由生物质制造纤维二糖的制作方法

xiaoxiao2020-6-24  3

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专利名称:由生物质制造纤维二糖的制作方法
技术领域
本发明涉及由甜菜和其它含有纤维素的生物质酶法制造纤维二糖的方法。纤维二糖是由经β-1,4键连接的两分子葡萄糖组成的二糖。本发明的方法允许纤维二糖的经济制造和高产率。
背景技术
纤维二糖是食物、动物饲料、化学品、化妆品和制药产业中的有价值成分。可以通过化学和生化方法由聚合纤维素或者由二糖比如蔗糖制造纤维二糖。当使用纤维素原料时,可以通过化学酸解或者通过酶解来制备纤维二糖。在化学水解过程中,使纤维素进行酸比如硫酸或冰醋酸处理以制造纤维二糖八乙酸酯,其随后通过化学去乙酰化被转化成纤维二糖(Pereira等人,(1988):Methods Enzymol., 160, 26)。在酶解过程中,通过纤维素水解酶的处理来由含纤维素的原料制造纤维二糖(Taniguchi (1989, Nippon Nogeikagaku Kaishi, 63,1133)。酶法可导致较高的产率,并且与化学方法相比,其不需要毒性试剂,也不涉及废料处理问题。当将木浆或纸浆用于酶催化的纤维二糖制造时,可以应用物化预处理,其可包括在存在或不存在碱或酸催化剂比如硫酸的情况下的水热处理(US4908311、JP2006204294)。这些物化预处理使底物的结晶度指数降低,这增加了纤维素酶作用于底物的纤维素部分的倾向,从而保证更高的产物产率(JP2006204294)。然而,高温(> 120°C )和/或高酸浓度(>l%w/v)预处理导致降低酶解活性并限制产物产率的抑制性化合物的形成(Palmqvist andHahn- Hagerdal (2000), Bioresource Technology, 74, pp.25-33)。除了物化方法外,还可以应用机械(B卩,洗涤、碾磨、筛分、干燥)和酶促预处理来从复合生物质比如甜菜渣中去除不想要的生物质组分,比如果胶和半纤维素(Bonnin, E.等人,(2000) Carb.Poly., 41, pp.143-151, M icard, V.等人,(1997) Lebensmitt.Wiss.U.Technol.30, pp.284-291)。在这些过程中,应用纤维素副活性(side-activities)非常低的果胶酶制剂来选择性地溶解和去除非纤维素组分。随后,可以使剩余的纤维素富集的固相与纤维素酶制剂接触以获得纤维二糖。可用于纤维二糖制造的商用纤维素酶制剂是具有水解酶活性的复合混合物。这些活性可以分组为内切纤维素酶(例如,内切葡聚糖酶)、外切纤维素酶(例如,纤维二糖水解酶)以及二糖和寡糖水解酶(例如,葡萄糖苷酶,也经常被称为纤维二糖酶)。尽管内切纤维素酶和外切纤维素酶从聚合纤维素链中释放寡糖和二糖(纤维二糖),但β -葡萄糖苷酶(beta-葡萄糖苷酶,BGL)将这些产物转化成葡萄糖单体。因此,为了最佳地制造纤维二糖,BGL活性是不期望的。大多数纤维素酶制剂含有β_葡萄糖苷酶活性,这会使纤维二糖降解成葡萄糖。该葡萄糖苷酶活性可以通过添加抑制剂比如D-葡糖酸内酯而被抑制(Reese 等人,1971, Carbohydrate Research, 18, 381-388)。尽管可以通过添加抑制剂比如D-葡糖酸内酯而原位(in-situ)实现BGL活性抑制(Bonnin 等人,(2000), Carbohydr.Polymers41, pp.143-151),但通常通过层析方式来实现BGL从酶复合物中的去除。可使用天然或加工过的纤维素(Tanaka,M.(2000), The Bull, of Okayama Univer.0f Sc1.36,pp.217-223; Homma 等人,(1992), J.Chem.Engineer, of Japan25, pp.288-93)或几丁质(Homma 等人,(1993), Biotechnol.andBioengineer.41,pp.405-410)作为层析树脂,其允许内切纤维素酶和外切纤维素酶的选择
性保留。已经将葡萄糖氧化酶用于从蛋白中去除葡萄糖(Sisak等人,2006,Enzyme andMicrobial Technology, 39, 1002-1007),从而从含甘露糖的混合物中(Mislovicova 等人,2009,Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 60, 45-49)并从葡聚糖寡糖中(Mislovicova 等人,2009,Process Biochemistry, 42, 704-709)去除葡萄糖。出于葡萄糖氧化的目的,需要分子氧或数种氧化剂,比如人工的钌或锇复合物(Ivanova等 Α 2003, Biochem.Moscow, 68 (4), 407-415 ;ffohlfahrt 等人,2004,Mol.Cel1.Biochem., 260, 69-83)。

根据现有技术,通过在45 55°C于50 200mM的pH为4.5 5.5的缓冲液中以I 20%w/w干物质的酶与底物比添加纤维素酶2 600小时来从纤维素底物中释放出纤维二糖(Micard 等人,(1997), Lebensm.-Wiss.u.-Technol.30, pp.284-291,Micard等人,2000,Vanderghem 等人,(2009),Appl.Biochem.Biotechnol.DOI10.1007/S12010-009-8724-7)。纤维二糖产率受纤维二糖水解酶(CBH)的催化效率的限制,该纤维二糖水解酶被终产物纤维二糖显著抑制(Ki 0.3mM)。已经描述了为提高纤维二糖产率的工艺选择,其中以适时间隔从反应混合物中去除含纤维二糖的液相。该工艺被描述为以分批(batch)、补料分批(fed-batch)或连续模式运行(Micard 等人,(1997),Lebensm.-Wiss.u.-Technol.30, pp.284-291,Bonnin 等人,(2000), Polymers41, pp.143-151,Vanderghem等人,(2009),Appl.Biochem.Biotechnol.DOI10.1007/sl2010-009-8724_7,Homma 等人,(1993),Biotechnol.and Bioengineer.41, pp.405-410, ;Tanaka, Μ.(2000), The Bull, ofOkayama Univer.0f Sc1.36,pp.217-223)。就初始纤维素成为期望的产物而言,已经描述了 2 40%w/w之间的纤维二糖产率。描述的酶解方法的纤维二糖选择性在60 85%w/w之间(Micard 等人,(1997),Lebensm.-Wiss.u.-Technol.30,pp.284-291 ;W09203565)o为了纯化纤维二糖,除了其它杂质之外,还需要将副产物葡萄糖从纤维二糖中分离出来。可通过使溶液通过固定化酵母柱,在此葡萄糖被酵母选择性地代谢,从而去除葡萄糖。之后回收纤维二糖(US4,908,311)。还可通过将溶液冷却至(TC或之下使纤维二糖沉淀来回收纤维二糖。或者,可以添加有机溶剂来沉淀纤维二糖。可通过在强酸性阳离子交换器上分馏随后反复结晶来进行纤维二糖的脱盐和脱色。已知的用于由纤维素酶法制造纤维二糖的方法利用含有低纤维素含量(2 7%w/V干物质)的原料流(例如,纸制浆废水)。结果,由酶促反应得到的纤维二糖浓度比较低。从经济的观点出发,酶促降解任意给定量的纤维素所需的比较大的容器和浓缩所得纤维二糖溶液的任选需求效率很低。已知的用于由纤维素酶法制造纤维二糖的方法还需要高达10%酶/底物w/w的高酶用量方案。因此,从经济的观点出发,理想的是减少所需的酶。
纤维二糖可以用作聚合物的构造块,用作食物成分,比如用作动物饲料添加剂,比如用作益生(pre-biotic)添加剂,用作化妆品添加剂或成分,或者用于抗炎性药物制剂中(Briton 等人,(2003) Ann.New York.Acad.Sc1.pp.750-54 ;Briton 等人,(2003)Hemijsk Industrija57,pp.622-625,US5219842 ;Kurita 等人,(2003),Poly.Chem.Ed.18,pp.365—370)。待解决的问题从经济的观点出发,酶成本和纤维二糖产物产率是酶促纤维二糖制造方法的重要参数。因此,本发明要解决的问题是提供用于制造纤维二糖的经济方法,其包括由含有纤维素的材料酶促降解纤维素。本发明要解决的问题还包括提供用于制造高浓度的纤维二糖的方法。

发明内容
本发明提供一种由含有纤维素的材料制造纤维二糖的经济上高效的方法,其中可实现高底物产率。本发明还提供由含有纤维素的材料制造纤维二糖的经济上高效的方法,其中使用低酶/底物。具体而言,本发明涵盖用于制造纤维二糖的方法,包括以下步骤:c)在 7.5 50% (w/w)、优选在 10 25% (w/w)、且更优选在 12 20% (w/w)的干物质含量下使含有纤维素的材料进行纤维素酶处理,以及d)将c)中获得的含有纤维二糖的液相与固相分离。用于制造纤维二糖的底物是含有纤维素的材料。许多含有纤维素的材料是适用于本发明方法的底物,具体是微晶纤维`素、来自造纸业的漂白和未漂白纸浆、organocell浆料、纸、纸板、硬纸板、木材、木片、树皮、小麦和其它粮食秸杆、玉米秸杆、甘蔗渣、甜菜渣、马铃薯皮、蔬菜残余物或果浆。在优选的实施方式中,用作本发明方法中底物的含有纤维素的材料是或者包括甜菜渣。在更优选的实施方式中,通过以下步骤进行上述方法:使含有纤维素的材料进行如下处理,该处理产生含有果胶、半纤维素和/或其降解产物的液相以及含有纤维素的固相;以及将所得固相与液相分离并使其进行上述的纤维素酶处理。在优选的实施方式中,在存在酶制剂的情况下进行上述的酶处理,该酶制剂包括至少一种类型的表现出纤维二糖水解酶活性的多肽。优选的是使用的纤维素酶组合物表现出降低的或最低的β_葡萄糖苷酶活性。用于获得这样的纤维素酶组合物有多种方式是可行的,包括但不限于:从缺乏表现出β_葡萄糖苷酶活性的酶的有机体中获得纤维素酶组合物,去除任何表现出β -葡萄糖苷酶活性的多肽,抑制任何表现出葡萄糖苷酶活性的多肽。在更优选的实施方式中,通过上述方法获得的含有纤维二糖的液相进行进一步的后处理(work-up)步骤,其包括:任选地浓缩纤维二糖溶液,以及由(任选浓缩的)纤维二糖溶液进一步纯化纤维二糖。可以例如通过一种或多种以下方式纯化纤维二糖:纤维二糖结晶、层析、纳滤、经有机溶剂沉淀、或使用微生物,其中优选结晶。可以在去除含有纤维二糖的液相之后进行含有纤维二糖的液相的去除。然而,在可选的实施方式中,也可以与去除含有纤维二糖的液相并行地进行含有纤维二糖的液相的去除。就本发明的意义而言,还可以去除可存在于含有纤维二糖的液相中的任何葡萄糖。葡萄糖去除的优选方式是将其氧化成葡糖酸。然后可通过一种或多种下列方式去除葡糖酸:离子交换层析、沉淀、电渗析,其中优选离子交换层析。


图1:以纤维素底物百分比呈现的在水解步骤中去除降解纤维二糖的酶活性之后的混合物中的纤维二糖和葡萄糖的产率图2:取决于干物质含量的水解后纤维二糖浓度图3:在不同的E/S比率下由甜菜渣制造纤维二糖图4:由不同的纤维素材料制造纤维二糖图5:水解甜菜渣之后的纤维二糖产率图6:葡萄糖氧化酶的底物特异性测试图7:葡萄糖氧化酶活性引起葡萄糖浓度降低图8:通过离子交换层析将葡糖酸与纤维二糖分离
具体实施例方式本发明提供由含有纤维素的材料制造纤维二糖的经济上高效的方法,其中可实现高底物产率。本发明还提供由含有纤维素的材料制造纤维二糖的经济上高效的方法,其中使用低酶/底物。底物:用于制造纤维二糖的底物是含有纤维素的材料。许多含有纤维素的材料是适用于本发明方法的底物,具体是微晶纤维素、来自造纸业的漂白和未漂白纸浆、organocell浆料、纸、纸板、硬纸板、木材、木片、树皮、小麦和其它粮食秸杆、玉米秸杆、甘蔗渣、甜菜渣、马铃薯皮、蔬菜残余物或果浆。在本发明的优选实施方式中,相关的底物含有显著较大的无定形纤维素与结晶纤维素的比率。进行下述酶解步骤的含有纤维素的材料相对于纤维素总量优选含有50%或更高的无定形纤维素,并且该材料优选是或者包括果浆或蔬菜残余物,或者是甜菜生物质,或者更优选地是或包括甜菜渣。优选的是相对于纤维素总量为50%或更高的无定形纤维素含量(《/ ),且特别优选的是在进行酶解步骤的含有纤维素的材料中无定形纤维素含量为60 99% (w/w)。在另一个优选的实施方式中,在酶解之前通过物化方式处理含有纤维素的底物。物化处理可以是酸处理或热处理或其任意组合,从而使底物中的部分或全部结晶纤维素部分无定形。在优选实施方式中,含有纤维素的底物是任意形式的甜菜、蔬菜或水果生物质。在特别优选的实施方式中,底物是甜菜渣,或蔬菜残余物,或果浆残余物。在特别优选的实施方式中,用作本发明方法中底物的含有纤维素的材料是或者包括甜菜渣。“甜菜渣”是指从甜菜(甜菜,Beta vulgaris)提取部分或所有蔗糖之后的残余生物质材料。可在提取之后新鲜地使用甜菜渣,经过或 不经过压制。新鲜的甜菜渣通常具有19 29%w/w的干物质含量。也可在干燥之后使用甜菜渣,经过或不经过造粒。干燥的甜菜渣通常具有85 90%w/w的干物质含量。底物可以是纤维素材料或木质纤维素材料。材料可以是新鲜的(例如,新鲜的甜菜渣、来自造纸厂的湿纤维素)、或干燥的(例如,干燥的稻草、干燥的甜菜渣、木材、纸)或者是任意其它形式,包括任意形式的保存材料。在特别优选的实施方式中,底物是新鲜的甜菜渣、青贮的甜菜渣、干燥的甜菜渣或干燥并造粒的甜菜渣。在优选的实施方式中,甜菜渣是底物并且以高干物质含量在升高的温度下用酸处理。通过使用输送带或螺旋输送机实现将这种材料运输入或运输出预处理反应器的处理。可以通过使用特殊种类的搅拌装置比如锚式搅拌器或分段式螺旋搅拌器来进行混合,这些装置确保均匀的动力输入以及温度和添加物质的均匀分布。底物中包括的纤维素水解成纤维二糖:本发明涵盖用于制造纤维二糖的方法,包括以下步骤:c)在 7.5 50% (w/w)、优选在 10 25% (w/w)、且更优选在 12 20% (w/w)的干物质含量下使含有纤维素的材料进行纤维素酶处理,以及d)将c)中获得的含有纤维二糖的液相与固相分离。可以使用基于膜的方法、或者在对流装置中(counter-flow setup)、或者以其任意组合以多种方式例如分批、反复分批(repeated batch)、连续、半连续的方式进行水解。这表明,在更优选的实施方式中,上述方法的步骤c )和d)重复多次,其中在后续的循环中向固相添加新鲜的水相,且任选地不添加纤维素酶或不添加包括表现出纤维素酶活性的多肽的酶制剂。下面详细给 出酶组合物及其各种优选的实施方式。在优选的实施方式中,同时进行上述方法的步骤c)和d)。实施该实施方式的技术方式是例如,通过使用膜反应器结构经液相去除纤维二糖。发现,通过使用膜反应器结构,时空产率显著改进。在更优选的实施方式中,使用膜,其在反应器中保持固相但允许溶解的组分比如纤维二糖和其它物质通过膜。在特别优选的实施方式中,使用微滤膜或超滤膜。通常可使用超滤来保持数个纳米或更大尺寸的颗粒,而采用孔径在0.05 10微米(μπι)之间的多孔膜的微滤能够以Pm尺寸范围来分离颗粒。超滤膜通常能够保持油、月旨、蜡、树脂、以及固体比如沙、研磨残余物和金属氢氧化物。然而,使用超滤膜通常不能保持可溶组分比如盐和低分子有机物质。典型的超滤膜具有500D 50kDa,或30kDa
3.5kDa的截留(cut-off)。因此,微滤膜和超滤膜两者均适用于该分离工序。其实例在以下实施例10中给出。在特别优选的实施方式中,在工序过程中向膜反应器中添加额外的水相比如水或缓冲液。在另一个特别优选的实施方式中,膜反应器中的容积保持在恒定水平。在另一个特别优选的实施方式中,在水解过程中添加额外的干物质,即额外的含有纤维素的固体。这些特别优选的实施方式中的两个或三个可以相互组合。当在水解过程中添加额外的含有纤维素的固体时,在水解过程中水解步骤中的干物质含量保持恒定或随时间升高。此外,平均的纤维二糖浓度增加,这对于纤维二糖下游加工而言被认为是有益的。在另一个优选的实施方式中,使用膜反应器结构,其包括粗膜、截留在500D 50kDa之间的超滤膜的组合,优选随后进行纳滤步骤。在另一个优选的实施方式中,超滤膜具有3.5kD 30kDa的截留。使用纳滤步骤来浓缩纤维二糖。因此,在更优选的实施方式中,同时进行上述方法的步骤c)和d)。这可以通过用新鲜的水相连续替换含有纤维二糖的液相来完成。在优选的实施方式中,使用反复分批方法,干物质含量在7.5 50%(w/w)之间,优选在10 25% (w/w)之间,且更优选在12 20% (w/w)之间,并且酶-底物比在0.05 1%酶d.m底物(w/w)之间。这允许短的循环时间和高的总体产率。在另一个优选实施方式中,使用膜反应器,其能够连续去除含有纤维二糖的液相。膜优选为粗膜、截留在500D 50kDa之间的超滤膜的组合,随后进行纳滤步骤。在另一个优选的实施方式中,超滤膜具有3.5kD 30kD的截留。使用纳滤步骤来浓缩纤维二糖。在另一个优选的实施方式中,除了超滤膜和纳滤膜之外,还使用微滤膜,以改进产物流的净化。上述方法允许高效地再循环纤维素酶、简单地回收纤维二糖。其还允许使用较小的反应器尺寸来处理任意给定量 的含有纤维素的材料,且其允许高效地再利用工艺水。各个这些优点以及其组合使得纤维二糖制造方法具有改进的经济特性。酶鉬合物 可以使用酶制剂或酶组合物来执行用于纤维二糖制造的上述步骤b)的纤维素酶处理。该酶制剂优选包括至少一种具有纤维二糖水解酶活性(EC3.2.1.91,CBH)的多肽。在优选的实施方式中,上述方法的步骤c)中的酶/底物比为0.01 0.5%,优选为0.05 0.1%。在本发明的更优选的实施方式中,纤维素酶制剂还含有至少一种具有内切葡聚糖酶活性(EC3.2.1.4,EG)的多肽,以将聚合底物纤维素分解成更小的片段,其更易受由纤维二糖水解酶活性引起的水解。在本发明的一个实施方式中,纤维素酶制剂来源于真菌发酵,例如,来源于真菌比如木霉属(Trichoderma)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、篮状菌属(Talaromyces sp.)或青霉属(Penicillium sp.)的培养上清。这些纤维素酶制剂,除了含有纤维二糖水解酶(EC3.2.1.91,CBH)和内切葡聚糖酶(EC3.2.1.4,EG)之外,还经常含有将纤维二糖水解成葡萄糖的β - (beta-)葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21,BGL)。在本发明的优选实施方式中,上述方法中用于降解含有纤维素的材料的纤维素酶制剂表现出降低的葡萄糖苷酶活性。在更优选的实施方式中,上述方法中使用的纤维素酶制剂源自缺乏表现出显著β -葡萄糖苷酶活性的酶的有机体,并且优选源自其中至少一个且更优选所有的编码表现出β-葡萄糖苷酶活性的多肽的基因都被删除或被致功能障碍。在优选的实施方式中,原始纤维素酶制剂含有β_葡萄糖苷酶活性,但通过将原始纤维素酶制剂加入选自含有纤维素、含有几丁质和含有壳聚糖的材料的吸附材料中随后洗涤该吸附材料,使β_葡萄糖苷酶活性最小化或消除,这样得到其中β_葡萄糖苷酶活性最小化或消除的含有β_葡萄糖苷酶活性的纤维素酶制剂。在特别优选的实施方式中,吸附材料是下述方法的步骤a)中获得的含有纤维素的固相。简而言之,所述步骤a)包括使含有纤维素的材料进行处理,该处理产生含有果胶、半纤维素和/或其降解产物的液相以及含有纤维素的固相。
在更优选的实施方式中,通过使纤维素酶制剂通过甜菜渣而使β_葡萄糖苷酶活性被去除或降低,这使得对于指定底物的纤维素酶(CBH,EG)活性被选择性地保留,而β -葡萄糖苷酶活性被去除或降低,最小化或消除。在另一个优选的实施方式中,使用β_葡萄糖苷酶活性不足的菌株来制造纤维素酶制剂。β -葡萄糖苷酶缺陷表达菌株可以通过常规的诱变和选择而产生,或者通过选择性分子生物学和特异敲除菌株的生成而产生。在另一个优选的实施方式中,上述方法中的包括表现出纤维素酶活性的多肽的酶制剂包括来自以下纤维二糖水解酶(EC3.2.1.91)的至少一种纤维二糖水解酶:属于糖基水解酶的第6家族或第7家族的糖基水解酶。糖基水解酶家族是本领域技术人员所熟知的,并且已被Henrissat等人(1998,FEBS Lett.425(2):352-354)分类。特别优选的是属于纤维二糖水解酶1、纤维二糖水解酶II之一的表现出纤维二糖水解酶活性的多肽。更优选的是以下表现出纤维二糖水解酶活性的多肽:来自里氏木霉(Trichoderma reesei)的CBHI(SEQ ID N0.1),来自里氏木霉的CBHII (SEQ ID N0.2),表现出纤维二糖水解酶活性且与SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.2具有70%或更多、优选80%或更多、且更优选90%或更多一致性的多肽。特别优选的是,由缺乏可测量的β_葡萄糖苷酶活性的重组酵母或真菌表达宿主的分泌而产生表现出纤维二糖水解酶活性的多肽。在本发明的优选实施方式中,由缺乏表现出任何可测量的β -葡萄糖苷酶活性的酶的有机体产生纤维素酶制剂。优选地,使用如下的有机体,其中至少一个、更优选所有的编码表现出可测量的β_葡萄糖苷酶活性的多肽的基因被删除或被致功能障碍。在优选的实施方式中,使用里氏木霉菌株,其中一个或多个编码表现出β_葡萄糖苷酶活性的多肽的基因被删除或被致功能障碍。在特别优选的实施方式中,使用里氏木霉菌株,其中至少基因bgll (E.C.3.2.1.21)被删除或被致功能障碍。在另一个优选的实施方式中,使用一种重组纤维素酶或多种重组纤维素酶,其由不表现出任何可检测的BGL活性的表达宿主异源表达。优选地,至少一个编码以下纤维二糖水解酶中的一种的基 因通过重组DNA技术被克隆到表达宿主中:属于糖基水解酶的第6家族或第7家族的糖基水解酶(Henrissat等人,1998,FEBS Lett.425(2): 352-354)。特别优选的是属于纤维二糖水解酶1、纤维二糖水解酶II之一的表现出纤维二糖水解酶活性的多肽。更优选的是以下表现出纤维二糖水解酶活性的多肽:来自里氏木霉的CBHI (SEQID N0.1),来自里氏木霉的CBHII (SEQ ID N0.2),表现出纤维二糖水解酶活性且与SEQ IDN0.1或SEQ ID N0.2具有70%或更多、优选80%或更多、且更优选90%或更多一致性的多肽。优选由缺乏可测量的葡萄糖苷酶活性的重组酵母或真菌表达宿主的分泌而产生纤维二糖水解酶。这样的有机体的非限制性列举包括毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、多形汉逊酵母(Hansenula poIymorpha)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)。在本发明的另一个实施方式中,纤维素酶制剂含有β_葡萄糖苷酶活性,但具有β -葡萄糖苷酶活性的多肽的酶活性因添加抑制剂比如D-葡糖酸内酯而受到抑制。可以向反应中添加D-葡糖酸内酯或者可以通过酶葡萄糖氧化酶和氧来由葡萄糖原位产生D-葡糖酸内酯。D-葡糖酸内酯可以自发分解并形成葡糖酸(Guisepp1-Elie等人,2009,Journalof Molecular Catalysis B:Enzymatic, 58,118-123)。
在本发明的优选实施方式中,连续地原位形成D-葡糖酸内酯,因此在反应的全部时间内都存在D-葡糖酸内酯尽管其可能分解。除了抑制作用,葡萄糖氧化成D-葡糖酸内酯以及后续的自发降解成葡糖酸还有利于之后通过例如离子交换层析或电渗析来进行纤维二糖的纯化。在本发明的另一个实施方式中,通过将葡萄糖氧化酶固定到活性碳上而使形成的对葡萄糖氧化酶具有损害作用的副产物过氧化氢的浓度最小化,该活性碳对过氧化氢分解有强催化作用。这具有额外的优点,即,一半量的所消耗分子氧得以回收。在本发明的更优选实施方式中,向反应器中加入过氧化氢酶或活性碳。过氧化氢酶或活性碳催化过氧化氢分解成水和分子氧。为此,通过向水解反应器中供应过氧化氢还可以原位产生分子氧,避免了复杂的空气或氧通风。在另一个优选的实施方式中,通过使用葡萄糖氧化酶(GOX)将副产物葡萄糖从经可选酶法制造的纤维二糖中去除。可选方法是通过使用磷酸化酶由淀粉(MasayukiSuzuki, Kyoko Kanedaj Yukiko Nakai,Motomitsu Kitaoka 和 Hajime Taniguchij NewBiotechnology Volume26,Issues3_4,310ctober2009,Pagesl37_142)或由鹿糖(US5077205,1991)而酶法制造纤维二糖。其它可选方法在高浓度的葡萄糖下利用β-葡萄糖苷酶的转移酶活性(Murray P, Aro N,Collins C,Grassick A,Penttila.Mj SaloheimoM,Tuohy Μ., Protein Expr Purif.2004Dec;38 (2):248-57)。包括表现出纤维素酶活性的多肽的酶混合物可以具有不同的细菌、植物、酵母或真菌来源,比如,来自细菌来源,如芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、链霉菌属(Streptomycessp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、埃希氏菌属(Escherichia sp.),或者来自酵母来源,如来自毕赤酵母属(Pichia sp.)、酵母属(Saccharomyces sp.)、假丝酵母(Candidasp.)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces sp.)、耶罗维亚酵母属(Yarrowia sp.)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces sp.)或者来自其它真菌来源,如来自枝顶孢属(Acremonium sp.)、曲霉属(Aspergillus sp.)、短梗霉属(Aureobasidiurn sp.)、隐球菌属(Cryptococcussp.)、Filibasidium 属、德刀菌属(`Fusarium sp.)、腐质霉属(Humicola sp.)、青霉菌属(Penecillium sp.)、篮状菌属(Talaromyces sp.)、嗜热子囊菌属(Thermoascus sp.)或木霉属(Trichoderma sp.)。在优选实施方式中,包括表现出纤维素酶活性的多肽的酶制剂源自木霉属,更具体地,源自里氏木霉、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichodermakoningii)、长枝木霉(Trichoderma 1ngibrachiaturn)或绿色木霉(Trichodermaviride)。在特别优选的实施方式中,上述纤维素酶制剂源自里氏木霉。纤维素酶制剂在其天然宿主中产生,比如源自细菌、植物、酵母或真菌,或者该酶由宿主有机体异源表达。这些重组表达宿主可以是细菌、酵母或真菌菌株,例如,大肠杆菌(Escherichia col i )、枯草芽抱杆菌(Bacillus subtil is)、短芽抱杆菌(Bacillusbrevis)、凝结芽抱杆菌(Bacillus coagulans)、巨大芽抱杆菌(Bacillus megaterium)、嗜热脂肪芽抱杆菌(Bacillus stearothermophilus)、链霉菌属(Streptomyces sp.)、假单抱菌属(Pseudomonas sp.)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、安格斯毕赤酵母(Pichiaangusta)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces sp.)、汉逊酵母属(Hansenula sp.)、耶罗维亚酵母属(Yarrowia sp.)、里氏木霉、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、或青霉属。为调节反应中的底物干物质含量,优选通过IR-balance确定各生物质的干质量。为关于底物干物质含量调节酶用量方案,使用Bradford比色方法(Bradford, Μ.Μ.(1976), Anal.Biochem.72,pp.248-254)通过测量各酶原液的总蛋白含量来确定酶浓度。关于线性标准曲线来确定蛋白浓度,其中该线性标准曲线使用牛血清白蛋白作为校准基准而得到。固体的含有纤维素的底物任选地在固液分离之后与纤维素酶制剂在一种或多种以下条件下一起孵育:恒定温度、恒定pH、恒定压力、干物质含量和酶-底物比。因此,在更优选的实施方式中,纤维素材料与纤维素酶制剂在10 80°C和3.0
9.0的pH以及0.01 3%w/w d.m.底物的酶-底物比下一起孵育0.1 24小时。使用纤维素酶制剂的蛋白含量和底物的干物质含量来调节酶-底物w/w比率。在更优选的实施方式中,含有纤维素的材料与纤维素酶制剂在40 60°C在4.5
5.5的pH下(干物质含量为2 20%,且酶-底物比为0.05 l%w/w d.m底物)一起孵育0.5 6小时。在更优选的实施方式中,含有纤维素的材料与纤维素酶制剂在45 55°C在4.5
5.0的pH下(干物质(d.m.)含量为7.5 15%,且酶-底物比为0.05 0.l%w/w d.m.底物)一起孵育2 6小时。

水解之前的底物处理:在本发明的方法中,优选底物在酶解之前被进一步处理。处理目的是在后续的水解步骤中提供更好的纤维素可得性(availab i I i ty )。处理可以是化学、物理或酶处理或其组合。处理可以是以下处理的任一种:酸处理(通过添加无机酸或有机酸),碱处理(通过添加无机碱或有机碱),施加温度、或压力,或应用有机溶剂工序(通过添加有机溶剂),使用离子液体,或水热预处理(施加或不施加压力),或冻融循环,或添加任何催化剂(均质的或非均质的),或添加一种或多种酶活性,或上述的任意组合。在优选的实施方式中,处理结合物理和化学(即,物化)处理。在特别优选的实施方式中,结合酸处理加热底物。在优选的实施方式中,甜菜渣是底物并且以高干物质含量在升高的温度下用酸处理。如上所述,可以使用基于膜的方法、或者在对流装置中、或以其任意组合以多种方式例如分批、反复分批、连续、半连续的方式进行水解。在特别优选的实施方式中,干物质含量在
7.5 50%w/w之间。在更优选的实施方式中,干物质含量在10 25%w/w之间。在更优选的实施方式中,干物质含量在12 20%w/w之间。在优选的实施方式中,结合温度和压力使用酸处理含有纤维素的底物,其中酸可以是任意无机或有机酸,温度在80 210°C的范围内,并且压力在0.5 100巴之间。在更优选的实施方式中,温度在95 135°C之间。在另一个优选的实施方式中,结合温度和压力使用酸处理含有纤维素的底物,其中酸是硫酸(H2SO4)、亚硫酸(H2SO3)、盐酸(HCl)、碳酸(H2CO3)或二氧化碳(CO2)、硝酸(HNO3)或亚硝酸(ΗΝ02)。结合酸使用的温度在80 150°C的范围内,并且施加压力在I 10巴内。在实施方式中,温度在80 210°C的范围内并且施加的压力在0.5 100巴内。在更优选的实施方式中,温度在95 135°C之间。在特别优选的实施方式中,向底物添加硫酸且在95 135°C的温度下以20 25%w/w的干物质含量处理底物。硫酸用量优选在0.1 l%w/w (硫酸/底物)之间。处理使底物中的部分或全部非纤维素材料可溶。由此,处理后的部分非纤维素材料处于液相中,而大部分的纤维素处于固相中。从底物中分离非纤维素材料在本发明的一个实施方式中,在产生纤维二糖的水解步骤之前将部分或全部的可溶非纤维素材料去除。非纤维素材料可包括半纤维素、果胶、半纤维素和果胶的水解产物、木质素、矿物盐、有机酸、醇、寡糖、蔗糖和/或其它可溶性糖。因此,本发明还涵盖用于制造纤维二糖的方法,包括以下步骤:a)使含有纤维素的材料进行如下处理,该处理产生含有果胶、半纤维素和/或其降解产物的液相以及含有纤维素的固相;b)将a)中获得的固相与液相分离;c)使b)中得到的固相进行纤维素酶处理,其中a)中得到的固相的干物质含量为7.5 25% (w/w),优选为10 20% (w/w),从而提供固相和含有纤维二糖的液相;d)将c)中获得的含有纤维二糖的液相与固相分离。在优选实施方式中,在步骤a)的处理过程中干物质含量在7.5 50% (w/w)之间,优选在10 30% (w/w)之间。本发明的作者发现,当底物是甜菜渣且在95 135°C的温度下以20 25%w/w的干物质含量使用酸处理底物时,使大部分非纤维素材料可溶,而大部分纤维素保持不可溶。甜菜渣的非纤维素材料包括果胶(聚半乳糖醛酸)和半纤维素(半乳醣阿拉伯聚糖),包括单体半乳糖醛酸、阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖和/或木糖。通常通过上述处理使至少80%w/w的果胶和半纤维素部分可溶,而至少80%w/w的纤维素保持在固相中。通过固液分离去除底物中经处理步骤而致可溶的部分。可通过连续或不连续离心、压滤或带压方法来执行固液分离。在另一个优选的实施方式中,在分离步骤之前添加果胶酶和阿拉伯糖酶。优选地,在20 60°C的温度下与这些酶一起孵育10分钟至12小时的时间。在更优选的实施方式中,在分离步骤之前添加果胶酶和阿拉伯糖酶,并在30 50°C的温度下孵育10分钟至4小时的时间。优选地,通过培养以下微生物中的一种来产生果胶酶和阿拉伯糖酶:黑曲霉、臭青霉(Penicillium foetidus)。在特别优选的实施方式中,使用分离后的液相作为增值产品源。其含有聚合物比如果胶、阿拉伯聚糖、半乳聚糖、鼠李半乳糖醒酸聚糖(rhamnogalacturonan)、木聚糖、以及这些聚合物的寡聚形式和单体。可以以纯化形式或者作为混合物使用聚合物(例如,在饲料或食物用途中作为增稠剂、表面活性剂、乳化剂)。此外,液相含有各种量(糖和糖酸的总含量为O 100%)的上述聚合物的单体糖和糖衍生物,例如,半乳糖醛酸、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、葡萄糖和果糖。单体糖和糖酸可以 在纯化为纯物质后直接使用,或者以各种混合物的形式使用。它们可在化学或生化转化以产生糖酸(例如,葡糖酸、半乳糖酸、阿拉伯糖酸、木糖酸、鼠李糖酸)、糖二酸(例如,半乳糖二酸、葡糖二酸、阿拉伯糖二酸、木糖二酸、鼠李糖二酸)、糖醇(例如,木糖醇、阿糖醇、半乳糖醇、鼠李糖醇)、糠醛、羟甲基糠醛、呋喃二羧酸及其衍生物之后被用作增值产品源。通过酶处理、通过均相和/或通过多相催化来完成转化步骤。处理步骤后去除液相对该方法有益,因为其例如通过去除抑制物质而提高了纤维素酶的纤维素酶解效率。因此,在优选实施方式中,本发明涉及用于由含有纤维素的材料制造纤维二糖的方法,其中在水解步骤之后去除液相。纤维二糖后处理和钝化可对通过上述方法得到的含有纤维二糖的液相进行收集和浓缩。在另一个优选的实施方式中,对上述方法的步骤d)的含有纤维二糖的液相中所含有的纤维二糖进行进一步的步骤e),其包括:任选地浓缩纤维二糖溶液,并进一步由(任选浓缩的)纤维二糖溶液纯化纤维二糖,优选纯化至至少50%的纯度,更优选至少60%,更优选至少70%,更优选至少80%,更优选至少90% (w/w),且最优选至少99% (w/w)的纯度。在更优选的实施方式中, 步骤e)包括以下中的一者或多者:纤维二糖结晶、层析、纳滤、经有机溶剂沉淀、或使用微生物,其中优选结晶。可通过本领域已知的方法来实现浓缩,例如,通过蒸发水分,通过膜技术,或者通过萃取将水分移到另一液相中。在优选的实施方式中,通过膜技术使用超滤、微滤和纳滤来去除水分,使纤维二糖从0.1% 1.5% (w/w)的浓度浓缩到高达20% (w/w)的浓度。在此之后,可使用薄膜蒸发器进行进一步的浓缩步骤,以将纤维二糖从10% (w/w)浓缩到高达40% (w/w)。在更优选的实施方式中,通过膜技术使用超滤、微滤和纳滤来去除水分,使纤维二糖从0.1% 1.5% (w/w)的浓度浓缩到高达10% (w/w),随后使用薄膜蒸发器进行进一步的浓缩步骤,以将纤维二糖从10% (w/w)浓缩到高达25% (w/w)。在另一个优选的实施方式中,通过薄膜蒸发器浓缩含有纤维二糖的液体,使纤维二糖从0.1%浓缩到高达40% (w/w)。在更优选的实施方式中,通过薄膜蒸发器浓缩含有纤维二糖的液体,使纤维二糖从0.1%浓缩到高达25% (w/w)。浓缩后的液体含有50 95%w/w纤维二糖(相对于糖类总量)、I 40%w/w葡萄糖以及少量的比如阿拉伯糖、木糖、半乳糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、果糖和其它杂质。可以通过例如结晶、层析、纳滤、经有机溶剂沉淀、或者使用微生物来进一步纯化纤维二糖,其中优选结晶。所得液体可具有褐色。因此,任选地在方法中增加脱色步骤,该步骤去除部分或全部的有色物质。优选通过将杂质吸附到吸附剂材料,优选吸附到木炭、离子交换树脂或膨润土来进行该步骤。在优选实施方式中,通过层析步骤使用向吸附材料(其是膨润土或包括膨润土)的吸附来进行此步骤。由包括纤维素和葡萄糖的组合物纯化纤维二糖的方法本发明还包括用于由包括纤维二糖和葡萄糖的组合物纯化纤维二糖的方法,包括通过在葡萄糖氧化酶(GOX)和氧的存在下进行葡萄糖氧化而将葡萄糖氧化成葡糖酸的步骤。在该方法中,通过使用葡萄糖氧化酶(GOX)(以及任选地,过氧化氢酶或活性碳)将葡萄糖氧化成葡糖酸来从纤维二糖中去除副产物葡萄糖。出于去除产物H2O2并避免产物纤维二糖的非特异性氧化的目的,添加过氧化氢酶或活性碳。因此,通过葡萄糖氧化来将通过上述方法得到的含有纤维二糖的液相中的葡萄糖转化成葡糖酸,葡萄糖氧化优选在葡萄糖氧化酶(GOX)和氧的存在下进行。在更优选的实施方式中,通过以下一种或数种方式来将通过上述方法得到的葡糖酸从含有纤维二糖的液相中去除:离子交换层析、沉淀、电渗析,其中优选离子交换层析。在一个实施方式中,可以通过离子交换层析来将葡糖酸从反应混合物中去除。在可选的实施方式中,存在于液相中的葡萄糖可以原位转化成D-葡糖酸内酯。然后可使用D-葡糖酸内酯来抑制任何表现出β -葡萄糖苷酶活性的多肽的活性。可以以如下方式实施根据本发明的获得纤维二糖的方法,即任何具有β -葡萄糖苷酶活性的多肽的酶活性受到抑制剂(优选为D-葡糖酸内酯)的抑制,其中D-葡糖酸内酯优选根据上述的葡萄糖氧化方法由液相中所包括的葡萄糖原位产生。许多其它单糖也可被GOX氧化,尽管特异活性很低,且随后被去除。在优选实施方式中,在30 60°C和5 50g/l葡萄糖和其它单糖的底物浓度下使用固定化的热稳定性葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶或活性碳和氧来将葡萄糖氧化成葡糖酸。之后,通过标准离子交换层析来去除葡糖酸。例如通过用酸洗脱,可从离子交换中回收葡糖酸。在另一个优选的实施方式中,通过沉淀、或通过使用阴离子选择性膜的电渗析来去除葡糖酸。为了提高纤维二糖的纯度,可以使用能够处理葡萄糖、其它单体糖和糖酸但不能破坏纤维二糖中的β -糖苷键并因此不能消化纤维二糖的微生物(例如,细菌、酵母、真菌)。在优选的实施方式中,所用的微生物是酵母(例如,酿酒酵母、克鲁维酵母菌属、裂殖酵母菌属)。在更优选的实施方式中,将酿酒酵母用于该工艺步骤。用于纯化纤维二糖的另一选择包括纤维二糖的选择性结晶,以便纯化产物并产生易储存的产物。用于产物的最终制备和存储的方法不限于任何特定的一种,并且可包括浓缩方法中的结晶、喷雾干燥、鼓式干燥、挤压技术和简单的水分蒸发。产物可作为无定形粉末,以结晶形式或作为纤维二糖浆液使用。在更优选的实施方式中,通过上述方法得到的纤维二糖被进一步纯化至高于99%(w/w)的纯度。使用通过本发明方法能得到的纤维二糖制剂通过本发明方法能得到的纤维二糖制剂可以用作食物成分、动物饲料添加剂、化妆品成分。纤维二糖制剂可以以抗炎药物制剂进行使用。制造的纤维二糖可以用于多种用途,例如,作为益生物质用于饲料和食物用途,作为低卡成分用于食物中,作为构造块用于聚合物、用于有机合成,作为添加剂用于聚合物,作为活性药物成分用于治疗用途,作为构造块用于聚合物,或者用于化妆品用途。在一个实施方式 中,纤维二糖被用作改进动物饲料产品的饲料添加剂。该饲料可以用于饲养猪、小猪、小牛、牛和/或家禽比如鸡和火鸡。通常以动物饲料组合物中纤维二糖的干物质含量为0.01 l%w/w的浓度使用纤维二糖。在该实施方式的优选变形中,以0.05 0.5%w/w的浓度使用纤维二糖。在该实施方式的更优选变形中,以.05 0.2%w/w的浓度使用纤维二糖。在另一个实施方式中,含有50 90% (w/w)纤维二糖和5 50葡糖酸(w/w)的组合产物被用作动物饲料成分,纤维二糖浓度为0.05 1.0%w/w,更优选为0.05 0.5%w/w,且更优选为0.05 0.2%w/w。优选地,向动物饲料制剂中以0.01 1% (w/w)的用量,优选以0.05 0.2% (w/w)的用量,添加纤维二糖制剂。纤维二糖制剂可对动物的肠道菌群具有益生作用。添加纤维二糖可以提高动物的整体健康状态。而且,该添加可以引起饲料摄取增加和/或体重增力口。动物饲料优选被用作猪、鱼、牛和/或家禽的饲料,更优选用作猪和家禽的饲料。在本发明的另一个实施方式中,纤维二糖制剂被用作食物成分。食物用途包括烘烤、饮料以及巧克力、糖和糖果中的成分。在烘烤和糖果用途中,纤维二糖用作具有低热值和低甜度但改进食品的香味(例如,通过形成美拉德产物)的成分。在优选的实施方式中,纤维二糖制剂与甜味剂比如木糖醇、麦芽糖醇和/或甜叶菊一起添加到糕饼或饼干的面团配方中,并且其中面团中的蔗糖用量降低。在特别优选的实施方式中,添加纤维二糖引起与不降低蔗糖用量时可比较的面团特性。这样的面团特性为以下中的一种或多种:棕色、香味形成、口感。在另一优选实施方式中,本发明涉及上述的纤维二糖制剂在食物组合物中的用途,其对食物提供益生性作用,从而改进摄取食物的人的整体健康状态(具体是通过改进肠道菌群)。在本发明的另一实施方式中,纤维二糖制剂被进一步纯化至高于99% (w/w)的纯度。该纤维二糖组合物意在用于在治疗炎症性肠病(比如,溃疡性结肠炎、克罗恩病、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、缺血性结肠炎、改道性结肠炎和/或贝塞综合征冲有效的口服药物组合物。通过本发明方法能得到的葡糖酸可以用于例如食物或饲料工业中,作为防腐剂,作为化妆品添加剂,用于有机合成。在另一优选 的实施方式中,通过本发明方法能得到的包括葡糖酸和纤维二糖的混合物被用作饲料工业中的组合产物,结合了纤维二糖的有益作用和有机酸的益处。实施本发明的最佳方式本发明包括用于制造纤维二糖的方法,其可以被实施为包括以下步骤:a)使含有纤维素的材料进行如下处理,该处理产生含有果胶、半纤维素和/或其降解产物的液相以及含有纤维素的固相;b)将a)中获得的固相与液相分离;c)使b)中得到的固相进行纤维素酶处理,其中b)中得到的固相的干物质含量为
7.5 25% (w/w),优选为10 20% (w/w),从而提供固相和含有纤维二糖的液相;d)将c)中获得的含有纤维二糖的液相与固相分离。处理a)可以是化学、物理或酶处理或其组合。该处理使底物中的部分或全部非纤维素材料可溶。由此,在该处理之后,部分的非纤维素材料处于液相中而大部分纤维素处于固相中。可以通过任意适用于固液分离的方法来实施分离步骤b ),例如,筛分、过滤等。本发明的作者发现,当b)中得到的固相的干物质含量为7.5 25% (w/w),优选为
10 20% (w/w)时,可以有效地进行酶解步骤C)。步骤c)的纤维素酶处理可以是使用单一类型的多肽或包括至少一种纤维素酶的酶组合物进行的处理。优选包括纤维二糖水解酶活性的酶或酶组合物。步骤c)中使用的酶或酶组合物可以从天然或重组来源获得。优选地,步骤c)的酶或酶组合物表现出降低的或最小的葡萄糖苷酶活性。获得此酶(组合物)的方法包括从表现出最小β_葡萄糖苷酶活性的有机物获得此酶(组合物)、通过添加抑制剂比如D-葡糖酸内酯来抑制任何可测量的β -葡萄糖苷酶活性、或者通过使酶组合物经过选自含有纤维素、含有几丁质和含有壳聚糖的材料的吸附材料而去除任何表现出可测量的β_葡萄糖苷酶活性的多肽。通常,任何表现出可测量的β_葡萄糖苷酶活性的多肽不与此种材料强烈地结合,因而被洗脱,而期望的酶保持对吸附材料的结合。优选的是该步骤中使用的吸附材料是待水解的含有纤维素的材料。特别优选的是吸附材料是在以下步骤a)中得到的含有纤维素的固相。通常,吸附过程比水解过程快得多。可以通过任意适用于固液分离的方法来将含有纤维二糖的液相与固相分离,比如任意类型的过滤,优选纳滤、超滤或微滤。含有纤维二糖的液相可以由新鲜的或再循环的水相替换。可以去除含有纤维二糖的液相,同时添加新的水相,但也可以顺序地执行这些步骤。上述方法的步骤c)和d)可以同时进行。这可以例如使用如上所述的膜反应器结构通过连续地用新鲜水相替换含有纤维二糖的液相来完成。

本发明还涉及从水相中去除葡萄糖的方法,包括在氧的存在下使用葡萄糖氧化酶(GOX)(以及任选地,过氧化氢酶或活性碳)来将葡萄糖氧化成D-葡糖酸内酯。过氧化氢酶对于去除产物H2O2和避免产物纤维二糖的非特异性氧化是必需的。可以通过沉淀或离子交换层析将源自D-葡糖酸内酯的水解的葡糖酸从反应混合物中去除。可以原位形成D-葡糖酸内酯;之后可以使用D-葡糖酸内酯作为任意表现出可测量的β-葡萄糖苷酶活性的多肽的抑制剂,如上所述。还可以任选地对得到的含有纤维二糖的液相进行浓缩并且例如通过结晶来由(任选浓缩的)液相进一步纯化纤维二糖。通过本发明方法得到的产物也是本发明的固有组分。可以使用产品,例如,作为食品添加剂,例如,作为益生性食品添加剂。本发明还涉产物在治疗疾病比如炎性疾病中的用途。定义术语“甜菜生物质”是指包括外皮和内浆的甜菜的完整且未处理的根组织。干组织通常含有80% (w/w)的可溶蔗糖,而甜菜渣主要由聚合糖和果胶组成,其包括通常7%的果胶(主要是聚半乳糖醛酸(polygalacturan))、通常7%的纤维素和通常7%的主要是阿拉伯聚糖形式的半纤维素。术语“果胶富集生物质”是指未处理的或处理过的水果植物组织和蔬菜组织,其由聚合糖和果胶组成,包括I 50%果胶、I 80%纤维素和I 80%半纤维素。术语“干物质(d.m.)”是指在从新鲜组织中去除水分之后例如通过使用IR-balance确定的质量与生物质之比。术语“聚合底物”是指由以线性或部分分支的分子结构共价键合的特定的单体成分或有限类的限定单体成分组成的物质。实例是原木质纤维素原料的不可溶部分,其可含有显著量的此种聚合底物,比如纤维素、木聚糖、甘露聚糖、半乳聚糖、阿拉伯木聚糖、葡糖醒酸木聚糖(glucoronoxylan)、葡甘露聚糖和木葡聚糖。
术语酶的“酶活性”是指在酶用作蛋白催化剂的合适条件下的催化活性。对于能够降解聚合或人工底物的酶,“酶活性”是指酶将特定的聚合或人工底物转化成特定的寡聚或单体产物的活性。术语“纤维素酶”是指表现出纤维素酶活性的多肽。术语“纤维素酶制剂”是指包括至少一种表现出纤维素酶活性的多肽的纤维素酶或组合物。在本说明书的上下文中,术语“酶制剂”与“纤维素酶制剂”同义地使用。纤维素酶制剂优选包括至少一种具有纤维二糖水解酶活性(EC3.2.1.91,CBH)的多肽。术语“纤维二糖水解酶”或“CBH” (E.C.3.2.1.91)是指催化聚合纤维素水解成纤维二糖和其它β-D-葡萄糖低聚物的酶。术语葡萄糖苷酶”或“beta-葡萄糖苷酶”或“BGL” (E.C.3.2.1.21)是指将纤维二糖、纤维三糖、纤维四糖和其它β -D-葡萄糖低聚物催化成相应的葡萄糖单体的酶。术语“膜反应器结构”是指反应器和一个或多个与反应器连接的外部膜模块的组合,或者是指具有一个或多个浸没的膜模块的反应器。实施例实施例1:甜菜渣的预处理将224.7g干燥的甜菜渣(89%w/w干物质含量)与535ml水和240.4mll%的H2SO4混合,并在135°C于压力下孵育I小时。通过过滤分离固相和液相。将固相用于纤维二糖制造。实施例2:通过将纤维素酶吸附到`底物上随后进行洗涤步骤来去除降解纤维二糖的酶活性将460g干物质含量为16.5%w/w的预处理的甜菜渣(参见实施例1)与750mg来自里氏木霉的纤维素酶制剂在室温下接触5分钟。为了去除降解纤维二糖的酶活性,通过过滤去除液相。随后添加50mM乙酸缓冲液(pH5.0)以将反应调节到相同的干物质含量(16.5%w/w)。将混合物在50°C孵育48小时,随后进行相分离步骤。通过HPLC在BioRadAminex HPX87-H柱上确定液相中葡萄糖和纤维二糖的量。从纤维素制剂中去除β-葡萄糖苷酶活性的数据示于图1中。实施例3:在不同干物质因素下液相中的纤维二糖浓度将460g预处理的甜菜洛(参见实施例1)与(i) 750mg, (ii) 375mg,和(iii) 75mg来自里氏木霉的纤维素酶制剂在室温下接触5分钟。根据实施例2中描述的步骤来去除降解纤维二糖的活性。将50mM乙酸缓冲液(pH5.0)添加到固体部分中,以分别达到(i) 15%,
(ii)7.5%和(iii)2.5%的干物质含量w/w。将混合物在50°C下孵育I小时,随后进行相分离步骤。如实施例2中所描述通过HPLC确定液相中葡萄糖和纤维二糖的量。与底物干物质含量相关的纤维二糖浓度的数据示于图2中。实施例4:在不同的酶/底物(E/S)比率下由甜菜渣制造纤维二糖将460g预处理的甜菜渣(参见实施例1)与(i)75mg,(ii)37.5mg,和(iii)7.5mg来自里氏木霉的纤维素酶制剂在室温下接触5分钟。根据实施例2中描述的步骤来去除降解纤维二糖的活性。将50mM乙酸缓冲液(pH5.0)添加到固体部分中,以达到15%的干物质含量w/w。将混合物在50°C下孵育,并在不同的时间点采集液相的代表性样品。如实施例2中所描述通过HPLC确定样品中葡萄糖和纤维二糖的量。与酶-底物比相关的纤维二糖制造示于图3中。实施例5:由不同的纤维素材料制造纤维二糖如实施例2所示处理460g预处理的(参见实施例1)或未处理的甜菜渣和Avicel,以去除降解纤维二糖的活性。向固体部分添加乙酸缓冲液以达到2.5%的干物质含量,且将混合物在50°C下孵育I小时。如实施例2中所描述通过HPLC确定液相中葡萄糖和纤维二糖的量。由不同的纤维素原料得到的纤维二糖产率示于图4中。实施例6:由甜菜渣制造纤维二糖如实施例2所示对460g预处理的甜菜渣(参见实施例1)进行处理。向固体部分添加50mM乙酸缓冲液(pH5.0)以达到7.5%的干物质含量w/w。将混合物在50°C下孵育I小时,随后进行固/液相分离步骤。液相分离、添加缓冲液至相同的干物质含量、随后进行孵育的过程重复六次。如实施例2中所描述通过HPLC确定各步骤的特定液体部分中的葡萄糖和纤维二糖的量。由甜菜渣制造葡萄糖和纤维二糖示于图5中。实施例7 =GOX底物特异性使用以下检定来评估葡萄糖氧化酶的底物特异性:将各测试糖类溶于IOOmMNa-乙酸缓冲液(pH5.5)中,得到的最终糖浓度为100mM。终溶液含有25U/mL辣根过氧化物酶和1禮2,2’ -连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)。通过添加0.lU/mL葡萄糖氧化酶来开始反应。反应在摇动的24孔微滴定板中进行。各孔容积为500 μ L。所有条件一式三份进行测试。在405nm 处检测到吸光度增加。使用H2O2的校正曲线来计算活性。所有试剂都得自Sigma-Aldrich (Deisenhofen,Germany)并且是分析级。GOX底物特异性示于图6中。实施例8:通过葡萄糖氧化酶将葡萄糖转化成葡糖酸将葡萄糖氧化酶固定到包被有聚乙烯亚胺和戊二醛的玻璃珠上。向IOOmL含有25mM葡萄糖、150mM纤维二糖和70,000U过氧化氢酶的IOOmM Na-乙酸缓冲液中添加20mg总活性为100U的这些玻璃珠。在反应器中进行反应,其中反应器持续用空气通风,通风速率为lL/min。采集等分试样并使用HPLC对葡萄糖浓度进行定量。通过葡萄糖氧化酶将葡萄糖转化为葡糖酸的数据示于图7中。实施例9:通过离子交换层析分离葡萄糖和葡糖酸将根据实施例8制备的30mL纤维二糖/葡糖酸混合物施加到75mL装有AMBERLITEIRA67 (Rohm and Haas,Germany)的玻璃柱。柱子用H2O洗涤并用IM碳酸铵洗脱。如实施例2所描述通过HPLC确定各部分中葡糖酸和纤维二糖的量。葡萄糖与葡糖酸的HPLC分离数据示于图8中。实施例10:使用超滤结合步骤c)和d)设置:向水解反应器中添加约5kg预处理的甜菜渣,该水解反应器与截留为
10.000道尔顿的超滤膜单元连接。加入酶和水以将干物质含量调节为9%。温度恒定保持在约45°C。在加入酶之后开启泵。平均而言,约3m3/h的水解混悬液被泵入到膜单元中。跨膜压在0.7 1.5巴之间。将截留物泵回到反应器中,收集渗透物。连续测量渗透物质量并通过HPLC分析其纤维二糖含量。为保持水解反应器中的容积恒定,添加水。九小时之后,通过将泵关闭并通过将混悬液冷却至4°C来停止水解。
结果:渗透物中纤维二糖与葡萄糖的平均比率大于5比I。存在于甜菜渣中的94%纤维素被转化,纤维二糖的产 率为79%。
权利要求
1.一种用于制造纤维二糖的方法,包括以下步骤:a)使含有纤维素的材料进行酸处理,所述酸处理产生液相和含有纤维素的固相,其中步骤a)过程中的干物质含量在7.5 50% (w/w)之间;b)将a)中得到的固相与液相分离;c)使b)中得到的固相在7.5 50% (w/w)的干物质含量下进行纤维素酶处理,其中在包括至少一种表现出纤维二糖水解酶活性的多肽的酶制剂的存在下进行所述纤维素酶处理,从而提供固相和含有纤维二糖的液相,以及d)将在c)中得到的所述含有纤维二糖的液相与固相分离。
2.根据权利要求1所述的用于制造纤维二糖的方法,其中在步骤c)中,b)中得到的固相的干物质含量在12 20% (w/w)之间。
3.根据前述权利要求中一项或多项所述的方法,其中进行步骤c)的含有纤维素的材料相对于纤维素的总量含有50%或更多的无定形纤维素。
4.根据权利要求2或3中一项或多项所述的方法,其中步骤a)的所述处理过程中的干物质含量在10 30%之间。
5.根据前述权利要求中一项或多项所述的方法,其中步骤c)中的酶/底物比为0.01 0.1。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述酶制剂源自缺乏表现出显著β-葡萄糖苷酶活性的酶的有机体。
7.根据权利要求2 5中一项或多项所述的方法,其中所述纤维素酶制剂含有β-葡萄糖苷酶活性,并且其中向 待进行步骤c)的含有纤维素的材料添加所述纤维素酶制剂,随后洗涤所述材料,使得固相中的β -葡萄糖苷酶活性最小化或被消除。
8.根据权利要求1 6中一项或多项所述的方法,其中所述纤维素酶制剂包括至少一种来自下列纤维二糖水解酶(EC3.2.1.91)的表现出纤维二糖水解酶活性的多肽:糖基水解酶GH6组的纤维二糖水解酶或糖基水解酶GH7组的纤维二糖水解酶,或者表现出纤维二糖水解酶活性且与SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.2中的任一者具有70%或更多的一致性的多肽,并且/或者其中表现出纤维二糖水解酶活性的多肽通过缺乏可测β-葡萄糖苷酶活性的重组酵母或真菌表达宿主的分泌而产生。
9.根据前述权利要求中一项或多项所述的方法,其中步骤d)的含有纤维二糖的液相中所含的纤维二糖进行进一步的步骤e),其包括:任选地浓缩纤维二糖溶液,并由所述(任选浓缩的)纤维二糖溶液进一步纯化所述纤维二糖。
10.根据权利要求9所述的方法,其中步骤e)包括以下的一者或多者:纤维二糖结晶、层析、纳滤、微滤、超滤、经有机溶剂沉淀、或者使用微生物。
11.根据前述权利要求中一项或多项所述的方法,其中步骤C)和d)重复多次,其中向后续循环中的固相添加新鲜水相。
12.根据前述权利要求中一项或多项所述的方法,其中通过连续地用新鲜水相替换所述含有纤维二糖的液相来同时进行步骤c)和d)。
13.一种用于由包括纤维二糖和葡萄糖的组合物纯化纤维二糖的方法,包括在葡萄糖氧化酶(GOX)和氧的存在下通过葡萄糖氧化来转化葡萄糖的步骤。
14.根据权利要求1 12中一项或多项所述的方法,其中通过权利要求14所述的方法将所述含有纤维二糖的液相中的葡萄糖转化成葡糖酸。
15.根据权利要求14所述的方法,其中通过一种或数种以下方法来从所述含有纤维二糖的液相中去除通过权利要求14所述的方法得到的葡糖酸:离子交换层析、沉淀、电渗析。
16.根据权利要求1 5中一项或多项所述的方法,其中任何具有β-葡萄糖苷酶活性的多肽的酶活性被抑制剂抑制。
17.—种纤维二糖制剂,其能通过权利要求1 16中的一项或多项得到。
18.根据权利要求17所述的纤维二糖制剂作为食物成分、动物饲料添加剂、化妆品成分的用途。
19.根据权利要求18所述的用途,其中以0.0l 1% (w/w)的用量向动物饲料制剂中添加所述纤维二糖制剂。
20.根据权利要求18所述的用途,其中所述纤维二糖制剂与甜味剂比如木糖醇、麦芽糖醇和/或甜叶菊组合添加到糕饼或饼干面团配方中,并且其中所述配方中的蔗糖用量降低。
21.根据权利要求17所述的纤维二糖制剂在治疗哺乳动物中的炎症性肠病比如溃疡性结肠炎、Crohn病、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、缺血性结肠炎、改道性结肠炎和/或Behget综合征的方法中 的用途。
全文摘要
本发明涉及一种由甜菜和其它含有纤维素的生物质酶法制造纤维二糖的方法。纤维二糖是由经β-1,4键连接的两分子葡萄糖组成的二糖。本发明的方法允许纤维二糖的经济制造和高产率。根据本发明的用于制造纤维二糖的方法包括以下步骤使含有纤维素的材料在7.5~50%(w/w),优选10~25%(w/w),且更优选12~20%(w/w)的干物质含量下进行纤维素酶处理,随后将含有纤维二糖的液相与固相分离。
文档编号C12P19/12GK103080330SQ201180041329
公开日2013年5月1日 申请日期2011年6月30日 优先权日2010年6月30日
发明者A.科尔, T.布吕克, J.格拉赫, M.扎夫热尔, L.吕歇尔, M.克劳斯 申请人:南方化学知识产权有限公司

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