全细胞生物催化剂的制作方法
专利名称：全细胞生物催化剂的制作方法
全细胞生物催化剂本发明涉及包含以下的核酸分子:(I)编码信号肽的区段、(2)包含异源氧化还原因子再生多肽或其变体的区段、(3)任选的编码蛋白酶识别位点的区段、(4)编码跨膜接头的区段、和(5)编码自主转运蛋白(autotransporter)或其变体的转运蛋白结构域的区段。所有已知酶的大约四分之一是氧化还原酶。对这一组酶已经开发了宽范围的应用，包括手性化合物诸如醇类、醛类和氨基酸的合成，聚合物的产生和改性，用于最为多样的应用的生物传感器的产生，和有害物质的降解。氧化还原酶的特征在于，它们不仅包括至少一条多肽链，而且包括一个或多个氧化还原反应性基团，其可以是一个或多个氧化还原反应性氨基酸侧链或辅基。氧化还原酶的底物包括代谢产物和氧化还原因子。不同于酶的辅基，这些氧化还原因子底物不作为催化剂起作用，而是以化学计量的量参与反应，并与其他底物一起进入化学反应。由于氧化还原因子通常比其他有机底物昂贵得多的事实，使用氧化还原酶的工业合成的可行性受到限制，由于需要提供合适的还原因子或氧化因子。为了解决这一问题，科学家们已经建议使用氧化还原因子再生酶。例如，已经提出使用甲酸脱氢酶(FDH)和NADH氧化酶或使用葡萄糖脱氢酶(GDH)来再生NADH或NADPH。将这样的酶固定在合适的载体上用于多个催化循环应当是可能的，以避免不得不重复地纯化大量的多肽。不幸地，氧化还原因 子再生酶通常是不稳定的，尤其是当处于固定化酶的形式时。Sanjust等(1997)将来自水生栖热菌(Thermus aquaticus)的NADH氧化酶固定在多种载体上，并比较了可溶性和固定化酶的动力学特性。发现，固定化酶具有比可溶性酶低的热稳定性。Hmnmel和Riebel (2003)描述了使用来自短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)的可溶性、纯化的NADH氧化酶用于再生NADH氧化酶。他们证明，该酶具有朝向快速氧化失活的趋势，很可能是因为蛋白催化中心中存在对氧化敏感的半胱氨酸残基。因此，还原剂(ImM DTT或巯基乙醇)的使用被描述为对于维持该酶的催化能力是重要的。Ahmed和 Claiborne (1992)从粪链球菌(Streptococcus faecalis) 10C1 纯化了含 FAD 的 NADH氧化酶并教导，2mM DTT的存在对于稳定全氧化酶(holo_oxidase)是必需的。El-Zahab等(2004)描述，并由Lee和Ping (2007)证实，将氧化还原因子再生酶例如葡萄糖脱氢酶(GDH)固定在固态载体上，狭义地固定在纳米孔石英玻璃上。然而，他们没有描述所述酶如何能够被稳定。因此本发明的目的是提供具有氧化还原因子再生活性的剂，其中活性的来源不仅对于底物分子是容易接近的，而且可被容易地扩增、回收和再生，使得多个催化步骤是可能的，而不需要重复地产生新鲜的剂。本发明的另一目的是提供一种剂，其本身或在存在可能失活性的化学物诸如抑制性金属离子时或在酸性或碱性PH，具有氧化还原因子再生活性和在动力学、热稳定性、储存能力和稳定性方面比对应的酶的原始形式更佳的特性。本发明的特殊目的是提供一种剂，其在存在氧或氧释放剂时或在氧化条件下表现稳定的氧化还原因子再生活性，其稳定性比对应的酶的原始形式更佳。本发明人令人惊讶地发现，使用自主转运蛋白系统，能够在全细胞的表面上表达氧化还原因子再生酶，且这些酶自身在存在氧和不同温度和条件时是令人惊讶地稳定的。而且，本发明人令人惊讶地发现，能够在多种条件中在多种溶液和缓冲液中培养氧化还原因子再生酶并在相当长的时间保持稳定。自主展示(autodisplay)是在细菌表面上呈递重组蛋白的精细工具。这一表达系统是基于属于V型分泌系统的自主转运蛋白的蛋白家族的分泌机制。在革兰氏阴性细菌中，自主转运蛋白途径由向细胞表面转运蛋白和向细胞外空间分泌蛋白二者形成(Jose和Meyer，2007)。自主转运蛋白作为前体蛋白被合成，其满足向细胞表面转运的所有结构要求(JoSe，2006)。它们被合成为带有N末端信号肽，这是Sec途径典型的，这使得跨过内膜成为可能。一旦在周质之内，截短信号肽之后，前体的C末端部分折叠进入外膜作为孔蛋白样结构，即所谓的￠-桶。经过这个孔，N末端结合的载客结构域(passenger domain)移位到表面(Jose等,2002)。在那里其可以被切割_通过自动蛋白水解或另外的蛋白酶-或能够经由转运蛋白结构域保持锚定在胞外被膜(cell envelope)上。用重组蛋白代替天然的载客导致重组蛋白的表面移位(surface translocation)。为此，必须使用遗传工程技术构建由信号肽、重组载客、￠-桶和其间的接头区域组成的非天然的前体，接头区域是不受限制地接近表面所需的。以这种方式，AIDA-1自主转运蛋白已经成功地被用于多种载客结构域的有效表面展示(Henderson等,2004)。利用自主展示系统，已经观察到活性酶上亚基的自缔合，例如对于二聚酶山梨糖醇脱氢酶(JoSe，2002 Jose和von Schwichow,2004) 具体地，自主展示技术是在大肠杆菌(E.coli)和其他革兰氏阴性细菌的外膜表面上表达某些蛋白的方法，其中自主展示系统基于自主转运蛋白的天然分泌机制(A.Banerjee等(2002))。重组载客蛋白的转运可简单地通过使用常规遗传工程技术在读码框中在自主展示载体的信号肽与移位结构域之间插入其编码序列来进行。信号肽可以从霍乱毒素的亚基获得，且其可以与非天然启动子联合。从而，将要经历跨外膜的移位的载客蛋白作为与另一蛋白的重组融合蛋白，称为自主转运蛋白，被表达在大肠杆菌的外膜上(AIDA-1)(J0Se，2006)。自主转运蛋白的C末端部分在大肠杆菌的外膜中形成孔蛋白样结构(￠-桶)。这种孔蛋白样结构使得重组载客蛋白能够被移位到大肠杆菌的外膜表面(Jose,1995，2006，2007)。固定氧化还原辅因子再生多肽的概念追溯到1974年，当时Sarborsky和Ogletree描述了经由活化其碳水化合物残基来固定葡萄糖氧化酶。自主展示系统的概念由Jose等(1995)首次描述，也已经被公知超过15年。尽管如此，就我们所知，使用自主转运蛋白系统来固定氧化还原因子再生酶没有被现有技术教导或提出。本发明的目的通过独立权利要求的目的来解决。优选的实施方案可见于从属权利要求。根据第一方面，本发明的目的如下解决，其还是第一方面的第一实施方案:一种核酸分子，包含(I)编码信号肽的区段、(2)包含异源氧化还原因子再生多肽或其变体的区段、(3)任选的编码蛋白 酶识别位点的区段、(4)编码跨膜接头的区段、和(5)编码自主转运蛋白或其变体的转运蛋白结构域的区段。在本发明优选的实施方案中，核酸分子被有功能地连接于表达调节序列。在优选的实施方案中，本文使用的术语“表达调节序列”是指能够调节核酸分子的表达水平的核酸序列，核酸分子优选地在表达调节序列下游。表达调节序列可以是例如启动子。本领域技术人员熟悉适于调节表达的序列和用于有功能地将这些序列与核酸分子连接的方法。在本发明优选的实施方案中，核酸分子是重组质粒的部分。在优选的实施方案中，核酸分子包括SEQ ID NO:1或其变体。在本发明优选的实施方案中，本文使用的术语“异源的”是指使用遗传工程技术，例如通过将表达调节序列和通常不处于这一表达调节序列控制下的待表达序列连接在一起，或通过使用具有相对于原始序列的点突变的序列而构建的核酸。即使构建体的仅一个区段被称为异源的，这因而暗示整个构建体是异源的。本领域技术人员熟悉遗传工程技术。在另一优选的实施方案中，本文使用的术语“异源的”是指连接于表达调节序列的编码多肽的核酸，和/或与表达调节序列来源于不同的生物体且待表达的融合的序列。在另一优选的实施方案中，本文与氧化还原因子再生多肽关联使用的术语“异源的”表示，编码该氧化还原因子再生多肽的核酸区段与至少一个其他区段从不同的生物体获得或取得，至少一个其他区段诸如转运蛋白结构域或表达调节序列或跨膜接头。例如，如果氧化还原因子再生多肽从短乳杆菌获得，而所有其他序列从大肠杆菌获得，则氧化还原因子再生多肽是异源的。在另一优选的实施方案中，本文使用的术语“异源的”表示，称为异源的核酸序列来源于不同于用于表达或扩增这一核酸序列的宿主或预期宿主的生物体。在本发明优选的实施方案中，本文使用的术语“信号肽”是指具有如果多肽被表达在宿主细胞的细胞质中，将其移位到细胞的特定区室、优选地不同于细胞质的区室的作用的氨基酸序列，信号肽优选地在多肽的N末端。在尤其优选的实施方案中，宿主细胞是革兰氏阴性细菌细胞，且信号肽具有将正在形成或完成的多肽移位到革兰氏阴性细菌细胞的周质或外膜中的作用。在本发明优选的实施方案中，本文使用的术语“蛋白酶识别位点”是指多肽中的特定氨基酸序列基序，其中这一序列基序以蛋白酶结合并裂解多肽这样一种方式被所述蛋白酶特异性地识别。在本发明优选的实施方案中，本文使用的术语“跨膜接头”是指用作连接自主转运蛋白结构域与氧化还原因子再生多肽但足够地柔性以允许该氧化还原因子再生多肽的独立折叠和/或转运的柔性多肽区段。在本发明优选的实施方案中，术语“自主转运蛋白的转运蛋白结构域”是指如果核酸分子表达产物在细胞内的核糖体被合成，优选地在细菌胞质中被合成，并被向细胞外膜移位，优选地向外膜的被暴露于细胞周围环境的一侧移位的话，可用于获得核酸分子表达产物的结构域。在尤其优选的实施方案中，转运蛋白结构域具有将所述表达产物定位于外膜的外表面的作用。在本发明优选的实施方案中，自主转运蛋白的转运蛋白结构域是位于细胞外膜上的蛋白，且编码NADH氧化酶的区段是转运蛋白结构域的结构域、环或某一其他部分的一部分或与其融合，从而NADH氧化酶被展示在细胞表面上。在本发明另一优选的实施方案中，自主转运蛋白的转运蛋白结构域是可用于在细胞表面上展示多肽的系统的蛋白。在尤其优选的实施方案中，转运蛋白结构域是革兰氏阴性细菌细胞的AIDA-1型的自主展示系统、还称为自主转运蛋白途径的转运蛋白结构域。在优选的实施方案中，氨基酸或核酸序列的变体例如通过名称或保藏号或甚至通过术语“的变体”在本申请中被明确地提到，或例如通过功能描述在本发明的上下文中被隐含地提到。在优选的实施方案中，本文 使用的术语“变体”包括与用作参考的氨基酸60%、70%、75%、80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%或 99%相同的氨基酸或核
酸序列。在优选的实施方案中，术语“变体”包括，就氨基酸序列而言，具有相对于参考序列的一个保守氨基酸置换或多个保守氨基酸置换的那些氨基酸序列。在优选的实施方案中，术语氨基酸序列或核酸序列的“变体”包括氨基酸序列或核酸序列的活性区段和/或片段。在优选的实施方案中，本文使用的术语“活性区段”是指比全长的氨基酸或核酸序列短，但仍然具有其必需生物活性、例如作为NADH氧化酶的生物活性的至少一部分的氨基酸序列或核酸序列。在优选的实施方案中，术语核酸的“变体”包括互补链的核酸，其-优选地在严格条件下-与参考核酸杂交。杂交反应的严格度可由本领域普通技术人员容易地确定，且通常是作为探针长度、洗涤温度和盐浓度的函数的经验计算值。一般，较长的探针要求较高的温度用来完全退火，而较短的探针要求较低的温度。杂交一般取决于当互补的链处在具有低于所述链的解链温度的温度的环境中时变性的DNA复性的能力。探针与可杂交序列之间期望的同源性程度越高，可施加的相对温度越高。因此其遵循以下:较高的相对温度趋向于使得反应条件更加严格，而较低温度减少这一严格度。杂交反应的严格度的进一步的细节和解释可见于Ausubel等(1995)中。在 另一优选的实施方案中，术语核酸或氨基酸的“变体”是指至少达到一定程度地具有与参考核酸或氨基酸相同的生物活性和/或功能的核酸或氨基酸。在优选的实施方案中，本文使用的术语核酸序列的“变体”是指编码与参考氨基酸序列相似的氨基酸序列的另一核酸序列。在本发明优选的实施方案中，本文使用的术语“氧化还原因子”是指具有氧化还原反应性即，在生理条件下能够被氧化或还原的有机化合物。在优选的实施方案中，氧化还原因子不包括任何氧化还原反应性氨基酸侧链。在优选的实施方案中，氧化还原因子是自由的氧化还原因子，即，其不被共价结合于肽构架(peptide frame)或肽。在优选的实施方案中，氧化还原因子具有不多于0.85 ( S卩，最高0.6V)、0.5,0.4、
0.2,0,-0.U-0.15、-0.2,-0.25、-0.3或-0.4V的标准还原电势。在尤其优选的实施方案中，氧化还原因子具有从-0.325至-0.2V的标准还原电势。在非常尤其优选的实施方案中，氧化还原因子具有从-0.35至-0.3的标准还原电势。在优选的实施方案中，本文使用的术语“氧化还原因子再生多肽”是指催化氧化还原因子的再生的多肽。在优选的实施方案中，本文使用的术语“再生氧化还原因子”是指还原被氧化的氧化还原因子的能力，氧化还原因子以其还原形式在化学合成中用作还原剂，或是指氧化被还原的氧化还原因子的能力，氧化还原因子以其氧化形式在化学合成中用作氧化剂。在另一优选的实施方案中，本文使用的术语“再生氧化还原因子”是指恢复氧化还原因子之前的氧化还原状态，优选地恢复其中氧化还原因子可用于目标合成的状态，尤其优选被氧化还原酶催化的合成，其中氧化还原因子用作底物。例如，反应中消耗的NAD+可通过氧化NADH为NAD+而再生。在本发明第一方面的第二实施方案中，其也代表第一实施方案的实施方案，被氧化还原因子再生多肽再生的氧化还原因子选自包括以下的组:NADH、NADPH、FADH2、血红素、金属离子、谷胱甘肽、吡咯并喹啉-醌(PQQ)、磷酸吡哆醛、焦磷酸硫胺素和抗坏血酸。金属离子包括但不限于，Fe、Cu、Zn、N1、Co、Mn、Cr和Mg离子。在优选的实施方案中，上述氧化还原因子的每一种具有氧化形式和还原形式二者或相应的共轭氧化还原对的形式，例如在氧化还原因子NADH的情形中NADH和NAD+ 二者，即使仅明确地提到一种形式。在本发明第一方面的第三实施方案中，其也代表本发明的第一和第二实施方案的实施方案，氧化还原因子再生多肽包括一种或多种黄素辅因子。在优选的实施方案中，本文使用的术语“黄素辅因子”是指基于异咯嗪环系统的氧化还原反应性辅因子。在优选的实施方案中，黄素辅因子选自包括以下的组:以其氧化和还原形式二者的核黄素、黄素单核苷酸(FMN)和黄素-腺嘌呤二核苷酸(FAD)。在本发明第一方面的第四实施方案中，其也代表第一至第三实施方案的实施方案，氧化还原因子再生多肽选自包括以下的组:NADH氧化酶、甲酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶。在本发明第一方面的第五实施方案中，其也代表第一至第四实施方案的实施方案，氧化还原因子再生多肽选自包括以下的组:来自乳杆菌属(Lactobacillus)、栖热菌属(Thermus)、短杆菌属(Brevibacterium)和链球菌属(Streptococcus)的 NADH 氧化酶,优选短乳杆菌的NADH氧化酶，和其变体。在本发明第一方面的第六实施方案中，其也代表第一至第五实施方案的实施方案，自主转运蛋白的转运蛋白结构域选自包括以下的组:Ssp、Ssp-hl、Ssp_h2、PspA、PspB、Ssal> SphBl> AspA/Nalp、VacA、AIDA-1> IcsA、MisL、TibA、Ag43、ShdA> AutA> Tsh、SepA、EspC、EspP、Pet、Pic、SigA、Sat、Vat、EpeA、EatA、Esp1、EaaA、EaaC、万日咳杆菌粘附素(pertactin)、BrkA> Tef、Vag8 、PmpD> Pmp20、Pmp21、AgAl 蛋白酶、App> Hap、rOmpA、rOmpB、ApeE> EstA、Lip-1、McaP> BabA> SabA> AlpA、Aae> NanB 和其变体。在本发明另一优选的实施方案中，本文使用的术语“自主转运蛋白的转运蛋白结构域”，包括在细胞表面上展示不同于转运蛋白结构域的多肽、尤其是氧化还原因子再生多肽的结构域，其中所述蛋白已被插入转运蛋白结构域的氨基酸序列或与其融合。优选地氧化还原因子再生多肽与自主转运蛋白的转运蛋白结构域融合。根据本发明的自主转运蛋白的转运蛋白结构域可以是任何自主转运蛋白的转运蛋白结构域，且优选地能够形成￠-桶结构。￠-桶结构的详细描述和￠-桶自主转运蛋白的优选实例公开于WO 97/35022中，并通过引用形成本说明书的部分。Henderson等(2004)描述具有适合的自主转运蛋白结构域的自主转运蛋白(概述在Henderson等,2004的表I中提供)。Henderson等(2004)的公开文件通过引用形成本说明书的部分。例如，自主转运蛋白的转运蛋白结构域可选自:Ssp (P09489,粘质沙雷氏菌(S.marcescens))、Ssp-hl (BAA33455,粘质沙雷氏菌)、Ssp-h2 (BAA11383,粘质沙雷氏菌)、PspA (BAA36466,荧光假单胞菌(P.fluorescens))、PspB (BAA36467,荧光假单胞菌)、Ssal (AAA80490,溶血巴斯德氏菌(P.haemolytica))、SphBl (CAC44081,百日咳博德特氏菌(B.pertussis))、AspA/NalP(AAN71715，脑膜炎奈氏球菌(N.meningitidis))、VacA(Q48247,幽门螺杆菌(H.pylori))、AIDA-1 (Q03155，大肠杆菌)、IcsA(AAA26547，弗氏志贺氏菌(S.flexneri))、MisL(AAD16954，肠沙门氏菌(S.enterica))、TibA (AAD41751，大肠杆菌)、Ag43 (P39180，大肠杆菌)、ShdA(AAD25110，肠沙门氏菌)、AutA(CAB89117，脑膜炎奈氏球菌)、Tsh (154632，大肠杆菌)、3印么(CAC05786，弗氏志贺氏菌)、EspC(AAC44731，大肠杆菌)、EspP (CAA66144,大肠杆菌)、Pet(AAC26634,大肠杆菌)、Pic (AAD23953，大肠杆菌)、SigA(AAF67320,弗氏志贺氏菌)、Sat (AAG30168,大肠杆菌)、Vat (AA021903,大肠杆菌)、EpeA(AAL18821,大肠杆菌)、EatA(AA017297,大肠杆菌)、EspI (CAC39286,大肠杆菌)、EaaA(AAF63237,大肠杆菌)、EaaC(AAF63038，大肠杆菌)、百日咳杆菌粘附素(P14283，百日咳博德特氏菌)、BrkA (AAA51646，百日咳博德特氏菌)、Tef (AAQ82668，百日咳博德特氏菌)、Vag8 (AAC31247,百日咳博德特氏菌)、PmpD (084818，沙眼衣原体(C.trachomatis))、Pmp20(Q9Z812，肺炎衣原体(C.pneumoniae))、Pmp21 (Q9Z6U5，肺炎衣原体)、IgAl 蛋白酶(NP_283693，脑膜炎奈氏球菌)、App(CAC14670，脑膜炎奈氏球菌)、IgAl蛋白酶(P45386，流感嗜血杆菌(H.1nfluenzae))、Hap (P45387,流感嗜血杆菌)、rOmpA(Pl5921,立氏立克次氏体(R.rickettsii))、r0mpB(Q53047，立氏立克次氏体)、ApeE (AAC38796，肠沙门氏菌)、EstA(AAB61674,绿脓假单胞菌(P.aeruginosa))、Lip-1 (P40601,发光致病杆菌(X.luminescens))、McaP (AAP97134,粘膜炎微球菌(M.catarrhal is))、BabA (AAC38081,幽门螺杆菌)、SabA (AAD06240,幽门螺杆菌)、AlpA (CAB05386,幽门螺杆菌)、Aae (AAP21063,伴放线放线杆菌(A.actinomycetemcomitans))、NanB (AAG35309,溶血巴斯德氏菌)、和这些自主转运蛋白的变体。对于自主转运蛋白的实例的每一种，适合的GenBank保藏号和可从中获得自主转运蛋白的物种的实例在括号中提供。自主转运蛋白的转运蛋白结构域优选地是大肠杆菌的AIDA-1蛋白或其变体，例如由Niewert等(2001)描述的那些。AIDA自主转运蛋白系统连接于来自已对其诊断为水肿病和所谓断奶后(postweaning)的猪的大肠杆菌分离株中的F18和Stx2e。以上提供的自主转运蛋白序列的变体可例如通过改变不属于跨膜区段的P -桶的环结构中的氨基酸序列来获得。任选地编码表面环的核酸可完全缺失。此外，保守氨基酸置换可在两亲性3-片层结构内进行，即，将一种亲水氨基酸置换为另一种亲水氨基酸和/或将一种疏水氨基酸置换为另一种疏水氨基酸。优选地变体尤其是在3-片层结构的区域中具有在氨基酸水平上与自主转运蛋白结构域的相应天然存在序列至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少98%的序列同一性。在本发明第一方面的第七实施方案中，其也代表第一至第六实施方案的实施方案，氧化还原因子再生多肽是氧敏感的。在优选的实施方案中，本文使用的术语“氧敏感的”表示，相应的多肽在氧存在、优 选地正常浓度(即，大气中存在的浓度)的氧存在下，经历快速的失活。在另一优选的实施方案中，本文使用的术语“氧敏感的”表示，相应的多肽在溶液和其他相中暴露于如同大气中的浓度或条件下的氧至少30分钟时，丧失其活性(优选地就其keat而言)的至少10 %、20 %、30 %、40 %、优选地50 %、非常尤其优选地80 %。在另一实施方案中，氧化还原因子再生多肽是可溶性多肽。在优选的实施方案中，本文使用的术语“可溶性多肽”是指在其天然环境中未结合于膜的多肽。例如，短乳杆菌的NADH氧化酶，一种胞质蛋白，是可溶性多肽。在另一优选的实施方案中，氧化还原因子再生多肽是膜结合的多肽，即，共价或非共价地结合或附加于细胞膜或膜内在蛋白的多肽。例如，呼吸链的复合体IV是膜结合的多肽。根据第二方面，本发明的目的由根据本发明第一方面的实施方案的核酸分子编码的多肽解决。在优选的实施方案中，该多肽包括SEQ ID NO:2或其变体。根据第三方面，本发明的目的以在其表面上表达根据第二方面的多肽或已经使用根据本发明第一方面的实施方案的核酸分子转化的细胞解决。在优选的实施方案中，本文使用的术语“细胞”与术语“宿主细胞”可互换地使用，是指能够表达多肽的细胞。这样的细胞还可称为“全细胞催化剂或生物催化剂”。在另一优选的实施方案中，细胞或宿主细胞是原核细胞，优选革兰氏阴性细菌细胞，非常尤其优选大肠杆菌细胞。在另一示例性实施方案中，细胞是真核细胞。在另一优选的实施方案中，细胞或宿主细胞是原核生物的孢子。根据第四方面，本发明的目的以可从根据本发明第三方面的细胞获得的膜级分(membrane fraction)角军决。细菌细胞包括多个区室，它们被疏水性膜彼此分隔。革兰氏阳性细菌细胞具有质膜，其对胞质即细胞的内部定界。质膜被肽聚糖层围绕。与之相比，革兰氏阴性细菌除了质膜以外，具有称为外膜的另一个膜。本文使用的术语“表面”优选地是指微生物暴露于周围环境的层，其中周围环境是例如用于培养目标细胞的液体培养基。在非常尤其优选的实施方案中，根据本发明的 多肽在革兰氏阴性细菌细胞的外膜外侧上表达。在优选的实施方案中，根据本发明的多肽在革兰氏阴性细菌细胞的外膜内侧上表达。在另一优选的实施方案中，根据本发明的多肽在原生质球的外侧上表达，其中原生质球是已经从其去除外膜的革兰氏阴性细菌细胞。本领域技术人员熟悉能够用于产生原生质球的方法。在另一优选的实施方案中，根据本发明的多肽在革兰氏阳性细菌细胞的外侧上表达。如此，在本文使用术语“在表面上展示”和“在表面上表达”时，它们是同义的。在本发明优选的实施方案中，可互换使用的两个术语膜级分或膜制备物，包括根据本发明第一方面的氧化还原因子再生多肽，优选地处于催化活性状态。本文使用的术语“膜级分”和“膜制备物”优选地是指富集膜组成部分、优选地革兰氏阴性细菌外膜的组成部分的产物。本领域技术人员熟悉可用于产生膜制备物的程序和方法。例如，可从培养物收获细菌细胞并将其裂解，例如通过冻融循环、超声处理、在裂解缓冲液中重悬或类似方法，随后差异离心，以分离细胞的膜级分。在本发明优选的实施方案中，膜制备物是外膜的制备物，即，其中相对于其他膜和区室的组成部分诸如胞质、内膜和周质，富集外膜组成部分的制备物。本领域技术人员熟悉可用于分离或富集外膜或其组成部分的程序和方法，例如溶菌酶处理细菌细胞，随后是离心步骤。在优选的实施方案中，膜级分可以是处理的膜级分，即，膜级分的内容物或特性已经被改变，例如通过纯化膜级分的蛋白组成部分或通过增溶膜级分和/或在小囊泡中吸收膜级分的组成部分。在本发明优选的实施方案中，膜级分可被固定-例如在容器表面或柱上。根据第五方面，本发明的目的以一种再生氧化还原因子的方法解决，所述方法包括以下步骤:a)提供根据本发明第二方面的多肽、根据第四方面的膜制备物或根据第三方面的细胞，和b)将根据第二方面的多肽、根据第四方面的膜制备物或根据第三方面的细胞与氧化还原因子再生多肽的至少一种底物接触。在优选的实施方案中，步骤a)和/或步骤b)在还原剂不存在时和/或在氧化环境中发生。根据第六方面，本发明的目的使用根据第三方面的细胞或根据第四方面的膜级分或根据第二方面的多肽以再生氧化还原因子来解决。根据第七方面，本发明的目的通过使用根据第三方面的细胞、根据第四方面的膜制备物和根据本发明第二方面的多肽以调整水溶液的氧化还原环境、优选地通过将所述水溶液脱氧来解决。在本发明优选的实施方案中，本文使用的术语“调整水溶液的氧化还原环境”是指直接作用于水溶液中的氧化还原条件，即，该溶液氧化或还原化合物的能力的任何措施。在本发明优选的实施方案中，本文使用的术语“将水溶液脱氧”是指可用于降低所述溶液中氧浓度的任何措施。本领域技术人员熟悉可用于测量水溶液的氧浓度的方法，诸如，例如，使用氧电极。根据第八方面，本发明的目的以一种产生在其表面上展示氧化还原因子再生多肽的细胞的方法解决，所述方法包括:(a)将根据本发明第一方面的实施方案的核酸引入细胞,和b)任选地将所述细胞与一种或多种氧化还原反应性辅基接触。根据第九方面，本发明的目的以一种产生氧化还原因子依赖性多肽的产物的方法解决，所述方法包括以下步骤:a)提供氧化还原因子依赖性酶，和(b)在根据第三方面的细胞、根据第四方面的膜制备物和根据本发明第二方面的多肽存在下，将所述氧化还原因子依赖性多肽与一种或多种其底物接触，从而根据第二方面的多肽再生氧化还原因子依赖性多肽所依赖的氧化还原因子。在优选的实施方案中，本文使用的术语“氧化还原因子依赖性多肽”是指具有生物活性、优选地酶活性的需要氧化还原因子作为辅因子、辅基、或优选地底物的多肽。在另一优选的实施方案中，本发明的目的用如下组合物解决:包含根据第三方面的细胞、根据第四方面的膜制备物和根据本发明第二方面的多肽以及氧化还原因子依赖性多肽和氧化还原因子的组合物。在一个实施方案中，氧化还原因子依赖性多肽使用自主转运蛋白系统展示，即，其表达由包括以下的核酸带来:(I)编码信号肽的区段、⑵包含优选为异源的氧化还原因子再生多肽或其变体的区段、(3)任选的编码蛋白酶识别位点的区段、
(4)编码跨膜接头的区段、和(5)编码自主转运蛋白或其变体的转运蛋白结构域的区段。本发明由以下附图和实施例进一步阐述，其不应理解为限制，从其可看到本发明的进一步的特征、实施方案、方面和益处。
图1显示质粒pAT-NOx的限制性图谱。图2显示SDS- 凝胶，其显示大肠杆菌外膜中的NADH氧化酶并通过全细胞消化显示了 NADH氧化酶的定向(orientation)。M)分子量标准；1)大肠杆菌UT5600 (DE3) ；2)大肠杆菌UT5600(DE3) pAT-NOx，未诱导的；3)大肠杆菌UT5600 (DE3)pAT_N0x，诱导的；4)大肠杆菌UT5600(DE3)pAT-NOx，诱导的，以蛋白酶K消化；5)大肠杆菌UT5600 (DE3)pAT-NOx，诱导的，以胰蛋白酶消化。图3显示在使用A)大肠杆菌UT5600 (DE3)pAT-NOx和B)大肠杆菌BL21 (DE3)pAT-NOx (在每种情形中诱导Ih后)的NADH氧化酶测定后上清液的吸收谱。图4显示在使用A)大肠杆菌UT5600 (DE3)pAT-NOx和B)大肠杆菌BL21 (DE3)pAT-NOx (在每种情形中诱导4h后)的NADH氧化酶测定后上清液的吸收谱。图5显示在使用A)大肠杆菌UT5600 (DE3)pAT-NOx和B)大肠杆菌BL21 (DE3)pAT-NOx (在每种情形中诱导20h后)的NADH氧化酶测定后上清液的吸收谱。图6显示使用在M9培养基中生长后的大肠杆菌BL21 (DE3) pAT-NOx在微量滴定板上进行的NADH氧化酶测定的结果。该图显示在340nm消光(extinction)随着时间的减少。图7显示已经在+8°C储存多于7周的NOX全细胞生物催化剂的结果。活性测定以储存前的细胞[A]和已经储存一周[B]、两周[C]、三周[D]、四周[E]、五周[F]、六周[G]和七周[H]的细胞进行。图8显示已经在_18°C储存多于7周的NOX全细胞生物催化剂的结果。活性测定以储存前的细胞[A]和已经储存一周[B]、两周[C]、三周[D]、四周[E]、五周[F]、六周[G]和七周[H]的细胞进行。图9显示已经在_70°C储存多于7周的NOX全细胞生物催化剂的结果。活性测定以储存前的细胞[A]和已经储存一周[B]、两周[C]、三周[D]、四周[E]、五周[F]、六周[G]和七周[H]的细胞进行。图10显示为了稳定性测定已经储存多于七周的样品中细胞计数的确定。该图显示在_18°C储存的样品中细胞计数的减少(■)，以及在+8°C储存的样品( )和在-70°C储存的样品(▲)中细胞计数的减少。对于确定细胞计数，从储存的部分样品中取出50 yl，用于准备系列稀释液。将50ml的10_9和10,稀释液的每一种铺板在含30mg/l卡那霉素的LB-琼脂平板上。在37°C培养平板过夜，次日对菌落计数。基于菌落形成单位的数目计算细胞计数/ml。图11显示周期性地重复五次的测定中NOX全细胞生物催化剂的再循环能力。 =宿主菌株大肠杆菌BL21 (DE3)，■=大肠杆菌BL21 (DE3) pAT-NOx。狭义地，显示了第一 [A]、第二 [B]、第三[C]、第四[D]和第五[E]循环中NADH浓度的减少的光度确定。图12显示使用生物催化剂大肠杆菌BL21 (DE3) pAT-NOx再生NAD+，狭义地显示全细胞生物催化剂大肠杆菌BL21 (DE3)pAT-NOx ( ■)、和再生系统( )中的NADH转化。大肠杆菌BL21 (DE3)pAT-NifAf( A )用作对照。NADH的消光在340nm监测。细胞的消光在590nm监测。通过计算E34tl-E59tl的差来进行评价。ALDH60mU，细胞0D1，反应以200 u M NADH开始。图13显示NAD+的再生，狭义地显示随着时间作为在340nm的消光的函数的NADH的浓度，尤其是在ALDH反应 期间或使用大肠杆菌BL21 (DE3) pAT-Nox的ALDH反应期间的NADH浓度。NADH浓度通过相对于细胞计数计算商数E34(l/E59(l来标准化。ALDH30mU，大肠杆菌 BL21 (DE3) pAT-NOx 0D5，大肠杆菌 BL21 (DE3) OD I，反应以 400 u MNAD+ 开始。
实施例通过在丝氨酸蛋白酶、胰蛋白酶或蛋白激酶K存在时培养细菌，检测载客、在这种情形中是NADH氧化酶的表面定位是可能的。由于其尺寸，胰蛋白酶和蛋白酶K不能穿过大肠杆菌的外膜，在这些蛋白酶存在时培养全细胞具有的效果是，只有位于外膜表面上的蛋白被消化。因此，表面上的载客被消化，而整合在膜中的蛋白组成部分被保护不受酶攻击，从而保持完整。这可通过SDS-PAGE证实。酶的定向基于全细胞消化来评价。图2显示以IPTG诱导表达后大肠杆菌菌株UT5600 (DE3) pAT-Nox的分离的外膜以及全细胞消化后分离的外膜。以IPTG诱导后，外膜中能够检测到约IOOkDa的预计的融合蛋白(泳道3)。以胰蛋白酶消化全细胞导致与代表0mpF/C和OmpA的初始粗略相等强度的条带相比,相应条带的强度减少，从而证实该蛋白朝向膜的外侧(泳道4和5)。这能够证实NADH氧化酶被使用自主展示系统展示在大肠杆菌的表面上。实施例2:建立用于监测NADH氧化酶活性的生长和试验条件NADH氧化酶的活性以光度测定来确定。NADH显示两个消光最大值，即在波长260nm和340nm,而NAD+仅在260nm显不一个最大值。这一差异可用于以光度学方法监测NADH向NAD+的氧化。向使用的营养培养基或缓冲液加入FAD，以允许酶的适当折叠以及FAD的获取。NOX生物催化剂的培养对20ml LB培养基(15 U g/ml卡那霉素)接种10 U I相应菌株的甘油培养物并在37°C和200转/分钟培养过夜。对于建立主要培养物(main culture)，对100ml LB培养基(15 u g/ml卡那霉素、IOii M EDTAUOmM巯基乙醇)接种2.5ml过夜培养物。在OD578 = 0.6时，以ImM IPTG诱导50ml培养物。在NADH氧化酶的情形，另外加入10 y M FAD。在30°C和200转/分钟诱导培养物lh、4h或20h。未诱导另一半培养物，但除此以外以与被诱导的培养物完全相同的方式处理。为NADH氧化酶测定准备细胞在诱导后，首先在冰上储存细胞15分钟，然后通过以5000转/分钟离心IOmin分离为沉淀。在20ml0.1M磷酸钾缓冲液，pH7.5，IOii M FAD中洗涤沉淀两次。然后以同样的缓冲液调整细胞的OD到50。NADH氧化酶测定用于检测NADH氧化酶活性的测定以Iml样品进行，其包含0.1M硫酸钾缓冲液，PH7.5、ImM DTT和IOOyM NADH作为底物。最终OD578为I的细胞用在测定中。在室温培养一小时后，通过离心从样品去除细胞。在200和400nm之间的波长记录上清液的光谱。首先，对于两种菌株，诱导NADH氧化酶基因的表达lh。图3中的UV谱显示，在这些条件下检测酶活性是不可能的，因为NADH已被缺少该质粒的宿主细胞氧化，这导致在340nm的消光最大值的消失。加入的酶被细胞获取，或被细胞分泌的酶转化。两种作用都能够由细胞在指数 生长期展示的高代谢率来解释，如对本文的细胞发现的。为了使得细胞进入静止生长期并从而将其基础代谢降到最低，首先将表达的诱导延长到4h。发现，加入的NADH再次被宿主细胞氧化(图4)。然而，包含pAT-Nox的细胞的NADH氧化活性超过缺少该质粒的宿主细胞的活性。而且，可检测到未诱导和诱导的细胞之间的定量差异。延长诱导时间到20h后，不再能够检测到NADH被缺少该质粒的宿主细胞氧化，这可以从以下事实观察到:在无细胞的阴性对照的情形中，NADH的消光最大值如此前一样存在，如图5所示。对于这些所谓的“静息细胞”(处于静止期的细胞)，现在有可能检测加入的NADH被位于表面上的NADH氧化酶的氧化。大肠杆菌BL21 (DE3)与大肠杆菌UT5600 (DE3)之间的许多差异是明显的。在大肠杆菌BL21 (DE)pAT-Nox的情形，未诱导的细胞将供应的NADH的大约一半转化为NAD+，而诱导的细胞转化所有可获得的NADH。未诱导的细胞的活性可以以下基础来解释:用于表达NADH氧化酶的17系统不是“钝的(denSe)”，g卩，T7-启动子的阻遏是不完全的，其甚至在未诱导的状态下导致基因被T7-聚合酶的低表达。与之相t匕，大肠杆菌UT5600(DE3)在未诱导的状态显示无活性，但诱导的细胞仅转化大约一半的NADH。这些结果证明，利用自主转运蛋白系统，能够在大肠杆菌表面上以其活性形式表达短乳杆菌的黄素蛋白-NADH氧化酶。随后在脱辅酶(apoenzyme)中掺入FAD表现为正确地继续并仅要求添加FAD。迄今的所有测量是定性性质的，是为了建立测定和为了寻找允许监测酶活性的条件。对于通过测量NADH随着时间的氧化来定量监测酶活性，将光学测定转移到微量滴定板，从而允许平行地观察尽可能多的样品。在基本培养基(M9)中培养细胞对IOml M9培养基(15 ii g/ml卡那霉素)接种相应菌株的20 ill甘油培养物并在37°C和200转/分钟培养过夜。将全部过夜培养物用于接种主要培养物，即160mlM9 (15 u g/ml卡那霉素)。培养物初始生长7h后，向培养物的一半加入ImM IPTG和0.2%乳糖作为碳源。另外，对于NADH氧化酶加入10 ii M FAD。诱导在30°C和200转/分钟进行16h。未向另一半培养物加入IPTG，但除此以外这些培养物以完全相同的方式处理。为活性测定准备细胞在诱导后，首先在冰上储存细胞15分钟，然后通过以5000转/分钟离心IOmin分离为沉淀。在20ml0.1M磷酸钾缓冲液，pH7.5，IOii M FAD中洗涤沉淀两次。然后以同样的缓冲液调整细胞到OD578 = 10。微量滴定板上的NADH氧化酶测定96孔微量滴定板的NADH氧化酶测定以0.1M磷酸钾缓冲液中每孔240 U I样品进行。使用的细胞的量使得测定中实现OD578为I。为了开始反应，加入200 ii M NADH0在室温培养0、3、7、15、30、45或60分钟后，在340nm观察微量滴定板中的测定(Mithras,BertholdTechnologies) 0为了避免细胞沉淀，在测量消光之前摇动板。在缓冲液中具有相应OD的细胞悬液用作参考。基于一系列试验，能够优化NADH氧化酶全细胞催化剂的产生，从而i)活性更高，ii)诱导的与未诱导的细胞之间的差异增加，和iii)对于无意义对照，仅存在低活性。尤其是，发现用于测量NADH氧化酶的培养物必须处于最佳状态。图6显示在标准条件下进行的NADH氧化酶测定的结果，如在“方法”部分描述的。与生长和试验条件有关的多种因素影响这一改进的酶活性。着眼于以更大规模使用，已经改良了细胞的生长，从而代替复合LB培养基，使用限定的M9培养基。在诱导期间，加入乳糖作为碳源，在OD578为约0.35较早地诱导细胞。较晚地诱导，通常在0.6，具有的结果是必须在M9培养基中过度长的生长，这导致自发的细胞裂解，具有的影响是无意义对照和未诱导的对照二者氧化作为底物供应的NADH。这很可能是因为由于细胞裂解而释放的酶。现在进行NADH氧化酶测定，并如上所述地在微量滴定板中直接在细胞悬液中观察。这使得操作更简单并且数据更可重现。然而，确定酶活性的绝对值是不可能的。以光度方法确定的酶活性根据Beer-Lambert法则计算。为了能够适用这一等式,必须已知比色杯或96-孔板的层厚度。在目前的试验设置中不能确定这一参数。因此以光度计确定NADH氧化酶的活性，使用具有确定的层厚度Icm的比色杯。从而能够适用Beer-Lambert法则。在30°C的温度,发现LB培养基中的活性为12.23mU/ml。在30°C M9培养基中的活性略高，为16.38mU/ml。在Hummel等(2003)的研究中，以简单方式纯化的酶的活性为10-15U/mg。实施例3:试验NADH氧化酶全细胞催化剂的稳定性和储存能力
对于研究NADH氧化酶全细胞催化剂的储存能力和稳定性，将诱导的细胞储存在冷藏室中8°C或冷冻室中-18°C或_70°C。每周通过NADH氧化酶测定以一式三份样品检查这些细胞。
在诱导基因表达后，将打算储存的细胞用磷酸钾缓冲液(0.1M，pH7.5)洗涤两次，在这一缓冲液中调整到OD578 = 10，分为部分的样品并在+8°C置于储存八周。如果细胞将要在-18°C或_70°C储存，向冷冻缓冲液中加入20%甘油。对于活性测定，将200-1i I样品中的细胞用前述缓冲液稀释到OD578 = 1，然后加入0.2mM NADH以开始反应。通过在入max=340nm测量消光的减少在一式三份的样品中监测NADH向NAD的氧化。为了考虑到储存期间发生的细胞裂解的效应，以与全细胞生物催化剂BL21 (DE3) pAT-NOX相同的方式储存宿主菌株大肠杆菌BL21 (DE3)并经历相同类型的活性测定。图7中的图显示在8°C储存不同时间的细胞悬液中NADH浓度的减少。如预计的，用作对照的宿主菌株大肠杆菌BL21(DE3)在储存前不显示任何NADH活性。然而，对于这些宿主细胞，储存刚一周后，该测定中观察到NADH浓度的明显减少，并且储存时间越长这一减少变得更显著。这一推测的NADH氧化酶活性可由细菌细胞的裂解来解释，这基于当细胞在8°C储存时经历开始得相对快速。在冷藏室中这一温度储存的细胞在数天后已经显示溶液中粘度增加，且不能被完全重悬。这一粘度增加可归因于细胞裂解期间染色体DNA的释放。此外，由于细胞裂解，释放了酶，其显然氧化了测定中用作底物的NADH。这一效应还可在储存NADH氧化酶全细胞催化剂大肠杆菌BL21 (DE3) pAT-NOX和随后的活性测定的情形中观察到。当储存时间增加时，在冷藏室中细胞裂解带来的NADH氧化将超过储存前测量的催化剂活性。因此不能建议在冷藏室中保存NADH氧化酶全细胞催化剂。当细胞在_18°C储存时，情况是不同的(图8)。对于用作阴性对照的宿主细胞，在卧式冷冻柜中_18°C储存后没有所导致的NADH氧化,而NADH氧化酶全细胞催化剂即使在8周后仍然展示NADH氧化酶活性，其-在正态分布的背景下-与初始活性相当。全细胞生物催化剂在-70°C储存7周后，没有观察到活性的显著减少(图9)。在这种情形中还能够排除宿主细胞的裂解。因此建议在_70°C储存全细胞生物催化剂。同时，与生物催化剂的活性平行地确定活细胞计数。结果显示在图10。储存在+8°C时，在前四周内活细胞计数减少三个数量级。储存持续另外三周时，此时活细胞计数保持相对恒定。这种曲线形状也 在_18°C或-70°C储存生物催化剂时观察到。然而，在这种情形中，前四周期间活细胞计数减少仅两个数量级。活细胞计数的减少与生物催化剂在七周的时间段内的活性不相关。活细胞计数随着在-18°C或-70°C储存减少,但活性保持粗略地恒定。然而，这一试验显示，在卧式冷冻柜(_18°C或-70°C)中储存比在冷藏室中+8°C储存更好。实施例4:全细胞生物催化剂的再循环能力的研究经30分钟的时间段以5个循环确定全细胞催化剂大肠杆菌BL21 (DE3)pAT-NOx有关转化NADH的再循环能力。对于这一测定，在诱导基因表达后，将细胞用磷酸钾缓冲液(0.lM，pH7.5)洗涤两次，且在这一缓冲液中重悬到最终OD578为10。对于确定活性，在微量滴定板中将200-1i I样品中的细胞用前述缓冲液稀释到OD578为1，然后加入0.2mM NADH以开始反应。通过在入_ = 340nm测量消光的减少在一式三份样品中监测NADH向NAD的氧化。对于再循环，完成反应后将细胞离心下来并重悬在160ul磷酸钾缓冲液中。再次地，力口A0.2mM NADH以开始反应，并以光度学方法监测氧化。这一程序重复共5个循环。为了考虑到处理期间可能发生的细胞裂解的影响，对作为阴性对照的宿主菌株大肠杆菌BL21(DE3)进行与全细胞生物催化剂BL21 (DE3)相同的测定。
缺少生物催化剂的宿主细胞用作对照。如可从图11观察到的，宿主细胞不转化任何NADH。在第一循环中(A)，全细胞生物催化剂在30分钟内转化几乎100%的存在的NADH。在进一步的循环中，转化和转化率减少。在最后一个循环中(第5循环，D)，培养时间内转化不到30%的NADH。细菌悬液的离心可能导致随后的循环中活性减少。离心力代表对细胞和尤其是对其表面上表达的分子的机械应力。实施例5:使用全细胞生物催化剂大肠杆菌BL21 (DE3) pAT-NOx再生NADH为NAD+进行这一试验以研究全细胞生物催化剂大肠杆菌BL21 (DE3) pAT-NOx是否能用作NAD+还原酶的再生系统。这使用包括全细胞生物催化剂和NAD+还原酶即醛脱氢酶(ALDH)的系统来试验。ALDH属于氧化醛类为相应的羧酸并从而还原NAD+为NADH的一组酶。以光度学方法监测NADH浓度。如可从图12观察到的，如预计的，包含全细胞生物催化剂大肠杆菌BL21(DE3)pAT-Nox的样品中的NADH浓度连续减少。与之相比,如果向生物催化剂加入重组酶ALDH，则在NAD+与NADH之间建立平衡，因为被ALDH连续还原为NADH的NAD+被生物催化剂大肠杆菌BL22(DE3)pAT-NOx再生。因此这一系统处于平衡。大肠杆菌BL21 (DE3)-NitAf用作所谓的无意义对照。这些细胞在其表面上展示来自粪产碱菌(A.faecalis)的腈水解酶，其不能氧化NADH，如也可从图12观察到的。图13在图的上半部显示，由ALDH介导的NADH增加。关于加入生物催化剂大肠杆菌BL21(DE3)pAT-Nox以再生NAD+，已经向这一反应加入宿主菌株大肠杆菌BL21 (DE3)，从而能够相对于细胞计数标准化NADH浓度(确定为在340nm的消光)。向ALDH反应加入生物催化剂大肠杆菌BL21 (DE3) pAT-NOx后，不能观察到NADH随着时间的进一步增加，因为由ALDH形成的NADH连续地被再氧化为NAD+。因此这一系统处于平衡。原始资料的细节就本文参考多种现有技术文献来说，这些文献通过引用以其全文形成本说明书的部分。提到的现有技术文献的完整目录细节在以下提供:
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在说明书、序列表、权利要求书和/或附图中公开的本发明的特征对于以其多种形式实施本发明可以·单独和以任何组合在法律上相关。
权利要求
1.一种核酸分子，包含以下组成部分: (1)编码信号肽的区段， (2)包含异源氧化还原因子再生多肽的区段， (3)任选的编码蛋白酶识别位点的区段， (4)编码跨膜接头的区段，和 (5)编码自主转运蛋白或其变体的转运蛋白结构域的区段。
2.如权利要求1所述的核酸分子，其中由所述氧化还原因子再生多肽再生的所述氧化还原因子选自包括以下的组:NADH、NADPH、FADH2、血红素、金属离子、谷胱甘肽、吡咯并喹啉-醌、磷酸吡哆醛、焦磷酸硫胺素和抗坏血酸。
3.如权利要求1或2之一所述的核酸分子，其中所述氧化还原因子再生多肽包括一种或多种黄素辅因子。
4.如权利要求1至3之一所述的核酸分子，其中所述氧化还原因子再生多肽选自包括以下的组:NADH氧化酶、甲酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶。
5.如权利要求4所述的核酸分子，其中所述氧化还原因子再生多肽选自包括以下的组:短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)、水生栖热菌(Thermus aquaticus)、短杆菌属(Brevibacterium)物种KU139和幾链球菌(Streptococcus faecalis)的NADH氧化酶,优选地短乳杆菌的NADH氧化酶,和其变体。
6.如权利要求1 至5之一所述的核酸分子，其中所述自主转运蛋白的转运蛋白结构域选自包括以下的组:Ssp、Ssp-hl、Ssp_h2、PspA、PspB、Ssal、SphBl、AspA/Nalp、VacA、AIDA-1> IcsA、MisL、TibA、Ag43、ShdA> AutA> Tsh、SepA、EspC、EspP、Pet、Pic、SigA、Sat、Vat、EpeA、EatA、Esp1、EaaA、EaaC、百日咳杆菌粘附素、BrkA、Tef、Vag8、PmpD、Pmp20、Pmp21、AgA I 蛋白酶、App、Hap、r OmpA、r OmpB、Ap eE、Es tA、Lip-1、McaP、BabA、SabA、AI pA、Aae、NanB、和其变体。
7.如权利要求1至6之一所述的核酸分子，其中所述氧化还原因子再生多肽是氧敏感的。
8.一种多肽，由权利要求1至7之一所述的核酸分子编码。
9.一种细胞，所述细胞在其表面上表达权利要求8所述的多肽或已经被使用权利要求1至7之一所述的核酸分子转化。
10.一种膜级分，所述膜级分是从权利要求9所述的细胞可获得的。
11.一种再生氧化还原因子的方法，包括以下步骤: (a)提供权利要求8所述的多肽、权利要求10所述的膜制备物或权利要求9所述的细胞， (b)将权利要求8所述的多肽、权利要求10所述的膜制备物或权利要求9所述的细胞与氧化还原因子再生多肽的一种或多种底物接触， 其中所述一种或多种底物包括所述氧化还原因子。
12.权利要求9所述的细胞或权利要求10所述的膜制备物或权利要求8所述的多肽用于再生氧化还原因子的用途。
13.权利要求9所述的细胞、权利要求10所述的膜制备物和权利要求8所述的多肽用于调整水溶液的氧化还原环境的用途，优选地是通过将所述水溶液脱氧。
14.一种产生在其表面上展示氧化还原因子再生多肽的细胞的方法，包括以下步骤: (a)将权利要求1至7之一所述的核酸引入细胞， (b)任选地将所述细胞与一种或多种氧化还原反应性辅基接触。
15.一种产生氧化还原因子依赖性酶的产物的方法，包括以下步骤: (a)提供氧化还原因子依赖性酶， (b)提供权利要求9所述的细胞、权利要求10所述的膜制备物或权利要求8所述的多肽，和 (c)在权利要求9所述的细胞、权利要求10所述的膜制备物或权利要求8所述的多肽存在下，将所述氧化还原因子依赖性酶与一种或多种其底物接触， 其中权利要求9所述的细胞、权利要求10所述的膜制备物或权利要求8所述的多肽包括再生所述氧 化还原因子依赖性多肽所依赖的氧化还原因子的多肽。
全文摘要
本发明涉及包含编码信号肽的区段、包含异源氧化还原因子再生多肽的区段、任选地编码蛋白酶识别位点的区段、编码跨膜接头的区段、和编码自主转运蛋白或其变体的转运蛋白结构域的区段的核酸分子。该核酸分子使得能够表达氧化还原因子再生酶。
文档编号C12N9/02GK103140583SQ201180041285
公开日2013年6月5日 申请日期2011年8月26日 优先权日2010年8月27日
发明者约阿希姆·乔斯, 鲁斯·马斯, 伊娃·克拉嫩 申请人:齐鲁斯专利I投资有限及两合公司
全细胞生物催化剂本发明涉及包含以下的核酸分子:(I)编码信号肽的区段、(2)包含异源氧化还原因子再生多肽或其变体的区段、(3)任选的编码蛋白酶识别位点的区段、(4)编码跨膜接头的区段、和(5)编码自主转运蛋白(autotransporter)或其变体的转运蛋白结构域的区段。所有已知酶的大约四分之一是氧化还原酶。对这一组酶已经开发了宽范围的应用，包括手性化合物诸如醇类、醛类和氨基酸的合成，聚合物的产生和改性，用于最为多样的应用的生物传感器的产生，和有害物质的降解。氧化还原酶的特征在于，它们不仅包括至少一条多肽链，而且包括一个或多个氧化还原反应性基团，其可以是一个或多个氧化还原反应性氨基酸侧链或辅基。氧化还原酶的底物包括代谢产物和氧化还原因子。不同于酶的辅基，这些氧化还原因子底物不作为催化剂起作用，而是以化学计量的量参与反应，并与其他底物一起进入化学反应。由于氧化还原因子通常比其他有机底物昂贵得多的事实，使用氧化还原酶的工业合成的可行性受到限制，由于需要提供合适的还原因子或氧化因子。为了解决这一问题，科学家们已经建议使用氧化还原因子再生酶。例如，已经提出使用甲酸脱氢酶(FDH)和NADH氧化酶或使用葡萄糖脱氢酶(GDH)来再生NADH或NADPH。将这样的酶固定在合适的载体上用于多个催化循环应当是可能的，以避免不得不重复地纯化大量的多肽。不幸地，氧化还原因 子再生酶通常是不稳定的，尤其是当处于固定化酶的形式时。Sanjust等(1997)将来自水生栖热菌(Thermus aquaticus)的NADH氧化酶固定在多种载体上，并比较了可溶性和固定化酶的动力学特性。发现，固定化酶具有比可溶性酶低的热稳定性。Hmnmel和Riebel (2003)描述了使用来自短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)的可溶性、纯化的NADH氧化酶用于再生NADH氧化酶。他们证明，该酶具有朝向快速氧化失活的趋势，很可能是因为蛋白催化中心中存在对氧化敏感的半胱氨酸残基。因此，还原剂(ImM DTT或巯基乙醇)的使用被描述为对于维持该酶的催化能力是重要的。Ahmed和 Claiborne (1992)从粪链球菌(Streptococcus faecalis) 10C1 纯化了含 FAD 的 NADH氧化酶并教导，2mM DTT的存在对于稳定全氧化酶(holo_oxidase)是必需的。El-Zahab等(2004)描述，并由Lee和Ping (2007)证实，将氧化还原因子再生酶例如葡萄糖脱氢酶(GDH)固定在固态载体上，狭义地固定在纳米孔石英玻璃上。然而，他们没有描述所述酶如何能够被稳定。因此本发明的目的是提供具有氧化还原因子再生活性的剂，其中活性的来源不仅对于底物分子是容易接近的，而且可被容易地扩增、回收和再生，使得多个催化步骤是可能的，而不需要重复地产生新鲜的剂。本发明的另一目的是提供一种剂，其本身或在存在可能失活性的化学物诸如抑制性金属离子时或在酸性或碱性PH，具有氧化还原因子再生活性和在动力学、热稳定性、储存能力和稳定性方面比对应的酶的原始形式更佳的特性。本发明的特殊目的是提供一种剂，其在存在氧或氧释放剂时或在氧化条件下表现稳定的氧化还原因子再生活性，其稳定性比对应的酶的原始形式更佳。本发明人令人惊讶地发现，使用自主转运蛋白系统，能够在全细胞的表面上表达氧化还原因子再生酶，且这些酶自身在存在氧和不同温度和条件时是令人惊讶地稳定的。而且，本发明人令人惊讶地发现，能够在多种条件中在多种溶液和缓冲液中培养氧化还原因子再生酶并在相当长的时间保持稳定。自主展示(autodisplay)是在细菌表面上呈递重组蛋白的精细工具。这一表达系统是基于属于V型分泌系统的自主转运蛋白的蛋白家族的分泌机制。在革兰氏阴性细菌中，自主转运蛋白途径由向细胞表面转运蛋白和向细胞外空间分泌蛋白二者形成(Jose和Meyer，2007)。自主转运蛋白作为前体蛋白被合成，其满足向细胞表面转运的所有结构要求(JoSe，2006)。它们被合成为带有N末端信号肽，这是Sec途径典型的，这使得跨过内膜成为可能。一旦在周质之内，截短信号肽之后，前体的C末端部分折叠进入外膜作为孔蛋白样结构，即所谓的￠-桶。经过这个孔，N末端结合的载客结构域(passenger domain)移位到表面(Jose等,2002)。在那里其可以被切割_通过自动蛋白水解或另外的蛋白酶-或能够经由转运蛋白结构域保持锚定在胞外被膜(cell envelope)上。用重组蛋白代替天然的载客导致重组蛋白的表面移位(surface translocation)。为此，必须使用遗传工程技术构建由信号肽、重组载客、￠-桶和其间的接头区域组成的非天然的前体，接头区域是不受限制地接近表面所需的。以这种方式，AIDA-1自主转运蛋白已经成功地被用于多种载客结构域的有效表面展示(Henderson等,2004)。利用自主展示系统，已经观察到活性酶上亚基的自缔合，例如对于二聚酶山梨糖醇脱氢酶(JoSe，2002 Jose和von Schwichow,2004) 具体地，自主展示技术是在大肠杆菌(E.coli)和其他革兰氏阴性细菌的外膜表面上表达某些蛋白的方法，其中自主展示系统基于自主转运蛋白的天然分泌机制(A.Banerjee等(2002))。重组载客蛋白的转运可简单地通过使用常规遗传工程技术在读码框中在自主展示载体的信号肽与移位结构域之间插入其编码序列来进行。信号肽可以从霍乱毒素的亚基获得，且其可以与非天然启动子联合。从而，将要经历跨外膜的移位的载客蛋白作为与另一蛋白的重组融合蛋白，称为自主转运蛋白，被表达在大肠杆菌的外膜上(AIDA-1)(J0Se，2006)。自主转运蛋白的C末端部分在大肠杆菌的外膜中形成孔蛋白样结构(￠-桶)。这种孔蛋白样结构使得重组载客蛋白能够被移位到大肠杆菌的外膜表面(Jose,1995，2006，2007)。固定氧化还原辅因子再生多肽的概念追溯到1974年，当时Sarborsky和Ogletree描述了经由活化其碳水化合物残基来固定葡萄糖氧化酶。自主展示系统的概念由Jose等(1995)首次描述，也已经被公知超过15年。尽管如此，就我们所知，使用自主转运蛋白系统来固定氧化还原因子再生酶没有被现有技术教导或提出。本发明的目的通过独立权利要求的目的来解决。优选的实施方案可见于从属权利要求。根据第一方面，本发明的目的如下解决，其还是第一方面的第一实施方案:一种核酸分子，包含(I)编码信号肽的区段、(2)包含异源氧化还原因子再生多肽或其变体的区段、(3)任选的编码蛋白 酶识别位点的区段、(4)编码跨膜接头的区段、和(5)编码自主转运蛋白或其变体的转运蛋白结构域的区段。在本发明优选的实施方案中，核酸分子被有功能地连接于表达调节序列。在优选的实施方案中，本文使用的术语“表达调节序列”是指能够调节核酸分子的表达水平的核酸序列，核酸分子优选地在表达调节序列下游。表达调节序列可以是例如启动子。本领域技术人员熟悉适于调节表达的序列和用于有功能地将这些序列与核酸分子连接的方法。在本发明优选的实施方案中，核酸分子是重组质粒的部分。在优选的实施方案中，核酸分子包括SEQ ID NO:1或其变体。在本发明优选的实施方案中，本文使用的术语“异源的”是指使用遗传工程技术，例如通过将表达调节序列和通常不处于这一表达调节序列控制下的待表达序列连接在一起，或通过使用具有相对于原始序列的点突变的序列而构建的核酸。即使构建体的仅一个区段被称为异源的，这因而暗示整个构建体是异源的。本领域技术人员熟悉遗传工程技术。在另一优选的实施方案中，本文使用的术语“异源的”是指连接于表达调节序列的编码多肽的核酸，和/或与表达调节序列来源于不同的生物体且待表达的融合的序列。在另一优选的实施方案中，本文与氧化还原因子再生多肽关联使用的术语“异源的”表示，编码该氧化还原因子再生多肽的核酸区段与至少一个其他区段从不同的生物体获得或取得，至少一个其他区段诸如转运蛋白结构域或表达调节序列或跨膜接头。例如，如果氧化还原因子再生多肽从短乳杆菌获得，而所有其他序列从大肠杆菌获得，则氧化还原因子再生多肽是异源的。在另一优选的实施方案中，本文使用的术语“异源的”表示，称为异源的核酸序列来源于不同于用于表达或扩增这一核酸序列的宿主或预期宿主的生物体。在本发明优选的实施方案中，本文使用的术语“信号肽”是指具有如果多肽被表达在宿主细胞的细胞质中，将其移位到细胞的特定区室、优选地不同于细胞质的区室的作用的氨基酸序列，信号肽优选地在多肽的N末端。在尤其优选的实施方案中，宿主细胞是革兰氏阴性细菌细胞，且信号肽具有将正在形成或完成的多肽移位到革兰氏阴性细菌细胞的周质或外膜中的作用。在本发明优选的实施方案中，本文使用的术语“蛋白酶识别位点”是指多肽中的特定氨基酸序列基序，其中这一序列基序以蛋白酶结合并裂解多肽这样一种方式被所述蛋白酶特异性地识别。在本发明优选的实施方案中，本文使用的术语“跨膜接头”是指用作连接自主转运蛋白结构域与氧化还原因子再生多肽但足够地柔性以允许该氧化还原因子再生多肽的独立折叠和/或转运的柔性多肽区段。在本发明优选的实施方案中，术语“自主转运蛋白的转运蛋白结构域”是指如果核酸分子表达产物在细胞内的核糖体被合成，优选地在细菌胞质中被合成，并被向细胞外膜移位，优选地向外膜的被暴露于细胞周围环境的一侧移位的话，可用于获得核酸分子表达产物的结构域。在尤其优选的实施方案中，转运蛋白结构域具有将所述表达产物定位于外膜的外表面的作用。在本发明优选的实施方案中，自主转运蛋白的转运蛋白结构域是位于细胞外膜上的蛋白，且编码NADH氧化酶的区段是转运蛋白结构域的结构域、环或某一其他部分的一部分或与其融合，从而NADH氧化酶被展示在细胞表面上。在本发明另一优选的实施方案中，自主转运蛋白的转运蛋白结构域是可用于在细胞表面上展示多肽的系统的蛋白。在尤其优选的实施方案中，转运蛋白结构域是革兰氏阴性细菌细胞的AIDA-1型的自主展示系统、还称为自主转运蛋白途径的转运蛋白结构域。在优选的实施方案中，氨基酸或核酸序列的变体例如通过名称或保藏号或甚至通过术语“的变体”在本申请中被明确地提到，或例如通过功能描述在本发明的上下文中被隐含地提到。在优选的实施方案中，本文 使用的术语“变体”包括与用作参考的氨基酸60%、70%、75%、80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%或 99%相同的氨基酸或核
酸序列。在优选的实施方案中，术语“变体”包括，就氨基酸序列而言，具有相对于参考序列的一个保守氨基酸置换或多个保守氨基酸置换的那些氨基酸序列。在优选的实施方案中，术语氨基酸序列或核酸序列的“变体”包括氨基酸序列或核酸序列的活性区段和/或片段。在优选的实施方案中，本文使用的术语“活性区段”是指比全长的氨基酸或核酸序列短，但仍然具有其必需生物活性、例如作为NADH氧化酶的生物活性的至少一部分的氨基酸序列或核酸序列。在优选的实施方案中，术语核酸的“变体”包括互补链的核酸，其-优选地在严格条件下-与参考核酸杂交。杂交反应的严格度可由本领域普通技术人员容易地确定，且通常是作为探针长度、洗涤温度和盐浓度的函数的经验计算值。一般，较长的探针要求较高的温度用来完全退火，而较短的探针要求较低的温度。杂交一般取决于当互补的链处在具有低于所述链的解链温度的温度的环境中时变性的DNA复性的能力。探针与可杂交序列之间期望的同源性程度越高，可施加的相对温度越高。因此其遵循以下:较高的相对温度趋向于使得反应条件更加严格，而较低温度减少这一严格度。杂交反应的严格度的进一步的细节和解释可见于Ausubel等(1995)中。在 另一优选的实施方案中，术语核酸或氨基酸的“变体”是指至少达到一定程度地具有与参考核酸或氨基酸相同的生物活性和/或功能的核酸或氨基酸。在优选的实施方案中，本文使用的术语核酸序列的“变体”是指编码与参考氨基酸序列相似的氨基酸序列的另一核酸序列。在本发明优选的实施方案中，本文使用的术语“氧化还原因子”是指具有氧化还原反应性即，在生理条件下能够被氧化或还原的有机化合物。在优选的实施方案中，氧化还原因子不包括任何氧化还原反应性氨基酸侧链。在优选的实施方案中，氧化还原因子是自由的氧化还原因子，即，其不被共价结合于肽构架(peptide frame)或肽。在优选的实施方案中，氧化还原因子具有不多于0.85 ( S卩，最高0.6V)、0.5,0.4、
0.2,0,-0.U-0.15、-0.2,-0.25、-0.3或-0.4V的标准还原电势。在尤其优选的实施方案中，氧化还原因子具有从-0.325至-0.2V的标准还原电势。在非常尤其优选的实施方案中，氧化还原因子具有从-0.35至-0.3的标准还原电势。在优选的实施方案中，本文使用的术语“氧化还原因子再生多肽”是指催化氧化还原因子的再生的多肽。在优选的实施方案中，本文使用的术语“再生氧化还原因子”是指还原被氧化的氧化还原因子的能力，氧化还原因子以其还原形式在化学合成中用作还原剂，或是指氧化被还原的氧化还原因子的能力，氧化还原因子以其氧化形式在化学合成中用作氧化剂。在另一优选的实施方案中，本文使用的术语“再生氧化还原因子”是指恢复氧化还原因子之前的氧化还原状态，优选地恢复其中氧化还原因子可用于目标合成的状态，尤其优选被氧化还原酶催化的合成，其中氧化还原因子用作底物。例如，反应中消耗的NAD+可通过氧化NADH为NAD+而再生。在本发明第一方面的第二实施方案中，其也代表第一实施方案的实施方案，被氧化还原因子再生多肽再生的氧化还原因子选自包括以下的组:NADH、NADPH、FADH2、血红素、金属离子、谷胱甘肽、吡咯并喹啉-醌(PQQ)、磷酸吡哆醛、焦磷酸硫胺素和抗坏血酸。金属离子包括但不限于，Fe、Cu、Zn、N1、Co、Mn、Cr和Mg离子。在优选的实施方案中，上述氧化还原因子的每一种具有氧化形式和还原形式二者或相应的共轭氧化还原对的形式，例如在氧化还原因子NADH的情形中NADH和NAD+ 二者，即使仅明确地提到一种形式。在本发明第一方面的第三实施方案中，其也代表本发明的第一和第二实施方案的实施方案，氧化还原因子再生多肽包括一种或多种黄素辅因子。在优选的实施方案中，本文使用的术语“黄素辅因子”是指基于异咯嗪环系统的氧化还原反应性辅因子。在优选的实施方案中，黄素辅因子选自包括以下的组:以其氧化和还原形式二者的核黄素、黄素单核苷酸(FMN)和黄素-腺嘌呤二核苷酸(FAD)。在本发明第一方面的第四实施方案中，其也代表第一至第三实施方案的实施方案，氧化还原因子再生多肽选自包括以下的组:NADH氧化酶、甲酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶。在本发明第一方面的第五实施方案中，其也代表第一至第四实施方案的实施方案，氧化还原因子再生多肽选自包括以下的组:来自乳杆菌属(Lactobacillus)、栖热菌属(Thermus)、短杆菌属(Brevibacterium)和链球菌属(Streptococcus)的 NADH 氧化酶,优选短乳杆菌的NADH氧化酶，和其变体。在本发明第一方面的第六实施方案中，其也代表第一至第五实施方案的实施方案，自主转运蛋白的转运蛋白结构域选自包括以下的组:Ssp、Ssp-hl、Ssp_h2、PspA、PspB、Ssal> SphBl> AspA/Nalp、VacA、AIDA-1> IcsA、MisL、TibA、Ag43、ShdA> AutA> Tsh、SepA、EspC、EspP、Pet、Pic、SigA、Sat、Vat、EpeA、EatA、Esp1、EaaA、EaaC、万日咳杆菌粘附素(pertactin)、BrkA> Tef、Vag8 、PmpD> Pmp20、Pmp21、AgAl 蛋白酶、App> Hap、rOmpA、rOmpB、ApeE> EstA、Lip-1、McaP> BabA> SabA> AlpA、Aae> NanB 和其变体。在本发明另一优选的实施方案中，本文使用的术语“自主转运蛋白的转运蛋白结构域”，包括在细胞表面上展示不同于转运蛋白结构域的多肽、尤其是氧化还原因子再生多肽的结构域，其中所述蛋白已被插入转运蛋白结构域的氨基酸序列或与其融合。优选地氧化还原因子再生多肽与自主转运蛋白的转运蛋白结构域融合。根据本发明的自主转运蛋白的转运蛋白结构域可以是任何自主转运蛋白的转运蛋白结构域，且优选地能够形成￠-桶结构。￠-桶结构的详细描述和￠-桶自主转运蛋白的优选实例公开于WO 97/35022中，并通过引用形成本说明书的部分。Henderson等(2004)描述具有适合的自主转运蛋白结构域的自主转运蛋白(概述在Henderson等,2004的表I中提供)。Henderson等(2004)的公开文件通过引用形成本说明书的部分。例如，自主转运蛋白的转运蛋白结构域可选自:Ssp (P09489,粘质沙雷氏菌(S.marcescens))、Ssp-hl (BAA33455,粘质沙雷氏菌)、Ssp-h2 (BAA11383,粘质沙雷氏菌)、PspA (BAA36466,荧光假单胞菌(P.fluorescens))、PspB (BAA36467,荧光假单胞菌)、Ssal (AAA80490,溶血巴斯德氏菌(P.haemolytica))、SphBl (CAC44081,百日咳博德特氏菌(B.pertussis))、AspA/NalP(AAN71715，脑膜炎奈氏球菌(N.meningitidis))、VacA(Q48247,幽门螺杆菌(H.pylori))、AIDA-1 (Q03155，大肠杆菌)、IcsA(AAA26547，弗氏志贺氏菌(S.flexneri))、MisL(AAD16954，肠沙门氏菌(S.enterica))、TibA (AAD41751，大肠杆菌)、Ag43 (P39180，大肠杆菌)、ShdA(AAD25110，肠沙门氏菌)、AutA(CAB89117，脑膜炎奈氏球菌)、Tsh (154632，大肠杆菌)、3印么(CAC05786，弗氏志贺氏菌)、EspC(AAC44731，大肠杆菌)、EspP (CAA66144,大肠杆菌)、Pet(AAC26634,大肠杆菌)、Pic (AAD23953，大肠杆菌)、SigA(AAF67320,弗氏志贺氏菌)、Sat (AAG30168,大肠杆菌)、Vat (AA021903,大肠杆菌)、EpeA(AAL18821,大肠杆菌)、EatA(AA017297,大肠杆菌)、EspI (CAC39286,大肠杆菌)、EaaA(AAF63237,大肠杆菌)、EaaC(AAF63038，大肠杆菌)、百日咳杆菌粘附素(P14283，百日咳博德特氏菌)、BrkA (AAA51646，百日咳博德特氏菌)、Tef (AAQ82668，百日咳博德特氏菌)、Vag8 (AAC31247,百日咳博德特氏菌)、PmpD (084818，沙眼衣原体(C.trachomatis))、Pmp20(Q9Z812，肺炎衣原体(C.pneumoniae))、Pmp21 (Q9Z6U5，肺炎衣原体)、IgAl 蛋白酶(NP_283693，脑膜炎奈氏球菌)、App(CAC14670，脑膜炎奈氏球菌)、IgAl蛋白酶(P45386，流感嗜血杆菌(H.1nfluenzae))、Hap (P45387,流感嗜血杆菌)、rOmpA(Pl5921,立氏立克次氏体(R.rickettsii))、r0mpB(Q53047，立氏立克次氏体)、ApeE (AAC38796，肠沙门氏菌)、EstA(AAB61674,绿脓假单胞菌(P.aeruginosa))、Lip-1 (P40601,发光致病杆菌(X.luminescens))、McaP (AAP97134,粘膜炎微球菌(M.catarrhal is))、BabA (AAC38081,幽门螺杆菌)、SabA (AAD06240,幽门螺杆菌)、AlpA (CAB05386,幽门螺杆菌)、Aae (AAP21063,伴放线放线杆菌(A.actinomycetemcomitans))、NanB (AAG35309,溶血巴斯德氏菌)、和这些自主转运蛋白的变体。对于自主转运蛋白的实例的每一种，适合的GenBank保藏号和可从中获得自主转运蛋白的物种的实例在括号中提供。自主转运蛋白的转运蛋白结构域优选地是大肠杆菌的AIDA-1蛋白或其变体，例如由Niewert等(2001)描述的那些。AIDA自主转运蛋白系统连接于来自已对其诊断为水肿病和所谓断奶后(postweaning)的猪的大肠杆菌分离株中的F18和Stx2e。以上提供的自主转运蛋白序列的变体可例如通过改变不属于跨膜区段的P -桶的环结构中的氨基酸序列来获得。任选地编码表面环的核酸可完全缺失。此外，保守氨基酸置换可在两亲性3-片层结构内进行，即，将一种亲水氨基酸置换为另一种亲水氨基酸和/或将一种疏水氨基酸置换为另一种疏水氨基酸。优选地变体尤其是在3-片层结构的区域中具有在氨基酸水平上与自主转运蛋白结构域的相应天然存在序列至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少98%的序列同一性。在本发明第一方面的第七实施方案中，其也代表第一至第六实施方案的实施方案，氧化还原因子再生多肽是氧敏感的。在优选的实施方案中，本文使用的术语“氧敏感的”表示，相应的多肽在氧存在、优 选地正常浓度(即，大气中存在的浓度)的氧存在下，经历快速的失活。在另一优选的实施方案中，本文使用的术语“氧敏感的”表示，相应的多肽在溶液和其他相中暴露于如同大气中的浓度或条件下的氧至少30分钟时，丧失其活性(优选地就其keat而言)的至少10 %、20 %、30 %、40 %、优选地50 %、非常尤其优选地80 %。在另一实施方案中，氧化还原因子再生多肽是可溶性多肽。在优选的实施方案中，本文使用的术语“可溶性多肽”是指在其天然环境中未结合于膜的多肽。例如，短乳杆菌的NADH氧化酶，一种胞质蛋白，是可溶性多肽。在另一优选的实施方案中，氧化还原因子再生多肽是膜结合的多肽，即，共价或非共价地结合或附加于细胞膜或膜内在蛋白的多肽。例如，呼吸链的复合体IV是膜结合的多肽。根据第二方面，本发明的目的由根据本发明第一方面的实施方案的核酸分子编码的多肽解决。在优选的实施方案中，该多肽包括SEQ ID NO:2或其变体。根据第三方面，本发明的目的以在其表面上表达根据第二方面的多肽或已经使用根据本发明第一方面的实施方案的核酸分子转化的细胞解决。在优选的实施方案中，本文使用的术语“细胞”与术语“宿主细胞”可互换地使用，是指能够表达多肽的细胞。这样的细胞还可称为“全细胞催化剂或生物催化剂”。在另一优选的实施方案中，细胞或宿主细胞是原核细胞，优选革兰氏阴性细菌细胞，非常尤其优选大肠杆菌细胞。在另一示例性实施方案中，细胞是真核细胞。在另一优选的实施方案中，细胞或宿主细胞是原核生物的孢子。根据第四方面，本发明的目的以可从根据本发明第三方面的细胞获得的膜级分(membrane fraction)角军决。细菌细胞包括多个区室，它们被疏水性膜彼此分隔。革兰氏阳性细菌细胞具有质膜，其对胞质即细胞的内部定界。质膜被肽聚糖层围绕。与之相比，革兰氏阴性细菌除了质膜以外，具有称为外膜的另一个膜。本文使用的术语“表面”优选地是指微生物暴露于周围环境的层，其中周围环境是例如用于培养目标细胞的液体培养基。在非常尤其优选的实施方案中，根据本发明的 多肽在革兰氏阴性细菌细胞的外膜外侧上表达。在优选的实施方案中，根据本发明的多肽在革兰氏阴性细菌细胞的外膜内侧上表达。在另一优选的实施方案中，根据本发明的多肽在原生质球的外侧上表达，其中原生质球是已经从其去除外膜的革兰氏阴性细菌细胞。本领域技术人员熟悉能够用于产生原生质球的方法。在另一优选的实施方案中，根据本发明的多肽在革兰氏阳性细菌细胞的外侧上表达。如此，在本文使用术语“在表面上展示”和“在表面上表达”时，它们是同义的。在本发明优选的实施方案中，可互换使用的两个术语膜级分或膜制备物，包括根据本发明第一方面的氧化还原因子再生多肽，优选地处于催化活性状态。本文使用的术语“膜级分”和“膜制备物”优选地是指富集膜组成部分、优选地革兰氏阴性细菌外膜的组成部分的产物。本领域技术人员熟悉可用于产生膜制备物的程序和方法。例如，可从培养物收获细菌细胞并将其裂解，例如通过冻融循环、超声处理、在裂解缓冲液中重悬或类似方法，随后差异离心，以分离细胞的膜级分。在本发明优选的实施方案中，膜制备物是外膜的制备物，即，其中相对于其他膜和区室的组成部分诸如胞质、内膜和周质，富集外膜组成部分的制备物。本领域技术人员熟悉可用于分离或富集外膜或其组成部分的程序和方法，例如溶菌酶处理细菌细胞，随后是离心步骤。在优选的实施方案中，膜级分可以是处理的膜级分，即，膜级分的内容物或特性已经被改变，例如通过纯化膜级分的蛋白组成部分或通过增溶膜级分和/或在小囊泡中吸收膜级分的组成部分。在本发明优选的实施方案中，膜级分可被固定-例如在容器表面或柱上。根据第五方面，本发明的目的以一种再生氧化还原因子的方法解决，所述方法包括以下步骤:a)提供根据本发明第二方面的多肽、根据第四方面的膜制备物或根据第三方面的细胞，和b)将根据第二方面的多肽、根据第四方面的膜制备物或根据第三方面的细胞与氧化还原因子再生多肽的至少一种底物接触。在优选的实施方案中，步骤a)和/或步骤b)在还原剂不存在时和/或在氧化环境中发生。根据第六方面，本发明的目的使用根据第三方面的细胞或根据第四方面的膜级分或根据第二方面的多肽以再生氧化还原因子来解决。根据第七方面，本发明的目的通过使用根据第三方面的细胞、根据第四方面的膜制备物和根据本发明第二方面的多肽以调整水溶液的氧化还原环境、优选地通过将所述水溶液脱氧来解决。在本发明优选的实施方案中，本文使用的术语“调整水溶液的氧化还原环境”是指直接作用于水溶液中的氧化还原条件，即，该溶液氧化或还原化合物的能力的任何措施。在本发明优选的实施方案中，本文使用的术语“将水溶液脱氧”是指可用于降低所述溶液中氧浓度的任何措施。本领域技术人员熟悉可用于测量水溶液的氧浓度的方法，诸如，例如，使用氧电极。根据第八方面，本发明的目的以一种产生在其表面上展示氧化还原因子再生多肽的细胞的方法解决，所述方法包括:(a)将根据本发明第一方面的实施方案的核酸引入细胞,和b)任选地将所述细胞与一种或多种氧化还原反应性辅基接触。根据第九方面，本发明的目的以一种产生氧化还原因子依赖性多肽的产物的方法解决，所述方法包括以下步骤:a)提供氧化还原因子依赖性酶，和(b)在根据第三方面的细胞、根据第四方面的膜制备物和根据本发明第二方面的多肽存在下，将所述氧化还原因子依赖性多肽与一种或多种其底物接触，从而根据第二方面的多肽再生氧化还原因子依赖性多肽所依赖的氧化还原因子。在优选的实施方案中，本文使用的术语“氧化还原因子依赖性多肽”是指具有生物活性、优选地酶活性的需要氧化还原因子作为辅因子、辅基、或优选地底物的多肽。在另一优选的实施方案中，本发明的目的用如下组合物解决:包含根据第三方面的细胞、根据第四方面的膜制备物和根据本发明第二方面的多肽以及氧化还原因子依赖性多肽和氧化还原因子的组合物。在一个实施方案中，氧化还原因子依赖性多肽使用自主转运蛋白系统展示，即，其表达由包括以下的核酸带来:(I)编码信号肽的区段、⑵包含优选为异源的氧化还原因子再生多肽或其变体的区段、(3)任选的编码蛋白酶识别位点的区段、
(4)编码跨膜接头的区段、和(5)编码自主转运蛋白或其变体的转运蛋白结构域的区段。本发明由以下附图和实施例进一步阐述，其不应理解为限制，从其可看到本发明的进一步的特征、实施方案、方面和益处。
图1显示质粒pAT-NOx的限制性图谱。图2显示SDS- 凝胶，其显示大肠杆菌外膜中的NADH氧化酶并通过全细胞消化显示了 NADH氧化酶的定向(orientation)。M)分子量标准；1)大肠杆菌UT5600 (DE3) ；2)大肠杆菌UT5600(DE3) pAT-NOx，未诱导的；3)大肠杆菌UT5600 (DE3)pAT_N0x，诱导的；4)大肠杆菌UT5600(DE3)pAT-NOx，诱导的，以蛋白酶K消化；5)大肠杆菌UT5600 (DE3)pAT-NOx，诱导的，以胰蛋白酶消化。图3显示在使用A)大肠杆菌UT5600 (DE3)pAT-NOx和B)大肠杆菌BL21 (DE3)pAT-NOx (在每种情形中诱导Ih后)的NADH氧化酶测定后上清液的吸收谱。图4显示在使用A)大肠杆菌UT5600 (DE3)pAT-NOx和B)大肠杆菌BL21 (DE3)pAT-NOx (在每种情形中诱导4h后)的NADH氧化酶测定后上清液的吸收谱。图5显示在使用A)大肠杆菌UT5600 (DE3)pAT-NOx和B)大肠杆菌BL21 (DE3)pAT-NOx (在每种情形中诱导20h后)的NADH氧化酶测定后上清液的吸收谱。图6显示使用在M9培养基中生长后的大肠杆菌BL21 (DE3) pAT-NOx在微量滴定板上进行的NADH氧化酶测定的结果。该图显示在340nm消光(extinction)随着时间的减少。图7显示已经在+8°C储存多于7周的NOX全细胞生物催化剂的结果。活性测定以储存前的细胞[A]和已经储存一周[B]、两周[C]、三周[D]、四周[E]、五周[F]、六周[G]和七周[H]的细胞进行。图8显示已经在_18°C储存多于7周的NOX全细胞生物催化剂的结果。活性测定以储存前的细胞[A]和已经储存一周[B]、两周[C]、三周[D]、四周[E]、五周[F]、六周[G]和七周[H]的细胞进行。图9显示已经在_70°C储存多于7周的NOX全细胞生物催化剂的结果。活性测定以储存前的细胞[A]和已经储存一周[B]、两周[C]、三周[D]、四周[E]、五周[F]、六周[G]和七周[H]的细胞进行。图10显示为了稳定性测定已经储存多于七周的样品中细胞计数的确定。该图显示在_18°C储存的样品中细胞计数的减少(■)，以及在+8°C储存的样品( )和在-70°C储存的样品(▲)中细胞计数的减少。对于确定细胞计数，从储存的部分样品中取出50 yl，用于准备系列稀释液。将50ml的10_9和10,稀释液的每一种铺板在含30mg/l卡那霉素的LB-琼脂平板上。在37°C培养平板过夜，次日对菌落计数。基于菌落形成单位的数目计算细胞计数/ml。图11显示周期性地重复五次的测定中NOX全细胞生物催化剂的再循环能力。 =宿主菌株大肠杆菌BL21 (DE3)，■=大肠杆菌BL21 (DE3) pAT-NOx。狭义地，显示了第一 [A]、第二 [B]、第三[C]、第四[D]和第五[E]循环中NADH浓度的减少的光度确定。图12显示使用生物催化剂大肠杆菌BL21 (DE3) pAT-NOx再生NAD+，狭义地显示全细胞生物催化剂大肠杆菌BL21 (DE3)pAT-NOx ( ■)、和再生系统( )中的NADH转化。大肠杆菌BL21 (DE3)pAT-NifAf( A )用作对照。NADH的消光在340nm监测。细胞的消光在590nm监测。通过计算E34tl-E59tl的差来进行评价。ALDH60mU，细胞0D1，反应以200 u M NADH开始。图13显示NAD+的再生，狭义地显示随着时间作为在340nm的消光的函数的NADH的浓度，尤其是在ALDH反应 期间或使用大肠杆菌BL21 (DE3) pAT-Nox的ALDH反应期间的NADH浓度。NADH浓度通过相对于细胞计数计算商数E34(l/E59(l来标准化。ALDH30mU，大肠杆菌 BL21 (DE3) pAT-NOx 0D5，大肠杆菌 BL21 (DE3) OD I，反应以 400 u MNAD+ 开始。
实施例通过在丝氨酸蛋白酶、胰蛋白酶或蛋白激酶K存在时培养细菌，检测载客、在这种情形中是NADH氧化酶的表面定位是可能的。由于其尺寸，胰蛋白酶和蛋白酶K不能穿过大肠杆菌的外膜，在这些蛋白酶存在时培养全细胞具有的效果是，只有位于外膜表面上的蛋白被消化。因此，表面上的载客被消化，而整合在膜中的蛋白组成部分被保护不受酶攻击，从而保持完整。这可通过SDS-PAGE证实。酶的定向基于全细胞消化来评价。图2显示以IPTG诱导表达后大肠杆菌菌株UT5600 (DE3) pAT-Nox的分离的外膜以及全细胞消化后分离的外膜。以IPTG诱导后，外膜中能够检测到约IOOkDa的预计的融合蛋白(泳道3)。以胰蛋白酶消化全细胞导致与代表0mpF/C和OmpA的初始粗略相等强度的条带相比,相应条带的强度减少，从而证实该蛋白朝向膜的外侧(泳道4和5)。这能够证实NADH氧化酶被使用自主展示系统展示在大肠杆菌的表面上。实施例2:建立用于监测NADH氧化酶活性的生长和试验条件NADH氧化酶的活性以光度测定来确定。NADH显示两个消光最大值，即在波长260nm和340nm,而NAD+仅在260nm显不一个最大值。这一差异可用于以光度学方法监测NADH向NAD+的氧化。向使用的营养培养基或缓冲液加入FAD，以允许酶的适当折叠以及FAD的获取。NOX生物催化剂的培养对20ml LB培养基(15 U g/ml卡那霉素)接种10 U I相应菌株的甘油培养物并在37°C和200转/分钟培养过夜。对于建立主要培养物(main culture)，对100ml LB培养基(15 u g/ml卡那霉素、IOii M EDTAUOmM巯基乙醇)接种2.5ml过夜培养物。在OD578 = 0.6时，以ImM IPTG诱导50ml培养物。在NADH氧化酶的情形，另外加入10 y M FAD。在30°C和200转/分钟诱导培养物lh、4h或20h。未诱导另一半培养物，但除此以外以与被诱导的培养物完全相同的方式处理。为NADH氧化酶测定准备细胞在诱导后，首先在冰上储存细胞15分钟，然后通过以5000转/分钟离心IOmin分离为沉淀。在20ml0.1M磷酸钾缓冲液，pH7.5，IOii M FAD中洗涤沉淀两次。然后以同样的缓冲液调整细胞的OD到50。NADH氧化酶测定用于检测NADH氧化酶活性的测定以Iml样品进行，其包含0.1M硫酸钾缓冲液，PH7.5、ImM DTT和IOOyM NADH作为底物。最终OD578为I的细胞用在测定中。在室温培养一小时后，通过离心从样品去除细胞。在200和400nm之间的波长记录上清液的光谱。首先，对于两种菌株，诱导NADH氧化酶基因的表达lh。图3中的UV谱显示，在这些条件下检测酶活性是不可能的，因为NADH已被缺少该质粒的宿主细胞氧化，这导致在340nm的消光最大值的消失。加入的酶被细胞获取，或被细胞分泌的酶转化。两种作用都能够由细胞在指数 生长期展示的高代谢率来解释，如对本文的细胞发现的。为了使得细胞进入静止生长期并从而将其基础代谢降到最低，首先将表达的诱导延长到4h。发现，加入的NADH再次被宿主细胞氧化(图4)。然而，包含pAT-Nox的细胞的NADH氧化活性超过缺少该质粒的宿主细胞的活性。而且，可检测到未诱导和诱导的细胞之间的定量差异。延长诱导时间到20h后，不再能够检测到NADH被缺少该质粒的宿主细胞氧化，这可以从以下事实观察到:在无细胞的阴性对照的情形中，NADH的消光最大值如此前一样存在，如图5所示。对于这些所谓的“静息细胞”(处于静止期的细胞)，现在有可能检测加入的NADH被位于表面上的NADH氧化酶的氧化。大肠杆菌BL21 (DE3)与大肠杆菌UT5600 (DE3)之间的许多差异是明显的。在大肠杆菌BL21 (DE)pAT-Nox的情形，未诱导的细胞将供应的NADH的大约一半转化为NAD+，而诱导的细胞转化所有可获得的NADH。未诱导的细胞的活性可以以下基础来解释:用于表达NADH氧化酶的17系统不是“钝的(denSe)”，g卩，T7-启动子的阻遏是不完全的，其甚至在未诱导的状态下导致基因被T7-聚合酶的低表达。与之相t匕，大肠杆菌UT5600(DE3)在未诱导的状态显示无活性，但诱导的细胞仅转化大约一半的NADH。这些结果证明，利用自主转运蛋白系统，能够在大肠杆菌表面上以其活性形式表达短乳杆菌的黄素蛋白-NADH氧化酶。随后在脱辅酶(apoenzyme)中掺入FAD表现为正确地继续并仅要求添加FAD。迄今的所有测量是定性性质的，是为了建立测定和为了寻找允许监测酶活性的条件。对于通过测量NADH随着时间的氧化来定量监测酶活性，将光学测定转移到微量滴定板，从而允许平行地观察尽可能多的样品。在基本培养基(M9)中培养细胞对IOml M9培养基(15 ii g/ml卡那霉素)接种相应菌株的20 ill甘油培养物并在37°C和200转/分钟培养过夜。将全部过夜培养物用于接种主要培养物，即160mlM9 (15 u g/ml卡那霉素)。培养物初始生长7h后，向培养物的一半加入ImM IPTG和0.2%乳糖作为碳源。另外，对于NADH氧化酶加入10 ii M FAD。诱导在30°C和200转/分钟进行16h。未向另一半培养物加入IPTG，但除此以外这些培养物以完全相同的方式处理。为活性测定准备细胞在诱导后，首先在冰上储存细胞15分钟，然后通过以5000转/分钟离心IOmin分离为沉淀。在20ml0.1M磷酸钾缓冲液，pH7.5，IOii M FAD中洗涤沉淀两次。然后以同样的缓冲液调整细胞到OD578 = 10。微量滴定板上的NADH氧化酶测定96孔微量滴定板的NADH氧化酶测定以0.1M磷酸钾缓冲液中每孔240 U I样品进行。使用的细胞的量使得测定中实现OD578为I。为了开始反应，加入200 ii M NADH0在室温培养0、3、7、15、30、45或60分钟后，在340nm观察微量滴定板中的测定(Mithras,BertholdTechnologies) 0为了避免细胞沉淀，在测量消光之前摇动板。在缓冲液中具有相应OD的细胞悬液用作参考。基于一系列试验，能够优化NADH氧化酶全细胞催化剂的产生，从而i)活性更高，ii)诱导的与未诱导的细胞之间的差异增加，和iii)对于无意义对照，仅存在低活性。尤其是，发现用于测量NADH氧化酶的培养物必须处于最佳状态。图6显示在标准条件下进行的NADH氧化酶测定的结果，如在“方法”部分描述的。与生长和试验条件有关的多种因素影响这一改进的酶活性。着眼于以更大规模使用，已经改良了细胞的生长，从而代替复合LB培养基，使用限定的M9培养基。在诱导期间，加入乳糖作为碳源，在OD578为约0.35较早地诱导细胞。较晚地诱导，通常在0.6，具有的结果是必须在M9培养基中过度长的生长，这导致自发的细胞裂解，具有的影响是无意义对照和未诱导的对照二者氧化作为底物供应的NADH。这很可能是因为由于细胞裂解而释放的酶。现在进行NADH氧化酶测定，并如上所述地在微量滴定板中直接在细胞悬液中观察。这使得操作更简单并且数据更可重现。然而，确定酶活性的绝对值是不可能的。以光度方法确定的酶活性根据Beer-Lambert法则计算。为了能够适用这一等式,必须已知比色杯或96-孔板的层厚度。在目前的试验设置中不能确定这一参数。因此以光度计确定NADH氧化酶的活性，使用具有确定的层厚度Icm的比色杯。从而能够适用Beer-Lambert法则。在30°C的温度,发现LB培养基中的活性为12.23mU/ml。在30°C M9培养基中的活性略高，为16.38mU/ml。在Hummel等(2003)的研究中，以简单方式纯化的酶的活性为10-15U/mg。实施例3:试验NADH氧化酶全细胞催化剂的稳定性和储存能力
对于研究NADH氧化酶全细胞催化剂的储存能力和稳定性，将诱导的细胞储存在冷藏室中8°C或冷冻室中-18°C或_70°C。每周通过NADH氧化酶测定以一式三份样品检查这些细胞。
在诱导基因表达后，将打算储存的细胞用磷酸钾缓冲液(0.1M，pH7.5)洗涤两次，在这一缓冲液中调整到OD578 = 10，分为部分的样品并在+8°C置于储存八周。如果细胞将要在-18°C或_70°C储存，向冷冻缓冲液中加入20%甘油。对于活性测定，将200-1i I样品中的细胞用前述缓冲液稀释到OD578 = 1，然后加入0.2mM NADH以开始反应。通过在入max=340nm测量消光的减少在一式三份的样品中监测NADH向NAD的氧化。为了考虑到储存期间发生的细胞裂解的效应，以与全细胞生物催化剂BL21 (DE3) pAT-NOX相同的方式储存宿主菌株大肠杆菌BL21 (DE3)并经历相同类型的活性测定。图7中的图显示在8°C储存不同时间的细胞悬液中NADH浓度的减少。如预计的，用作对照的宿主菌株大肠杆菌BL21(DE3)在储存前不显示任何NADH活性。然而，对于这些宿主细胞，储存刚一周后，该测定中观察到NADH浓度的明显减少，并且储存时间越长这一减少变得更显著。这一推测的NADH氧化酶活性可由细菌细胞的裂解来解释，这基于当细胞在8°C储存时经历开始得相对快速。在冷藏室中这一温度储存的细胞在数天后已经显示溶液中粘度增加，且不能被完全重悬。这一粘度增加可归因于细胞裂解期间染色体DNA的释放。此外，由于细胞裂解，释放了酶，其显然氧化了测定中用作底物的NADH。这一效应还可在储存NADH氧化酶全细胞催化剂大肠杆菌BL21 (DE3) pAT-NOX和随后的活性测定的情形中观察到。当储存时间增加时，在冷藏室中细胞裂解带来的NADH氧化将超过储存前测量的催化剂活性。因此不能建议在冷藏室中保存NADH氧化酶全细胞催化剂。当细胞在_18°C储存时，情况是不同的(图8)。对于用作阴性对照的宿主细胞，在卧式冷冻柜中_18°C储存后没有所导致的NADH氧化,而NADH氧化酶全细胞催化剂即使在8周后仍然展示NADH氧化酶活性，其-在正态分布的背景下-与初始活性相当。全细胞生物催化剂在-70°C储存7周后，没有观察到活性的显著减少(图9)。在这种情形中还能够排除宿主细胞的裂解。因此建议在_70°C储存全细胞生物催化剂。同时，与生物催化剂的活性平行地确定活细胞计数。结果显示在图10。储存在+8°C时，在前四周内活细胞计数减少三个数量级。储存持续另外三周时，此时活细胞计数保持相对恒定。这种曲线形状也 在_18°C或-70°C储存生物催化剂时观察到。然而，在这种情形中，前四周期间活细胞计数减少仅两个数量级。活细胞计数的减少与生物催化剂在七周的时间段内的活性不相关。活细胞计数随着在-18°C或-70°C储存减少,但活性保持粗略地恒定。然而，这一试验显示，在卧式冷冻柜(_18°C或-70°C)中储存比在冷藏室中+8°C储存更好。实施例4:全细胞生物催化剂的再循环能力的研究经30分钟的时间段以5个循环确定全细胞催化剂大肠杆菌BL21 (DE3)pAT-NOx有关转化NADH的再循环能力。对于这一测定，在诱导基因表达后，将细胞用磷酸钾缓冲液(0.lM，pH7.5)洗涤两次，且在这一缓冲液中重悬到最终OD578为10。对于确定活性，在微量滴定板中将200-1i I样品中的细胞用前述缓冲液稀释到OD578为1，然后加入0.2mM NADH以开始反应。通过在入_ = 340nm测量消光的减少在一式三份样品中监测NADH向NAD的氧化。对于再循环，完成反应后将细胞离心下来并重悬在160ul磷酸钾缓冲液中。再次地，力口A0.2mM NADH以开始反应，并以光度学方法监测氧化。这一程序重复共5个循环。为了考虑到处理期间可能发生的细胞裂解的影响，对作为阴性对照的宿主菌株大肠杆菌BL21(DE3)进行与全细胞生物催化剂BL21 (DE3)相同的测定。
缺少生物催化剂的宿主细胞用作对照。如可从图11观察到的，宿主细胞不转化任何NADH。在第一循环中(A)，全细胞生物催化剂在30分钟内转化几乎100%的存在的NADH。在进一步的循环中，转化和转化率减少。在最后一个循环中(第5循环，D)，培养时间内转化不到30%的NADH。细菌悬液的离心可能导致随后的循环中活性减少。离心力代表对细胞和尤其是对其表面上表达的分子的机械应力。实施例5:使用全细胞生物催化剂大肠杆菌BL21 (DE3) pAT-NOx再生NADH为NAD+进行这一试验以研究全细胞生物催化剂大肠杆菌BL21 (DE3) pAT-NOx是否能用作NAD+还原酶的再生系统。这使用包括全细胞生物催化剂和NAD+还原酶即醛脱氢酶(ALDH)的系统来试验。ALDH属于氧化醛类为相应的羧酸并从而还原NAD+为NADH的一组酶。以光度学方法监测NADH浓度。如可从图12观察到的，如预计的，包含全细胞生物催化剂大肠杆菌BL21(DE3)pAT-Nox的样品中的NADH浓度连续减少。与之相比,如果向生物催化剂加入重组酶ALDH，则在NAD+与NADH之间建立平衡，因为被ALDH连续还原为NADH的NAD+被生物催化剂大肠杆菌BL22(DE3)pAT-NOx再生。因此这一系统处于平衡。大肠杆菌BL21 (DE3)-NitAf用作所谓的无意义对照。这些细胞在其表面上展示来自粪产碱菌(A.faecalis)的腈水解酶，其不能氧化NADH，如也可从图12观察到的。图13在图的上半部显示，由ALDH介导的NADH增加。关于加入生物催化剂大肠杆菌BL21(DE3)pAT-Nox以再生NAD+，已经向这一反应加入宿主菌株大肠杆菌BL21 (DE3)，从而能够相对于细胞计数标准化NADH浓度(确定为在340nm的消光)。向ALDH反应加入生物催化剂大肠杆菌BL21 (DE3) pAT-NOx后，不能观察到NADH随着时间的进一步增加，因为由ALDH形成的NADH连续地被再氧化为NAD+。因此这一系统处于平衡。原始资料的细节就本文参考多种现有技术文献来说，这些文献通过引用以其全文形成本说明书的部分。提到的现有技术文献的完整目录细节在以下提供:
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在说明书、序列表、权利要求书和/或附图中公开的本发明的特征对于以其多种形式实施本发明可以·单独和以任何组合在法律上相关。
权利要求
1.一种核酸分子，包含以下组成部分: (1)编码信号肽的区段， (2)包含异源氧化还原因子再生多肽的区段， (3)任选的编码蛋白酶识别位点的区段， (4)编码跨膜接头的区段，和 (5)编码自主转运蛋白或其变体的转运蛋白结构域的区段。
2.如权利要求1所述的核酸分子，其中由所述氧化还原因子再生多肽再生的所述氧化还原因子选自包括以下的组:NADH、NADPH、FADH2、血红素、金属离子、谷胱甘肽、吡咯并喹啉-醌、磷酸吡哆醛、焦磷酸硫胺素和抗坏血酸。
3.如权利要求1或2之一所述的核酸分子，其中所述氧化还原因子再生多肽包括一种或多种黄素辅因子。
4.如权利要求1至3之一所述的核酸分子，其中所述氧化还原因子再生多肽选自包括以下的组:NADH氧化酶、甲酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶。
5.如权利要求4所述的核酸分子，其中所述氧化还原因子再生多肽选自包括以下的组:短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)、水生栖热菌(Thermus aquaticus)、短杆菌属(Brevibacterium)物种KU139和幾链球菌(Streptococcus faecalis)的NADH氧化酶,优选地短乳杆菌的NADH氧化酶,和其变体。
6.如权利要求1 至5之一所述的核酸分子，其中所述自主转运蛋白的转运蛋白结构域选自包括以下的组:Ssp、Ssp-hl、Ssp_h2、PspA、PspB、Ssal、SphBl、AspA/Nalp、VacA、AIDA-1> IcsA、MisL、TibA、Ag43、ShdA> AutA> Tsh、SepA、EspC、EspP、Pet、Pic、SigA、Sat、Vat、EpeA、EatA、Esp1、EaaA、EaaC、百日咳杆菌粘附素、BrkA、Tef、Vag8、PmpD、Pmp20、Pmp21、AgA I 蛋白酶、App、Hap、r OmpA、r OmpB、Ap eE、Es tA、Lip-1、McaP、BabA、SabA、AI pA、Aae、NanB、和其变体。
7.如权利要求1至6之一所述的核酸分子，其中所述氧化还原因子再生多肽是氧敏感的。
8.一种多肽，由权利要求1至7之一所述的核酸分子编码。
9.一种细胞，所述细胞在其表面上表达权利要求8所述的多肽或已经被使用权利要求1至7之一所述的核酸分子转化。
10.一种膜级分，所述膜级分是从权利要求9所述的细胞可获得的。
11.一种再生氧化还原因子的方法，包括以下步骤: (a)提供权利要求8所述的多肽、权利要求10所述的膜制备物或权利要求9所述的细胞， (b)将权利要求8所述的多肽、权利要求10所述的膜制备物或权利要求9所述的细胞与氧化还原因子再生多肽的一种或多种底物接触， 其中所述一种或多种底物包括所述氧化还原因子。
12.权利要求9所述的细胞或权利要求10所述的膜制备物或权利要求8所述的多肽用于再生氧化还原因子的用途。
13.权利要求9所述的细胞、权利要求10所述的膜制备物和权利要求8所述的多肽用于调整水溶液的氧化还原环境的用途，优选地是通过将所述水溶液脱氧。
14.一种产生在其表面上展示氧化还原因子再生多肽的细胞的方法，包括以下步骤: (a)将权利要求1至7之一所述的核酸引入细胞， (b)任选地将所述细胞与一种或多种氧化还原反应性辅基接触。
15.一种产生氧化还原因子依赖性酶的产物的方法，包括以下步骤: (a)提供氧化还原因子依赖性酶， (b)提供权利要求9所述的细胞、权利要求10所述的膜制备物或权利要求8所述的多肽，和 (c)在权利要求9所述的细胞、权利要求10所述的膜制备物或权利要求8所述的多肽存在下，将所述氧化还原因子依赖性酶与一种或多种其底物接触， 其中权利要求9所述的细胞、权利要求10所述的膜制备物或权利要求8所述的多肽包括再生所述氧 化还原因子依赖性多肽所依赖的氧化还原因子的多肽。
全文摘要
本发明涉及包含编码信号肽的区段、包含异源氧化还原因子再生多肽的区段、任选地编码蛋白酶识别位点的区段、编码跨膜接头的区段、和编码自主转运蛋白或其变体的转运蛋白结构域的区段的核酸分子。该核酸分子使得能够表达氧化还原因子再生酶。
文档编号C12N9/02GK103140583SQ201180041285
公开日2013年6月5日 申请日期2011年8月26日 优先权日2010年8月27日
发明者约阿希姆·乔斯, 鲁斯·马斯, 伊娃·克拉嫩 申请人:齐鲁斯专利I投资有限及两合公司
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