细胞，其中所述的病毒扩增子由三种质粒编码，其中所述的第一质粒包含得自第一病毒亚组的一个扩增子节段，并且所述的第二和第三质粒均包含得自第二病毒亚组的一个扩增子节段。
38.权利要求33所述的细胞，其中所述的病毒扩增子为黄瓜花叶病毒组扩增子。
39.权利要求38所述的细胞，其中所述的病毒扩增子为CMV扩增子。
40.权利要求33所述的细胞，其中所述的第一扩增子节段为得自CMV亚组II的RNA3。
41.权利要求40所述的细胞，其中RNA3包含片段RNA4，其中所述的RNA4包含经修饰的5’ -前导序列，与野生型RNA4 5’ -前导序列相比，所述的经修饰的5’ -前导序列具有更多的限制性酶切位点。
42.权利要求33所述的细胞，其中所述的第二扩增子节段为得自CMV亚组I的RNAl或RNA2。
43.权利要求42所述的细胞，其中所述的CMV亚组I为California亚组I。
44.权利要求33所述的细胞，其中编码所述的异源蛋白质的核酸序列经密码子优化。
45.权利要求33所述的细胞，其中所述的异源蛋白质为分泌蛋白质。
46.权利要求33所述的细胞，其中所述的异源蛋白质为GFP或RFP。
47.权利要求33所述的细胞，其中所述的异源蛋白质为能够修饰、降解或分解植物细胞壁的酶。
48.权利要求47所述的细胞，其中所述的酶在>30°C的温度下具有最佳的活性。
49.权利要求47所述的细胞，其中所述的酶为纤维素酶。
50.权利要求49所述的细胞，其中所述的纤维素酶为内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β -葡糖苷酶或木聚糖酶。
51.权利要求50所述的细胞，其中所述的内切葡聚糖酶为得自解纤维热酸菌的ΕΙβ-1,4-内切葡聚糖酶。
52.权利要求50所述的细胞，其中所述的木聚糖酶得自解纤维热酸菌。
53.权利要求33所述的细胞，其中所述的扩增子节段包含编码所述的异源蛋白质的核酸序列，所述的扩增子节段进一步包含与编码所述的异源蛋白质的核酸序列可操作地连接的CaM 35S启动子。
54.权利要求33所述的细胞，进一步包含编码基因沉默抑制子的cDNA。
55.权利要求54所述的细胞，其中所述的基因沉默抑制子为Hc-Pro。
56.权利要求33所述的细胞，进一步包含编码突变体形式的所述的CMV3a移动蛋白的cDNA。
57.权利要求56所述的细胞，其中所述的突变体形式的所述的CMV3a移动蛋白包含C-末端33个氨基酸的删除。
58.权利要求33所述的细胞，其中所述的病毒扩增子能够在植物体中复制并系统性地移动。
59.权利要求33所述的细胞， 其中至少一个扩增子节段包含响应于化学诱导剂的启动子序列；以及 其中所述的启动子序列与编码病毒蛋白质的核酸序列可操作地连接。
60.权利要求59所述的细胞，其中所述的化学诱导剂为雌二醇或甲氧虫酰肼。
61.权利要求59所述的细胞，其中所述的病毒蛋白质为复制酶或复制酶亚单元。
62.一种用于制备异源蛋白质的方法，该方法包括: 1.将植物细胞、植物或切除的植物组织与细菌细胞相接触，所述的细菌细胞包含: 完整的病毒扩增子，其中所述的扩增子包含多个扩增子节段，该扩增子节段能够扩增编码所述的异源蛋白质的核酸序列的转录； .允许足够的时间，从而在所述的植物细胞中制备所述的异源蛋白质；以及 ii1.收获至少2.0mg异源蛋白质/kg鲜重的所述的植物细胞、植物或切除的植物组织。
63.权利要求62所述的方法，其中所述的至少2.0mg异源蛋白质/kg鲜重的所述的植物细胞、植物或切除的植物组织为至少3.0mg异源蛋白质/kg鲜重的所述的植物细胞、植物或切除的植物组织。
64.权利要求62所述的方法，其中所述的至少2.0mg异源蛋白质/kg鲜重的所述的植物细胞、植物或切除的植物组织为至少4.0mg异源蛋白质/kg鲜重的所述的植物细胞、植物或切除的植物组织。
65.一种用于制备异源蛋白质的方法，该方法包括: 1.将植物细胞与至少一种植物激素相接触； .将所述的植物细胞与细菌细胞相接触，所述的细菌细胞包含: 完整的病毒扩增子，其中所述的扩增子包含多个扩增子节段，该扩增子能够扩增编码所述的异源蛋白质的核酸序列的转录； ii1.允许足够的时间，从而在所述的植物细胞中制备所述的异源蛋白质；以及 iv.收获由所述的植物细胞制备的所述的异源蛋白质。
66.权利要求65所述的方法，其中所述的至少一种植物激素为至少两种植物激素。
67.权利要求65所述的方法，其中所述的至少一种植物激素选自茉莉酸、赤霉素A3、吲哚乙酸、2，4-二氯苯氧乙酸、激动素和水杨酸。
68.权利要求65所述的方法，其中与野生型植物细胞相比，所述的植物细胞为表达高水平基因沉默抑制子的转基因植物细胞。
69.权利要求65 所述的方法，进一步包含将所述的植物细胞与第二细菌细胞相接触，其中所述的第二细菌细胞包含编码基因沉默抑制子的重组核酸序列。
70.权利要求65所述的方法，其中所述的植物细胞包含基因组DNA，并且所述的病毒扩增子在所述的植物基因组DNA中稳定地整合。
71.权利要求65所述的方法，其中所述的异源蛋白质在所述的植物细胞中瞬时制备。
72.权利要求65所述的方法，其中所述的植物细胞由植物、切除的植物组织或植物细胞培养物所包含。
73.权利要求65所述的方法，进一步包含通过离质体洗涤而除去所述的植物或切除的植物组织离质体的可溶性成分。
74.权利要求65所述的方法，其中所述的植物细胞为烟草、柳枝稷、芒草、向日葵、糖南瓜或南瓜小果的植物细胞。
75.权利要求65所述的方法，其中所述的烟草植物细胞为烟草本塞姆氏细胞。
76.一种用于制备异源蛋白质的方法，该方法包括: 1.机械创伤植物或切除的植物组织； .将所述的植物或切除的植物组织与细菌细胞相接触，所述的细菌细胞包含: 完整的病毒扩增子，其中所述的扩增子包含多个扩增子节段，该扩增子能够扩增编码所述的异源蛋白质的核酸序列的转录； ii1.允许足够的时间，从而在所述的植物细胞中制备所述的异源蛋白质；以及 iv.收获由所述的植物细胞制备的所述的异源蛋白质。
77.权利要求76所述的方法，其中机械创伤所述的植物或切除的植物组织包含使用刷子压制所述的植物或切除的植物组织。
78.权利要求76所述的方法，其中所述的植物或切除的植物组织为转基因植物或切除的植物组织，与野生型植物或切除的植物组织相比，所述的转基因植物或切除的植物组织表达高水平的基因沉默抑制子。
79.权利要求76所述的方法，其中所述的异源蛋白质在所述的植物细胞中瞬时制备。
80.权利要求65或76所述的方法，其中步骤ii)是通过加压渗透或真空渗透实施的。
81.权利要求76所述的方法，其中所述的植物细胞形成植物、切除的植物组织或植物细胞培养物的一部分。
82.权利要求76所述的方法，进一步包括通过离质体洗涤来除去所述的植物或切除的植物组织离质体的可溶性成分。
83.权利要求76所述的方法，其中所述的植物细胞为烟草、柳枝稷、芒草、向日葵、糖南瓜或南瓜小果的植物细胞。
84.权利要求76所述的方法，其中所述的烟草植物细胞为烟草本塞姆氏细胞。
85.权利要求76所述的方法，进一步包括将所述的植物或切除的植物组织与第二种细菌细胞相接触，其中所述的第二种细菌细胞包含编码基因沉默抑制子的重组核酸序列。
86.权利要求69或85所述的方法，其中所述的基因沉默抑制子为HC-Pix)。
87.权利要求69或85所述的方法，其中所述的基因沉默抑制子衍生自番茄茂密矮小病毒或烟草蚀刻病毒。
88.权利要求77所述的方法，进一步包括将所述的植物或切除的植物组织与第二细菌细胞相接触，其中所述的第二细菌细胞包含编码病毒外壳蛋白质的重组核酸序列。
89.权利要求88所述的方法，其中所述的病毒外壳蛋白质为CMV外壳蛋白质。
90.权利要求65或76所述的方法，其中所述的病毒扩增子包含单一质粒。
91.权利要求65或76所述的方法，其中所述的病毒扩增子包含: 包含至少一个扩增子节段的第一质粒，其中所述的至少一个节段包含编码所述的异源蛋白质的核酸序列；以及 包含至少一个扩增子节段的第二质粒； 其中所述的第一质粒不同于所述的第二质粒。
92.权利要求65或76所述的方法，其中所述的病毒扩增子包含3种质粒。
93.权利要求65或76所述的方法，其中所述的病毒扩增子包含: 得自第一病毒亚组的第一扩增子节段；以及 得自第二病毒亚组的第二扩增子节段， 其中所述的第一或第二扩增子节段包含编码所述的异源蛋白质的核酸序列。
94.权利要求65或76所述的方法，进一步包括将所述的植物细胞与化学诱导剂相接触。
95.权利要求94所述的方法，其中所述的化学诱导剂为雌二醇或甲氧虫酰肼。
96.权利要求65或76所述的方法，其中所述的异源蛋白质为能够修饰、降解或分解植物细胞壁的酶。
97.权利要求65或76所述的方法，进一步包括原位活化的所述的异源蛋白质，由此蛋白质活化使得植物细胞壁被降解。
98.权利要求65或76所述的方法，其中所述的第一和第二细菌细胞为根癌土壤杆菌细胞。
99.权利要求65或76所述的方法，其中所述的植物细胞包含基因组DNA，并且所述的病毒扩增子在所述的植物基因组DNA中稳定地整合。
100.权利要求65或76所述的方法，其中4天为在所述的植物细胞中制备所述的异源蛋白质的足够的时间。
101.权利要求65或76所述的方法，其中6天为在所述的植物细胞中制备所述的异源蛋白质的足够的时间。
102.一种用于制备异源蛋白质的方法，该方法包括: .1.将所述的植物细胞与细菌细胞在第一温度下相接处， 其中所述的细菌细胞包含完整的病毒扩增子， 所述的扩增子包含多个扩增子节段，该扩增子能够扩增编码所述的异源蛋白质的核酸序列的转录； .在第二温度下将所述的植物细胞温育足够的时间，从而在所述的植物细胞中制备所述的异源蛋白质；以及 ii1.收获由所述的植物细胞制备的所述的异源蛋白质。
103.权利要求102所述的方法， 其中所述的第一温度为20°C，并且所述的第二温度为.26°C或 30°C。
104.一种能够表达木聚糖酶的植物细胞，该植物细胞包含: .1.编码由解纤维热酸菌得到的木聚糖酶的密码子优化的核酸序列， .与所述的优化的核酸序列可操作地连接的CaM 35S启动子，以及 ii1.编码所述的基因沉默抑制子Hc-Pio的核酸序列。
全文摘要
本文描述了病毒扩增子基蛋白质表达系统以及通过农杆菌真空渗透法来制备异源蛋白质的方法，其中所述的异源蛋白质例如为酶。所述的方法涉及使用编码异源蛋白质的Ti质粒来制备土壤杆菌属，使用该土壤杆菌属来感染植物细胞，允许异源蛋白质表达，以及由植物细胞回收异源蛋白质。在一个实施方案中，所制备的蛋白质为内切葡聚糖酶。
文档编号C12N15/82GK103180447SQ201180041076
公开日2013年6月26日 申请日期2011年7月19日 优先权日2010年7月19日
发明者M·黄, B·E·林登穆斯, K·A·麦克唐纳, A·M·丹德卡尔, B·W·福克, S-k·郑, N·J·金斯伯里 申请人:加州大学评议会
技术领域：
本公开总体而言涉及异源蛋白质的植物基制备，更具体而言，涉及异源蛋白质的在植物体中制备。2.相关技术的说明
诸如乙醇之类的生物燃料是由葡萄糖发酵得到的，并且生物质中的纤维素是这种糖的潜在来源。然而，需要一组协同作用的酶来将纤维素降解为葡萄糖。通常，这些酶是通过真菌细胞培养制备的，这种真菌细胞培养需要高的资金成本以及大量的生物反应器。因此，需要更有效的酶制备系统，该系统需要较少的资金成本、消耗较少的能量，并释放较少的二氧化碳。发明概述本公开的组合物和方法通过促进异源蛋白质的高产率、低成本的在植物体中制备(例如纤维素酶)而解决了这种需要。在植物体中制备细胞壁降解酶可以减轻对昂贵且能量密集型的制备生物质发酵所用的纯化纤维素酶的需要，并由此帮助降低制备成本且改善生物燃料制造方法的能量平衡。具体而言，本公开提供了植物病毒基系统，其能够瞬时在植物体中表达异源蛋白质，例如纤维素酶。本公开进一步提供了使用此类植物病毒基表达系统来在植物中制备高产率异源蛋白质的方法。本公开的一个方面提供了能够表达异源蛋白质的植物细胞，其中所述的植物细胞包括被多于I种质粒编码的完整的病毒扩增子。扩增子包括多个扩增子节段。扩增子能够扩增编码所关注的异源蛋白质的核酸序列的转录。扩增子包括至少2种质粒，其中第一质粒不同于第二质粒。第一质粒包括至少一个含有核酸序列的扩增子节段，其中所述的核酸序列编码了异源蛋白质，并且第二质粒包括至少一个扩增子节段。在一些实施方案中，病毒扩增子为黄瓜花叶病毒组扩增子，并且在具体的实施方案中，扩增子为黄瓜花叶病毒(CMV)扩增子。
在一些实施方案在红，病毒扩增子为通过2种质粒编码的二份系统。在优选的实施方案中，第一质粒包括CMV RNA3扩增子节段，其中RNA3包括编码异源蛋白质的核酸序列。在另一个优选的实施方案中，第二质粒包括CMV RNAl和RNA2扩增子节段。在一些具体的实施方案中，第二质粒包括启动子序列，该启动子序列响应于化学诱导剂并且可操作地与编码病毒蛋白质的核酸序列连接。在一些具体的实施方案中，化学诱导剂为雌二醇或甲氧虫酰肼。在一些具体的实施方案中，病毒蛋白质为复制酶或复制酶亚单元。在一些具体的实施方案中，第二质粒包括卡那霉素选择标志物，并且第一质粒不包括卡那霉素选择标志物。在一些实施方案中，病毒扩增子为通过3种质粒编码的三份系统。在优选的实施方案中，第一质粒包括CMV RNA3扩增子节段，其中RNA3包括编码异源蛋白质的核酸序列。在另一个优选的实施方案中，第二质粒包括CMV RNAl扩增子节段，并且第三质粒包括CMVRNA2扩增子节段。本公开的另一个方面提供了能够表达异源蛋白质的植物细胞，其中所述的植物细胞包括完整的病毒扩增子 ，该完整的病毒扩增子包括得自多于一个的病毒亚组的扩增子节段。在优选的实施方案中，病毒扩增子为CMV扩增子，扩增子节段RNA3得自CMV亚组II的菌株，并且扩增子节段RNAl和RNA2得自CMV亚组I的菌株，例如California亚组I的菌株。在一些实施方案中，CMV RNA3扩增子节段包括RNA4节段，该RNA4节段具有经修饰的5’-引导序列，与相应的野生型RNA5’-引导序列相比，经修饰的5’-引导序列包含更多的限制性酶切位点。在一些实施方案中，异源蛋白质为分泌的蛋白质。在其他实施方案中，异源蛋白质为GFP或RFP。在其他实施方案中，异源蛋白质为能够修饰、降解或分解植物细胞壁的酶。在一些具体的实施方案中，所述的酶在> 30°C的温度下具有最佳的活性。在一些具体的实施方案中，所述的酶为纤维素酶。在一些具体的实施方案中，纤维素酶为内切葡聚糖酶、夕卜切葡聚糖酶、β -葡糖苷酶或木聚糖酶。在优选的实施方案中，内切葡聚糖酶为得自解纤维热酸菌(Acidothermus cellulolyticus)的El β-1,4-内切葡聚糖酶。在一些实施方案中，包括编码异源蛋白质的核酸序列的扩增子节段进一步包括与编码异源蛋白质的核酸序列可操作地连接的CaM35S启动子。植物细胞可以形成细胞培养物、切除的植物组织或完整植物的一部分。在一些实施方案中，植物细胞为烟草、柳枝稷、芒草、向日葵、糖南瓜或南瓜小果的植物细胞。在具体的实施方案中，植物细胞为烟草本塞姆氏(Nicotiana benthamiana)的细胞。在一些实施方案中，植物细胞还包括编码基因沉默抑制子的cDNA。在一些实施方案中，基因沉默抑制子为RNA-沉默抑制子(RSS)。在一些实施方案中，RSS为辅助成分蛋白酶HC-Pix)。在一些实施方案中，基因沉默抑制子得自番茄茂密矮小病毒(TBSV)或烟草蚀刻病毒(TEV)。在一些实施方案中，与野生型植物细胞相比，所述的植物细胞为表达高水平的基因沉默抑制子的转基因植物细胞。在一些实施方案中，病毒扩增子可以在植物体中复制并系统性地移动。在一些具体的实施方案中，植物包括包括编码突变形式的CMV 3a移动蛋白的cDNA。在优选的实施方案中，突变形式的CMV3a移动蛋白包括C-末端33个氨基酸的删除。本公开的另一个方面提供了通过以下过程制备异源蛋白质的方法:i)将植物细胞、植物或切除的植物组织与细菌细胞相接触，这种细菌细胞包括完整的病毒扩增子，其中扩增子包括多个扩增子节段，并且扩增子能够扩增编码异源蛋白质的核酸序列的转录；ii)在植物细胞中允许足够的时间来制备异源蛋白质；以及iii)收获至少0.5毫克异源蛋白质/千克鲜重的植物细胞、植物或切除的植物组织。在一些实施方案中，至少0.5毫克为至少
1.0毫克。在一些实施方案中，至少1.0毫克为至少1.5毫克。在一些实施方案中，至少1.5毫克为至少2.0毫克。在一些实施方案中，至少2.0毫克为至少3.0毫克。在一些实施方案中，至少3.0毫克为至少4.0毫克。本公开的另一个方面提供了通过以下过程制备异源蛋白质的方法:i)将植物细胞与至少一种植物激素相接触；ii)将植物细胞与细菌细胞相接触，该细菌细胞包括完整的病毒扩增子，其中扩增子包括多个扩增子节段，并且该扩增子能够扩增编码异源蛋白质的核酸序列的转录；iii)在植物细胞中允许足够的时间来制备异源蛋白质；以及iv)收获由植物细胞制备的异源蛋白质。在一些实施方案中，至少一种植物激素为至少两种植物激素。在一些实施方案中，至少一种植物激素选自茉莉酸、赤霉素A3、吲哚乙酸、2，4_ 二氯苯氧乙酸、激动素和水杨酸。本公开的另一个方面提供了通过以下过程制备异源蛋白质的方法:i)以机械方式创伤植物或切除的植物组织；ii)将植物或切除的植物组织与细菌细胞相接触，该细菌细胞包括完整的病毒扩增子，其中扩增子包括多个扩增子节段，其中该扩增子能够扩增编码异源蛋白质的核酸序列的转录；iii`)在植物细胞中允许足够的时间来制备异源蛋白质；以及iv)收获由植物细胞制备的异源蛋白质。在一些实施方案中，植物或切除的植物组织通过使用刷子压制植物或切除的植物组织而以机械方式受到创伤。本公开的另一个方面提供了通过以下过程制备异源蛋白质的方法:i)在第一温度下将植物细胞与细菌细胞相接触，其中细菌细胞包括完整的病毒扩增子，并且该扩增子包括多个扩增子节段并且能够扩增编码异源蛋白质的核酸序列的转录；ii)在第二温度下将植物细胞温育足够的时间，从而在植物细胞中制备异源蛋白质；以及iii)收获由植物细胞制备的异源蛋白质。在一些实施方案中，第一温度为20°C，并且第二温度为26°C或30°C。在一些实施方案中，异源蛋白质在植物细胞、植物或切除的植物组织中瞬时制备。在一些实施方案中，接触植物细胞、植物或切除的植物组织是通过加压过滤或真空过滤实施的。在一些实施方案中，4天为在植物细胞、植物或切除的植物组织中制备异源蛋白质的足够的时间。在其他实施方案中，6天为足够的时间。在优选的实施方案中，第一和第二细菌细胞为根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)细胞。在一些实施方案中，所述的方法包括将细菌细胞与化学诱导剂相接触的额外步骤。在一些实施方案中，所述的方法包括将植物细胞、植物或切除的植物组织与第二种细菌细胞相接触的额外步骤，其中所述的细菌细胞包括编码基因沉默抑制子或病毒外壳蛋白质的重组核酸序列。在一些实施方案中，所述的方法包括原位活化异源蛋白质的额外步骤，其中蛋白质的活化使得植物细胞壁被降解。在一些实施方案中，所述的方法包括通过离质体洗涤来除去植物或切除的植物组织离质体的可溶性成分的额外步骤。
附图简述
图1描绘了通过DNA 2.0，Inc合成的基因的示意图。RAMY 3D SP编码了得自大米α淀粉酶的信号肽。El为得自解纤维热酸菌的β-1，4-内切葡聚糖酶El。El_cd编码了 El催化结构域。El-1ink编码了 El连接体结构域。El_cbd编码了 El纤维素结合结构域。PFT-6His编码了肽融合标记，6个聚组氨酸标签。终止密码子和限制性酶切位点(Xhol，PstI, HindIII和SpeI)已经加入到侧翼区域。图2描绘了得自β -1,4-内切葡聚糖酶翻译产物的所预计的氨基酸序列。图3描绘了 pDP0701载体的图谱。图4描绘了 pDP07.0202a 二元载体的图谱。图5描绘了在得自烟草植物(烟草本塞姆氏)的各种组织样品中制备的内切葡聚糖酶的量。对照#1和#2为使用缓冲液但不含细菌渗透的两种不同的烟草植物。试验#1和#2为使用悬浮在缓冲液中的土壤杆菌渗透的两种不同的烟草植物。检测同一叶片的不同区域之间和试验植物#1的叶片之间的变化性。检测试验植物#1和#2之间的植物与植物的变化性。图6描绘了在烟草植物中内切葡聚糖酶的瞬时表达。在一定时间内，监测在渗透的完整植物以及储存在不同环境下的所收获的叶片中的内切葡聚糖酶的量。热是指最大温度> 30°C。冷是指最大温度< 30°C。光是指16/8h的光/暗循环。暗是指24h黑暗。
图7描绘了得自的内切葡聚糖酶的经修饰的基因。得自花椰菜花叶病毒的35S启动子有助于构成性转录。图8描绘了将其Ti质粒的特定节段转移至植物细胞中的土壤杆菌属。图9描绘了水解纤维素链中的β -1，4_糖苷键(箭头)的内切葡聚糖酶。图10描绘了内切葡聚糖酶活性的最佳条件。图11描绘了真空渗透如何将土壤杆菌和植物细胞结合在一起。将叶片组织浸溃在土壤杆菌的悬浮液中，并将真空推入到室中。气泡由叶组织中出现，并升至表面。释放真空，并且包含土壤杆菌的液体淹没了组织，从而使细菌与植物细胞直接接触。图12描绘了用于渗透完整植物(左侧)或者分离的叶片(右侧)的实验室-级
的真空室。图13描绘了在使用土壤杆菌渗透之后分离叶片的第4天(左侧)、第6天(中间)和第9天(右侧)。图14描绘了包括RNAl、RNA2、RNA3和RNA4的CMV va表达系统。图15A和15B描绘了两份可诱导系统载体:(A)pDUR2XLRl和(B)pB301_RNA3的载体图谱。图16A、16B 和 16C 描绘了三份复制系统载体:(A) pCB301_RNAl、(B) pCB301-RNA2和(C)pCB301-RNA3的载体图谱。图17描绘了经修饰的RNA4前导序列。使用经修饰的RNA4前导序列来增强CMV外壳蛋白质和其他插入序列(GFP，内切葡聚糖酶)的表达。图18A、18B和18C描绘了在用于三份复制的植物中的症状。(A)描绘了烟草本塞姆氏；(B)描绘了小糖南瓜；和(C)描绘了美洲南瓜小果。图19描绘了解纤维热酸菌内切葡聚糖酶(El)的特征。
图20描绘了使用缺乏基因沉默抑制子的二份和三份载体系统的内切葡聚糖酶(El)表达对照(RT-PCR)。示出了用于酶活性测试的结果(以mg/kg计)。W是指野生型，2、6和8是指特定的前导序列。结果是使用非转基因烟草本塞姆氏植物但使用非共表达的沉默抑制子蛋白质而获得的。图21描绘了使用RT-PCR，在HcPro-烟草本塞姆氏中使用二份和三份载体系统的内切葡聚糖酶(El)的表达。结果是使用通过转基因烟草本塞姆氏植物表达的HC-Pix)沉默抑制子而获得的。图22描绘了改善El表达的其他方法。图23以概略的方式描绘了在具有反式CP或RNA4的渗透和上部叶中三份复制El表达。图24描绘了经修饰的前导序列(A)以及它们的二级结构(B)。(A)与野生型RNA4前导序列相比，经修饰的前导序列包含额外的序列，该序列包括额外的限制性酶切位点。(B)示出了野生型和经修饰的RNA4构建体的二级结构。共有的结构茎和环元件被突出。图25描绘了用于复制三份扩增子的结果，其影响了糖南瓜、南瓜小果和烟草本塞姆氏植物。植物受到系统性的影响，并在渗透之后的2周时，在上方系统叶片中，显示出退氯斑症状。图26描绘了 El催化的反应。底物MUC被切割成纤维二糖和荧光团MU，可以监测一定时间内它们的浓度。当在65°C和135μΜ MUC下运行时，该反应用作用于植物提取物和酵母培养物的El活性测定。图27描绘了在不同的反应温度(50，65，80和93 °C )下用于El活性的Lineweaver-Burke图。活性的单位(V)为μ M MU/min,并且底物浓度的单位为μ M MUC0图28描绘了针对底物浓度绘制的活性数据。线条表示具有根据试验衍生的参数的 Michaelis-Menten 等式。图29描绘了 JA(茉莉酸)对El表达的影响。如图所示，与不具有JA的对照叶片相比，在渗透溶液中加入250 μ M JA在第6天会将El的表达水平增大3.5倍。图30描绘了 2种不同植物激素的组合的影响，所述的植物激素包括茉莉酸(JA)、赤霉素A3 (GA)、吲哚乙酸(IAA)、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4_D)、激动素(CK)和水杨酸(SA)。图31描绘了在叶片温育过程中不同温度概况的影响。在渗透之后，在不同的天数，将叶片温育的温度由20°C变为30°C，并保持2天。与对照相比，温度4或温度5概况得到了最高的表达情况。在温育的后期阶段增加温育的温度会增加El的制备。图32描绘了叶片温育温度的两相最优组合。每个柱都表达单独的叶片。温育温度在第2天由20°C升至26°C，并在26°C下保持接下来的4天。图33描绘了机械创伤处理对向日葵叶片的效力。使用刷子对植物叶片多次压制，然后经过真空渗透。示出了在具有创伤处理和不具有创伤处理之间的直接比较。图34描绘了在由3种无关的烟草本塞姆氏叶片(经渗透从而瞬时表达El)得到的匀化产物提取物(HE ;蓝柱)和离质体洗液(AWF ;紫柱)中A)纯度、B)浓度和C)产率的值的比较。各值仅用于第一次得到的AWF。图下方的表表示AWF的值除以HE的值的比值。图35描绘了 通过离质体洗涤5种不同蛋白质而得到的重组蛋白质回收物与通过匀化产物提取所获得物质的效力的比较。如在美国专利N0.7034128中所报道的那样，在烟草(N.tabacum)中生长的且大规模回收的3种重组蛋白质的Large Scale Biology Corp.(LSB)结果显示与作为独立的试验系列的一部分所得到的小试规模的结果相近。在该系列中，每个样品5次收集离质体洗液(AWF)，这与LSB数据的仅收集I次相反，并将数据取平均值或者总计在一起。由独立的试验系列所提供的数据是所得到的最好结果的代表。图36描绘了在经历5次连续的离质体洗涤从而除去分泌的El之后瞬时表达内切葡聚糖酶El的烟草本塞姆氏叶片。由于AWF体积不够，所以不能对第二次获得的AWF进行活性测试。图37描绘了在每mg总可溶性蛋白质(TSP)的离质体洗液(AWF)和匀化产物提取物(HE)中，El和MDH活性的相关级份。将各级份的最高活性任意地设定为100%以用于各次比较。使用PH5.5的El收获缓冲液(0.1M NaCl，0.05M乙酸，0.1 % Tween 80或0.01%Silwet L77)作为渗透缓冲液从而回收离质体洗液，或者用于获得匀化产物提取物。测定各样品中El以及苹果酸酶(MDH)(细胞内标志物)的活性。各样品为合并的AWF，其是通过由同一叶片上切除的4块叶盘离心而收集得到的。图38描绘了通过匀化作用和离子体洗液回收而回收的El内切葡聚糖酶的比较。发明详述以下说明列出了多个示例性的构造、参数等。但是，应该意识到此类说明无意于限定本发明的范围，而是作为示例性实施方案的说明而提供的。1.异源蛋白质的选择解纤维热酸菌为生活在高温、酸性环境(例如黄石国家公园的热泉)下的嗜热细菌。由嗜热有机体得到的酶通常在>30°C的温度下具有最佳活性。由这种有机体选择β-1，4-内切葡聚糖酶El作为异源蛋白质的优选实施方案，因为所述的酶水解纤维素的能力在环境温度下被抑制，这样该基因的在植物体中表达不会改变植物的显型。所述的酶在高温及低PH下活性最强。El内切葡聚糖酶在大约80°C和pH5.5下具有最佳的活性，其中所述的PH为植物细胞离质体的大致pH。El的序列得自NIH Entrez跨数据库检索(编号P54583)。成熟蛋白质(不具有天然分泌信号肽)由521个氨基酸构成，其估测分子量为56477Da。所述的蛋白质由催化结构域(El_cd， 40.3kDa)和纤维素结合结构域(El-cbd, 10.8kDa)构成,它们通过连接体区域连接(El-link, 5.4kDa)。41个氨基酸的信号肽被得自水稻α-淀粉酶(Ramy3D SP)的25个氨基酸的信号肽替代，从而有利于蛋白质由植物细胞分泌到离质体中。2.密码子优化，基因合成使用得自KEGG数据库的针对所述这种植物的密码子使用表来对纤维热酸菌β-1,4-内切葡聚糖酶El的基因进行密码子优化，以用于在烟草本塞姆氏中表达。将聚组氨酸标签加入到蛋白质的C-末端，从而允许通过金属亲和层析而快速纯化。加入合适的限制性酶切位点，从而允许插入我们其他的表达盒。整体1566bp DNA片段是通过外部公司(DNA 2.0, Inc.，Menlo Park, CA)化学合成的(图1)。3.克隆到二元表达载体中编码了得自解纤维热酸菌的β- 1，4_内切葡聚糖酶El的化学合成El基因由DNA
2.0在载体pj 210:11772中提供。图2所示的552aa蛋白质的编码区域包含与N-末端融合的25aa Ramy3D信号肽以及在C-末端的6aa组氨酸标签。
4.克隆到35S表达载体中(用于构成性表达)使用限制性内切核酸酶XhoI和HindIII分别在位置1198和2872处消化包含El的载体PJ 210:11772，从而产生1674bp片段，该片段被定向克隆到穿梭载体pDEO0.0113中，由此建立质粒PDP0701。在35S启动子的下游且在ocs3’调节序列的上游克隆El编码区域，从而建立E135S表 达盒。pDP0701(图3)中的El表达盒通过使用内切核酸酶AscI消化而被切除，并插入到二元载体PDU97.1005中，从而建立载体消化的pDP07.0202a (图4)。5.包含35S表达盒的重组土壤杆菌属菌株的建立将二元质粒pDP07.0202a电穿孔进入到以下两种土壤杆菌属菌株(EHA105pCH32和C58C1)中，从而得到可以在植物系统中用于瞬时表达El蛋白质的两种重组根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)菌株。 6.在烟草本塞姆氏中使用瞬时农杆菌真空渗透法来制备重组纤维素酶在瞬时表达研究中，使用了具有构成性CaMV35S启动子的重组EHA105pCH32 土壤杆囷I的囷株。在该表达系统中，在强35S构成性启动子的控制下制备El转录物。将所述的细菌菌株在实验室中培养，并用于感染4周大的烟草(烟草本塞姆氏)植物。感染可以在基因沉默抑制子的存在或缺乏下发生。将4周大的烟草本塞姆氏植物的叶片进行真空渗透。4周后，收获植物组织，匀化，提取并进行酶活性的测试。结果概括于图5中。4天后表达的酶的最少量为大约Img纤维素酶/kg植物细胞鲜重。在pH5.5及65°C下，与图5中所示的酶量相应的活性为40000至52000nmolMU/min/kg植物组织鲜重。本试验证实了一个原理的证明，S卩，根癌土壤杆菌可以用于瞬时(且快速)在植物组织内制备功能性内切葡聚糖酶。在不同的组织以及不同的植物之间观察变化性，但是通常产率为Img酶/kg植物鲜重。使用这种方法，在使用这种用于制备不同蛋白质(人AAT)的构成性启动子的情况下观察到相似的结果(Sudarshana et al.Plant Biotech J.4:551-559 (2006))。但是，当使用病毒扩增的表达系统来表达AAT时，产率增大70倍，这样可预计的是当使用病毒扩增子表达系统时，可以观察到制备率制备率大幅改善。此外，活性测试用于显示根癌土壤杆菌本身不会制备所述的酶，植物组织可以。此外，证明在C-末端的组氨酸标签的rEl不会消除活性。因此，本文所述的方法的一个实施方案为通过瞬时农杆菌真空渗透法到植物组织中来功能性地制备rEl。此外，证明可以在切除的植物组织(例如收获的烟草本塞姆氏叶片)中以甚至稍微高的表达水平来制备功能性重组El (图6)。在这些瞬时表达的研究中，EHA 105pCH32 土壤杆菌I菌株与构成性CaMV 35S启动子一起使用。在实验室中培养这些细菌菌株，并用于感染4周大的烟草(烟草本塞姆氏)植物。对4周大的烟草本塞姆氏植物的叶片进行真空渗透。4天后，收获植物组织，匀化，提取并测试酶活性。将经渗透的植物和叶片储存在各种条件下，以确定它们对酶产率的影响。将完整的植物储存在热的温室(每日高温> 30°C，每日14小时光照)。为了保持收获的叶片存活，将它们储存在恒温22°C的潮湿的容器中，并防止光照。为了对植物和叶片之间进行有效的比较，在 25°C下，在每日光照16小时的条件下，将一些植物和叶片在室内彼此相邻储存。将叶片储存在具有透明覆盖物的潮湿的容器中，从而允许照明。在4天和6天温育之后，测试完整植物和收获叶片的酶活性。在6天后所表达的平均酶量为大约2.6mg纤维素酶/kg植物细胞鲜重。根据所报道的天然El的特异活性，将活性测试转化为表达水平(mg El/kg植物组织鲜重)。
在另一个实施方案中，纤维素酶的在植物体中活化允许在叶片组织内原位降解纤维素。在具体的实施方案中，纤维素的活化可以包括将温度升高至30°C以上。在另一个具体的实施方案中，纤维素酶的活化可以包括将温度升高至纤维素酶具有最佳酶活性的大致温度。尽管这种El实施方案涉及在使用构成性表达系统(CaMV 35S启动子)的烟草本塞姆氏中，rEl的瞬时农杆菌真空渗透法的具体实例，但是所述的方法可以用于制备任何异源蛋白质。通常，本公开的异源蛋白质可以包括非酶类的蛋白质，例如绿色或红色荧光蛋白质GFP或RFP ;或者病毒外壳蛋白质，例如CMV外壳蛋白质(CP)。备选地，异源蛋白质可以包括酶，例如能够修饰、降解或分解植物细胞壁的酶。例如，酶可以包括纤维素降解酶，包括但不限于其他内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、葡糖苷酶和木聚糖酶。此外，多种酶可以在使用共渗透的同一宿主植物中表达，不同的宿主植物可以用于蛋白质的制备，并且可以使用不同的启动子、质粒和表达系统。异源蛋白质可以选自多种有机体，包括但不限于解纤维热酸菌。通常，编码本发明的异源蛋白质的核酸序列可以进行密码子优化。短语“密码子优化”是指适于在结构基因或其片段中使用的DNA核苷酸的选择，其中所述的结构基因或其片段接近于所关注的植物中的密码子使用情况。因此，优化的基因或核酸序列是指这样的基因，其中天然的或天然形成的基因的核苷酸序列已经被修饰，以便在植物中使用统计学优选的或统计学有利的密码子。通常在DNA水平下检测核苷酸序列，并使用任何合适的方法(例如在 Sardana et al 中所述,Plant Cell Reports 15,677-81 (1996))测定为了在植物物种中进行表达而优化的编码区域。7.用于制备异源蛋白质的病毒扩增子基表达系统就本公开的目的而言，术语“病毒扩增子”用于描述在宿主细胞中扩增核酸序列的转录所需的最少的非宿主细胞的基因材料，其中所述的核酸序列编码了异源蛋白质，并启动其在宿主细胞中的表达。病毒扩增子可以由多个节段构成，例如染色体的黄瓜花叶病毒组RNA节段RNAl、RNA2或RNA3。可以在单一质粒或多质粒(例如2种或种3质粒)上编码病毒扩增子。在任何给定的病毒扩增子中，可以选择单个的扩增子节段，并与不同的病毒家族或亚组再结合，例如黄瓜花叶病毒(CMV)的亚组I和II。可以由任何植物病毒选择病毒扩增子，包括植物病毒的雀麦花叶病毒科及其6个属:苜猜花叶病毒属，例如紫花苜猜镶嵌病毒(Alfalfa Mosaic Virus) ;Anulavirus,例如天竺葵曲叶病毒(Pelargonium Zonate Spot Virus) ;Bromovirus,例如花叶病毒(BromeMosaic Virus);黄瓜病毒，例如黄瓜花叶病毒；Ilarvirus,例如烟草条纹病毒(TobaccoStreak Virus);以及油橄榄潜隐病毒,例如橄榄潜隐病毒(Olive Latent Virus) 2。
包含得自一个CMV亚组的扩增子节段的重组CMV扩增子用于增加CMV外壳蛋白质和异源基因(蛋白质)在CMV病毒扩增子(CMVva)系统中表达(图14)。通过使用用于CMV分离物Q的特定CMV基因组节段来研发原始的CMVva系统，其中所述的CMV分离物Q命名为分类学CMV亚组II。CMV的文献显示CMV亚组I分离物更普通，并且在植物中通常更具有攻击性，表明它们复制达到较高的水平。由于CMV具有3个染色体节段(RNA1、RNA2和RNA3)，并且由于这些节段在某些情况下可以混合从而建立新的重配株CMV毒株，所以CaliforniaCMV亚组I毒株用于建立与所有3个染色体节段相应的完整的cDNA。因此，通过将CMV亚组I扩增子节段RNAl和RNA2与CMV亚组II扩增子节段RNA3混合在一起来建立重组病毒扩增子。节段RNAl和RNA2编码了复制相关的蛋白质和宿主防御蛋白质2b (沉默抑制子)。扩增子节段RNA3编码了 3a移动蛋白和衣壳蛋白。但是，亚组II RNA3节段经修饰用于异源基因(蛋白质)的插入和表达。当重组CMV扩增子在烟草本塞姆氏植物中用于农杆菌真空渗透法和蛋白质的表达时，迄今为止重组CMV扩增子得到了更高水平的3种蛋白质。它们为CMV外壳蛋白质、GFP和内切葡聚糖酶El (内切葡聚糖酶El通过免疫印迹分析来评估并就酶活性进行评估)。特别就本文所述的编码CMV的质粒和RNA而言，在PCT公开W02008/036424 (2008年3月27日公开)中描述了使用单份表达系统(基于编码CMV扩增子的单一质粒)的早先的著作，所述的文献以引用方式并入本文。备选地，可以使用二份或三份表达系统来编码病毒扩增子，例如CMV扩增子。在二份系统中，在2种不同的质粒上编码了扩增子节段，例如CMVRNA1、RNA2和RNA3，在三份系统中，在3种不同的质粒上编码了所述的阶段(图15和16)。在单、二或三份表达系统中的扩增子节段可以被修饰。例如，扩增子节段可以包括响应于化学诱导剂的启动子序列，其中所述的化学诱导剂例如为雌二醇或甲氧虫酰肼。诸如CMV RNA3片段RNA4之类的扩增子节段在它们与野生型序列相关的前导序列中可以进一步包括额外的限制性酶切位点(图17和35)。诸如CMV RNA3之类的扩增子节段可以通过使用包含异源蛋白质的核酸序列替代编码病毒蛋白质(例如CMV外壳蛋白质)的核酸序列而进一步被修饰。此外，病毒扩增子序列可以编码病毒蛋白质突变体，例如移动蛋白(MP)的突变体。具体而言，CMV3a移动蛋白的删除33个氨基酸的突变体用于帮助扩增子复制和病毒扩增子在烟草本塞姆氏植物中的系统性细胞与细胞间的移动，并使蛋白质表达的产率增加(图22)。使用病毒扩增子基表达系统来制备异源蛋白质的方法总体而言，使用 病毒扩增子基表达系统使异源蛋白质在植物细胞中表达包括以下步骤:i)使植物细胞与包含人工病毒扩增子的细菌细胞(例如根癌土壤杆菌)相接触；ii)允许足够的时间(例如2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13或14天)来在植物细胞中制备异源蛋白质；以及iii)收获所述的蛋白质。根据标准的农杆菌真空渗透法方案(例如加压渗透或真空渗透)，可以将植物细胞与细菌细胞相接触。植物细胞可以选自植物，包括烟草(例如烟草本塞姆氏)、柳枝稷、芒草、向日葵、糖南瓜或南瓜小果。所述的植物细胞可以为得自部分植物细胞培养物的分离的细胞，或者它们可以形成完整植物的一部分或者切除的植物组织，例如植物叶片。本公开描述了使用病毒扩增子基表达系统来增加异源蛋白质的表达的方法。这些方法可以包括抑制异源基因沉默，有利于扩增子复制和细胞与细胞间的移动，植物组织的机械创伤，植物激素处理，以及叶片温育温度的优化(图20-22、25和29-37)。例如，解纤维热酸菌内切葡聚糖酶El与基因沉默抑制子HC-Pix)共表达显示出会显著促进El在烟草本塞姆氏细胞中的表达(图23和24)。为了进行细胞与细胞间的移动以及系统性的蛋白质的表达，CMV需要MP (3a移动蛋白)和CP (衣壳蛋白)，这二者均由RNA3编码。当MP缺乏C-末端的33个氨基酸时，CMV感染甚至可以在不具有CP的情况下在植物中进行细胞与细胞间的移动。因此，异源蛋白质与病毒外壳蛋白质或移动蛋白删除突变体共表达可以通过有利于扩增子的复制、细胞与细胞间的移动、以及异源蛋白质的系统性表达来促进异源蛋白质的表达(图22)。通常，诸如HC-PioXP或MP突变体之类的蛋白质与异源蛋白质共表达可以通过使用包含质粒的细菌细胞对制备异源蛋白质的植物细胞进行农杆菌真空渗透法而取得，其中所述的质粒编码HC-Pio、CP或MP突变体蛋白质。备选地，制备异源蛋白质的植物细胞可以为构成性表达HC-Pio、CP或MP的转基因植物细胞。通过使用刷子在农杆菌真空渗透法之前即刻重复地压制所述的组织来以机械方式创伤烟草本塞姆氏组织显示出内切葡聚糖酶El的表达增加的结果(图29)。其他试验显示使用植物激素在农杆菌真空渗透法之前即刻处理植物或切除的植物组织会增加El的表达(图30)。诸如茉莉酸(JA)、赤霉素A3 (GA)、吲哚乙酸(IAA)、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、激动素(CK)和水杨酸(SA)之类的植物激素可以单独施加，或者至少两种植物激素结合施加(图30-35)。优化叶片温育温度显示出El内切葡聚糖酶的表达增加的结果(图31-32)。可以将温育时期分为土壤杆菌属感染阶段和蛋白质制备阶段，并且可以对这两个阶段分别优化温育温度。土壤杆菌属感染阶段可以为在将土壤杆菌属与叶片相接触之后的1、2、3、4或5天的时期。在土壤杆菌属感染阶段的温育温度可以为15，16，17，18，19，20，21，22，23，24或25°C。蛋白质制备阶段可以为在土壤杆菌属感染阶段之后的1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12或13天的时期。蛋白质制备温度可以为26，27，28，29，30，31，32，33，34或35°C。通常，本文所述的CMV扩增子基表达系统显示出蛋白质产率为大约0.5，1.0, 1.5，
2.0，2.5，3.0，3.5 和 4.0mg El/kg 植物组织鲜重(图 20-21 和 34-35)。如本文所用，术语“大约”是指所述值在可接受范围内的近似值。优选的是，所述的范围为所述值+/-10%。图14-39公开了多种病毒扩增子系统、RNA种类和上文所述的结果。示出El构建体的结果的图显示包含未经修饰的前导序列的El构建体与高的表达水平一致，特别是在三份复制系统中。该结果可 能是由于CMV优选被复制酶络合物识别的其本身的野生型RNA3。此外，包含亚组I复制酶络合物的重组的CMV扩增子得到了比亚组II复制酶络合物更好的El的表达。
实施例下文所述的实施例使用了以下材料和方法:材料和方法植物和照片:烟草(烟草本塞姆氏)种子在堆肥中发芽并在温室中生长。在试验中使用3周大的植物。使用装配有Tiffen Deep Yellow 15滤光镜的Cannon G6数码相机对植物进行拍照。使用手持式长波UV灯来照明植物。植物的感染:对9天大的南瓜小果(Cucurbita pepo L.cv.Green Bush)、小糖南瓜和烟草本塞姆氏的完全发育的子叶进行测试，观察其是否可以系统性地移动。首先，使用研杵在50mM NaH2PO4(pH 7.0)中研磨感染的烟草本塞姆氏叶片，并通过使用金刚砂粉末(Carborandum grit 300,BDH,UK)作为研磨料温和地摩擦子叶的上表面而对植物进行机械接种。农杆菌真空渗透法:使用电穿孔仪(BIO-RAD)将由E.coli培养物纯化得到的二元质粒转化到根癌土壤杆菌菌株GV3101和EHA105中。当使用GV3101时，将转化的细胞平板接种到包含正大霉素(25^/πι1)、卡那霉素(SOyg/ml)和利福平(lOyg/ml)的Luria-Bertani平板中，或者当使用EHA105时，将转化的细胞平板接种到包含利福平(10 μ g/ml),正大霉素(20yg/ml)和四环素(10yg/ml)的Luria-Bertani平板中。就农杆菌真空渗透法而言，将单个菌落接种与5ml L-MESA 10培养基(100ml LB培养液，2ml0.5MMES (pH5.7), 20 μ I 0.1M乙酰丁香酮)中，并生长至0D600为大约L O。通过在3500xg下离心10分钟来收获细胞，并再次悬浮于农杆菌注射培养基(50ml无菌dH20，0.5mllM MgCl2,Iml IM MES (pH5.7)，50 μ I 0.1M乙酰丁香酮)中，将所得物在室温下平衡，以用于超过3hr的预渗透。当混合的土壤杆菌培养物渗透到植物中时，在诱导培养基中单独制备细菌培养物，并在渗透之前即刻结合在一起。包含经修饰的前导序列的表达载体的制备，其中所述的经修饰的前导序列用于CP、E1和GFP基因:用于表达3个CMV基因组RNA(用于复制)的土壤杆菌属基基因传递系统以及所有4个CMV编码的蛋白质被研发。pQA表达载体包含EcoR1-Pst 1-Eco R1-HindIII限制性酶切位点。所述的前导序列通过PCR引物标签而被修饰，从而包括额外的限制性位点，并且所述的表达系统通过Pfu聚合酶扩增产物的平端连接而被插入到微型二元载体PCB301 (Xiang 1999)的Sma I限制性位点中。该表达系统包括RK2复制起点，赋予细菌以卡那霉素抗性的nptIII基因，以及右侧和左侧的T-DNA边界。所有的构建体都是经证实的序列并通过使用特异抗体的免疫印迹在植物中被测定表达了外壳蛋白质。表达克隆子2、6和8都是根据它们优异的蛋白质表达特征来选择的，并且选择野生型前导序列构建体作为对照。包含GFP和El但不包含外壳蛋白质(CP)序列的RNA3表达构建体按照以下方式制备。简言之，使用引物对载体的骨架进行PCR扩增，其中所述的引物被设计用于分别与CPORF正向引物(载体骨架的5’末端)的正向下游序列以及CP ORF反向引物(骨架的3’末端)的正向上游退火。载体骨架和Pfu聚合酶扩增的GFP和El片段通过平端连接而连接。此外，二元表达系 统的亚组I和II RNAl和RNA2构建体通过载体骨架和插入物的平端连接而制备。使用35ST正向和35SP反向引物组来制备载体骨架。接着，将亚组I和II RNAl和RNA2进行pfu聚合酶扩增和连接。所有构建体的序列都被证实。二级结构预测:使用Zuker的网络基程序来预测RNA的二级结构(Zuker 2000)。RNA提取和实时RT-PCR:在渗透后的第5天，由渗透的叶片以及非渗透的叶片收获用于RNA和蛋白质提取的样品。使用RNeasy试剂盒(Qiagen)，根据制造商提供的说明书来提取RNA，并在37°C下使用不含RNase的DNaseI处理20min。在DNaseI钝化后，使用随机六聚体和Superscript II逆转录酶,按照制造商提供的手册所述(Invitrogen),使用总计500ng的RNA进行逆转录。使用7500 ABI程序，使用针对各种RNA的基因特异引物组来进行实时 PCR，并进行分析。25 μ I PCR 包括 5μ I RT 产物，2XSYBR PCR Master Mix (AppliedBiosystems), 400nM基因特异引物。在标准的扩增条件下，在ABI Prism 7500 SequenceDetection系统(Applied Biosystems)中进行实时PCR。对各种基因进行解链曲线分析。使用Tukey-Kramer检验,进行统计学分析,P = 0.05。在95°C下,将反应物在96孔板中温育5min，然后在95°C、15s以及60°C、Imin下进行40个循环。所有的反应都运行3个重复。阈值循环(Ct)被定义为荧光通过固定的阈值时的分级循环数。蛋白质的提取和免疫印迹:通过两次施加30s的珠磨式组织研磨器，将蛋白质由叶片提取到蛋白质提取缓冲液(IOOmM Tris-HCKpH 8.0), IOmM EDTA, 5mM DTT, 150mMNaCl，0.1% Triton X-100，IX蛋白酶抑制剂(Roche))中。在将细胞提取物在12000rpm下离心20min而除去所有的细胞碎片之后,使用Bradford Protein Assay试剂盒(BIO-RAD,USA)以牛血清白蛋白作为标准品测定上清液中蛋白质的浓度。由叶片提取蛋白质，并进行SDS-PAGE分析(12%聚丙烯酰胺凝胶)。将分级的蛋白质转移至硝酸纤维素薄膜(Hybond-C ；Amersham Pharmacia Biotech)上，以 1: 2500 稀释与兔抗-CP 多克隆抗体、然后与山羊抗兔IgG-碱性磷酸酶缀合物(I ；2500)温育。洗涤后，加入紫色底物溶液(BIO-RAD)，并使用蒸馏水使所述的反应猝灭。内切葡聚糖酶的活性测试:内切葡聚糖酶(El)切割甲基伞形酮标记的纤维二糖苷(MUC)，从而释放甲基伞形酮(MU)。可以测量MU荧光来确定El的活性。使用相对荧光读数为0.024至3.0 μ M的MU溶液来建立线性标准曲线。稀释包含El的样品，使得所释放的MU的浓度落入标准曲线内。60 μ I等分的稀释上清液加入到540 μ I乙酸盐缓冲液(200mM乙酸盐，pH 5.5，IOOmM NaCl)和200 μ I底物(500 μ M MUC)中。在时间零点和30分钟之后取样200 μ I反应物，并加入到800 μ I终止缓冲液(150mM甘氨酸，pH 10)。使用VersaFluor荧光计(Bio-Rad)测量一定时间内荧光的变化。荧光被转变为活性，并且文献中所报道的特异活性用于接近毕赤酵母上清液的浓度。实施例1用于在植物体中蛋白质表达的二份和三份黄瓜花叶病毒(CMV)基表达载体本实施例描述了用于在植物中瞬时高产率地制备异源蛋白质的农杆菌真空渗透法基方法。通过使用CMV扩增子基表达系统得到异源蛋白质的表达。该CMV扩增子是通过2个或3质粒编码的，并且包含得自I个或2个病毒亚组的扩增子节段。高效表达GFP、RFP和外壳蛋白质的二份`和三份系统首先，制备二份和三份构建体来在植物中制得CMV基异源蛋白质的表达系统。在二份和三份系统中测定RFP和GFP的表达，从而证实三份系统可以用于在植物中制备多种异源蛋白质。所有这3个基因组节段均包括35S启动子，并且扩增终止子序列，然后使用平端连接而连接到PCB301中，证实所述的序列。对于二份系统而言，将包含RNA3的二元载体与PDU97XLR1R2混合在一起，并使用混合物来渗透烟草本塞姆氏。就GFP的表达而言，使用恰好由ORF的下游起始的正向引物和恰好在ORF之前起始的反向引物由RNA3除去外壳蛋白质区域。使用特异引物扩增GFP序列，并将其与RNA3载体产物连接。就RFP而言，使用相同的克隆方法。使用包含所有3种RNA1、RNA2和RNA3构建体的混合物转染土壤杆菌。在二份表达系统的情况下，在渗透后16小时，使用卷棉子施加雌二醇。渗透后5天，收获渗透的叶片，并提取总蛋白质。在GFP和RFP的情况下，二份和三份系统都良好地工作。如通过使用RFP滤波器组在显微镜下观察到的红色所示，RFP极好地进行在植物体中表达。在UV光下检测GFP表达。三份系统显示出即使不高于二份系统的蛋白质表达，也与其相似。在渗透后5天分析所有的叶片组织。经修饰的RNAl的前导序列会增加外壳蛋白质的表达水平和RNA的水平为了简化扩增子的克隆，将3种CMV扩增子节段RNA1、RNA2和RNA3分离到不同的质粒中，并在外壳蛋白质(即，被其他所关注的基因替代的外壳蛋白质基因)的上游区域和前导序列的下游区域引入多个额外的限制性序列(图24)。然后，制备多个构建体，其包含用于外壳蛋白质表达的RNA4的不同前导序列。图24不出了构建体的多个前导序列，包括野生型前导序列。与野生型前导序列相比，经修饰的序列具有额外的序列，包含有利于将异源基因插入到RNA4亚基因组启动子的下游区域的限制性酶切位点(图24A，斜体和下划线表示)。根据RNAfold计算机程序，经修饰的前导序列仍包含二级茎和环的结构(图24B)。然后，将这些构建体用于农杆菌真空渗透法。在多个不同植物中测定蛋白质的表达，包括烟草(烟草本塞姆氏)、小糖南瓜和美洲南瓜小果。已知南瓜对CMV感染敏感。因为所述的植物富含营养，所以预计会支持高水平的表达。最后，使用渗透的叶片的汁液接种难关子叶，并经常检查CMV感染的症状，例如叶片上的斑点的形成。当使用三份表达系统(包含所有3种扩增子节段RNA1、RNA2和RNA3)时，在接种后的第7天在系统叶片上观察到特征性的症状(图25)。与三份系统相反，包含删除的RNAl的5’ 46bp的二份系统不能在南瓜中进行系统性地移动，或者在南瓜叶片上引起症状斑点的形成。这些结果证明三份系统可以在植物体中复制，并在其宿主中系统性地移动和展开。这些是三分系统超过任何其他系统的重要有优点，包括CMViva单份系统。CMViva单份系统的最大优点在于所有3种RNA成分均由同一质粒编码，并在农杆菌感染后将在同一细胞中定位并表达。但是，CMViva单份系统包含RNAl删除，病毒粒子不能复制并且蛋白质的表达取决于雌二醇的诱导。总之，所公开的三份系统高 效地在植物中表达异源蛋白质，包括CMV外壳蛋白质、GFP和RFP。此夕卜，三份系统在南瓜中会系统性地移动。qPCR和免疫印迹分析证明包含经修饰的前导序列的RNA4构建体表达了比野生型RNA4更高水平的外壳蛋白质。在二份或三份表达系统中，表达概况是相似的。与二份或三份系统相比，包括CMViva和Q123的单份系统在植物体中制备了稍高的外壳蛋白质。为了确定前导序列对RNA水平的影响，实施实时RT-PCR来定量渗透植物中RNA的水平。使用对于健康对照的相对Ct值，相对野生型RNA4前导序列构建体来评估RNA1、RNA2、RNA3以及包括RNA4的RNA3的水平。在二份系统中，发现包含经修饰的前导序列的构建体与相应的野生型构建体相比，RNA3和RNA4的水平更高，因此解释了较高的蛋白质表达。有趣的是，就RNAl和RNA2表达的相对水平而言，与其中缺乏RNA3的试验相比，包含所有3种成分RNA1、RNA2和RNA3的试验都产生了较高的RNA水平。这种趋势在三份系统中是特别明显的。不管是使用突变体还是使用野生型前导序列，RNA3的表达水平均高于RNAl或RNA2的表达水平。在三份系统中，与由包含经修饰的前导序列的RNA构建体所产生的外壳蛋白质RNA水平相比，包含所有3种RNA的野生型构建体均产生了较高的外壳蛋白质RNA水平。该结果由蛋白质的表达水平所反映。为了估测除了外壳蛋白质以外的蛋白质的表达情况，制备GFP克隆子，其包含与之前外壳蛋白质表达所用的相同的前导序列。使用与之前所述的相同的方法，使用GFP构建体渗透植物，并在渗透后的第6天和第10天在UV光下检测荧光。通过经修饰的前导序列驱动的GFP的表达产生了比野生型前导构建体稍高的荧光强度。相比之下，三份系统表达了与二份系统相似或者甚至稍高水平的GFP。使用二份和三份表达系统的在植物体中内切葡聚糖酶(El)的表达接着，使用所述的蛋白质表达系统来制备内切葡聚糖酶E1，其为纤维素降解酶。所选择的特定的内切葡聚糖酶是由嗜热细菌解纤维热酸菌天然制备的。该细菌在例如黄石国家公园的热泉中发现。所述细菌的酶在高温和低PH下活性最高。成熟的蛋白质包含521个氨基酸，分子量为56.5，并且等电点为5.5。最初的359个氨基酸形成了催化结构域。存在大约57个氨基酸的连接体区域，其将催化结构域与碳水化合物结合结构域连接，并且其本身跨越了 C-末端105个氨基酸。由于内切葡聚糖酶通过其碳水化合物结构域附着在植物组织上，所以在蛋白质提取和纯化过程中所述的酶不能由细胞碎片完全回收。El内切葡聚糖酶在二份和三份蛋白质表达系统中表达。在这两种情况下，使用沉默抑制子HC-Pro共渗透二份和三份表达构建体。通常，在二份和三份表达系统中，El构建体的经修饰的前导序列在酶活性方面增加了产率(图20-21)。增强CMVva的复制能力CMV具有极广泛的宿主范围；它感染超过1000种植物，并且CMV分离物已经由全世界回收得到。将CMV毒株分为两个亚组I和II。之前所述的CMV表达系统是基于亚组II毒株。亚组I毒株更普通，并且通常显示出比亚组II毒株更严重的症状，可能是由于病毒复制的水平更高。此外，与亚组II相比，亚组I毒株编码了更强版本的2b沉默抑制子蛋白质。由于这种特点，研发了亚组I CMVva三份系统。首先，测定亚组I RNAl和RNA2是否有利于之前研发的亚组II RNA3的表达。估测GFP的表达情况，并使用亚组I与亚组II复制酶成分观察到GFP的表达高很多。然后，测定内切葡聚糖酶的表达情况，并发现与亚组II复制酶系统相比，亚组I复制酶使得蛋白质的表达高很多。病毒二份和三份扩增子系统(使用了重新排布的亚组I和II节段)的示例性结果示于图20和21中。在典型的试验中，与编码亚组II复制酶的病毒扩增子系统相比，编码亚组I复制酶的重新排布的病毒扩增子系统产生了更高的蛋白质表达和酶活性水平。具有细胞与细胞间的移动能力的CMVva
就细胞与细胞间的移动而言，CMV需要MP (3a移动蛋白)和CP (衣壳蛋白)，它们二者均由RNA3编码。当MP缺少C-末端的33个氨基酸时，CMV感染甚至可以在不具有CP的条件下在植物中进行细胞与细胞间的移动。之前所述的CMVa表达系统缺乏细胞与细胞间的移动(这是由于CP基因被所关注的产物基因取代)，因此所需的蛋白质仅在初始感染的细胞中表达。为了重建细胞与细胞间的移动能力，生成删除33aa的MP突变体，该突变体仍通过CP编码区域表达内切葡聚糖酶。当使用三份CMVva表达系统渗透这些构建体时，得到了较高水平表达的内切葡聚糖酶，这可通过免疫印迹和酶活性测试确定。接着，针对删除33个氨基酸的MP突变体会促进在在植物体中蛋白质表达中产率额外增加的能力来测定该突变体。在亚组I复制酶存在下进行表达时，包含野生型前导序列的GFP构建体在UV光下会制备强的荧光信号。当与MP删除突变体结合时，与野生型MP结合的情况相比，包含经修饰的前导序列的构建体#6在亚组I复制酶的存在下会产生水平高很多的GFP的表达。此外，使用亚组I复制酶和MP删除突变体还会强烈地增加植物中El的表达，这可通过酶活性测量确定。当将亚组I复制酶络合物26与删除33个氨基酸的MP突变体结合使用时，在植物体中取得了最高的El活性水平。发现当野生型MP与亚组I复制酶结合使用时，其不会良好地表达。相反，发现MP删除突变体与亚组I或II复制酶相结合会良好地表达。综上，本实施例证明了 CMV扩增子基蛋白质表达系统可以高效地制备多种异源蛋白质，包括解纤维热酸菌内切葡聚糖酶El。CMV扩增子可以分为二份或三份表达系统，其中CMV扩增子节段RNA1、RNA2和RNA3分布在2个或3个不同的质粒上。CMV亚组I节段RNAl和RNA2与CMV亚组节段RNA3使得蛋白质表达的产率增加。在一些情况下，RNA4前导序列的优化使得蛋白质和RNA的表达水平得到改善。重要的是，CMV3a移动蛋白删除突变体的表达有利于复制、CMV扩增子的细胞与细胞间的移动以及异源蛋白质(例如GFP或El)的系统性表达。显示CMV扩增子基的表达系统会使异源蛋白质的产率为至多大约4mg蛋白质/kg植物组织鲜重。实施例2内切葡聚糖酶(El)蛋白质在毕赤酵母(Pichia pastoris)用作标准品的制备和表征本实施例证明毕赤酵母制备的El可以用作用于估测植物制备的El的特异活性和产率的标准品。确定经纯化的内切葡聚糖酶的Michaelis-Menten动力学参数。在毕赤酵母中制备E1，并通过IMAC (固定化金属亲和层析)纯化。针对图26所示的特异反应确定参数。El将底物(MUC)切割成纤维二糖和荧光团(MU)，可以在一定时间内监测其浓度。当在65°C和135 μ M底物下运行时，这为用于在植物提取物和酵母培养物中针对El进行活性测试的反应。在这组试验中，改变底物的浓度来确定在不同温度下的动力学参数。用于展示Michaelis-Menten动力学的反应的速率示于等式I中。速率取决于催化速率(kcat)，酶的总浓度(ET)，归并为Michaelis-Menten常数的吸附/解吸附速率(Km)以及底物浓度(S)。在高底物浓度下(S > > Km)，所述的速率接近最大，并且kcatET通常写为Vmax。
权利要求
1.一种能够表达异源蛋白质的植物细胞，该植物细胞包含: 病毒扩增子，其中所述的扩增子包含多个扩增子节段，该扩增子能够扩增编码所述的异源蛋白质的核酸序列的转录，所述的扩增子包含: 1.包含至少一个扩增子节段的第一质粒，其中所述的至少一个节段包含编码所述的异源蛋白质的核酸序列；以及 .包含至少一个扩增子节段的第二质粒； 其中所述的第一质粒不同于所述的第二质粒。
2.权利要求1所述的细胞，其中所述的扩增子包含第三质粒，所述的质粒包含至少一个扩增子节段，其中所述的第三质粒不同于所述的第一质粒和所述的第二质粒。
3.权利要求1所述的细胞，其中所述的第一质粒包含至少一个不被所述的第二质粒所包含的扩增子节段。
4.权利要求1所述的细胞，其中所述的第二质粒包含至少一个不被所述的第二质粒所包含的扩增子节段。
5.权利要求1所述的细胞，其中所述的第一质粒包含卡那霉素选择标志物基因，并且所述的第二质粒不包含所述的卡那霉素选择标志物基因。
6.权利要求1所述的细胞，其中所述的病毒扩增子为黄瓜花叶病毒组扩增子。
7.权利要求6所述的细胞，其中所述的黄瓜花叶病毒组扩增子为CMV扩增子。
8.权利要求1所述的细胞 ，其中所述的第一质粒的至少一个扩增子节段为CMVRNA3。
9.权利要求8所述的细胞，其中所述的CMVRNA3包含片段RNA4，其中所述的RNA4包含经修饰的5’ -前导序列，与野生型RNA4 5’ -前导序列相比，所述的经修饰的5’ -前导序列具有更多的限制性酶切位点。
10.权利要求8所述的细胞，其中所述的第二质粒的至少一个扩增子节段为CMVRNAI,并且所述的第三质粒的至少一个扩增子节段为CMVRNA2。
11.权利要求1所述的细胞，其中所述的第二质粒的至少一个扩增子节段为2个扩增子节段。
12.权利要求11所述的细胞，其中所述的2个扩增子节段为CMVRNAl和CMV RNA2。
13.权利要求1所述的细胞， 其中所述的第一质粒的所述的至少一个扩增子节段得自第一个病毒亚组；以及 其中所述的第二质粒的所述的至少一个扩增子节段得自第二个病毒亚组。
14.权利要求1所述的细胞， 其中在所述的第二质粒上的至少一个扩增子节段包含响应于化学诱导剂的启动子序列；以及 其中所述的启动子序列与编码病毒蛋白质的核酸序列可操作地连接。
15.权利要求14所述的细胞，其中所述的化学诱导剂为雌二醇或甲氧虫酰肼。
16.权利要求14所述的细胞，其中所述的病毒蛋白质为复制酶或复制酶亚单元。
17.权利要求1所述的细胞，其中编码所述的异源蛋白质的核酸序列经密码子优化。
18.权利要求1所述的细胞，其中所述的异源蛋白质为分泌蛋白质。
19.权利要求1所述的细胞，其中所述的异源蛋白质为GFP或RFP。
20.权利要求1所述的细胞，其中所述的异源蛋白质为能够修饰、降解或分解植物细胞壁的酶。
21.权利要求20所述的细胞，其中所述的酶在>30°C的温度下具有最佳的活性。
22.权利要求20所述的细胞，其中所述的酶为纤维素酶。
23.权利要求22所述的细胞，其中所述的纤维素酶为内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β -葡糖苷酶或木聚糖酶。
24.权利要求23所述的细胞，其中所述的内切葡聚糖酶为得自解纤维热酸菌的ΕΙβ-1,4-内切葡聚糖酶。
25.权利要求23所述的细胞，其中所述的木聚糖酶得自解纤维热酸菌。
26.权利要求1所述的细胞，其中所述的扩增子节段包含编码所述的异源蛋白质的核酸序列，所述的扩增子节段进一步包含与编码所述的异源蛋白质的核酸序列可操作地连接的CaM 35S启动子。
27.权利要求1所述的细胞，进一步包含编码基因沉默抑制子的cDNA。
28.权利要求27所述的细胞，其中所述的基因沉默抑制子为Hc-Ρι 。
29.权利要求1所述的细胞，进一步包含编码病毒外壳蛋白质的cDNA。
30.权利要求1所述的细胞，进一步包含编码突变体形式的所述的CMV3a移动蛋白的cDNA。
31.权利要求 30所述的细胞，其中所述的突变体形式的所述的CMV3a移动蛋白包含C-末端33个氨基酸的删除。
32.权利要求1所述的细胞，其中所述的第一质粒和所述的第二质粒为T-DNA质粒。
33.一种能够表达异源蛋白质的植物细胞，该植物细胞包含: 病毒扩增子，其中所述的扩增子包含多个扩增子节段，该扩增子能够扩增编码所述的异源蛋白质的核酸序列的转录，所述的扩增子包含: 1.得自第一病毒亚组的第一扩增子节段；以及 .得自第二病毒亚组的第二扩增子节段； 其中所述的第一或第二扩增子节段包含编码所述的异源蛋白质的核酸序列。
34.权利要求33所述的细胞，其中所述的病毒扩增子进一步包含第三扩增子节段，其中所述的第三扩增子节段得自所述的第一或第二病毒亚组。
35.权利要求33所述的细胞，其中所述的病毒扩增子在单一质粒上编码。
36.权利要求33所述的细胞，其中所述的病毒扩增子由两种质粒编码，其中所述的第一质粒包含得自第一病毒亚组的两个扩增子节段，并且所述的第二质粒包含得自第二病毒亚组的一个扩增子节段。
37.权利要求33所述的细胞，其中所述的病毒扩增子由三种质粒编码，其中所述的第一质粒包含得自第一病毒亚组的一个扩增子节段，并且所述的第二和第三质粒均包含得自第二病毒亚组的一个扩增子节段。
38.权利要求33所述的细胞，其中所述的病毒扩增子为黄瓜花叶病毒组扩增子。
39.权利要求38所述的细胞，其中所述的病毒扩增子为CMV扩增子。
40.权利要求33所述的细胞，其中所述的第一扩增子节段为得自CMV亚组II的RNA3。
41.权利要求40所述的细胞，其中RNA3包含片段RNA4，其中所述的RNA4包含经修饰的5’ -前导序列，与野生型RNA4 5’ -前导序列相比，所述的经修饰的5’ -前导序列具有更多的限制性酶切位点。
42.权利要求33所述的细胞，其中所述的第二扩增子节段为得自CMV亚组I的RNAl或RNA2。
43.权利要求42所述的细胞，其中所述的CMV亚组I为California亚组I。
44.权利要求33所述的细胞，其中编码所述的异源蛋白质的核酸序列经密码子优化。
45.权利要求33所述的细胞，其中所述的异源蛋白质为分泌蛋白质。
46.权利要求33所述的细胞，其中所述的异源蛋白质为GFP或RFP。
47.权利要求33所述的细胞，其中所述的异源蛋白质为能够修饰、降解或分解植物细胞壁的酶。
48.权利要求47所述的细胞，其中所述的酶在>30°C的温度下具有最佳的活性。
49.权利要求47所述的细胞，其中所述的酶为纤维素酶。
50.权利要求49所述的细胞，其中所述的纤维素酶为内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β -葡糖苷酶或木聚糖酶。
51.权利要求50所述的细胞，其中所述的内切葡聚糖酶为得自解纤维热酸菌的ΕΙβ-1,4-内切葡聚糖酶。
52.权利要求50所述的细胞，其中所述的木聚糖酶得自解纤维热酸菌。
53.权利要求33所述的细胞，其中所述的扩增子节段包含编码所述的异源蛋白质的核酸序列，所述的扩增子节段进一步包含与编码所述的异源蛋白质的核酸序列可操作地连接的CaM 35S启动子。
54.权利要求33所述的细胞，进一步包含编码基因沉默抑制子的cDNA。
55.权利要求54所述的细胞，其中所述的基因沉默抑制子为Hc-Pro。
56.权利要求33所述的细胞，进一步包含编码突变体形式的所述的CMV3a移动蛋白的cDNA。
57.权利要求56所述的细胞，其中所述的突变体形式的所述的CMV3a移动蛋白包含C-末端33个氨基酸的删除。
58.权利要求33所述的细胞，其中所述的病毒扩增子能够在植物体中复制并系统性地移动。
59.权利要求33所述的细胞， 其中至少一个扩增子节段包含响应于化学诱导剂的启动子序列；以及 其中所述的启动子序列与编码病毒蛋白质的核酸序列可操作地连接。
60.权利要求59所述的细胞，其中所述的化学诱导剂为雌二醇或甲氧虫酰肼。
61.权利要求59所述的细胞，其中所述的病毒蛋白质为复制酶或复制酶亚单元。
62.一种用于制备异源蛋白质的方法，该方法包括: 1.将植物细胞、植物或切除的植物组织与细菌细胞相接触，所述的细菌细胞包含: 完整的病毒扩增子，其中所述的扩增子包含多个扩增子节段，该扩增子节段能够扩增编码所述的异源蛋白质的核酸序列的转录； .允许足够的时间，从而在所述的植物细胞中制备所述的异源蛋白质；以及 ii1.收获至少2.0mg异源蛋白质/kg鲜重的所述的植物细胞、植物或切除的植物组织。
63.权利要求62所述的方法，其中所述的至少2.0mg异源蛋白质/kg鲜重的所述的植物细胞、植物或切除的植物组织为至少3.0mg异源蛋白质/kg鲜重的所述的植物细胞、植物或切除的植物组织。
64.权利要求62所述的方法，其中所述的至少2.0mg异源蛋白质/kg鲜重的所述的植物细胞、植物或切除的植物组织为至少4.0mg异源蛋白质/kg鲜重的所述的植物细胞、植物或切除的植物组织。
65.一种用于制备异源蛋白质的方法，该方法包括: 1.将植物细胞与至少一种植物激素相接触； .将所述的植物细胞与细菌细胞相接触，所述的细菌细胞包含: 完整的病毒扩增子，其中所述的扩增子包含多个扩增子节段，该扩增子能够扩增编码所述的异源蛋白质的核酸序列的转录； ii1.允许足够的时间，从而在所述的植物细胞中制备所述的异源蛋白质；以及 iv.收获由所述的植物细胞制备的所述的异源蛋白质。
66.权利要求65所述的方法，其中所述的至少一种植物激素为至少两种植物激素。
67.权利要求65所述的方法，其中所述的至少一种植物激素选自茉莉酸、赤霉素A3、吲哚乙酸、2，4-二氯苯氧乙酸、激动素和水杨酸。
68.权利要求65所述的方法，其中与野生型植物细胞相比，所述的植物细胞为表达高水平基因沉默抑制子的转基因植物细胞。
69.权利要求65 所述的方法，进一步包含将所述的植物细胞与第二细菌细胞相接触，其中所述的第二细菌细胞包含编码基因沉默抑制子的重组核酸序列。
70.权利要求65所述的方法，其中所述的植物细胞包含基因组DNA，并且所述的病毒扩增子在所述的植物基因组DNA中稳定地整合。
71.权利要求65所述的方法，其中所述的异源蛋白质在所述的植物细胞中瞬时制备。
72.权利要求65所述的方法，其中所述的植物细胞由植物、切除的植物组织或植物细胞培养物所包含。
73.权利要求65所述的方法，进一步包含通过离质体洗涤而除去所述的植物或切除的植物组织离质体的可溶性成分。
74.权利要求65所述的方法，其中所述的植物细胞为烟草、柳枝稷、芒草、向日葵、糖南瓜或南瓜小果的植物细胞。
75.权利要求65所述的方法，其中所述的烟草植物细胞为烟草本塞姆氏细胞。
76.一种用于制备异源蛋白质的方法，该方法包括: 1.机械创伤植物或切除的植物组织； .将所述的植物或切除的植物组织与细菌细胞相接触，所述的细菌细胞包含: 完整的病毒扩增子，其中所述的扩增子包含多个扩增子节段，该扩增子能够扩增编码所述的异源蛋白质的核酸序列的转录； ii1.允许足够的时间，从而在所述的植物细胞中制备所述的异源蛋白质；以及 iv.收获由所述的植物细胞制备的所述的异源蛋白质。
77.权利要求76所述的方法，其中机械创伤所述的植物或切除的植物组织包含使用刷子压制所述的植物或切除的植物组织。
78.权利要求76所述的方法，其中所述的植物或切除的植物组织为转基因植物或切除的植物组织，与野生型植物或切除的植物组织相比，所述的转基因植物或切除的植物组织表达高水平的基因沉默抑制子。
79.权利要求76所述的方法，其中所述的异源蛋白质在所述的植物细胞中瞬时制备。
80.权利要求65或76所述的方法，其中步骤ii)是通过加压渗透或真空渗透实施的。
81.权利要求76所述的方法，其中所述的植物细胞形成植物、切除的植物组织或植物细胞培养物的一部分。
82.权利要求76所述的方法，进一步包括通过离质体洗涤来除去所述的植物或切除的植物组织离质体的可溶性成分。
83.权利要求76所述的方法，其中所述的植物细胞为烟草、柳枝稷、芒草、向日葵、糖南瓜或南瓜小果的植物细胞。
84.权利要求76所述的方法，其中所述的烟草植物细胞为烟草本塞姆氏细胞。
85.权利要求76所述的方法，进一步包括将所述的植物或切除的植物组织与第二种细菌细胞相接触，其中所述的第二种细菌细胞包含编码基因沉默抑制子的重组核酸序列。
86.权利要求69或85所述的方法，其中所述的基因沉默抑制子为HC-Pix)。
87.权利要求69或85所述的方法，其中所述的基因沉默抑制子衍生自番茄茂密矮小病毒或烟草蚀刻病毒。
88.权利要求77所述的方法，进一步包括将所述的植物或切除的植物组织与第二细菌细胞相接触，其中所述的第二细菌细胞包含编码病毒外壳蛋白质的重组核酸序列。
89.权利要求88所述的方法，其中所述的病毒外壳蛋白质为CMV外壳蛋白质。
90.权利要求65或76所述的方法，其中所述的病毒扩增子包含单一质粒。
91.权利要求65或76所述的方法，其中所述的病毒扩增子包含: 包含至少一个扩增子节段的第一质粒，其中所述的至少一个节段包含编码所述的异源蛋白质的核酸序列；以及 包含至少一个扩增子节段的第二质粒； 其中所述的第一质粒不同于所述的第二质粒。
92.权利要求65或76所述的方法，其中所述的病毒扩增子包含3种质粒。
93.权利要求65或76所述的方法，其中所述的病毒扩增子包含: 得自第一病毒亚组的第一扩增子节段；以及 得自第二病毒亚组的第二扩增子节段， 其中所述的第一或第二扩增子节段包含编码所述的异源蛋白质的核酸序列。
94.权利要求65或76所述的方法，进一步包括将所述的植物细胞与化学诱导剂相接触。
95.权利要求94所述的方法，其中所述的化学诱导剂为雌二醇或甲氧虫酰肼。
96.权利要求65或76所述的方法，其中所述的异源蛋白质为能够修饰、降解或分解植物细胞壁的酶。
97.权利要求65或76所述的方法，进一步包括原位活化的所述的异源蛋白质，由此蛋白质活化使得植物细胞壁被降解。
98.权利要求65或76所述的方法，其中所述的第一和第二细菌细胞为根癌土壤杆菌细胞。
99.权利要求65或76所述的方法，其中所述的植物细胞包含基因组DNA，并且所述的病毒扩增子在所述的植物基因组DNA中稳定地整合。
100.权利要求65或76所述的方法，其中4天为在所述的植物细胞中制备所述的异源蛋白质的足够的时间。
101.权利要求65或76所述的方法，其中6天为在所述的植物细胞中制备所述的异源蛋白质的足够的时间。
102.一种用于制备异源蛋白质的方法，该方法包括: .1.将所述的植物细胞与细菌细胞在第一温度下相接处， 其中所述的细菌细胞包含完整的病毒扩增子， 所述的扩增子包含多个扩增子节段，该扩增子能够扩增编码所述的异源蛋白质的核酸序列的转录； .在第二温度下将所述的植物细胞温育足够的时间，从而在所述的植物细胞中制备所述的异源蛋白质；以及 ii1.收获由所述的植物细胞制备的所述的异源蛋白质。
103.权利要求102所述的方法， 其中所述的第一温度为20°C，并且所述的第二温度为.26°C或 30°C。
104.一种能够表达木聚糖酶的植物细胞，该植物细胞包含: .1.编码由解纤维热酸菌得到的木聚糖酶的密码子优化的核酸序列， .与所述的优化的核酸序列可操作地连接的CaM 35S启动子，以及 ii1.编码所述的基因沉默抑制子Hc-Pio的核酸序列。
全文摘要
本文描述了病毒扩增子基蛋白质表达系统以及通过农杆菌真空渗透法来制备异源蛋白质的方法，其中所述的异源蛋白质例如为酶。所述的方法涉及使用编码异源蛋白质的Ti质粒来制备土壤杆菌属，使用该土壤杆菌属来感染植物细胞，允许异源蛋白质表达，以及由植物细胞回收异源蛋白质。在一个实施方案中，所制备的蛋白质为内切葡聚糖酶。
文档编号C12N15/82GK103180447SQ201180041076
公开日2013年6月26日 申请日期2011年7月19日 优先权日2010年7月19日
发明者M·黄, B·E·林登穆斯, K·A·麦克唐纳, A·M·丹德卡尔, B·W·福克, S-k·郑, N·J·金斯伯里 申请人:加州大学评议会
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