作用在离子通道上的化合物的筛选用材料及其应用的制作方法
专利名称：作用在离子通道上的化合物的筛选用材料及其应用的制作方法
技术领域：
相关申请的交叉参考本申请要求2010年6月29日提交的日本专利申请N0.2010-147255的优先权，所述专利申请的内容通过参考结合于此。本发明涉及作用在离子通道上的化合物的筛选用材料及其应用，更具体地，本发明涉及可用于筛选作用在离子通道(包括膜转运蛋白)上的化合物的含细胞材料以及使用所述材料的筛 选方法。
背景技术：
离子通道在生理学上具有重要功能。通过靶向这些离子通道发现作用在离子通道上的激动剂和抑制剂有望提供有用的药物。用于评价靶向这种离子通道例如电压依赖性离子通道的药物的筛选系统的方法的已知实例是荧光膜电位测定法，所述荧光膜电位测定法用电压依赖性荧光染料检测细胞中膜电位的变化(专利文献I)。另外，通过将玻璃电极附着(封接)于细胞膜来电学检测膜电位的膜片钳法也是已知的。此外，最近已开发出自动膜片钳法，所述自动膜片钳法使用在每个孔中具有与玻璃电极的末端相对应的开口的多孔膜片板(patch plate),以在每个孔中通过自动封接细胞膜和膜片电极(patch electrode)来检测膜电位(非专利文献I)。存在的情况是，尽管常规的荧光膜电位测定法适用于评价大量样本，但它们在测定的精确度和可适用的离子通道的范围方面存在局限性。另外，尽管膜片钳法具有高测定精确度并允许从测定中获得大量信息，但它由于一次只能够测定少量样本，因而具有低效率。此外，尽管自动膜片钳法采用了允许同时对大量样本进行评价的结构，但该膜片的效率是低的，从而使得该方法不适合于高通量筛选。另外，自动膜片钳法还具有设备和运行成本高的问题。在靶向离子通道筛选的情况下，由于内源性配体是离子，因此，难以预测能够与靶标结合的结构。因此，在构建靶向离子通道的筛选系统时，与靶向受体和其它蛋白质的情况相比，允许施加大量受试化合物的高通量甚至是更重要的。另外，在靶向离子通道筛选的情况下，配体的优化常常是困难的，从而导致在高通量的同时还需要测定的精确度。然而，正如前面所描述的，用于测定细胞中膜电位的微小变化的常规荧光膜电位测定法具有精确度和适用范围方面的问题，而自动膜片钳法具有效率和成本方面的问题。因此，还需构建表现出有利的精确度和优异的效率的靶向离子通道的筛选系统。现有技术文献专利文献专利文献1:日本特开2006-126073号公报非专利文献非专利文献I:Tim J.Dale 等，Mol.Biosyst.2007，3，714-72
发明内容
本说明书的公开内容的目的是构建靶向离子通道并具有优异的效率的筛选系统。本发明的发明人注意到，靶向离子通道的筛选系统被迫使用基于检测活细胞的膜电位的评价技术，这些评价技术所具有的问题使得难以构建筛选系统。因此，为了构建能够应用更简单的评价技术而不是这些常规评价技术的筛选系统，进行了各种研究。结果，本发明的发明人发现，一旦用来自于细胞外的刺激诱导去极化后，由于细胞中离子浓度的变化、典型地由于细胞内钠(Na)离子浓度的增加而发生细胞死亡的细胞作为用于检测受试化合物对离子通道的作用的介质(筛选用材料)，使得可以通过利用细胞死亡或者引起细胞死亡或与细胞死亡相当的持续动作电位作为指标来检测受试化合物对离子通道的活化或抑制。根据本说明书的公开内容，提供了以下几个方面。根据本说明书的公开内容，提供了化合物的筛选用材料，所述材料包含细胞，所述化合物作用在靶离子通道上，所述细胞保持有至少一种第一 DNA，所述第一 DNA编码电压依赖性Na离子通道，所述电压依赖性Na离子通道已被抑制而不失活，并且其中K离子通道已被活化，以致静息膜电位在负方向上变得更深。另外，根据本说明书的公开内容，提供了筛选方法，所述方法包括下面的步骤:通过利用上述细胞的存活或死亡作为指标，使用上述筛选用材料的上述细胞来检测受试化合物对上述靶离子通道的作用。此外，根据本说明书的公开内容，提供了用于筛选作用在离子通道上的化合物的装置，所述装置包含:细胞容纳单元，所述细胞容纳单元提供有容纳细胞的一个或多个区域；以及测定单元，所述测定单元测定所述一个或多个区域中的上述细胞的死亡。
图1是示出了本说明书中公开的筛选方法的实例的概述的图。图2示出了表示使用电压钳法测定HEK-Kir细胞中Kir通道电流而获得的结果的图；图2A示出了以100 μ M Ba离子形式施用Kir2.1通道的特异性阻断剂之前和之后的电流-电压关系，而图2B示出了施用100 μ M Ba离子之前和之后膜电位的变化。图3示出了表示通过在HEK-Kir细胞中瞬时表达野生型和突变型Navl.5通道来测定Na离子电流而获得的结果的电流图；图3八示出了野生型的结果，而图3Β示出了突变型的结果。图4示出了表示通过在HEK-Kir细胞中瞬时表达野生型和突变型Navl.5通道经去极化电刺激来产生动作电位的动作电位图；图4八示出了野生型的结果，而图4Β示出了突变型的结果。图5是表示通过电刺激三种类型的细胞HEK、HEK_Kir和HEK-Kir突变的Nav细胞经MTT法测定细胞数的变化而获得的结果的图；数值I被指定为未受刺激的对照细胞的吸光度。图6是表示以利多卡因(Sigma公司)的形式向HEK-Kir突变的Nav细胞施用Na离子通道抑制剂、然后进行电刺激而获得的结果的图；数值I被指定为未受刺激的对照细胞的吸光度。
图7示出了在已在HEK细胞中瞬时表达hERG通道的情况下在施用尼非卡兰之前和之后的电流图。图8是表示其中瞬时表达有hERG通道的hERG_HEK细胞中在施用尼非卡兰之前和之后的电流-电压曲线的图。图9示出了在hERG通道被瞬时表达在Kir突变的Nav细胞中而获得的hERG-HEK-Kir突变的Nav细胞中在施用尼非卡兰之前和之后的电流图。图10示出了在hERG-HEK-Kir突变的Nav细胞中在施用尼非卡兰之前和之后由去极化刺激诱导的动作电位图。图11是表示在hERG-HEK-Kir突变的Nav细胞中在施用尼非卡兰之前和之后的动作电位时间(持续时间)的图。图12是表示在hERG-HEK-Kir突变的Nav细胞中由施用尼非卡兰产生的去极化刺激诱导的细胞死亡的图。图13是表示使用hERG-HEK-Kir突变的Nav细胞获得的基于细胞死亡比率的尼非卡兰剂量-响应曲线的图。图14是表示HEK-Kir细胞中由高K+刺激诱导的荧光变化的图。图15是表示HEK-Kir突变的Nav细胞中由高K+刺激诱导的荧光变化的图。图16是表示HEK-Kir细胞和HEK-Kir突变的Nav细胞中在15.3mM的细胞外K+浓度下荧光强度差异的图。
图17是表示HEK-Kir突变的Nav细胞中利多卡因对高K+刺激诱导的荧光变化的抑制的图。
具体实施例方式本说明书的公开内容涉及靶向离子通道的筛选系统，更具体地，本发明涉及能够用于筛选作用在离子通道(膜转运蛋白)上的化合物的含细胞的筛选用材料、使用所述材料的筛选方法、以及筛选装置。根据本说明书的公开内容，通过被构建用于筛选的细胞的细胞死亡可以检测筛选期间对靶离子通道的作用。也就是说，赋予了控制细胞死亡的机制，其中细胞死亡的发生是由于短暂诱导去极化而发生的动作电位的延长。也就是说，本说明书的公开内容利用这种控制细胞死亡的机制作为用于检测受试化合物对靶离子通道的作用的手段。根据这种控制细胞死亡的机制检测受试化合物对靶离子通道的作用的概述的实例示于图1中。如图1中所示，当向本发明的细胞形式的筛选用材料供给受试化合物时，所述细胞提供有Na离子通道，所述Na离子通道的失活已被抑制，并且其中K离子通道已被活化，所述K离子通道使静息电位变深，受试化合物对靶离子通道的作用被表示为诱导或抑制去极化的结果。当受试化合物作用在靶离子通道上并诱导去极化时，基于本发明的筛选用材料的细胞膜上的上述Na离子通道和K离子通道控制细胞死亡的机制的开关被打开，并且本发明的筛选用材料发生细胞死亡。另一方面，当受试化合物作用在靶离子通道上并抑制去极化时，上述控制细胞死亡的机制的开关没有被打开并保持关闭，并且本发明的筛选用材料仍然是活的。因此，根据控制细胞死亡的机制是否被打开或关闭，或者换言之，根据引起细胞死亡或细胞存活的持续动作电位的存在或不存在，本发明的筛选用材料检测由于受试化合物的作用诱导的去极化的存在或不存在。结果，无需测定膜电位的变化，简单地根据细胞的存活或死亡就可以检测受试化合物对靶离子通道的作用。由于与简单地检测细胞膜电位或测定膜电流的形式的电学检测相比，细胞的存活或死亡的检测是更容易且更精确的，并且适合于同时评价大量样本，因此，通量是高的。另夕卜，该程序简单并可以确保测定的精确度。对于靶向离子通道的化合物的初步筛选来说，这种类型的筛选方法也是优选的。下面提供了本说明书的公开内容的多种实施方式的详细解释。(筛选用材料)本说明书中公开的筛选用材料包含细胞，所述细胞保持有编码电压依赖性Na离子通道的第一 DNA，所述电压依赖性Na离子通道的失活已被抑制，并且其中K离子通道例如内向整流性K离子通道被活化，所述K离子通道使静息电位在负方向上变得更深，并由此通过Na离子内流到细胞中而避免了细胞死亡。在下面的描述中，这些细胞被称为筛选用细胞。本发明的筛选用材料可以只含有筛选用细胞，或者除了筛选用细胞以外，还可以含有允许筛选用细胞的生存或适合于筛选用细胞的生存的培养材料或添加剂等。这些培养材料的实例包括普通培养基以及缓冲液、抗生素等。(失活抑制的电压依赖性Na离子通道)筛选用细胞保持有编码电压依赖性Na离子通道的第一 DNA，所述电压依赖性Na离子通道的失活已被抑制。筛选用细胞表达这种Na离子通道。本文中，电压依赖性Na离子通道是指通过依赖于细胞膜电位的开口来介导Na离子的被动扩散的在细胞膜上的蛋白质。对本说明书中使用的电压依赖性Na离子通道没有特别的限制，但可以使用各种类型的已知的电压依赖性Na离子通道，优选的是Navl.5通道。Navl.5通道分布在心肌细胞中，并被认为参与动作电位的产生和兴奋的传导。在门打开后，由于失活机制的作用，电压依赖性Na离子通道丧失Na离子通透性(被失活)，并且Na离子通透性表现出依赖于膜电位。相反，其失活已被抑制的电压依赖性Na离子通道是该失活机制已被抑制(丧失)的那种Na离子通道。也就是说，失活抑制的电压依赖性Na离子通道是指其中在门打开后不会发生这种失活并且离子通透性表现出依赖于膜电位的Na离子通道。在失活抑制的电压依赖性Na离子通道中，尽管在细胞膜中诱导了去极化并且离子通道本身被活化时，通道打开并采取了能够被Na离子的被动扩散介导的状态，但是，由于离子通道本身的失活被抑制，所述通道被维持在开放状态。结果，在失活抑制的电压依赖性Na离子通道中，一旦它经受刺激并产生动作电位后，通道的失活被延迟，并且与天然的电压依赖性Na离子通道相比，动作电位持续一段更长的时间。另外，失活抑制的Na离子通道在比较深的静息膜电位下是恒定部分活化的或者很容易活化的(或者换言之，具有所谓的大窗口电流)。因此，在表达失活抑制的Na离子通道的细胞中，只有在静息膜电位被保持到足够深的负电位的情况下，才能防止Na离子的过度内流。在已充分表达失活抑制的电压依赖性Na离子通道的细胞中，去极化很容易使Na离子通道的活性增加，并且动作电位或去极化被维持约I分钟以上，优选为2分钟以上，更优选为3分钟以上，甚至更优选 为5分钟以上。因此，发生了 Na过度内流到细胞中，并引起了细胞死亡。这种失活抑制可以通过在电压依赖性Na离子通道的氨基酸序列中插入氨基酸突变来适当地实现。已经公开了几种具体技术用于抑制Navl.5通道的失活。所报道的技术的实例包括修饰 IFM 基序(A.0.Grant 等,Biophys.J., Vol.79, pp.3019-3035, 2000)，将第406位的天冬酰胺突变成谷氨酸、精氨酸或赖氨酸(Μ.M.McNulty等，Mol.Pharmacol.,Vol.70, pp.1514-1523，2006)，将连接结构域III和IV的含IFM基序的接头位点缺失(D.E.Patton 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, Vol.89，pp.10905-10909，1992 ；ffestJ.ff.等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, Vol.89，pp.10910-10914，1992)，以及将结构域 IV 的片段 4 的氨基酸突变(L.Q.Chen 等，J.Gen.Physiol.，Vol.108，pp.549-556，1996)。根据这些文献和公知技术常识，本领域的普通技术人员可以适当地执行在氨基酸序列中插入突变。筛选用细胞以该突变体的形式可表达地保持有编码该突变蛋白的第一 DNA。筛选用细胞可以恒定表达或瞬时表达该突变体，即失活抑制的电压依赖性Na离子通道。换言之，第一 DNA可以被整合到染色体中以便传递给子细胞，或者可以被整合到在染色体外自主扩增并且不一定传递给子细胞的质粒中。优选地，第一 DNA被连接到有恒定活性的启动子(组成性启动子)的控制下。根据本领域普通技术人员公知的基因工程技术和转化体生产技术，通过构建含有第一 DNA的表达载体等，然后通过将其插入其中来转化筛选用细胞的宿主，这些筛选用细胞可以作为恒定表达的细胞或瞬时表达的细胞被适当地获得。此外，在电压依赖性Na离子通道由两个以上的亚基构成的情况下，并且当含有对失活有效的突变的亚基只构成其整体的一部分时，各自编码那些亚基的DNA可以至少一种第一 DNA的形式被表达在筛选用细胞中，或者可以第一 DNA的形式分别并可表达地保持有编码这些亚基的DNA，以便同时共表达构成Na离子通道的其它亚基。此外，如果需要酶或其它蛋白质来使所表达的失活抑制的电压依赖性Na离子通道更有效地发挥功能，也可以适当地表达这些蛋白质。(K离子通道的活化 )在筛选用细胞中，K离子通道被活化，以致静息膜电位在负方向上变得更深，或者换言之，以致负电位增加。也就是说，促进了 K离子内流到细胞中。当保持有上述第一 DNA并且Na离子通道突变体(失活抑制的膜电位依赖性Na离子通道)被表达并活化时，导致了其中由于细胞内外Na离子之间的浓度差引起Na离子过度流入到细胞中这样的状态，这最终导致细胞内Na离子浓度增加和细胞死亡。有必要的是，在诱导细胞死亡机制之前，细胞是活的，以便允许细胞起到筛选用细胞的功能。因此，K离子通道被活化，以便促进K离子内流到细胞中，从而加深(降低)静息膜电位。当K离子通道以这种方式被活化时，静息膜电位在负方向上可以被设置得比正常的静息膜电位深。静息膜电位优选在负方向上被加深到不影响细胞存活的程度。膜电位优选为-50mV，更优选为_60mV，甚至更优选为约_70mV，还更优选为约_80mV。其中K离子通道被活化以致静息膜电位在负方向上变得更深这样的状态是指例如其中内向整流性K离子通道(Kir)、4次跨膜型或2孔型K离子通道、或者串联孔域型K离子通道等被活化这样的状态。存在各种类型的具有不同性质的4次跨膜型和2孔型K离子通道，并被分类为如TWIK、TERK, TASK、TALK、THIK和TRESK这样的类型。由于这些通道不依赖于电位或时间，因此，它们起到渗漏通道的功能。这些渗漏通道的性质使得它们能够起到固定细胞的静息膜电位的功能。尽管对内向整流性K离子通道没有特别的限制，但实例包括各种类型的Kir2.x通道，例如Kir2.1、2.2、2.3和2.4通道。Kir2.1通道是具有两次跨膜结构的内向整流性K+通道。该通道不依赖于电压，并具有使膜电位接近K+平衡电位这样的性质。该通道表达在神经、心脏和骨骼肌中，并执行静息膜电位的形成及其稳定化和维持。另一个实例是Kir2.2。尽管以与Kir2.1相同的方式，Kir2.2也是内向整流性K离子通道，但是与Kir2.1相比，它具有更强大的内向整流性。它与Kir2.1 一起表达在心脏、脑和骨骼肌中，并且在其它内向整流性K离子通道之中，它在人血管内皮细胞中发挥最主要的作用。Kir2.x 离子通道被描述在如 Circ.Res.2004，94，1332-1339 和 Am.J.Physiol.Cell Physiol.2005，289，C1134-C1144这样的出版物中。编码人源性Kir2.x通道的碱基序列的实例包括 Kir2.1 (GenBank 登录号 U12507，ΝΜ_00891.2)、Kir2.2 (GenBank 登录号AB074970,NM_021012 (人 KCNJ12))、Kir2.3 (GenBank 登录号 U07364，U24056)以及 Kir2.4(GenBank 登录号 AF081466.1)。类似地，另一个实例是GIRK (Kir3)。GIRK (Kir3)是与Kir2不同的内向整流性K离子通道，它被G蛋白活化。其亚基是组织特异性的，并在心脏中形成由Kir3.1和Kir3.4构成的异源四聚体或者在中枢神经系统中形成由Kir3.1和Kir3.2构成的异源四聚体。它们通常不被活化，并只被激动剂刺激而活化。然而，据报道，在使用爪蟾卵母细胞的实验中，通过将形成通道孔的跨膜螺旋的氨基酸突变，这些通道可恒定地保持开放(J.Biol.Chem.，2003，Vol.278，N0.50，pp.50654-50663)。基于这个发现，该突变体的使用被认为允许以与Kir2.1相同的方式形成深静息膜电位。编码人源性Kir3.x通道的碱基序列的实例包括Kir3.1 (GenBank 登录号 NM_002239.2)、Kir3.2 (GenBank 登录号 NM_002240.2)、Kir3.3(GenBank 登录号 ΝΜ_004983.2)以及 Kir3.4 (GenBank 登录号 ΝΜ_000890.3)。此外，另一个实例是Katp (Kir6)通道。Katp通道是被ATP抑制并被ADP活化的内向整流性K离子通道。Katp通道控制与细胞的代谢状态相对应的细胞兴奋性。Katp通道是由4个Katp通道和4个磺脲类药物受体(SUR)构成的异源八聚体。尽管单独的Katp通道不具有功能，但是据报道，通过缺失C末端`，单独的Katp通道具有功能(EMBO J.,Vol.17, N0.12,pp.3290-3296，1998)。另外，通过进行进一步的突变来降低ATP敏感性，可以使该缺失突变体被恒定地活化。该突变体的使用也使得能够形成深静息膜电位。编码人源性Kir6.x通道的碱基序列的实例包括Kir6.1 (GenBank登录号ΝΜ_004982.2)和Kir6.2 (GenBank登录号 ΝΜ_001166290.I)。另外，4次跨膜型和2孔型K离子通道的已知实例包括THIK通道(其中当表达在 ΗΕΚ293 细胞中时，膜电位变得更深(V.A.Campanucci 等,Neuroscience, Vol.135, pp.1087-1094, 2005))、TASK2通道(其中当表达在爪蟾卵母细胞中时，静息膜电位变得更深(C.Kindler 等,J.Pharmacol.Exp.Ther., Vol.306, pp.84-92，2003))、以及 Kv 离子通道(其中在平滑肌组织中Kv离子通道的静息膜电位变得更深(S.S.McDaniel等，J.Appl.Physio1.，Vol.91，pp.2322-2333, 2001))。2孔型K离子通道被归类到由TWIK、TREK、TASK、TALK、THIK和TRESK组成的各个亚族中。TWIK亚族包括TWIK-1和TWIK-2通道(Cell.Biochem.Biophys.(2007)，47，209-256)。TWIK通道存在于人体的许多组织中。人源性TWIK离子通道的实例包括 TWIK-1 (GenBank 登录号 ΝΜ_002245.3)和 TWIK-2 (GenBank 登录号 ΝΜ_004823.I)。TREK亚族包括TREK-1、TREK-2和TRAAK通道。人源性TREK离子通道的实例包括TREK-1 (GenBank 登录号 ΝΜ_014217.3)、TREK-2 (GenBank 登录号 ΝΜ_138317.2)和 TRAAK(GenBank 登录号 ΝΜ_033310.2)。TASK亚族包括TASK-1、TASK-3和TASK-5通道。人源性TASK离子通道的实例包括TASK-1 (GenBank 登录号 NM_002246.2),TASK-3 (GenBank 登录号 ΝΜ_016601.2)和 TASK-5(GenBank 登录号 ΝΜ_022358.3)。TALK亚族包括TALK-1、TALK-2和TASK-2通道。人源性TALK离子通道的实例包括 TALK-1 (GenBank 登录号 NM_001135106.1), TALK-2 (GenBank 登录号 NM_001135111.1)和 TASK-2 (GenBank 登录号 ΝΜ_003740.3)。THIK亚族包括THIK-1和ΤΗΙΚ-2通道。人源性THIK离子通道的实例包括ΤΗΙΚ-1(GenBank 登录号 ΝΜ_022054.2)和 ΤΗΙΚ-2 (GenBank 登录号 ΝΜ_022055.I)。TRESK 亚族的实例包括 TRESK (GenBank 登录号 ΝΜ_181840.I)。在本发明的筛选用细胞中，出于加深静息膜电位的目的，可以适当地组合这些K离子通道中的一种或多种。
在其中K离子通道已被活化以便在负方向上加深静息膜电位这样的状态下的筛选用细胞优选通过使用编码K离子通道蛋白的第二 DNA以外源DNA的形式可表达地保持有该蛋白。筛选用细胞可以恒定表达或瞬时表达K离子通道。也就是说，第二DNA可以被整合到染色体中以便传递给子细胞，或者可以被整合到在染色体外自主扩增并且不一定传递给子细胞的质粒中。优选地，第二 DNA被连接到有恒定活性的启动子(组成性启动子)的控制下。根据本领域普通技术人员公知的基因工程技术和转化体生产技术，通过构建含有第二DNA的表达载体等，然后通过将其插入其中来转化筛选用细胞的宿主，这些筛选用细胞可以作为恒定表达的细胞或瞬时表达的细胞被适当地获得。此外，在活化的K离子通道由两个以上的不同亚基(其可以是不同K离子通道的亚基)构成的情况下，各自编码那些亚基的DNA优选以至少一种第二 DNA的形式被表达在筛选用细胞中。此外，在需要酶或其它蛋白质来使所表达的K离子通道有效地发挥功能的情况下，也可以共表达这些蛋白质。在这种情况下，可以可表达地保持有编码这些其它蛋白质的DNA。此外，在例如K离子通道是G蛋白偶联的K离子通道的情况下，其它蛋白质的实例包括G蛋白。由于筛选用细胞在生物膜例如细胞膜上具有失活抑制的电压依赖性Na离子通道，并且K离子通道同时起作用以便降低(加深)静息膜电位，或者换言之，内向整流性K离子通道等作用在细胞膜上，因此，即使筛选用细胞具有失活抑制突变型电压依赖性Na离子通道，在诱导去极化之前仍可避免由于Na离子内流引起的细胞死亡。也就是说，诱导细胞死亡的机制是一种待机状态，其等待筛选用细胞的细胞膜中诱导去极化而起作用。通过基因插入，筛选用细胞也可以被用作用于表达新的靶离子通道的编码DNA的宿主细胞。(靶离子通道)对筛选用细胞中的靶离子通道没有特别的限制，并且一种或多种靶离子通道可以适当地选自已知或新的离子通道。此外，离子通道是指穿过生物膜例如动物或植物细胞的细胞膜或内膜并被动地允许特定离子透过的一种蛋白质。离子的实例包括Na离子、K离子、Ca离子和Cl离子。根据其控制开放和关闭的方式，离子通道的实例包括电压依赖性通道、配体依赖性通道、机械刺激依赖性通道、温度依赖性通道、渗漏通道和磷酸化依赖性通道。根据本说明书的公开内容，由于可以根据筛选用细胞的存活或死亡来检测对靶离子通道的作用(活化或抑制)，因此，广泛范围的离子通道通常可以被用作靶离子通道。此外，在本说明书中，离子通道是指不管其控制开放和关闭的方式如何，也不论其是电压依赖性离子通道还是配体依赖性离子通道等。另外，离子通道包括参与产生电压的离子转运的生物膜以及其它细胞内的细胞器膜等的转运蛋白、离子交换体(例如Na-Ca交换体)和离子泵(Na-K泵)，所述生物膜包括细胞膜和核膜。通过对筛选用细胞中的靶离子通道进行选择，提供用于预防或治疗与靶离子通道相关的疾病的筛选用细胞。靶离子通道的第一实例由各种类型的离子通道整合型药物受体组成。这些受体的实例包括烟碱乙酰胆碱受体、离子通道型ATP受体(P2x受体)、离子通道型谷氨酸受体、离子通道型GABAa受体、离子通道型甘氨酸受体和3型血清素受体。另外，其它实例包括各种类型的瞬时受体电位(TRP)通道(非选择性阳离子通道)。其它实例包括钙池操纵的Ca离子通道，例如Orai通道和Stim蛋白。另外，靶离子通道的其它实例包括各种类型的电压依赖性离子通道。其实例包括所有电压依赖性Ca离子通道、所有电压依赖性K离子通道(包括HERG通道)、所有电压依赖性Na离子通道和所有电压依赖性Cl离子通道。此外，其它实例包括配体依赖性Ca离子通道、Na离子通道、质子离子通道、K离子通道和Cl离子通道。此夕卜，其它实例包括通过感应诸如电压电位、温度、PH或张力的刺激而打开和关闭的所有离子通道。与疾病或症状密切相关的离子通道是优选的靶离子通道。这样的Na离子通道的实例包括Navl.1至1.3以及Navl.5至1.9离子通道。这些离子通道与癫痫、神经性疼痛、心律失常和其它类型的疼痛相关，并且可用于筛选用于治疗或预防这些病症的药物。另外，Ca离子通道的实例包括Cavl.1、1.2、1.3、1.4、2.1、2.2、2.3、3.1、3.2和3.3离子通道。这些离子通道与心血管疾病、阿尔茨海默氏病、疼痛、癫痫和高血压相关，并且可用于筛选用于治疗或预防这些病症的药物。K离子通道的实例包括Kvl.1至1.5、Kv3.2、Kv4.3、Kv7.1至7.5、Kvl0.1、Kvl1.1 (包括hERG)和Kvl2.1至12.3离子通道。这些离子通道与多发性硬化症、自身免疫性疾病、疼痛、房颤、糖尿病、癫痫、神经痛、阿尔茨海默氏病、尿失禁、心律失常和癌症相关，并且可用于筛选用于治疗或预防这些病症的药物。另外，Cl离子通道的实例包括CLC-1至7、-Ka和Kb离子通道，与高血压相关，并且可用于筛选用于预防或治疗这种病症的药物。特别是，hERG K离子通道是优选的靶离子通道。该离子通道是电压依赖性K离子通道的一种，其具有6次跨膜结构并形成四聚体。该K离子通道与其它电压依赖性K离子通道之间的差异之一是该K离子通道表现出内向整流性。这是由于极其快速地发生C型失活而引起的。该K离子通道还在心脏的动作电位的第三相复极化相中起到强烈的作用。已知，该K离子通道参与心律失常，因为它会在心脏动作电位的复极化相中引起超极化，并且该K离子通道也参与癌症。由于当hERG通道被抑制时诱导了高度致死性的长QT综合征，因此，目前所有类型的药物候选化合物都需要评估其引起心律失常的作用，该作用是由起源于对hERG K离子通道的抑制作用的心脏毒性引起的。因此，对于靶离子通道而言，具有hERG K离子通道的筛选用细胞是非常有用的。在筛选用细胞中表达hERG K离子通道的情况下，由于例如由电刺激产生的动作电位被缩短，因此，细胞死亡是不太可能发生的。通过加入已知具有或怀疑具有对hERG K离子通道的抑制作用的化合物，根据该抑制的程度，在筛选用细胞中细胞死亡更容易发生，从而使得可以定量评价对hERG K离子通道的抑制效应。hERG的实例是 GenBank 登录号 NM_000238.2。任何筛选用细胞均可用于筛选，条件是它们表达靶离子通道。用于筛选的筛选用细胞优选特异性表达或高表达靶离子通道。这是出于具有更有利的精确度和灵敏度的筛选的目的。由于离子通道常常分布在特定的细胞中，因此，预先要靶向的离子通道高表达的细胞可以被选择作为筛选用细胞的亲代细胞。然而，为了在筛选用细胞中试管外稳定表达靶离子通道，筛选用细胞保持并表达编码靶离子通道的DNA (第三DNA)。另外，筛选用细胞可以恒定表达或瞬时表达靶离子通道。也就是说，第三DNA可以被整合到染色体中以便传递给子细胞，或者可以被整合到在染色体外自主扩增并且不一定传递给子细胞的质粒中。优选地，第三DNA被连接到恒定地起作用的启动子(组成性启动子)的控制下。根据本领域普通技术人员公知的基因工程技术和转化体生产技术，通过构建含有第三DNA的表达载体等，然后通过将其插入其中来转化筛选用细胞的宿主，这些筛选用细胞可以作为恒定表达的细胞或瞬时表达的细胞被适当地获得。此外，在待表达的靶离子通道由两个以上的不同亚基(其可以是不同离子通道的亚基)构成的情况下，各自编码那些亚基的DNA优选以至少一种第三DNA的形式被表达在筛选用细胞中。此外，在需要酶或其它蛋白质来使所表达的靶离子通道有效地发挥功能的情况下，也可以共表达这些蛋白质。在这种情况下，可以可表达地保持有编码这些其它蛋白质的DNA。此外，其它蛋白质的实例包括各种类型的受体蛋白质、GTP结合蛋白和磷酸化酶。对筛选用细胞的宿主细胞没有特别的限制，条件是它们可以用于筛选，并且可以使用各种类型的动物和植物细胞。动物细胞的实例包括哺乳动物细胞和昆虫细胞，但是对此没有特别的限制。在宿主细胞是人类细胞以外的细胞例如牛、猪、马、禽类、犬或猫的细胞的情况下，可以获得用 于预防或治疗这些动物中的疾病的药物的筛选用细胞。另外，在使用昆虫细胞作为宿主的情况下，可以获得可用于筛选靶向用于抗昆虫的农业化学品等的筛选用细胞。另外，当宿主细胞是植物细胞时，可以获得可用于筛选农业化学品等的筛选用细胞。通常使用的动物细胞的实例包括人胚胎肾细胞(HEK细胞)、非洲绿猴细胞(COS细胞)、中国仓鼠卵巢细胞(CH0细胞)、幼仓鼠肾细胞(BHK细胞)和爪蟾卵母细胞。(筛选方法)可以使用下面的步骤来提供本说明书中公开的筛选方法:通过利用筛选用细胞的存活或死亡作为指标，使用本说明书中公开的筛选用材料的筛选用细胞来检测受试化合物对靶离子通道的作用。根据本发明的筛选方法，本说明书中公开的筛选用细胞的使用使得可以通过利用筛选用细胞的存活或死亡作为指标来检测受试化合物对靶离子通道的作用。因此，可以容易地并高效率地同时评价大量样本。另外，由于不需要特殊的程序和设备，因此，可以降低筛选成本而不会降低该程序固有的精确度。通过使用靶向如前面所解释的各种类型的离子通道的筛选用细胞，本说明书中公开的筛选方法可用于筛选用于预防或治疗与靶离子通道相关的疾病或症状的药物。在执行筛选时，可以向筛选用细胞供给一种或多种受试化合物。可以使用单个受试化合物来检测受试化合物的作用，或者可以使用两种以上的受试化合物来检测这些化合物的联合作用或协同作用。在基于筛选用细胞的存活或死亡来检测对靶离子通道的作用中，在不供给受试化合物的情况下筛选用细胞的存活或死亡可以被用作对照。或者，对靶离子通道具有已知的作用的化合物可以被用作对照。通过与这样的对照进行比较，可以检测受试化合物对靶离子通道的作用的存在或不存在或者该作用的程度。对受试化合物没有特别的限制。除了低分子量化合物以外，受试化合物可以是蛋白质、肽、核酸(DNA或RNA)例如寡核苷酸或多核苷酸(polyoligonucleotide)、寡糖、多糖或脂质。在必要时，除了受试化合物以外，可以向筛选用细胞给予各种类型的刺激。这是因为通过与这些刺激组合可以促进或抑制作用。另外，还可以评价对这样的靶离子通道的作用，所述靶离子通道在刺激的存在下被活化或失活。这样的刺激的实例包括温度变化(高温或低温)、pH变化、O2ZCO2浓度的变化以及渗透压的变化。另外，正如随后将描述的，存在的情况是，在检测步骤中有必要诱导筛选用细胞的细胞膜的去极化。在这种情况下，优选使用不太可能影响受试化合物的刺激例如电刺激。在利用筛选用细胞的细胞死亡作为指标来检测受试化合物对靶离子通道的作用中，所述指标并不限于就筛选用细胞的存活或死亡而言的二选一的选择，而是包括利用细胞死亡的比率(或者换言之，活细胞的比率)作为指标。通过利用细胞死亡的比率作为指标，还可以对作用的效力或程度或敏感性等进行评价。对于用于检测筛选用细胞的细胞死亡(或者筛选用细胞的存活)的方法，可以采用各种类型的已知技术，对此没有任何特别的限制。这种方法的实例包括各种技术，例如基于细胞染色、核染色或酶活性的MTT法。考虑到精确度和效率，可以对这些技术适当地进行选择。另外，也可以通过检测导致细胞死亡的持续动作电位来检测细胞死亡。也就是说,可以检测引起细胞死亡的类似的动作电位的持续时间。通过常规的膜电位电学检测或者通过荧光膜电位检测或使用膜电位敏感的染料，可以检测该动作电位的持续状态。
在本说明书中公开的筛选方法中，筛选方法的模式被适当地选择成与靶离子通道的类型相对应。更具体地，筛选方法的模式被适当地选择成与靶离子通道的控制方法或功能相对应。例如，用于使靶离子通道活化(或失活)的刺激的存在或不存在或者刺激的类型被选择成与靶离子通道的控制方法(例如它是否为电压依赖性、配体依赖性、机械刺激依赖性、温度依赖性、渗漏通道或磷酸化依赖性等)相对应。另外，利用细胞死亡作为指标的评价模式(例如通过活化或抑制靶离子通道)被选择成与靶离子通道的功能相对应。例如，在靶离子通道是电压依赖性离子通道的情况下，已知通过活化(由规定的膜去极化而活化)可表达各种类型的功能。其具体实例包括动作电位的产生、兴奋的传导(与Na离子通道相关)、神经递质的释放、神经和心肌中动作电位的产生(与Ca离子通道相关)、维持膜电位、兴奋的控制、动作电位的复极化(与K离子通道相关)、膜电位的复极化、蛋白质的重吸收、骨基质的吸收和Cl的转运(与Cl离子通道相关)。例如，当靶离子通道是通过活化来诱导筛选用细胞的生物膜例如细胞膜的去极化的离子通道时，检测步骤中使用的筛选模式的实例如下所示。也就是说，一个实例是(I)通过利用筛选用细胞的存活或死亡作为指标，在受试化合物的存在下检测受试化合物对筛选用材料的靶离子通道的作用的步骤。更具体地，在已向筛选用细胞给予受试化合物后，检测筛选用细胞的存活或死亡。当检测到促进细胞死亡时，受试化合物可以被确定为对靶离子通道具有活化作用的激动剂(活化剂)。另外，当类似地使用离子通道作为靶标时，另一个实例是(2)通过利用上述细胞的存活或死亡作为指标，在受试化合物和作用在靶离子通道上的刺激的存在下检测受试化合物的作用的步骤。更具体地，预先向筛选用细胞给予受试化合物，随后加入靶离子通道的已知激动剂，然后检测筛选用细胞的存活或死亡。在没有检测到细胞死亡或细胞死亡被抑制的情况下，受试化合物可以被确定为对靶离子通道有抑制性的拮抗剂(抑制剂)。另外，当靶离子通道是抑制筛选用细胞等的细胞膜的去极化和/或动作电位(促进超极化)的离子通道例如渗漏通道时，检测步骤的模式的实例如下所示。也就是说，通过利用筛选用细胞的存活或死亡作为指标，在受试化合物和诱导筛选用细胞的生物膜去极化的刺激的存在下检测受试化合物的作用。在这种情况下，在受试化合物的存在下，靶离子通道被恒定地活化，并且去极化被抑制或动作电位被抑制(促进了复极化)。因此，即使当通过给予诱导筛选用细胞的细胞膜去极化的刺激例如电刺激来激活控制细胞死亡的机制时，动作电位既没有被产生也没有被延长。结果，筛选用细胞仍然是活的。另一方面，当向筛选用细胞给予受试化合物和上述刺激时，如果促进了筛选用细胞的细胞死亡，则受试化合物可以被确定为抑制靶离子通道的抑制剂。另外，当·靶离子通道是通过活化来抑制筛选用细胞的生物膜例如细胞膜的去极化和/或动作电位(促进复极化)的离子通道例如hERG K离子通道时，检测步骤中筛选模式的实例如下所示。也就是说，通过利用筛选用细胞的存活或死亡作为指标，在受试化合物和诱导筛选用细胞的生物膜去极化的刺激的存在下检测受试化合物的作用。更具体地，当在向筛选用细胞给予受试化合物的同时或之后，通过电刺激等诱导了生物膜的去极化时，如果筛选用细胞的细胞死亡被抑制，则受试化合物可以被确定为使靶离子通道活化的激动齐U。另一方面，当促进了筛选用细胞的细胞死亡时，受试化合物可以被确定为抑制靶离子通道活化的抑制剂。正如上面所描述的，根据本说明书中公开的筛选方法，通过利用筛选用细胞的存活或死亡作为指标，可以各种模式容易并有效地检测受试化合物对靶离子通道的作用。该筛选方法还适用于需要快速结果的筛选系统，以及具有困难的化学结构的、靶向离子通道的药物的筛选，特别是需要高通量的初步筛选。(测试方法)根据本说明书的公开·内容，还提供了用于测试受试化合物的方法，所述方法提供有下面的步骤:通过利用筛选用细胞的存活或死亡作为指标，使用本说明书中公开的筛选用材料的筛选用细胞来检测受试化合物对靶离子通道的作用。根据该测试方法，可以容易并快速地测定受试化合物对靶离子通道的作用(活化或抑制)。因此，在受试化合物需要具有一定程度以上的作用的情况下，这是有用的测试方法。在本说明书所公开的测试方法中，可以直接使用本说明书中公开的如前面所解释的筛选方法的各种类型的模式。(筛选装置)本说明书中公开的筛选装置是用于筛选对离子通道具有作用的化合物的装置，并且可以提供有细胞容纳单元和测定单元，所述细胞容纳单元提供有容纳细胞的一个或多个区域(细胞容纳区域)，所述测定单元用于测定上述一个或多个区域中上述细胞的细胞死亡。根据本说明书中公开的筛选装置，由于提供了细胞死亡测定单元，因此可以有效地检测所述细胞容纳单元中的细胞死亡。该筛选装置可以使用本说明书中公开的筛选用细胞。此夕卜，可以采用如前面在本发明的筛选方法中所解释的各种方法来检测细胞死亡。细胞容纳单元可以在其中提供有已知的多孔板的孔或类似大小的孔以用作细胞容纳区域，条件是它们能够容纳适合于测定细胞死亡的细胞数。这些孔通常还能够含有培养基，以便能够温育细胞。所述孔优选被布置为阵列的形式。细胞死亡测定单元可以采用与用于检测细胞死亡的方法相对应的各种模式。例如，在通过供给一种或多种药物来检测活细胞或死细胞的情况下，可以提供药物供给单元，所述药物供给单元允许将药物供给至细胞容纳区域。所述药物供给单元典型地是用于将药物同时或顺次供给至细胞容纳区域的药物注入单元，而所述药物供给单元的其它实例包括用于储存药物的药物储存单元、用于从药物储存单元输送药物并从药物注入单元排出的泵单元、以及用于控制供给的药物量的控制单元。在这些各单元之中，优选提供药物注入单元，而根据需要适当地提供其它各单元。另外，细胞死亡测定单元尽管根据检测方法而变化，但是可以提供有光学检测单元，所述光学检测单元用于电学或光学检测细胞容纳区域中细胞的细胞死亡。除了提供有光源之外，所述光学检测单元通常可以提供有扫描器单元，并且还提供有控制单元，所述控制单元用于通过参照对照等来计算检测到的作为光强度的信号。此外，细胞死亡测定单元和/或筛选装置可以提供有控制筛选步骤并储存结果的储存单元以及提供有所述储存单元的控制单元。此外，还可以提供显示这些步骤和结果的显示单元。此外，可以提供用于打印出结果的打印机单元。 筛选装置还可以提供有电压施加单元，所述电压施加单元用于向一个或多个细胞容纳区域施加电压。由于使得可以向细胞容纳区域中的细胞给予电刺激，因此，可以有效地执行在筛选方法的检测步骤中给予电刺激的程序。通过向细胞容纳区域中本发明的筛选用细胞给予电刺激并诱导细胞膜的去极化，该电压施加单元可用于激活控制细胞死亡的机制。电压施加单元可以提供有适用于一部分或全部的细胞容纳区域的电极以及用于向电极施加电压的电源。另外，优选 通过前面解释的控制单元来控制施加的电压。(筛选用试剂盒)本说明书中公开的筛选用试剂盒提供有本说明书中公开的筛选用材料。根据该试剂盒，可以容易并有效地执行使用本发明的筛选用细胞来筛选作用在离子通道上的受试化合物。除了本发明的筛选用材料之外，本发明的试剂盒还可以提供有用于测定细胞死亡的试剂。另外，本发明的试剂盒还可以提供有适用于筛选用细胞的培养基。本发明的筛选用试剂盒还可以提供有本说明书中公开的筛选装置。根据前面解释的各种类型的模式，适当地选择并组合本发明的筛选用试剂盒中使用的筛选用细胞、筛选用材料和筛选装置。实施例尽管下面提供了实施本说明书的公开内容的实施例的解释，但本说明书的公开内容不限于此。[实施例1](Nav1.5通道失活位点的IFM基序突变体的产生)将存在于控制Navl.5通道的失活的II1-1V接头区域中的疏水性氨基酸序列Ile-Phe-Met (IFM基序)全部突变成Gin。下面示出了突变后的氨基酸序列(基序)。hNavl.5氨基酸序列(仅示出了含有被靶向突变的IFM的区域)(SEQ ID NO:1)1470-1DNFNQQKKKLGGQDIFMTEEQKKYYNAMKK-1500(IFM的带下划线的部分被突变成QQQ)通过使用pcDNA3.1/Nav1.5作为模板，并使用如下所示的特异性PCR引物和QuikChange 定点诱变试 剂盒(Quik Change Site-Directed Mutagenesis Kit) (Stratagene公司)，来产生失活抑制的突变体Nav-QQQ，所述pcDNA3.1/Nav1.5是通过将人源性Navl.5(GenBank登录号:ΝΜ_198056.2)亚克隆到pcDNA3.1 (+)(Invitrogen公司)中而获得的。使用 Big Dye 终止剂 3.1 版循环测序试剂盒(Big Dye Terminator Ver.3.1Cycle SequencingKit) (Applied Biosystems公司)和突光毛细管测序仪(ABI Prism3100Avent遗传分析仪，Applied Biosystems公司)来证实所得到的克隆的DNA序列，并使用Hipure PlasmidMaxiprep试剂盒(Invitrogen公司)大量纯化质粒DNA。引物:5’-GTTAGGGGGCCAGGACCAACAACAGACAGAGGAGCAGAAG-3， (SEQ ID NO:2)5’-CTTCTGCTCCTCTGTCTGTTGTTGGTCCTGGCCCCCTAAC-3’ (SEQ ID NO:3)[实施例2](细胞培养和基因插入)人源性胚胎肾细胞(HEK293细胞)购自卫生科学研究资源库(Health SciencesResearch Resource Bank)(HSRRB)。在含有lOOU/ml青霉素(和光纯药株式会社)和100 μ g/ml链霉素(明治制果株式会社)的D-MEM培养基(和光纯药)中，向其中加入10%FBS (Gibco公司)，然后在37°C下在CO2中进行培养。使用Lipofectamine2000试剂(Invitrogen公司)来插入pcDNA/Kir2.1，所述pcDNA/Kir2.1是通过将人源性Kir2.1 (NM_00891.2)亚克隆到pcDNA3.1(+) (Invitrogen公司)中而获得的，接着在通过向上述D-MEM培养基加入0.2mg/ml博来霉素(Invitrogen公司)而获得的培养基中进行培养，然后克隆耐博来霉素的细胞以产生恒定表达Kir2.1的细胞(HEK-Kir)。另外，使用相同的方法将失活的突变体Nav-QQQ(HEK-Kir突变的Nav)插入到恒定表达Kir2.1的细胞中，然后在24至72小时后进行实验。(电生理学实验)使用由Hamill等建立的膜片钳法执行电流测定。使用两阶段的电极制造机(PB-7，成茂科学(Narishige C0.Ltd.))从含有外径为1.04 μ m至1.08 μ m的细丝的玻璃管制造尖端直径为约I μ m的玻璃微电极，然后在500X放大倍数下在显微镜下进行热处理以使尖端变平滑。在本实验中，所使用的电极是当填充有电极内液时电极电阻为2ΜΩ至5ΜΩ的电极。固定载玻片并用外液进行灌流，在所述载玻片中，细胞被结合在体积为约500μ I的腔室中，并在倒置显微镜(Nikon TMD)台上进行固定。外液(正常的HEPES缓冲液)组合物由 137mM NaCl,5.9mM KC1、2.2mM CaCl2U.2mM MgCl2、14mM 葡萄糖和 IOmM HEPES (ρΗ7.4，用 NaOH 确定)组成。移液管内液组合物由 140mM KCl、4mM MgCl2、5mM ATP_2Na、0.05mM EGTA和IOmM HEPES (ρΗ7.2，用KOH确定)组成。所有实验均在室温(23± 1°C )下执行。用液压显微操纵器(M0-203，成茂科学)对着那些附着于载玻片的细胞压紧玻璃微电极，并使用电压钳法和电流钳法记录数据。使用微电流放大器(EPC-7:Heka Electronik GmbH)放大所测得的电流和电位，并使用A-D转换器(Digdatal400A:Axon Instruments公司)将其记录在计算机上。使用 Clampfitl0.2 软件(Axon Instruments 公司)和 0rigin6.0J (MicrocalSoftware公司)对数据进行分析。(细胞死亡的测定)将三种类型的细胞(HEK、HEK-Kir和HEK-Kir突变的Nav)分配在含有100 μ ID-MEM培养基的96孔板中，使浓度为5Χ IO3个细胞/孔，然后在37°C下在5%C02中进行培养。I天后，两个直径为0.5mm的刺激性银丝电极被插入到每个孔的培养液中，使其尖端被插入到约2mm的深度，然后使用电刺激装置(日本光电工业株式会社(Nihon KohdenCorp.))每隔3分钟使用刺激幅度为200ms的方波在40mA、80mA、120mA和160mA四个电流强度(强度I至4)下进行电刺激，共3次。并不一定需要如上所示的电刺激条件，而只需要所选择的条件能够可靠地产生动作电位即可。然后，将细胞在37°C下在5%C02中进行培养，并在I天后，加入10 μ I MTT试剂(通过用磷酸盐缓冲盐水PBS (-)将其溶解成终浓度为5mg/mL来制备)，将细胞在37°C下在5%C02中培养4小时，然后加入100 μ I裂解溶液(20%SDS/50%DMF溶液)来裂解细胞并溶解甲臜盐。此外，在37°C下温育8小时至12小时后，使用Multiscan JX (版本1.1, Thermo Labsystems公司，美国)在595nm的测定波长和650nm的参照波长下测定吸光度，所述吸光度被用作活细胞数目的间接指标。然而，也可以通过将上述4小时和8至12小时的时间分别缩短为2小时和3小时来进行测定。(结果)1.HEK-Kir细胞的功能分析通过对HEK-Kir细胞应用电压钳法来测定Kir通道电流。结果，如图2A中所示，观察到Kir通道电流的向内整流性，并且，当施用选择性抑制剂100 μ M Ba离子时，该内向电流被抑制。另外，当用电流钳法测定膜电位时，如图2Β中所示，观察到约_70mV的深静息膜电位，并且，由于100 μ M Ba离子的施 用，静息电流电位变浅。2.野生型和突变型Navl.5通道电流的失活速率以及动作电位产生时间(持续时间)的差异在HEK-Kir细胞中瞬时表达野生型和突变型Navl.5通道，然后测定Na离子通道电流。结果，如图3中所示，所观察到的电流为，在突变型的情况下(图3Β)，Na离子通道电流的失活是极其缓慢的。另外，当使用相同的细胞通过去极化电刺激(对于野生型为300ρΑ持续10ms，对于突变型为200ρΑ持续100ms)来产生动作电位时，在突变型的情况下(图4Β)，产生动作电位的时间被确定为显著更长。结果示于图4中。3.由于电刺激引起的细胞死亡的变化从上面第2部分中描述的结果可清楚地确定，在突变型Navl.5通道中产生了极长的动作电位。由于当通过电刺激来产生动作电位时，认为有发生细胞死亡的可能性，因此，测定由于电刺激引起的细胞死亡。使三种类型的细胞HEK、HEK-Kir和HEK-Kir突变的Nav细胞经受电刺激，然后通过MTT法测定细胞数的变化。如图5中所示，当在80mA下经受3次200ms的方波电刺激(每隔3分钟)时，HEK-Kir突变的Nav细胞的数目显著降低。这表明，HEK-Kir突变的Nav细胞对去极化刺激高度敏感。另外，施用Na离子通道抑制剂利多卡因(Sigma公司)，然后在相同的刺激强度下经受电刺激。结果，如图6中所示，抑制了细胞死亡的发生。在此基础上，HEK-Kir突变的Nav细胞中发生的细胞死亡被确定为是产生了极长的动作电位的结果，而抑制Na离子通道阻断细胞死亡。
[实施例3]按照实施例2，通过将人源性hERG (NM_000238.2)亚克隆到pcDNA3.1 (+)中并插入到天然的HEK细胞以及恒定表达HEK-Kir突变的Nav的细胞中，来产生hERG_HEK细胞和hERG-Kir突变的Nav细胞，然后在24小时至72小时后执行电生理学实验。按照实施例2，在天然的HEK细胞、hERG-HEK细胞和hERG_HEK突变的Nav细胞上执行电生理学实验，然后测定hERG通道电流和动作电位。hERG K离子通道表现出内向整流性，并在已被表达在筛选用细胞中的情况下，所述hERG K离子通道起到通过缩短由电刺激等产生的动作电位来抑制细胞死亡的作用。向通过在天然的HEK细胞中瞬时表达hERG通道而获得的hERG-HEK细胞施用hERG通道抑制剂尼非卡兰，并在施用之前和之后测定细胞膜的电位。电流图示于图7中，而电流-电压曲线示于图8中。如图7和8中所示，在施用尼非卡兰之后，hERG通道电流被确定为是被抑制的。另外，向通过在HEK-Kir突变的Nav细胞中瞬时表达hERG通道而获得的hERG-HEK-Kir突变的Nav细胞施用尼非卡兰，并在施用之前和之后测定细胞膜的电流。电流图示于图9中，通过去极化电刺激产生的动作电位图示于图10中，通过去极化电刺激产生的动作电位时间(持续时间)被总结在图11中。如图9至11中所示，在hERG-HEK-Kir突变的Nav细胞的情况下，所述hERG-HEK-Kir突变的Nav细胞提供有控制细胞死亡的机制以及表达的hERG，当未施用尼非卡兰时，动作电位的持续时间被hERG缩短，而通过施用尼非卡兰，hERG通道被抑制，并且动作电位的持续时间显著延长。基于上面的结果，当hERG通道被表达在HEK-Kir突变的Nav细胞中时，据认为，由于电刺激引起的细胞死亡被抑制，并且通过施用尼非卡兰，诱导了细胞死亡。[实施例4]在本实施例中，在hERG-HEK-Kir突变的Nav细胞中检查由电刺激和尼非卡兰诱导的细胞死亡。按照实施例2执行细胞死亡的测定。此外，通过在150mA下用300ms的方波脉冲电刺激3次(每隔3分钟)来执行电刺激。通过施用尼非卡兰诱导的细胞死亡的结果示于图12中，而诱导细胞死亡所需要的尼非卡兰剂量的剂量-响应曲线示于图13中。如图12中所示，尽管即使在hERG-HEK-Kir突变的Nav细胞经受方波电刺激时仍未诱导细胞死亡，但是，细胞死亡被确定为由通过施用尼非卡兰引起的去极化刺激所诱导。此外，如图13中所示，尼非卡兰被确定为浓度依赖性地诱导细胞死亡。基于上面的结果，作为用于筛选作用在离子通道例如hERG上的化合物并监测细胞死亡等的筛选用材料，hERG-HEK-Kir突变的Nav细胞被确定为是优选的。[实施例5]在本实施例中，使用DiBAC4(3)形式的膜电位敏感的染料并使用用于去极化刺激的含有高浓度K离子的细胞外溶液，对膜电位的测定进行了研究。DiBAC4 (3)具有在去极化后荧光强度增加的性质，并证实了膜电位与荧光强度变化之间的关联性。在用IOOnM的DiBAC4(3)(双(1，3_ 二丁基巴比妥酸)三次甲基氧烯洛尔)在含有该染料的正常的HEPES缓冲液中 在室温下荷载两种类型的细胞(HEK和HEK-Kir突变的Nav细胞)30分钟后,通过在488nm下激发并用分色镜在505nm下反射,在520nm以上的波长下测定荧光。另外，具有增加的K离子浓度的高K+细胞外液被用作使细胞膜去极化的刺激。这是因为K离子主要参与静息膜电位的形成。尽管Na-K泵将细胞内K离子浓度维持在比细胞外高的水平，但是，渗漏通道使K离子排出到细胞外。由Na-K泵引起的K离子内流和由渗漏通道引起的K离子排出之间达到平衡时的电位是静息膜电位。因此，由于当细胞外K离子浓度增加时，细胞内和细胞外的K离子浓度之间的差异变小，因此，静息膜电位变浅。在本实施例中，使用这种去极化刺激来测定两种类型的细胞的荧光强度的变化。此外，在使细胞外K离子浓度为140mM K+的情况下，荧光强度的值为1，基于这一点来进行测定。Argus/HiSCA高速冷却式CO)相机突光成像系统(滨松光子(Hamamatsu Photonics K.K.))被用于测定荧光。结果示于图14至17中。图14和15分别示出了 HEK-Kir细胞和HEK-Kir突变的Nav细胞中由高K+刺激引起的荧光变化(横轴:时间，纵轴:荧光强度，顶迹:细胞外K离子浓度)。如图14和15中所示，从细胞获得的荧光强度被确定为随细胞外K离子浓度增加而增加。也就是说，细胞外K离子浓度被确定为促进膜电位的去极化。图16示出了当向HEK-Kir细胞和HEK-Kir突变的Nav细胞分别给予相同浓度的细胞外K离子(15.3mM)刺激时的荧光强度。如图16中所示，与HEK-Kir细胞相比，HEK-Kir突变的Nav细胞对该相同的K离子浓度刺激表现出更高的荧光强度，并且被确定为对去极化的促进更敏感或更易感。图17示出了在引起细胞外K离子浓度从5.9mM变化成15.3mM的情况下施用利多卡因对HEK-Kir突变的Nav细胞中荧光强度的影响。利多卡因是Na离子通道的抑制剂，在图17中，用下划线表示施用ImM利多卡因的持续时间。如图17中所示，通过用含有K离子浓度的细胞外溶液刺激而引起的荧光变化被确定为被利多卡因抑制。此外，HEK-Kir突变的Nav细胞和HEK-Kir细胞被证实在利多卡因存在下表现出相同的荧光变化。基于上面的结果，在HEK-Kir突变的Nav细胞中，失活抑制的Na离子通道被确定为参与由K刺激引起的显著的荧光变化。本发明的筛选用细胞被确定为可用于测定膜电位敏感的染料DiBAC4(3)的荧光。[序列表自由文本]SEQ ID N0:2 和 3:引物
权利要求
1.作用在靶离子通道上的化合物的筛选用材料，所述材料包含细胞，所述细胞保持有至少一种第一 DNA，所述第一 DNA编码电压依赖性Na离子通道，所述电压依赖性Na离子通道已被抑制而不失活，并且其中K离子通道已被活化，以致静息膜电位在负方向上变得更深。
2.权利要求1的筛选用材料，其中所述至少一种第一DNA包括编码Navl.5通道突变体的 DNA。
3.权利要求1或2的筛选用材料，其中所述K离子通道包括Kir2.1通道。
4.权利要求1至3任一项的筛选用材料，其中所述细胞还保持有至少一种外源的第二DNA,所述第二 DNA编码K离子通道。
5.权利要求1至4任一项的筛选用材料，其中所述靶离子通道包括hERG离子通道。
6.权利要求1至5任一项的筛选用材料，其中所述细胞保持有至少一种第三DNA，所述第三DNA编码靶离子通道。
7.靶离子通道的激动剂或抑制剂的筛选方法，所述方法包括下面的步骤: 通过利用细胞的存活或死亡或者与细胞死亡相当的持续动作电位作为指标，使用权利要求I至6任一项的筛选用材料来检测受试化合物对靶离子通道的作用。
8.权利要求7的方法，其中所述靶离子通道是通过活化来诱导细胞中细胞膜的去极化的离子通道，并且 检测步骤是在受试化合物的存在下检测受试化合物对筛选用材料的靶离子通道的作用的步骤。
9.权利要求 7的筛选方法，其中所述靶离子通道是通过活化来诱导细胞中细胞膜的去极化的离子通道，并且 检测步骤是在受试化合物和作用在靶离子通道上的刺激的存在下检测受试化合物的作用的步骤。
10.权利要求7的方法，其中所述靶离子通道是抑制细胞中细胞膜的去极化和/或动作电位的离子通道，并且 检测步骤是在受试化合物和诱导细胞中细胞膜的去极化的刺激的存在下检测受试化合物的作用的步骤。
11.权利要求7的方法，其中所述靶离子通道是通过活化来抑制细胞中细胞膜的去极化的离子通道，并且 检测步骤是在受试化合物和诱导细胞中细胞膜的去极化的刺激的存在下检测受试化合物的作用的步骤。
12.用于筛选作用在离子通道上的化合物的装置，所述装置包含: 细胞容纳单元，其提供有用于容纳细胞的一个或多个区域，以及 测定单元，其测定所述一个或多个区域中的细胞死亡或与细胞死亡相当的持续动作电位。
13.权利要求12的装置，其中所述测定单元提供有供给单元和光学检测单元，所述供给单元供给一种或多种用于检测所述一个或多个区域中的细胞死亡或与细胞死亡相当的持续动作电位的药物，所述光学检测单元用于光学检测所述一个或多个区域中的细胞死亡或与细胞死亡相当的持续动作电位。
14.权利要求13的装置，其还包含电压施加单元，所述电压施加单元向所述一个或多个区域施加电压。
15.用于筛选作用在离子通道上的化合物的筛选用试剂盒，其包含权利要求1至6任一项的筛选用 材料。
全文摘要
本发明的目的是提供靶向离子通道并具有优异的效率的筛选系统。具体地，本发明提供了作用在靶离子通道上的化合物的筛选用材料，所述材料包含细胞，所述细胞保持有至少一种第一DNA，所述第一DNA编码电压依赖性Na离子通道，所述电压依赖性Na离子通道已被抑制而不失活，并且其中K离子通道已被活化，以致静息膜电位在负方向上变得更深。
文档编号C12N15/09GK103228793SQ201180041709
公开日2013年7月31日 申请日期2011年6月29日 优先权日2010年6月29日
发明者今泉祐治, 藤井将人, 大矢进, 山村寿男 申请人:公立大学法人名古屋市立大学, 切诺洛舍曲科技有限会社
技术领域：
相关申请的交叉参考本申请要求2010年6月29日提交的日本专利申请N0.2010-147255的优先权，所述专利申请的内容通过参考结合于此。本发明涉及作用在离子通道上的化合物的筛选用材料及其应用，更具体地，本发明涉及可用于筛选作用在离子通道(包括膜转运蛋白)上的化合物的含细胞材料以及使用所述材料的筛 选方法。
背景技术：
离子通道在生理学上具有重要功能。通过靶向这些离子通道发现作用在离子通道上的激动剂和抑制剂有望提供有用的药物。用于评价靶向这种离子通道例如电压依赖性离子通道的药物的筛选系统的方法的已知实例是荧光膜电位测定法，所述荧光膜电位测定法用电压依赖性荧光染料检测细胞中膜电位的变化(专利文献I)。另外，通过将玻璃电极附着(封接)于细胞膜来电学检测膜电位的膜片钳法也是已知的。此外，最近已开发出自动膜片钳法，所述自动膜片钳法使用在每个孔中具有与玻璃电极的末端相对应的开口的多孔膜片板(patch plate),以在每个孔中通过自动封接细胞膜和膜片电极(patch electrode)来检测膜电位(非专利文献I)。存在的情况是，尽管常规的荧光膜电位测定法适用于评价大量样本，但它们在测定的精确度和可适用的离子通道的范围方面存在局限性。另外，尽管膜片钳法具有高测定精确度并允许从测定中获得大量信息，但它由于一次只能够测定少量样本，因而具有低效率。此外，尽管自动膜片钳法采用了允许同时对大量样本进行评价的结构，但该膜片的效率是低的，从而使得该方法不适合于高通量筛选。另外，自动膜片钳法还具有设备和运行成本高的问题。在靶向离子通道筛选的情况下，由于内源性配体是离子，因此，难以预测能够与靶标结合的结构。因此，在构建靶向离子通道的筛选系统时，与靶向受体和其它蛋白质的情况相比，允许施加大量受试化合物的高通量甚至是更重要的。另外，在靶向离子通道筛选的情况下，配体的优化常常是困难的，从而导致在高通量的同时还需要测定的精确度。然而，正如前面所描述的，用于测定细胞中膜电位的微小变化的常规荧光膜电位测定法具有精确度和适用范围方面的问题，而自动膜片钳法具有效率和成本方面的问题。因此，还需构建表现出有利的精确度和优异的效率的靶向离子通道的筛选系统。现有技术文献专利文献专利文献1:日本特开2006-126073号公报非专利文献非专利文献I:Tim J.Dale 等，Mol.Biosyst.2007，3，714-72
发明内容
本说明书的公开内容的目的是构建靶向离子通道并具有优异的效率的筛选系统。本发明的发明人注意到，靶向离子通道的筛选系统被迫使用基于检测活细胞的膜电位的评价技术，这些评价技术所具有的问题使得难以构建筛选系统。因此，为了构建能够应用更简单的评价技术而不是这些常规评价技术的筛选系统，进行了各种研究。结果，本发明的发明人发现，一旦用来自于细胞外的刺激诱导去极化后，由于细胞中离子浓度的变化、典型地由于细胞内钠(Na)离子浓度的增加而发生细胞死亡的细胞作为用于检测受试化合物对离子通道的作用的介质(筛选用材料)，使得可以通过利用细胞死亡或者引起细胞死亡或与细胞死亡相当的持续动作电位作为指标来检测受试化合物对离子通道的活化或抑制。根据本说明书的公开内容，提供了以下几个方面。根据本说明书的公开内容，提供了化合物的筛选用材料，所述材料包含细胞，所述化合物作用在靶离子通道上，所述细胞保持有至少一种第一 DNA，所述第一 DNA编码电压依赖性Na离子通道，所述电压依赖性Na离子通道已被抑制而不失活，并且其中K离子通道已被活化，以致静息膜电位在负方向上变得更深。另外，根据本说明书的公开内容，提供了筛选方法，所述方法包括下面的步骤:通过利用上述细胞的存活或死亡作为指标，使用上述筛选用材料的上述细胞来检测受试化合物对上述靶离子通道的作用。此外，根据本说明书的公开内容，提供了用于筛选作用在离子通道上的化合物的装置，所述装置包含:细胞容纳单元，所述细胞容纳单元提供有容纳细胞的一个或多个区域；以及测定单元，所述测定单元测定所述一个或多个区域中的上述细胞的死亡。
图1是示出了本说明书中公开的筛选方法的实例的概述的图。图2示出了表示使用电压钳法测定HEK-Kir细胞中Kir通道电流而获得的结果的图；图2A示出了以100 μ M Ba离子形式施用Kir2.1通道的特异性阻断剂之前和之后的电流-电压关系，而图2B示出了施用100 μ M Ba离子之前和之后膜电位的变化。图3示出了表示通过在HEK-Kir细胞中瞬时表达野生型和突变型Navl.5通道来测定Na离子电流而获得的结果的电流图；图3八示出了野生型的结果，而图3Β示出了突变型的结果。图4示出了表示通过在HEK-Kir细胞中瞬时表达野生型和突变型Navl.5通道经去极化电刺激来产生动作电位的动作电位图；图4八示出了野生型的结果，而图4Β示出了突变型的结果。图5是表示通过电刺激三种类型的细胞HEK、HEK_Kir和HEK-Kir突变的Nav细胞经MTT法测定细胞数的变化而获得的结果的图；数值I被指定为未受刺激的对照细胞的吸光度。图6是表示以利多卡因(Sigma公司)的形式向HEK-Kir突变的Nav细胞施用Na离子通道抑制剂、然后进行电刺激而获得的结果的图；数值I被指定为未受刺激的对照细胞的吸光度。
图7示出了在已在HEK细胞中瞬时表达hERG通道的情况下在施用尼非卡兰之前和之后的电流图。图8是表示其中瞬时表达有hERG通道的hERG_HEK细胞中在施用尼非卡兰之前和之后的电流-电压曲线的图。图9示出了在hERG通道被瞬时表达在Kir突变的Nav细胞中而获得的hERG-HEK-Kir突变的Nav细胞中在施用尼非卡兰之前和之后的电流图。图10示出了在hERG-HEK-Kir突变的Nav细胞中在施用尼非卡兰之前和之后由去极化刺激诱导的动作电位图。图11是表示在hERG-HEK-Kir突变的Nav细胞中在施用尼非卡兰之前和之后的动作电位时间(持续时间)的图。图12是表示在hERG-HEK-Kir突变的Nav细胞中由施用尼非卡兰产生的去极化刺激诱导的细胞死亡的图。图13是表示使用hERG-HEK-Kir突变的Nav细胞获得的基于细胞死亡比率的尼非卡兰剂量-响应曲线的图。图14是表示HEK-Kir细胞中由高K+刺激诱导的荧光变化的图。图15是表示HEK-Kir突变的Nav细胞中由高K+刺激诱导的荧光变化的图。图16是表示HEK-Kir细胞和HEK-Kir突变的Nav细胞中在15.3mM的细胞外K+浓度下荧光强度差异的图。
图17是表示HEK-Kir突变的Nav细胞中利多卡因对高K+刺激诱导的荧光变化的抑制的图。
具体实施例方式本说明书的公开内容涉及靶向离子通道的筛选系统，更具体地，本发明涉及能够用于筛选作用在离子通道(膜转运蛋白)上的化合物的含细胞的筛选用材料、使用所述材料的筛选方法、以及筛选装置。根据本说明书的公开内容，通过被构建用于筛选的细胞的细胞死亡可以检测筛选期间对靶离子通道的作用。也就是说，赋予了控制细胞死亡的机制，其中细胞死亡的发生是由于短暂诱导去极化而发生的动作电位的延长。也就是说，本说明书的公开内容利用这种控制细胞死亡的机制作为用于检测受试化合物对靶离子通道的作用的手段。根据这种控制细胞死亡的机制检测受试化合物对靶离子通道的作用的概述的实例示于图1中。如图1中所示，当向本发明的细胞形式的筛选用材料供给受试化合物时，所述细胞提供有Na离子通道，所述Na离子通道的失活已被抑制，并且其中K离子通道已被活化，所述K离子通道使静息电位变深，受试化合物对靶离子通道的作用被表示为诱导或抑制去极化的结果。当受试化合物作用在靶离子通道上并诱导去极化时，基于本发明的筛选用材料的细胞膜上的上述Na离子通道和K离子通道控制细胞死亡的机制的开关被打开，并且本发明的筛选用材料发生细胞死亡。另一方面，当受试化合物作用在靶离子通道上并抑制去极化时，上述控制细胞死亡的机制的开关没有被打开并保持关闭，并且本发明的筛选用材料仍然是活的。因此，根据控制细胞死亡的机制是否被打开或关闭，或者换言之，根据引起细胞死亡或细胞存活的持续动作电位的存在或不存在，本发明的筛选用材料检测由于受试化合物的作用诱导的去极化的存在或不存在。结果，无需测定膜电位的变化，简单地根据细胞的存活或死亡就可以检测受试化合物对靶离子通道的作用。由于与简单地检测细胞膜电位或测定膜电流的形式的电学检测相比，细胞的存活或死亡的检测是更容易且更精确的，并且适合于同时评价大量样本，因此，通量是高的。另夕卜，该程序简单并可以确保测定的精确度。对于靶向离子通道的化合物的初步筛选来说，这种类型的筛选方法也是优选的。下面提供了本说明书的公开内容的多种实施方式的详细解释。(筛选用材料)本说明书中公开的筛选用材料包含细胞，所述细胞保持有编码电压依赖性Na离子通道的第一 DNA，所述电压依赖性Na离子通道的失活已被抑制，并且其中K离子通道例如内向整流性K离子通道被活化，所述K离子通道使静息电位在负方向上变得更深，并由此通过Na离子内流到细胞中而避免了细胞死亡。在下面的描述中，这些细胞被称为筛选用细胞。本发明的筛选用材料可以只含有筛选用细胞，或者除了筛选用细胞以外，还可以含有允许筛选用细胞的生存或适合于筛选用细胞的生存的培养材料或添加剂等。这些培养材料的实例包括普通培养基以及缓冲液、抗生素等。(失活抑制的电压依赖性Na离子通道)筛选用细胞保持有编码电压依赖性Na离子通道的第一 DNA，所述电压依赖性Na离子通道的失活已被抑制。筛选用细胞表达这种Na离子通道。本文中，电压依赖性Na离子通道是指通过依赖于细胞膜电位的开口来介导Na离子的被动扩散的在细胞膜上的蛋白质。对本说明书中使用的电压依赖性Na离子通道没有特别的限制，但可以使用各种类型的已知的电压依赖性Na离子通道，优选的是Navl.5通道。Navl.5通道分布在心肌细胞中，并被认为参与动作电位的产生和兴奋的传导。在门打开后，由于失活机制的作用，电压依赖性Na离子通道丧失Na离子通透性(被失活)，并且Na离子通透性表现出依赖于膜电位。相反，其失活已被抑制的电压依赖性Na离子通道是该失活机制已被抑制(丧失)的那种Na离子通道。也就是说，失活抑制的电压依赖性Na离子通道是指其中在门打开后不会发生这种失活并且离子通透性表现出依赖于膜电位的Na离子通道。在失活抑制的电压依赖性Na离子通道中，尽管在细胞膜中诱导了去极化并且离子通道本身被活化时，通道打开并采取了能够被Na离子的被动扩散介导的状态，但是，由于离子通道本身的失活被抑制，所述通道被维持在开放状态。结果，在失活抑制的电压依赖性Na离子通道中，一旦它经受刺激并产生动作电位后，通道的失活被延迟，并且与天然的电压依赖性Na离子通道相比，动作电位持续一段更长的时间。另外，失活抑制的Na离子通道在比较深的静息膜电位下是恒定部分活化的或者很容易活化的(或者换言之，具有所谓的大窗口电流)。因此，在表达失活抑制的Na离子通道的细胞中，只有在静息膜电位被保持到足够深的负电位的情况下，才能防止Na离子的过度内流。在已充分表达失活抑制的电压依赖性Na离子通道的细胞中，去极化很容易使Na离子通道的活性增加，并且动作电位或去极化被维持约I分钟以上，优选为2分钟以上，更优选为3分钟以上，甚至更优选 为5分钟以上。因此，发生了 Na过度内流到细胞中，并引起了细胞死亡。这种失活抑制可以通过在电压依赖性Na离子通道的氨基酸序列中插入氨基酸突变来适当地实现。已经公开了几种具体技术用于抑制Navl.5通道的失活。所报道的技术的实例包括修饰 IFM 基序(A.0.Grant 等,Biophys.J., Vol.79, pp.3019-3035, 2000)，将第406位的天冬酰胺突变成谷氨酸、精氨酸或赖氨酸(Μ.M.McNulty等，Mol.Pharmacol.,Vol.70, pp.1514-1523，2006)，将连接结构域III和IV的含IFM基序的接头位点缺失(D.E.Patton 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, Vol.89，pp.10905-10909，1992 ；ffestJ.ff.等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, Vol.89，pp.10910-10914，1992)，以及将结构域 IV 的片段 4 的氨基酸突变(L.Q.Chen 等，J.Gen.Physiol.，Vol.108，pp.549-556，1996)。根据这些文献和公知技术常识，本领域的普通技术人员可以适当地执行在氨基酸序列中插入突变。筛选用细胞以该突变体的形式可表达地保持有编码该突变蛋白的第一 DNA。筛选用细胞可以恒定表达或瞬时表达该突变体，即失活抑制的电压依赖性Na离子通道。换言之，第一 DNA可以被整合到染色体中以便传递给子细胞，或者可以被整合到在染色体外自主扩增并且不一定传递给子细胞的质粒中。优选地，第一 DNA被连接到有恒定活性的启动子(组成性启动子)的控制下。根据本领域普通技术人员公知的基因工程技术和转化体生产技术，通过构建含有第一 DNA的表达载体等，然后通过将其插入其中来转化筛选用细胞的宿主，这些筛选用细胞可以作为恒定表达的细胞或瞬时表达的细胞被适当地获得。此外，在电压依赖性Na离子通道由两个以上的亚基构成的情况下，并且当含有对失活有效的突变的亚基只构成其整体的一部分时，各自编码那些亚基的DNA可以至少一种第一 DNA的形式被表达在筛选用细胞中，或者可以第一 DNA的形式分别并可表达地保持有编码这些亚基的DNA，以便同时共表达构成Na离子通道的其它亚基。此外，如果需要酶或其它蛋白质来使所表达的失活抑制的电压依赖性Na离子通道更有效地发挥功能，也可以适当地表达这些蛋白质。(K离子通道的活化 )在筛选用细胞中，K离子通道被活化，以致静息膜电位在负方向上变得更深，或者换言之，以致负电位增加。也就是说，促进了 K离子内流到细胞中。当保持有上述第一 DNA并且Na离子通道突变体(失活抑制的膜电位依赖性Na离子通道)被表达并活化时，导致了其中由于细胞内外Na离子之间的浓度差引起Na离子过度流入到细胞中这样的状态，这最终导致细胞内Na离子浓度增加和细胞死亡。有必要的是，在诱导细胞死亡机制之前，细胞是活的，以便允许细胞起到筛选用细胞的功能。因此，K离子通道被活化，以便促进K离子内流到细胞中，从而加深(降低)静息膜电位。当K离子通道以这种方式被活化时，静息膜电位在负方向上可以被设置得比正常的静息膜电位深。静息膜电位优选在负方向上被加深到不影响细胞存活的程度。膜电位优选为-50mV，更优选为_60mV，甚至更优选为约_70mV，还更优选为约_80mV。其中K离子通道被活化以致静息膜电位在负方向上变得更深这样的状态是指例如其中内向整流性K离子通道(Kir)、4次跨膜型或2孔型K离子通道、或者串联孔域型K离子通道等被活化这样的状态。存在各种类型的具有不同性质的4次跨膜型和2孔型K离子通道，并被分类为如TWIK、TERK, TASK、TALK、THIK和TRESK这样的类型。由于这些通道不依赖于电位或时间，因此，它们起到渗漏通道的功能。这些渗漏通道的性质使得它们能够起到固定细胞的静息膜电位的功能。尽管对内向整流性K离子通道没有特别的限制，但实例包括各种类型的Kir2.x通道，例如Kir2.1、2.2、2.3和2.4通道。Kir2.1通道是具有两次跨膜结构的内向整流性K+通道。该通道不依赖于电压，并具有使膜电位接近K+平衡电位这样的性质。该通道表达在神经、心脏和骨骼肌中，并执行静息膜电位的形成及其稳定化和维持。另一个实例是Kir2.2。尽管以与Kir2.1相同的方式，Kir2.2也是内向整流性K离子通道，但是与Kir2.1相比，它具有更强大的内向整流性。它与Kir2.1 一起表达在心脏、脑和骨骼肌中，并且在其它内向整流性K离子通道之中，它在人血管内皮细胞中发挥最主要的作用。Kir2.x 离子通道被描述在如 Circ.Res.2004，94，1332-1339 和 Am.J.Physiol.Cell Physiol.2005，289，C1134-C1144这样的出版物中。编码人源性Kir2.x通道的碱基序列的实例包括 Kir2.1 (GenBank 登录号 U12507，ΝΜ_00891.2)、Kir2.2 (GenBank 登录号AB074970,NM_021012 (人 KCNJ12))、Kir2.3 (GenBank 登录号 U07364，U24056)以及 Kir2.4(GenBank 登录号 AF081466.1)。类似地，另一个实例是GIRK (Kir3)。GIRK (Kir3)是与Kir2不同的内向整流性K离子通道，它被G蛋白活化。其亚基是组织特异性的，并在心脏中形成由Kir3.1和Kir3.4构成的异源四聚体或者在中枢神经系统中形成由Kir3.1和Kir3.2构成的异源四聚体。它们通常不被活化，并只被激动剂刺激而活化。然而，据报道，在使用爪蟾卵母细胞的实验中，通过将形成通道孔的跨膜螺旋的氨基酸突变，这些通道可恒定地保持开放(J.Biol.Chem.，2003，Vol.278，N0.50，pp.50654-50663)。基于这个发现，该突变体的使用被认为允许以与Kir2.1相同的方式形成深静息膜电位。编码人源性Kir3.x通道的碱基序列的实例包括Kir3.1 (GenBank 登录号 NM_002239.2)、Kir3.2 (GenBank 登录号 NM_002240.2)、Kir3.3(GenBank 登录号 ΝΜ_004983.2)以及 Kir3.4 (GenBank 登录号 ΝΜ_000890.3)。此外，另一个实例是Katp (Kir6)通道。Katp通道是被ATP抑制并被ADP活化的内向整流性K离子通道。Katp通道控制与细胞的代谢状态相对应的细胞兴奋性。Katp通道是由4个Katp通道和4个磺脲类药物受体(SUR)构成的异源八聚体。尽管单独的Katp通道不具有功能，但是据报道，通过缺失C末端`，单独的Katp通道具有功能(EMBO J.,Vol.17, N0.12,pp.3290-3296，1998)。另外，通过进行进一步的突变来降低ATP敏感性，可以使该缺失突变体被恒定地活化。该突变体的使用也使得能够形成深静息膜电位。编码人源性Kir6.x通道的碱基序列的实例包括Kir6.1 (GenBank登录号ΝΜ_004982.2)和Kir6.2 (GenBank登录号 ΝΜ_001166290.I)。另外，4次跨膜型和2孔型K离子通道的已知实例包括THIK通道(其中当表达在 ΗΕΚ293 细胞中时，膜电位变得更深(V.A.Campanucci 等,Neuroscience, Vol.135, pp.1087-1094, 2005))、TASK2通道(其中当表达在爪蟾卵母细胞中时，静息膜电位变得更深(C.Kindler 等,J.Pharmacol.Exp.Ther., Vol.306, pp.84-92，2003))、以及 Kv 离子通道(其中在平滑肌组织中Kv离子通道的静息膜电位变得更深(S.S.McDaniel等，J.Appl.Physio1.，Vol.91，pp.2322-2333, 2001))。2孔型K离子通道被归类到由TWIK、TREK、TASK、TALK、THIK和TRESK组成的各个亚族中。TWIK亚族包括TWIK-1和TWIK-2通道(Cell.Biochem.Biophys.(2007)，47，209-256)。TWIK通道存在于人体的许多组织中。人源性TWIK离子通道的实例包括 TWIK-1 (GenBank 登录号 ΝΜ_002245.3)和 TWIK-2 (GenBank 登录号 ΝΜ_004823.I)。TREK亚族包括TREK-1、TREK-2和TRAAK通道。人源性TREK离子通道的实例包括TREK-1 (GenBank 登录号 ΝΜ_014217.3)、TREK-2 (GenBank 登录号 ΝΜ_138317.2)和 TRAAK(GenBank 登录号 ΝΜ_033310.2)。TASK亚族包括TASK-1、TASK-3和TASK-5通道。人源性TASK离子通道的实例包括TASK-1 (GenBank 登录号 NM_002246.2),TASK-3 (GenBank 登录号 ΝΜ_016601.2)和 TASK-5(GenBank 登录号 ΝΜ_022358.3)。TALK亚族包括TALK-1、TALK-2和TASK-2通道。人源性TALK离子通道的实例包括 TALK-1 (GenBank 登录号 NM_001135106.1), TALK-2 (GenBank 登录号 NM_001135111.1)和 TASK-2 (GenBank 登录号 ΝΜ_003740.3)。THIK亚族包括THIK-1和ΤΗΙΚ-2通道。人源性THIK离子通道的实例包括ΤΗΙΚ-1(GenBank 登录号 ΝΜ_022054.2)和 ΤΗΙΚ-2 (GenBank 登录号 ΝΜ_022055.I)。TRESK 亚族的实例包括 TRESK (GenBank 登录号 ΝΜ_181840.I)。在本发明的筛选用细胞中，出于加深静息膜电位的目的，可以适当地组合这些K离子通道中的一种或多种。
在其中K离子通道已被活化以便在负方向上加深静息膜电位这样的状态下的筛选用细胞优选通过使用编码K离子通道蛋白的第二 DNA以外源DNA的形式可表达地保持有该蛋白。筛选用细胞可以恒定表达或瞬时表达K离子通道。也就是说，第二DNA可以被整合到染色体中以便传递给子细胞，或者可以被整合到在染色体外自主扩增并且不一定传递给子细胞的质粒中。优选地，第二 DNA被连接到有恒定活性的启动子(组成性启动子)的控制下。根据本领域普通技术人员公知的基因工程技术和转化体生产技术，通过构建含有第二DNA的表达载体等，然后通过将其插入其中来转化筛选用细胞的宿主，这些筛选用细胞可以作为恒定表达的细胞或瞬时表达的细胞被适当地获得。此外，在活化的K离子通道由两个以上的不同亚基(其可以是不同K离子通道的亚基)构成的情况下，各自编码那些亚基的DNA优选以至少一种第二 DNA的形式被表达在筛选用细胞中。此外，在需要酶或其它蛋白质来使所表达的K离子通道有效地发挥功能的情况下，也可以共表达这些蛋白质。在这种情况下，可以可表达地保持有编码这些其它蛋白质的DNA。此外，在例如K离子通道是G蛋白偶联的K离子通道的情况下，其它蛋白质的实例包括G蛋白。由于筛选用细胞在生物膜例如细胞膜上具有失活抑制的电压依赖性Na离子通道，并且K离子通道同时起作用以便降低(加深)静息膜电位，或者换言之，内向整流性K离子通道等作用在细胞膜上，因此，即使筛选用细胞具有失活抑制突变型电压依赖性Na离子通道，在诱导去极化之前仍可避免由于Na离子内流引起的细胞死亡。也就是说，诱导细胞死亡的机制是一种待机状态，其等待筛选用细胞的细胞膜中诱导去极化而起作用。通过基因插入，筛选用细胞也可以被用作用于表达新的靶离子通道的编码DNA的宿主细胞。(靶离子通道)对筛选用细胞中的靶离子通道没有特别的限制，并且一种或多种靶离子通道可以适当地选自已知或新的离子通道。此外，离子通道是指穿过生物膜例如动物或植物细胞的细胞膜或内膜并被动地允许特定离子透过的一种蛋白质。离子的实例包括Na离子、K离子、Ca离子和Cl离子。根据其控制开放和关闭的方式，离子通道的实例包括电压依赖性通道、配体依赖性通道、机械刺激依赖性通道、温度依赖性通道、渗漏通道和磷酸化依赖性通道。根据本说明书的公开内容，由于可以根据筛选用细胞的存活或死亡来检测对靶离子通道的作用(活化或抑制)，因此，广泛范围的离子通道通常可以被用作靶离子通道。此外，在本说明书中，离子通道是指不管其控制开放和关闭的方式如何，也不论其是电压依赖性离子通道还是配体依赖性离子通道等。另外，离子通道包括参与产生电压的离子转运的生物膜以及其它细胞内的细胞器膜等的转运蛋白、离子交换体(例如Na-Ca交换体)和离子泵(Na-K泵)，所述生物膜包括细胞膜和核膜。通过对筛选用细胞中的靶离子通道进行选择，提供用于预防或治疗与靶离子通道相关的疾病的筛选用细胞。靶离子通道的第一实例由各种类型的离子通道整合型药物受体组成。这些受体的实例包括烟碱乙酰胆碱受体、离子通道型ATP受体(P2x受体)、离子通道型谷氨酸受体、离子通道型GABAa受体、离子通道型甘氨酸受体和3型血清素受体。另外，其它实例包括各种类型的瞬时受体电位(TRP)通道(非选择性阳离子通道)。其它实例包括钙池操纵的Ca离子通道，例如Orai通道和Stim蛋白。另外，靶离子通道的其它实例包括各种类型的电压依赖性离子通道。其实例包括所有电压依赖性Ca离子通道、所有电压依赖性K离子通道(包括HERG通道)、所有电压依赖性Na离子通道和所有电压依赖性Cl离子通道。此外，其它实例包括配体依赖性Ca离子通道、Na离子通道、质子离子通道、K离子通道和Cl离子通道。此夕卜，其它实例包括通过感应诸如电压电位、温度、PH或张力的刺激而打开和关闭的所有离子通道。与疾病或症状密切相关的离子通道是优选的靶离子通道。这样的Na离子通道的实例包括Navl.1至1.3以及Navl.5至1.9离子通道。这些离子通道与癫痫、神经性疼痛、心律失常和其它类型的疼痛相关，并且可用于筛选用于治疗或预防这些病症的药物。另外，Ca离子通道的实例包括Cavl.1、1.2、1.3、1.4、2.1、2.2、2.3、3.1、3.2和3.3离子通道。这些离子通道与心血管疾病、阿尔茨海默氏病、疼痛、癫痫和高血压相关，并且可用于筛选用于治疗或预防这些病症的药物。K离子通道的实例包括Kvl.1至1.5、Kv3.2、Kv4.3、Kv7.1至7.5、Kvl0.1、Kvl1.1 (包括hERG)和Kvl2.1至12.3离子通道。这些离子通道与多发性硬化症、自身免疫性疾病、疼痛、房颤、糖尿病、癫痫、神经痛、阿尔茨海默氏病、尿失禁、心律失常和癌症相关，并且可用于筛选用于治疗或预防这些病症的药物。另外，Cl离子通道的实例包括CLC-1至7、-Ka和Kb离子通道，与高血压相关，并且可用于筛选用于预防或治疗这种病症的药物。特别是，hERG K离子通道是优选的靶离子通道。该离子通道是电压依赖性K离子通道的一种，其具有6次跨膜结构并形成四聚体。该K离子通道与其它电压依赖性K离子通道之间的差异之一是该K离子通道表现出内向整流性。这是由于极其快速地发生C型失活而引起的。该K离子通道还在心脏的动作电位的第三相复极化相中起到强烈的作用。已知，该K离子通道参与心律失常，因为它会在心脏动作电位的复极化相中引起超极化，并且该K离子通道也参与癌症。由于当hERG通道被抑制时诱导了高度致死性的长QT综合征，因此，目前所有类型的药物候选化合物都需要评估其引起心律失常的作用，该作用是由起源于对hERG K离子通道的抑制作用的心脏毒性引起的。因此，对于靶离子通道而言，具有hERG K离子通道的筛选用细胞是非常有用的。在筛选用细胞中表达hERG K离子通道的情况下，由于例如由电刺激产生的动作电位被缩短，因此，细胞死亡是不太可能发生的。通过加入已知具有或怀疑具有对hERG K离子通道的抑制作用的化合物，根据该抑制的程度，在筛选用细胞中细胞死亡更容易发生，从而使得可以定量评价对hERG K离子通道的抑制效应。hERG的实例是 GenBank 登录号 NM_000238.2。任何筛选用细胞均可用于筛选，条件是它们表达靶离子通道。用于筛选的筛选用细胞优选特异性表达或高表达靶离子通道。这是出于具有更有利的精确度和灵敏度的筛选的目的。由于离子通道常常分布在特定的细胞中，因此，预先要靶向的离子通道高表达的细胞可以被选择作为筛选用细胞的亲代细胞。然而，为了在筛选用细胞中试管外稳定表达靶离子通道，筛选用细胞保持并表达编码靶离子通道的DNA (第三DNA)。另外，筛选用细胞可以恒定表达或瞬时表达靶离子通道。也就是说，第三DNA可以被整合到染色体中以便传递给子细胞，或者可以被整合到在染色体外自主扩增并且不一定传递给子细胞的质粒中。优选地，第三DNA被连接到恒定地起作用的启动子(组成性启动子)的控制下。根据本领域普通技术人员公知的基因工程技术和转化体生产技术，通过构建含有第三DNA的表达载体等，然后通过将其插入其中来转化筛选用细胞的宿主，这些筛选用细胞可以作为恒定表达的细胞或瞬时表达的细胞被适当地获得。此外，在待表达的靶离子通道由两个以上的不同亚基(其可以是不同离子通道的亚基)构成的情况下，各自编码那些亚基的DNA优选以至少一种第三DNA的形式被表达在筛选用细胞中。此外，在需要酶或其它蛋白质来使所表达的靶离子通道有效地发挥功能的情况下，也可以共表达这些蛋白质。在这种情况下，可以可表达地保持有编码这些其它蛋白质的DNA。此外，其它蛋白质的实例包括各种类型的受体蛋白质、GTP结合蛋白和磷酸化酶。对筛选用细胞的宿主细胞没有特别的限制，条件是它们可以用于筛选，并且可以使用各种类型的动物和植物细胞。动物细胞的实例包括哺乳动物细胞和昆虫细胞，但是对此没有特别的限制。在宿主细胞是人类细胞以外的细胞例如牛、猪、马、禽类、犬或猫的细胞的情况下，可以获得用 于预防或治疗这些动物中的疾病的药物的筛选用细胞。另外，在使用昆虫细胞作为宿主的情况下，可以获得可用于筛选靶向用于抗昆虫的农业化学品等的筛选用细胞。另外，当宿主细胞是植物细胞时，可以获得可用于筛选农业化学品等的筛选用细胞。通常使用的动物细胞的实例包括人胚胎肾细胞(HEK细胞)、非洲绿猴细胞(COS细胞)、中国仓鼠卵巢细胞(CH0细胞)、幼仓鼠肾细胞(BHK细胞)和爪蟾卵母细胞。(筛选方法)可以使用下面的步骤来提供本说明书中公开的筛选方法:通过利用筛选用细胞的存活或死亡作为指标，使用本说明书中公开的筛选用材料的筛选用细胞来检测受试化合物对靶离子通道的作用。根据本发明的筛选方法，本说明书中公开的筛选用细胞的使用使得可以通过利用筛选用细胞的存活或死亡作为指标来检测受试化合物对靶离子通道的作用。因此，可以容易地并高效率地同时评价大量样本。另外，由于不需要特殊的程序和设备，因此，可以降低筛选成本而不会降低该程序固有的精确度。通过使用靶向如前面所解释的各种类型的离子通道的筛选用细胞，本说明书中公开的筛选方法可用于筛选用于预防或治疗与靶离子通道相关的疾病或症状的药物。在执行筛选时，可以向筛选用细胞供给一种或多种受试化合物。可以使用单个受试化合物来检测受试化合物的作用，或者可以使用两种以上的受试化合物来检测这些化合物的联合作用或协同作用。在基于筛选用细胞的存活或死亡来检测对靶离子通道的作用中，在不供给受试化合物的情况下筛选用细胞的存活或死亡可以被用作对照。或者，对靶离子通道具有已知的作用的化合物可以被用作对照。通过与这样的对照进行比较，可以检测受试化合物对靶离子通道的作用的存在或不存在或者该作用的程度。对受试化合物没有特别的限制。除了低分子量化合物以外，受试化合物可以是蛋白质、肽、核酸(DNA或RNA)例如寡核苷酸或多核苷酸(polyoligonucleotide)、寡糖、多糖或脂质。在必要时，除了受试化合物以外，可以向筛选用细胞给予各种类型的刺激。这是因为通过与这些刺激组合可以促进或抑制作用。另外，还可以评价对这样的靶离子通道的作用，所述靶离子通道在刺激的存在下被活化或失活。这样的刺激的实例包括温度变化(高温或低温)、pH变化、O2ZCO2浓度的变化以及渗透压的变化。另外，正如随后将描述的，存在的情况是，在检测步骤中有必要诱导筛选用细胞的细胞膜的去极化。在这种情况下，优选使用不太可能影响受试化合物的刺激例如电刺激。在利用筛选用细胞的细胞死亡作为指标来检测受试化合物对靶离子通道的作用中，所述指标并不限于就筛选用细胞的存活或死亡而言的二选一的选择，而是包括利用细胞死亡的比率(或者换言之，活细胞的比率)作为指标。通过利用细胞死亡的比率作为指标，还可以对作用的效力或程度或敏感性等进行评价。对于用于检测筛选用细胞的细胞死亡(或者筛选用细胞的存活)的方法，可以采用各种类型的已知技术，对此没有任何特别的限制。这种方法的实例包括各种技术，例如基于细胞染色、核染色或酶活性的MTT法。考虑到精确度和效率，可以对这些技术适当地进行选择。另外，也可以通过检测导致细胞死亡的持续动作电位来检测细胞死亡。也就是说,可以检测引起细胞死亡的类似的动作电位的持续时间。通过常规的膜电位电学检测或者通过荧光膜电位检测或使用膜电位敏感的染料，可以检测该动作电位的持续状态。
在本说明书中公开的筛选方法中，筛选方法的模式被适当地选择成与靶离子通道的类型相对应。更具体地，筛选方法的模式被适当地选择成与靶离子通道的控制方法或功能相对应。例如，用于使靶离子通道活化(或失活)的刺激的存在或不存在或者刺激的类型被选择成与靶离子通道的控制方法(例如它是否为电压依赖性、配体依赖性、机械刺激依赖性、温度依赖性、渗漏通道或磷酸化依赖性等)相对应。另外，利用细胞死亡作为指标的评价模式(例如通过活化或抑制靶离子通道)被选择成与靶离子通道的功能相对应。例如，在靶离子通道是电压依赖性离子通道的情况下，已知通过活化(由规定的膜去极化而活化)可表达各种类型的功能。其具体实例包括动作电位的产生、兴奋的传导(与Na离子通道相关)、神经递质的释放、神经和心肌中动作电位的产生(与Ca离子通道相关)、维持膜电位、兴奋的控制、动作电位的复极化(与K离子通道相关)、膜电位的复极化、蛋白质的重吸收、骨基质的吸收和Cl的转运(与Cl离子通道相关)。例如，当靶离子通道是通过活化来诱导筛选用细胞的生物膜例如细胞膜的去极化的离子通道时，检测步骤中使用的筛选模式的实例如下所示。也就是说，一个实例是(I)通过利用筛选用细胞的存活或死亡作为指标，在受试化合物的存在下检测受试化合物对筛选用材料的靶离子通道的作用的步骤。更具体地，在已向筛选用细胞给予受试化合物后，检测筛选用细胞的存活或死亡。当检测到促进细胞死亡时，受试化合物可以被确定为对靶离子通道具有活化作用的激动剂(活化剂)。另外，当类似地使用离子通道作为靶标时，另一个实例是(2)通过利用上述细胞的存活或死亡作为指标，在受试化合物和作用在靶离子通道上的刺激的存在下检测受试化合物的作用的步骤。更具体地，预先向筛选用细胞给予受试化合物，随后加入靶离子通道的已知激动剂，然后检测筛选用细胞的存活或死亡。在没有检测到细胞死亡或细胞死亡被抑制的情况下，受试化合物可以被确定为对靶离子通道有抑制性的拮抗剂(抑制剂)。另外，当靶离子通道是抑制筛选用细胞等的细胞膜的去极化和/或动作电位(促进超极化)的离子通道例如渗漏通道时，检测步骤的模式的实例如下所示。也就是说，通过利用筛选用细胞的存活或死亡作为指标，在受试化合物和诱导筛选用细胞的生物膜去极化的刺激的存在下检测受试化合物的作用。在这种情况下，在受试化合物的存在下，靶离子通道被恒定地活化，并且去极化被抑制或动作电位被抑制(促进了复极化)。因此，即使当通过给予诱导筛选用细胞的细胞膜去极化的刺激例如电刺激来激活控制细胞死亡的机制时，动作电位既没有被产生也没有被延长。结果，筛选用细胞仍然是活的。另一方面，当向筛选用细胞给予受试化合物和上述刺激时，如果促进了筛选用细胞的细胞死亡，则受试化合物可以被确定为抑制靶离子通道的抑制剂。另外，当·靶离子通道是通过活化来抑制筛选用细胞的生物膜例如细胞膜的去极化和/或动作电位(促进复极化)的离子通道例如hERG K离子通道时，检测步骤中筛选模式的实例如下所示。也就是说，通过利用筛选用细胞的存活或死亡作为指标，在受试化合物和诱导筛选用细胞的生物膜去极化的刺激的存在下检测受试化合物的作用。更具体地，当在向筛选用细胞给予受试化合物的同时或之后，通过电刺激等诱导了生物膜的去极化时，如果筛选用细胞的细胞死亡被抑制，则受试化合物可以被确定为使靶离子通道活化的激动齐U。另一方面，当促进了筛选用细胞的细胞死亡时，受试化合物可以被确定为抑制靶离子通道活化的抑制剂。正如上面所描述的，根据本说明书中公开的筛选方法，通过利用筛选用细胞的存活或死亡作为指标，可以各种模式容易并有效地检测受试化合物对靶离子通道的作用。该筛选方法还适用于需要快速结果的筛选系统，以及具有困难的化学结构的、靶向离子通道的药物的筛选，特别是需要高通量的初步筛选。(测试方法)根据本说明书的公开·内容，还提供了用于测试受试化合物的方法，所述方法提供有下面的步骤:通过利用筛选用细胞的存活或死亡作为指标，使用本说明书中公开的筛选用材料的筛选用细胞来检测受试化合物对靶离子通道的作用。根据该测试方法，可以容易并快速地测定受试化合物对靶离子通道的作用(活化或抑制)。因此，在受试化合物需要具有一定程度以上的作用的情况下，这是有用的测试方法。在本说明书所公开的测试方法中，可以直接使用本说明书中公开的如前面所解释的筛选方法的各种类型的模式。(筛选装置)本说明书中公开的筛选装置是用于筛选对离子通道具有作用的化合物的装置，并且可以提供有细胞容纳单元和测定单元，所述细胞容纳单元提供有容纳细胞的一个或多个区域(细胞容纳区域)，所述测定单元用于测定上述一个或多个区域中上述细胞的细胞死亡。根据本说明书中公开的筛选装置，由于提供了细胞死亡测定单元，因此可以有效地检测所述细胞容纳单元中的细胞死亡。该筛选装置可以使用本说明书中公开的筛选用细胞。此夕卜，可以采用如前面在本发明的筛选方法中所解释的各种方法来检测细胞死亡。细胞容纳单元可以在其中提供有已知的多孔板的孔或类似大小的孔以用作细胞容纳区域，条件是它们能够容纳适合于测定细胞死亡的细胞数。这些孔通常还能够含有培养基，以便能够温育细胞。所述孔优选被布置为阵列的形式。细胞死亡测定单元可以采用与用于检测细胞死亡的方法相对应的各种模式。例如，在通过供给一种或多种药物来检测活细胞或死细胞的情况下，可以提供药物供给单元，所述药物供给单元允许将药物供给至细胞容纳区域。所述药物供给单元典型地是用于将药物同时或顺次供给至细胞容纳区域的药物注入单元，而所述药物供给单元的其它实例包括用于储存药物的药物储存单元、用于从药物储存单元输送药物并从药物注入单元排出的泵单元、以及用于控制供给的药物量的控制单元。在这些各单元之中，优选提供药物注入单元，而根据需要适当地提供其它各单元。另外，细胞死亡测定单元尽管根据检测方法而变化，但是可以提供有光学检测单元，所述光学检测单元用于电学或光学检测细胞容纳区域中细胞的细胞死亡。除了提供有光源之外，所述光学检测单元通常可以提供有扫描器单元，并且还提供有控制单元，所述控制单元用于通过参照对照等来计算检测到的作为光强度的信号。此外，细胞死亡测定单元和/或筛选装置可以提供有控制筛选步骤并储存结果的储存单元以及提供有所述储存单元的控制单元。此外，还可以提供显示这些步骤和结果的显示单元。此外，可以提供用于打印出结果的打印机单元。 筛选装置还可以提供有电压施加单元，所述电压施加单元用于向一个或多个细胞容纳区域施加电压。由于使得可以向细胞容纳区域中的细胞给予电刺激，因此，可以有效地执行在筛选方法的检测步骤中给予电刺激的程序。通过向细胞容纳区域中本发明的筛选用细胞给予电刺激并诱导细胞膜的去极化，该电压施加单元可用于激活控制细胞死亡的机制。电压施加单元可以提供有适用于一部分或全部的细胞容纳区域的电极以及用于向电极施加电压的电源。另外，优选 通过前面解释的控制单元来控制施加的电压。(筛选用试剂盒)本说明书中公开的筛选用试剂盒提供有本说明书中公开的筛选用材料。根据该试剂盒，可以容易并有效地执行使用本发明的筛选用细胞来筛选作用在离子通道上的受试化合物。除了本发明的筛选用材料之外，本发明的试剂盒还可以提供有用于测定细胞死亡的试剂。另外，本发明的试剂盒还可以提供有适用于筛选用细胞的培养基。本发明的筛选用试剂盒还可以提供有本说明书中公开的筛选装置。根据前面解释的各种类型的模式，适当地选择并组合本发明的筛选用试剂盒中使用的筛选用细胞、筛选用材料和筛选装置。实施例尽管下面提供了实施本说明书的公开内容的实施例的解释，但本说明书的公开内容不限于此。[实施例1](Nav1.5通道失活位点的IFM基序突变体的产生)将存在于控制Navl.5通道的失活的II1-1V接头区域中的疏水性氨基酸序列Ile-Phe-Met (IFM基序)全部突变成Gin。下面示出了突变后的氨基酸序列(基序)。hNavl.5氨基酸序列(仅示出了含有被靶向突变的IFM的区域)(SEQ ID NO:1)1470-1DNFNQQKKKLGGQDIFMTEEQKKYYNAMKK-1500(IFM的带下划线的部分被突变成QQQ)通过使用pcDNA3.1/Nav1.5作为模板，并使用如下所示的特异性PCR引物和QuikChange 定点诱变试 剂盒(Quik Change Site-Directed Mutagenesis Kit) (Stratagene公司)，来产生失活抑制的突变体Nav-QQQ，所述pcDNA3.1/Nav1.5是通过将人源性Navl.5(GenBank登录号:ΝΜ_198056.2)亚克隆到pcDNA3.1 (+)(Invitrogen公司)中而获得的。使用 Big Dye 终止剂 3.1 版循环测序试剂盒(Big Dye Terminator Ver.3.1Cycle SequencingKit) (Applied Biosystems公司)和突光毛细管测序仪(ABI Prism3100Avent遗传分析仪，Applied Biosystems公司)来证实所得到的克隆的DNA序列，并使用Hipure PlasmidMaxiprep试剂盒(Invitrogen公司)大量纯化质粒DNA。引物:5’-GTTAGGGGGCCAGGACCAACAACAGACAGAGGAGCAGAAG-3， (SEQ ID NO:2)5’-CTTCTGCTCCTCTGTCTGTTGTTGGTCCTGGCCCCCTAAC-3’ (SEQ ID NO:3)[实施例2](细胞培养和基因插入)人源性胚胎肾细胞(HEK293细胞)购自卫生科学研究资源库(Health SciencesResearch Resource Bank)(HSRRB)。在含有lOOU/ml青霉素(和光纯药株式会社)和100 μ g/ml链霉素(明治制果株式会社)的D-MEM培养基(和光纯药)中，向其中加入10%FBS (Gibco公司)，然后在37°C下在CO2中进行培养。使用Lipofectamine2000试剂(Invitrogen公司)来插入pcDNA/Kir2.1，所述pcDNA/Kir2.1是通过将人源性Kir2.1 (NM_00891.2)亚克隆到pcDNA3.1(+) (Invitrogen公司)中而获得的，接着在通过向上述D-MEM培养基加入0.2mg/ml博来霉素(Invitrogen公司)而获得的培养基中进行培养，然后克隆耐博来霉素的细胞以产生恒定表达Kir2.1的细胞(HEK-Kir)。另外，使用相同的方法将失活的突变体Nav-QQQ(HEK-Kir突变的Nav)插入到恒定表达Kir2.1的细胞中，然后在24至72小时后进行实验。(电生理学实验)使用由Hamill等建立的膜片钳法执行电流测定。使用两阶段的电极制造机(PB-7，成茂科学(Narishige C0.Ltd.))从含有外径为1.04 μ m至1.08 μ m的细丝的玻璃管制造尖端直径为约I μ m的玻璃微电极，然后在500X放大倍数下在显微镜下进行热处理以使尖端变平滑。在本实验中，所使用的电极是当填充有电极内液时电极电阻为2ΜΩ至5ΜΩ的电极。固定载玻片并用外液进行灌流，在所述载玻片中，细胞被结合在体积为约500μ I的腔室中，并在倒置显微镜(Nikon TMD)台上进行固定。外液(正常的HEPES缓冲液)组合物由 137mM NaCl,5.9mM KC1、2.2mM CaCl2U.2mM MgCl2、14mM 葡萄糖和 IOmM HEPES (ρΗ7.4，用 NaOH 确定)组成。移液管内液组合物由 140mM KCl、4mM MgCl2、5mM ATP_2Na、0.05mM EGTA和IOmM HEPES (ρΗ7.2，用KOH确定)组成。所有实验均在室温(23± 1°C )下执行。用液压显微操纵器(M0-203，成茂科学)对着那些附着于载玻片的细胞压紧玻璃微电极，并使用电压钳法和电流钳法记录数据。使用微电流放大器(EPC-7:Heka Electronik GmbH)放大所测得的电流和电位，并使用A-D转换器(Digdatal400A:Axon Instruments公司)将其记录在计算机上。使用 Clampfitl0.2 软件(Axon Instruments 公司)和 0rigin6.0J (MicrocalSoftware公司)对数据进行分析。(细胞死亡的测定)将三种类型的细胞(HEK、HEK-Kir和HEK-Kir突变的Nav)分配在含有100 μ ID-MEM培养基的96孔板中，使浓度为5Χ IO3个细胞/孔，然后在37°C下在5%C02中进行培养。I天后，两个直径为0.5mm的刺激性银丝电极被插入到每个孔的培养液中，使其尖端被插入到约2mm的深度，然后使用电刺激装置(日本光电工业株式会社(Nihon KohdenCorp.))每隔3分钟使用刺激幅度为200ms的方波在40mA、80mA、120mA和160mA四个电流强度(强度I至4)下进行电刺激，共3次。并不一定需要如上所示的电刺激条件，而只需要所选择的条件能够可靠地产生动作电位即可。然后，将细胞在37°C下在5%C02中进行培养，并在I天后，加入10 μ I MTT试剂(通过用磷酸盐缓冲盐水PBS (-)将其溶解成终浓度为5mg/mL来制备)，将细胞在37°C下在5%C02中培养4小时，然后加入100 μ I裂解溶液(20%SDS/50%DMF溶液)来裂解细胞并溶解甲臜盐。此外，在37°C下温育8小时至12小时后，使用Multiscan JX (版本1.1, Thermo Labsystems公司，美国)在595nm的测定波长和650nm的参照波长下测定吸光度，所述吸光度被用作活细胞数目的间接指标。然而，也可以通过将上述4小时和8至12小时的时间分别缩短为2小时和3小时来进行测定。(结果)1.HEK-Kir细胞的功能分析通过对HEK-Kir细胞应用电压钳法来测定Kir通道电流。结果，如图2A中所示，观察到Kir通道电流的向内整流性，并且，当施用选择性抑制剂100 μ M Ba离子时，该内向电流被抑制。另外，当用电流钳法测定膜电位时，如图2Β中所示，观察到约_70mV的深静息膜电位，并且，由于100 μ M Ba离子的施 用，静息电流电位变浅。2.野生型和突变型Navl.5通道电流的失活速率以及动作电位产生时间(持续时间)的差异在HEK-Kir细胞中瞬时表达野生型和突变型Navl.5通道，然后测定Na离子通道电流。结果，如图3中所示，所观察到的电流为，在突变型的情况下(图3Β)，Na离子通道电流的失活是极其缓慢的。另外，当使用相同的细胞通过去极化电刺激(对于野生型为300ρΑ持续10ms，对于突变型为200ρΑ持续100ms)来产生动作电位时，在突变型的情况下(图4Β)，产生动作电位的时间被确定为显著更长。结果示于图4中。3.由于电刺激引起的细胞死亡的变化从上面第2部分中描述的结果可清楚地确定，在突变型Navl.5通道中产生了极长的动作电位。由于当通过电刺激来产生动作电位时，认为有发生细胞死亡的可能性，因此，测定由于电刺激引起的细胞死亡。使三种类型的细胞HEK、HEK-Kir和HEK-Kir突变的Nav细胞经受电刺激，然后通过MTT法测定细胞数的变化。如图5中所示，当在80mA下经受3次200ms的方波电刺激(每隔3分钟)时，HEK-Kir突变的Nav细胞的数目显著降低。这表明，HEK-Kir突变的Nav细胞对去极化刺激高度敏感。另外，施用Na离子通道抑制剂利多卡因(Sigma公司)，然后在相同的刺激强度下经受电刺激。结果，如图6中所示，抑制了细胞死亡的发生。在此基础上，HEK-Kir突变的Nav细胞中发生的细胞死亡被确定为是产生了极长的动作电位的结果，而抑制Na离子通道阻断细胞死亡。
[实施例3]按照实施例2，通过将人源性hERG (NM_000238.2)亚克隆到pcDNA3.1 (+)中并插入到天然的HEK细胞以及恒定表达HEK-Kir突变的Nav的细胞中，来产生hERG_HEK细胞和hERG-Kir突变的Nav细胞，然后在24小时至72小时后执行电生理学实验。按照实施例2，在天然的HEK细胞、hERG-HEK细胞和hERG_HEK突变的Nav细胞上执行电生理学实验，然后测定hERG通道电流和动作电位。hERG K离子通道表现出内向整流性，并在已被表达在筛选用细胞中的情况下，所述hERG K离子通道起到通过缩短由电刺激等产生的动作电位来抑制细胞死亡的作用。向通过在天然的HEK细胞中瞬时表达hERG通道而获得的hERG-HEK细胞施用hERG通道抑制剂尼非卡兰，并在施用之前和之后测定细胞膜的电位。电流图示于图7中，而电流-电压曲线示于图8中。如图7和8中所示，在施用尼非卡兰之后，hERG通道电流被确定为是被抑制的。另外，向通过在HEK-Kir突变的Nav细胞中瞬时表达hERG通道而获得的hERG-HEK-Kir突变的Nav细胞施用尼非卡兰，并在施用之前和之后测定细胞膜的电流。电流图示于图9中，通过去极化电刺激产生的动作电位图示于图10中，通过去极化电刺激产生的动作电位时间(持续时间)被总结在图11中。如图9至11中所示，在hERG-HEK-Kir突变的Nav细胞的情况下，所述hERG-HEK-Kir突变的Nav细胞提供有控制细胞死亡的机制以及表达的hERG，当未施用尼非卡兰时，动作电位的持续时间被hERG缩短，而通过施用尼非卡兰，hERG通道被抑制，并且动作电位的持续时间显著延长。基于上面的结果，当hERG通道被表达在HEK-Kir突变的Nav细胞中时，据认为，由于电刺激引起的细胞死亡被抑制，并且通过施用尼非卡兰，诱导了细胞死亡。[实施例4]在本实施例中，在hERG-HEK-Kir突变的Nav细胞中检查由电刺激和尼非卡兰诱导的细胞死亡。按照实施例2执行细胞死亡的测定。此外，通过在150mA下用300ms的方波脉冲电刺激3次(每隔3分钟)来执行电刺激。通过施用尼非卡兰诱导的细胞死亡的结果示于图12中，而诱导细胞死亡所需要的尼非卡兰剂量的剂量-响应曲线示于图13中。如图12中所示，尽管即使在hERG-HEK-Kir突变的Nav细胞经受方波电刺激时仍未诱导细胞死亡，但是，细胞死亡被确定为由通过施用尼非卡兰引起的去极化刺激所诱导。此外，如图13中所示，尼非卡兰被确定为浓度依赖性地诱导细胞死亡。基于上面的结果，作为用于筛选作用在离子通道例如hERG上的化合物并监测细胞死亡等的筛选用材料，hERG-HEK-Kir突变的Nav细胞被确定为是优选的。[实施例5]在本实施例中，使用DiBAC4(3)形式的膜电位敏感的染料并使用用于去极化刺激的含有高浓度K离子的细胞外溶液，对膜电位的测定进行了研究。DiBAC4 (3)具有在去极化后荧光强度增加的性质，并证实了膜电位与荧光强度变化之间的关联性。在用IOOnM的DiBAC4(3)(双(1，3_ 二丁基巴比妥酸)三次甲基氧烯洛尔)在含有该染料的正常的HEPES缓冲液中 在室温下荷载两种类型的细胞(HEK和HEK-Kir突变的Nav细胞)30分钟后,通过在488nm下激发并用分色镜在505nm下反射,在520nm以上的波长下测定荧光。另外，具有增加的K离子浓度的高K+细胞外液被用作使细胞膜去极化的刺激。这是因为K离子主要参与静息膜电位的形成。尽管Na-K泵将细胞内K离子浓度维持在比细胞外高的水平，但是，渗漏通道使K离子排出到细胞外。由Na-K泵引起的K离子内流和由渗漏通道引起的K离子排出之间达到平衡时的电位是静息膜电位。因此，由于当细胞外K离子浓度增加时，细胞内和细胞外的K离子浓度之间的差异变小，因此，静息膜电位变浅。在本实施例中，使用这种去极化刺激来测定两种类型的细胞的荧光强度的变化。此外，在使细胞外K离子浓度为140mM K+的情况下，荧光强度的值为1，基于这一点来进行测定。Argus/HiSCA高速冷却式CO)相机突光成像系统(滨松光子(Hamamatsu Photonics K.K.))被用于测定荧光。结果示于图14至17中。图14和15分别示出了 HEK-Kir细胞和HEK-Kir突变的Nav细胞中由高K+刺激引起的荧光变化(横轴:时间，纵轴:荧光强度，顶迹:细胞外K离子浓度)。如图14和15中所示，从细胞获得的荧光强度被确定为随细胞外K离子浓度增加而增加。也就是说，细胞外K离子浓度被确定为促进膜电位的去极化。图16示出了当向HEK-Kir细胞和HEK-Kir突变的Nav细胞分别给予相同浓度的细胞外K离子(15.3mM)刺激时的荧光强度。如图16中所示，与HEK-Kir细胞相比，HEK-Kir突变的Nav细胞对该相同的K离子浓度刺激表现出更高的荧光强度，并且被确定为对去极化的促进更敏感或更易感。图17示出了在引起细胞外K离子浓度从5.9mM变化成15.3mM的情况下施用利多卡因对HEK-Kir突变的Nav细胞中荧光强度的影响。利多卡因是Na离子通道的抑制剂，在图17中，用下划线表示施用ImM利多卡因的持续时间。如图17中所示，通过用含有K离子浓度的细胞外溶液刺激而引起的荧光变化被确定为被利多卡因抑制。此外，HEK-Kir突变的Nav细胞和HEK-Kir细胞被证实在利多卡因存在下表现出相同的荧光变化。基于上面的结果，在HEK-Kir突变的Nav细胞中，失活抑制的Na离子通道被确定为参与由K刺激引起的显著的荧光变化。本发明的筛选用细胞被确定为可用于测定膜电位敏感的染料DiBAC4(3)的荧光。[序列表自由文本]SEQ ID N0:2 和 3:引物
权利要求
1.作用在靶离子通道上的化合物的筛选用材料，所述材料包含细胞，所述细胞保持有至少一种第一 DNA，所述第一 DNA编码电压依赖性Na离子通道，所述电压依赖性Na离子通道已被抑制而不失活，并且其中K离子通道已被活化，以致静息膜电位在负方向上变得更深。
2.权利要求1的筛选用材料，其中所述至少一种第一DNA包括编码Navl.5通道突变体的 DNA。
3.权利要求1或2的筛选用材料，其中所述K离子通道包括Kir2.1通道。
4.权利要求1至3任一项的筛选用材料，其中所述细胞还保持有至少一种外源的第二DNA,所述第二 DNA编码K离子通道。
5.权利要求1至4任一项的筛选用材料，其中所述靶离子通道包括hERG离子通道。
6.权利要求1至5任一项的筛选用材料，其中所述细胞保持有至少一种第三DNA，所述第三DNA编码靶离子通道。
7.靶离子通道的激动剂或抑制剂的筛选方法，所述方法包括下面的步骤: 通过利用细胞的存活或死亡或者与细胞死亡相当的持续动作电位作为指标，使用权利要求I至6任一项的筛选用材料来检测受试化合物对靶离子通道的作用。
8.权利要求7的方法，其中所述靶离子通道是通过活化来诱导细胞中细胞膜的去极化的离子通道，并且 检测步骤是在受试化合物的存在下检测受试化合物对筛选用材料的靶离子通道的作用的步骤。
9.权利要求 7的筛选方法，其中所述靶离子通道是通过活化来诱导细胞中细胞膜的去极化的离子通道，并且 检测步骤是在受试化合物和作用在靶离子通道上的刺激的存在下检测受试化合物的作用的步骤。
10.权利要求7的方法，其中所述靶离子通道是抑制细胞中细胞膜的去极化和/或动作电位的离子通道，并且 检测步骤是在受试化合物和诱导细胞中细胞膜的去极化的刺激的存在下检测受试化合物的作用的步骤。
11.权利要求7的方法，其中所述靶离子通道是通过活化来抑制细胞中细胞膜的去极化的离子通道，并且 检测步骤是在受试化合物和诱导细胞中细胞膜的去极化的刺激的存在下检测受试化合物的作用的步骤。
12.用于筛选作用在离子通道上的化合物的装置，所述装置包含: 细胞容纳单元，其提供有用于容纳细胞的一个或多个区域，以及 测定单元，其测定所述一个或多个区域中的细胞死亡或与细胞死亡相当的持续动作电位。
13.权利要求12的装置，其中所述测定单元提供有供给单元和光学检测单元，所述供给单元供给一种或多种用于检测所述一个或多个区域中的细胞死亡或与细胞死亡相当的持续动作电位的药物，所述光学检测单元用于光学检测所述一个或多个区域中的细胞死亡或与细胞死亡相当的持续动作电位。
14.权利要求13的装置，其还包含电压施加单元，所述电压施加单元向所述一个或多个区域施加电压。
15.用于筛选作用在离子通道上的化合物的筛选用试剂盒，其包含权利要求1至6任一项的筛选用 材料。
全文摘要
本发明的目的是提供靶向离子通道并具有优异的效率的筛选系统。具体地，本发明提供了作用在靶离子通道上的化合物的筛选用材料，所述材料包含细胞，所述细胞保持有至少一种第一DNA，所述第一DNA编码电压依赖性Na离子通道，所述电压依赖性Na离子通道已被抑制而不失活，并且其中K离子通道已被活化，以致静息膜电位在负方向上变得更深。
文档编号C12N15/09GK103228793SQ201180041709
公开日2013年7月31日 申请日期2011年6月29日 优先权日2010年6月29日
发明者今泉祐治, 藤井将人, 大矢进, 山村寿男 申请人:公立大学法人名古屋市立大学, 切诺洛舍曲科技有限会社
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