Hspc117分子作为rna连接酶的用途的制作方法

xiaoxiao2020-6-24  3

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专利名称:Hspc117分子作为rna连接酶的用途的制作方法
HSPC117分子作为RNA连接酶的用途
技术领域
本发明涉及细胞和分子生物学工具领域,尤其是涉及RNA连接酶,及用于分析和治疗的使用及抑制RNA连接酶的方法。
背景技术
天然的连接RNA或DNA的酶通常将具有磷酰基的核酸分子在5’位置接合到具有羟基的第2核酸分子在3’位置。在能量转移步骤中5’端的磷酸通常由ATP提供。转移RNA (tRNA)是对于信使RNA (mRNA)翻译成蛋白必要的衔接子分子。类似于其他RNA分子,使前体tRNA转录物(前-tRNA)在它们实现它们的生物学功能之前经历扩展的翻译后加工。除了移出5’ -前导序列和3’ -尾随序列,扩展的碱基和糖修饰和核苷酸的模板-独立添加之外,一些tRNA不得不经历干扰序列的切除。tRNA内含子的移出由不同于mRNA的规范剪接体-依赖性加工的剪接过程实现。tRNA剪接还需要切下内含子的特化的内切核酸酶和用于接合外显子半的连接酶(图W。W02004/087884A2描述用于筛选涉及tRNA加工的小有机分子的方法。Pascal etal., Current Opinion in Structural Biologyl8 (I) (2008): 96-105 涉及 PNA 和 RNA 连接酶中的差异。Kato et al., Journal of Molecular Biology239 (5) (2003):903-911 描述嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)的 RNA 连接酶的晶体结构。Wang et al., RNAll (6)
(2005):966-975 实施了酵母 tRNA连接酶的结构-功能分析。Okada et al., PR0TEINS63 (4)
(2006): 1119-1122提供来自超嗜热火球菌(Pyrococcus horikoshii )的RtcB同源蛋白,一种RNA环化酶的晶体结构。

尽管tRNA基因中内含子的存在似乎是在全部生命域中共通的,剪接机理的进化在连接步骤明显分歧。已描述可归因于不同生命界的2种主要的连接通路(Abelson等人,1998)。真菌及植物分化体使用由与噬菌体T4RNA连接酶I同源的单多功能多肽催化的共同的连接机理。此通路需要环状磷酸二酯酶和多核苷酸激酶活性的作用,以制备用于随后连接的外显子末端。结果,来源于三磷酸核苷(NTP)供体的外源磷酸合入成熟tRNA (图1A,上枝)。相反,动物和古细菌分化体可通过在内切核酸酶反应后直接接合2’,3’-环磷酸和5’-羟基(5’-0H)左末端来连接tRNA外显子(Laski等人,1983)。此连接酶反应(图1A,降低枝)依赖于2’,3’-环状-磷酸酯终结的RNA (RNA>p),且导致源于前体的2’,3’-环磷酸并合到作为3’,5’ -磷酸二酯的成熟tRNA的剪接连接部(Fi Iipowicz和Shatkin,1983)。已阐明此RNA>p连接酶反应的关键生物化学方面。但是,尽管许多生物化学,生物信息学和遗传努力,自从起初假定tRNA剪接通路,还未鉴定适合的RNA连接酶。

发明内容因此,本发明的目标是提供至少也能使用2’,3’ -环磷酸终结的RNA作为底物的RNA连接酶(〃RNA>p连接酶〃)。此目标由权利要求的主题达到。尤其是,本发明涉及HSPC117分子作为RNA连接酶作为分子生物学工具及在治疗中的用途。HSPCl 17已被测序(例如.Genbank ACC NO:NP_055121或CAG33456),及位于第22染色体orf28 (〃C220RF28〃)。HSPC117是由未知的功能的高度保守的结构域(UPR)027)和独特蛋白折叠表征的细菌/古细菌RtcB基因家族的人同源物。UPR)027蛋白形成在植物或真菌模型生物中无可检测的代表的直系同源基因(K0G3833)簇。此种系分布高度暗示动物和古细菌中RNA>p连接酶活性的排他性的发生。HSPC117在本文也被称为HSPC117/C220RF28或RtcB/HSPC117。如本文所用,表述"HSPC117分子〃指称此簇中任何同源或直系同源分子,其现在已鉴定为催化RNA连接酶反应。该"HSPC117分子〃的例序列在图6中作为SEQ IDN0:1 SEQ ID NO: 11给出。全部HSPCl 17分子已发现含有对应于SEQ ID NO:1的C122的催化性半胱氨酸残基。HSPCl 17分子和序列已进一步描述于,例如US2007/0204352A1 (尤其SEQID NO: 15,16,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78),但是之前无创造性用途的认识。US2007/0204352A1涉及潜在地涉及α -突触核蛋白的聚集的基因的筛选。在段落[50],US2007/0204352A1提供显著的程度的HSPC117基因的进化保守的背景,其蛋白可在本发明的方法中,在这些HSPCl 17分子的新功能的知识中使用。本发明的RNA连接酶可用于催化第IRNA转移到第2RNA。两个RNA末端可由连接酶连接。此连接通常是两个RNA之间的磷酸二酯键的共价连接。尤其是,一个RNA可包含3’磷酸,尤其是以2’,3’ -环磷酸形式,及另一 RNA可包含5’ -OH末端。该端之间尤其是通过使用5’ -OH末端形成连接的能力是本发明的HSPC117分子的独特特征。一般而言,RNA连接可为链间或链内连接。2个分离RNA链可分别在3’和5’端连接。此外,在链内连接中 ,连接一个RNA分子的5’和3’端。在本发明的进一步实施方式中,RNA是双链。尤其是,由本发明的RNA连接酶连接的第I和/或第2RNA分子可包含双链部分或是完全双链或替代性地是单链。尤其优选的是,由RNA连接酶反应连接的其他RNA端的上述3’端以及5’末端可为双链。RNA的,尤其是RNA剪接的其他部分也可为单链,通常有前-tRNA的单链3’悬伸。而且,由RNA连接酶反应连接的5’和/或3’端可为单链,如在前-tRNA加工中的通常情况。双-链可为第I和第2RNA分子之间的碱基配对,或替代性地可为与其他RNA链的碱基配对。在尤其优选的实施方式中,本发明的HSPC117分子用于RNA剪接。在RNA剪接反应中,将由本发明的RNA连接酶连接的2外显子之间的内含子部分移出。典型剪接反应是外显子1-内含子-外显子2序列到外显子1-外显子2的反应。其他剪接反应可移出几个内含子,且任选地也移出这些内含子部分之间的外显子。由HSPC117分子作为RNA连接酶的创造性使用连接的RNA可具有任何长度。例RNA长度是2 3000个核苷酸或碱基对长。在特定实施方式中,第IRNA或第2RNA可为多于 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20,25,30,40,45,50,60,70,80,90 或多于 100 个核苷酸或碱基对长。替代性地或此外,RNA,第IRNA或第2RNA或二者,可为达3000,2000,1500,1200,1000,900,800,700,600,500,400,300,200,100,80,70,60 或达 50 个核苷酸或碱基对长。本发明的HSPC117分子可具有下列之任一个:SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ IDNO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO:1l0 序列提供分别智人(H.sapiens),小家鼠(Μ.musculus),光滑爪蟾(X.1aevis),紫色球海胆(S.purpuratus),黑腹果蚬(D.melanogaster),秀丽隐杆线虫(C.elegans),莱哈衣滴虫(C.reinhardtii),詹氏甲烧球菌(M.jannaschii),超嗜热火球菌(P.horikoshii),嗜热栖热菌(T.thermophilus)或大肠埃希氏菌(E.coli)的例HSPC117分子。其他HSPCl 17序列或序列变体公开于SEQ ID NO: 12 23,还提供来自智人(Homo sapiens),秀丽隐杆线虫(C.elegans),果蚬属(Drosophila),始(Danio rerio),牛,小鼠和大鼠的核酸和氨基酸序列。本发明的HSPC117分子可从任何这些生物得到。在优选的实施方式中,本发明的HSPC117分子是动物或古细菌的,尤其是哺乳动物,诸如灵长类动物,包括人,或啮齿动物,尤其是小鼠或大鼠的。本发明的HSPC117分子可还由一个或更多氨基酸取代或缺失修饰。此外,本发明的HSPC117分子可作为融合蛋白的部分表达,且可还包含另外的氨基酸或多肽序列。尤其优选的是,本发明的HSPCl 17分子与下列之任何一个具有至少45%,50%, 55%,60%, 65%,70%,75%,80%,85%,90%或至少 95% 的序列同一性:SEQID NO:1SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ IDNO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:21,SEQ ID N0:23。在优选的实施方式中,序列同一性是与SEQ ID NO:1相关的。序列同一性通常在 SEQ ID NO: 1,SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID N0:6,SEQ ID N0:7, SEQ ID N0:8, SEQ ID N0:9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13,SEQ ID NO: 15,SEQ ID NO: 17,SEQ ID NO: 19,SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:23 的全长序列上计算。当然该HSPC117分子变体维持上述RNA连接酶活性,如可由标准测定容易测定,如在本文实施例部分中显示。尤其重要性的是,HSPCl 17分子维持催化性地重要残基,诸如SEQID N0:1的半胱氨酸122。本发明的HSPC117分子的变体例如描述于US2007/0204352A1(尤其是其 SEQ ID N0:15,16,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78),在本文通过引用作为 SEQ IDNO: 12 23合并,且可用于本发明的目的。在氨基酸取代的情况中,在优选的实施方式中,至少50%,至少60%,至少70%,至少80%,至少90%或至少95%的取代是保守的氨基酸取代。保守的取代是氨基酸基之内的突变。氨基酸通常根据 它们的极性,电荷和/或尺寸分组。以下组是值得注意的:碱性氨基酸:精氨酸,组氨酸,赖氨酸;酸性氨基酸:天冬氨酸,谷氨酸;极性氨基酸:天冬酰胺,谷氨酰胺;小氨基酸:丙氨酸,丝氨酸,苏氨酸,甲硫氨酸,甘氨酸;芳族氨基酸:苯丙氨酸,色氨酸,酪氨酸,组氨酸;疏水氨基酸:亮氨酸,异亮氨酸,缬氨酸。半胱氨酸是特殊情况,由于其可通常用丝氨酸和任何其他极性不带电的侧链保守地取代和反之亦然。甘氨酸可用作任何氨基酸的取代基。甘氨酸可通常由小侧链诸如由丙氨酸,丝氨酸,苏氨酸取代。脯氨酸可通常取代,或用作甘氨酸的取代基。在再一方面,本发明涉及连接至少2个RNA分子的方法-例如以上描述-包括使用上述HSPC117分子。在本文中,表述〃使用..作为RNA连接酶〃和〃连接RNA分子的方法〃互换使用。在优选的实施方式中,本发明的用途或方法可包括使至少2个RNA分子与HSPCl 17分子在细胞内接触。本发明也涉及重组HSPC117的用途。上述重组HSPC117 (包括任何同源物或直系同原物)可通过包含与调控DNA序列(其可为异源调控序列),诸如启动子或增强子可操作的连接的一个或更多HSPC117DNA序列的遗传构建体在宿主细胞内的表达来容易获得。例宿主细胞是细菌,古细菌,真菌(包括酵母),植物或动物(包括昆虫或哺乳动物)细胞。在该构建体中,其设计在常见的实验室手册中描述且对于熟练的技工常规,调控序列可可操作地连接到编码HSPC117分子的多核苷酸或其具有RNA连接酶活性的有活性的变体。本发明的HSPC117分子可诸如在细胞中体内使用,例如人工提供到其中或在细胞内重组表达。2个RNA分子可在所述细胞内根据本发明的一实施方式连接。细胞可为上述任何细胞,优选非-人细胞或分离的人细胞。在进一步实施方式中RNA分子可与HSPCl 17分子体外或原位诸如例如包括在细胞之外或在无细胞的溶液中接触。用本发明的HSPC117分子,以分离的样式,离体连接RNA分子是可能的。根据本发明,发现HSPC117是可天然地在体内在复合物中也含有的催化性地有活性的蛋白。因此,根据本发明的进一步实施方式,本发明的HSPC117分子也在该复合物中提供。复合物可为例如剪接体粒子,诸如可从核HeLa细胞提取物分离的SF3B粒子。其他复合成员,尤其是关于其他生物的其他HSPCl 17分子或其变体可从相应生物的细胞提取物分离。在尤其优选的实施方式中,本发明的复合物可包含DEAD盒解螺旋酶DDX1,FAM98B分子,CG1-99分子,ASW或其任何组合,尤其优选的是,DDXl和FAM98B分子的组合。可包含在HSPCl 17分子的复合物中的其他复合成员可为在实施例5中显示的表I和2中的任何一种。根据本发明,HSPC117分子可本身提供。或者,HSPCl 17分子可作为试剂盒的组分使用或提供。由此,在再一方面,本发明涉及含有HSPC117分子的试剂盒。试剂盒可还包含用于RNA连接酶的反应缓冲剂,其包含缓冲剂组分或选自下列的一种或更多金属离子:Mg2+,Mn2+, Ni2+或其混合物。在优选的实施方式中,金属离子以用于ca0.1 20mM,优选I IOmM,尤其优选的是2 5mM的终浓度范围使用的量包括。除了以上-提及的金属离子之外,试剂盒的缓冲剂可含有为本领域所熟知的通常的缓冲剂组分。该缓冲剂可例如包括磷酸盐,Hepes, Tris-HCl组分。优选缓冲剂在例如。PH6 pH9,优选pH7 8,尤其优选约pH7.4的生理学pH值的范围。缓冲剂可包含强直物质或约10 200mM KCl或NaCl的盐。此外,缓冲剂可含有非-离子张度物质诸如甘油。以测试试剂盒的形式,试剂盒可还包含是本发明的HSPC117分子的底物的RNA分子,尤其具有2’,3’环磷酸的RNA分子。此RNA分子可例如还包含标记物诸如放射性标记物,以在RNA连接酶反应之前或之后检测RNA分子。该试剂盒对于全部类型的反应有用及以监测RNA加工或杂交。本发明的HSPC117分子或试剂盒可尤其用于RNA连接或剪接研究。本发明在再一方面涉及包含外源地表达的HSPC117分子的转基因细胞。细胞可为细胞系或包含在动物模型,尤其是非-人动物模型中。细胞系也可为稳定地表达HSPC117分子的人细胞系。外源地表达的HSPC117分子的稳定的表达通过在细胞内插入HSPC117DNA在启动子,优选诱导型启动子控制下来达到。在特定实施方式中,可将此DNA插入细胞的基因组,其可由常规方法诸如可商购的系统如四环素-诱导性系统诸如t-REx系统(invitiOgen)达到。该细胞在与可连接的 RNA,尤其具有用于连接RNA分子的2’,3’环磷酸或5’ -OH的RNA组合是有用的。
本发明还涉及减少细胞内的RNA连接酶活性,尤其是RNA>p连接酶活性的方法,其包括抑制细胞内的HSPC117分子,优选由敲除或RNAi。RNA>p连接酶活性,如上所述,涉及使用2’,3’ -环磷酸终结的RNA作为底物的RNA连接酶反应。该方法可用于在所述细胞中减少tRNA产生或加工。HSPC117的减小可通过将结合,分开或通常灭活HSPC117的HSPC117的配体施用到所述细胞中或通过抑制HSPC117表达来达到。该结合抑制物是例如HSPC117抗体,其是例如可商购的。"HSPC117-抗体〃包括任何功能相当体和其衍生物,包括结合HSPCl 17的抗体片段诸如Fab,F(ab)2,Fv或单链抗体(scAb)。在优选的实施方式中,抑制通过减少所述细胞中HSPCl 17分子,优选内源性HSPCl 17分子的表达来达到。减少HSPCl 17表达的适合的抑制物是诱导RNAi的HSPC siRNA分子。优选的抑制HSPCl 17表达的方法是敲除或RNAi。为敲除,将基因组HSPCl 17修饰为呈递功能性HSPC117分子的表达,转录或翻译。该修饰可包括例如达200或更多核苷酸的大延伸缺失或催化性中心中的选择性修饰(缺失或取代)。例如根据SEQ ID NO:1的人HSPCl 17序列的催化性C122的修饰足以防止功能分子的表达。当然,本领域技术人员可容易选择替代性的修饰,其在分子细胞生物学家的常规能力之内。进一步优选的方法是RNAi(RNA干涉)。为拮抗细胞HSPCl 17表达,优选施用siRNA分子,以减少表达和功能。RNA干涉是以序列特异性方式抑制基因表达的机理。RNA干涉是用于真核生物细胞中的特定基因功能的阻遏的高度有效方法。当应用于细胞和生物时,RNAi使短干扰RNA (siRNA)寡聚体或短-发卡RNA (shRNA)编码载体的转染后靶mRNA的降解。已描述各种RNAi的方法及通常知道改变植物细胞,果蝇和人黑色素瘤细胞中基因表达,如描述于例如US2002/0162126和US2002/0173478。选择用于在本发明的方法和组合物中使用的siRNA以靶向HSPC117分子。以此方式,它们靶向对应于HSPC117基因的各种RNA或其部分。本领域技术人员明白,在本文描述的siRNA也可包括是杂交体DNA/RNA构建体或其任何相当体,双链RNA,微RNA (miRNA),以及siRNA形式诸如siRNA复制,病毒和非-病毒载体中的小发卡RNA (shRNA)和载体中的siRNA或shRNA的改变的siRNA。
在进一步实施方式中,本发明涉及HSPC117敲除细胞或具有减少的或抑制的内源性HSPCl 17表达的细胞。该细胞系可还用于RNA连接或剪接研究,即以研究RNA连接的功能。内源性HSPC117表达的减小也具有无介导2’,3’环磷酸转变为5’-0H RNA分子的本发明的HSPC117连接酶的背景活性的益处。与HSPC117在诱导型启动子控制下的转基因细胞组合,此允许RNA连接酶的特定开/关研究,且是控制连接酶活性的有用的工具,其仅用于剪接研究或作为细胞生物化学加工工具。因此,在优选的实施方式中,本发明涉及不表达内源性HSPC117、但用在诱导型启动子控制下的HSPCl 17分子另外外源地转染的HSPCl 17敲除细胞。在优选的实施方式中,细胞是哺乳动物细胞,尤其优选灵长类动物的细胞,尤其是人或啮齿动物细胞诸如小鼠细胞。这些细胞,包括具有增加的或降低的上述HSPCl 17表达的细胞,可用于RNA连接或剪接研究。在再一方面,本发明中涉及具有异常tRNA加工的疾病或依赖于(增加的)tRNA加工的疾病的治疗。在特定实施方式中,本发明提供HSPC117分子作为RNA连接酶的用途或抑制HSPC117分子的方法,前提是,排除由疗法治疗人或动物身体的方法,或HSPC117分子或HSPC117抑制物用作药物的用途。HSPC117抑制物是减少上述HSPC117活性或表达的任何分子,优选HSPCl 17抗体或HSPC117siRNA。HSPC117分子抑制可在几种疾病中具有治疗效果。该疾病包括增殖疾病,尤其是癌。通过减少tRNA加工,增殖活性可为大大降低,导致减少的细胞生长。因此,本发明提供减少肿瘤细胞生长的方法,包括给所述细胞施用HSPC117分子抑制物。已知,肿瘤细胞具有异常地高的聚合酶(Pol)III转录速率(Marshall&White, 2008)。由于Pol III合成tRNA,靶向tRNA连接酶会在癌细胞中转(高)tRNA生产率-限制。用于增殖的tRNA剪接组分的重要性例如公开于W02004/087884A2 (在本文通过引用合并)。在再一方面,本发明中提供治疗依赖于宿主聚合酶的疾病或感染,诸如丁型肝炎病毒感染的方法,其包括给所述细胞施用HSPC117分子抑制物。人丁型肝炎病毒是仅动物病毒,已知使用宿主聚合酶复制其RNA基因组。病毒复制中涉及的宿主因子是难以捉摸的。牵涉在复制期间环化病毒基因组中的连接酶-宿主因子(Reid&Lazinski,2000)。在组合的蛋白质组学-RNAi筛选中鉴定了多于100种与丁型肝炎抗原关联的蛋白。部分鉴定的蛋白在RNA代谢中具有作用,且那些之一是HSPC117。组合的此显示,HSPC117是用于治疗丁型肝炎病毒感染的决定性靶。此外,本发明涉及治疗与功能异常性tRNA剪接关联的受试者中的疾病,尤其是由RNA>p而在tRNA连接中有缺陷,优选脑桥小脑发育不全的方法,包括给所述受试者施用HSPC117分子。tRNA剪接通路和脑桥小脑发育不全之间的关联已建立。此疾病属于一组退行性常染色体隐性病症,其具有出生前发作,小脑萎缩或发育不全和其他运动损伤。机理上,这些疾病相关于在tRNA剪 接期间的内含子的异常移出和外显子的连接。因此功能HSPC117分子的施用可恢复正常剪接及内含子移出及治疗疾病,尽管其也是良好知道的,但在分子水平不明白tRNA代谢对脑功能具有特定影响。细胞通过分泌血管生成素(除了在血管发生中的知道的作用,显示核糖核酸酶活性的因子)来应答氧化应激。血管生成素在反密码子环切割成熟tRNA,由此产生被称为tiRNA的tRNA块,用于源于tRNA的应激-诱导的RNA。tiRNA蓄积损伤蛋白合成,及因此有害于细胞健康和功能。灭活人tRNA连接酶HSPCl 17导致培养细胞中tiRNA增加。增加的HSPCl 17回复血管生成素切割及减少tiRNA水平。HSPCl 17因此可在再连接血管生成素-切割的tRNA中具有不同作用。此血管生成素反应不可在HSPC117分子抑制后回复。由此,本发明也涉及诸如通过增加或降低细胞中的HSPC117活性来调节细胞中tiRNA量的方法。在再一方面,本发明提供药物组合物,其包含表达HSPC117分子的核酸,优选表达载体形式的,或HSPC117分子抑制物,优选上述抗体或其siRNA或变体。该组合物可为即用组合物,例如用于治疗上述任何疾病。用于治疗或预防性使用的药物组合物或制剂可包含药学可接受的稀释剂,载体,增溶剂,乳化剂和/或防腐剂。本发明也提供用于药物组合物,其包含治疗有效量的HSPCl 17抑制物或表达核酸。术语〃治疗有效量〃是指提供用于特定的条件和施用途径的治疗效果的量。组合物可为液体或冷冻干燥的形式,且包含具有各种pH值和离子强度的稀释剂(Tris,乙酸盐或磷酸盐缓冲剂),增溶剂诸如吐温或聚山梨酯,载体诸如人血清白蛋白或明胶,防腐剂诸如硫柳汞或苄基醇,及抗氧化剂诸如抗坏血酸或偏亚硫酸氢钠。特定组合物的选择会依赖于许多因素,包括待治疗的病情,施用途径和期望的药代动力学参数。核酸和siRNA制剂优选在脂质体制剂中施用。本发明的组合物可通过注射,皮下,静脉内或肌内施用,或由口腔,鼻,肺部或直肠施用。最终选择的施用途径会依赖于许多因素和可由本领域技术人员查明。以下会参照图和实施例更详细解释本发明,不旨在限制。

图1.RNA连接机理和RNA>p连接酶HSPCl 17的鉴定。(A)例证在描述的RNA连接通路中的机理差异的方案(B)将[5’ -32P]-pCp-放射性标记的5’ -0H,3’ -P RNA寡核苷酸(以灰色描绘,星号标记放射性标记物的位置)与或不与AP温育,及退火到RNA链(以黑色描绘),在ATP的存在下与或不与T4Pnk温育。将获得的RNA双联体用作HeLa细胞提取物中链间连接的底物。在指示的时间点抽出连接反应的等份,及通过变性凝胶电泳分析。
(C)为自HeLa提取物部分纯化RNA>p连接酶建立的分级分离方案。在整个纯化过程中,[5’ -32P]-pCp放射性标记的5’ -0H,3’ -P dsRNA的链间连接用于监测RNA>p连接酶活性。
(D)检定来自HSPCl17-siRNA-转染的细胞和对照-siRNA-转染的细胞制备的蛋白提取物的稀释系列的链间连接。以上泳道的数指示提取物稀释。(E)检定相同的提取物在时程实验中的[a -32Pl-GTP-放射性标记的前-tRNA的加工。(F)由蛋白印迹确认提取物中HSPC117水平的减小。图2.自稳定地转染的HeLa细胞系的c-myc-HSPC117的亲和纯化产生RNA>p连接酶复合物。(A)将WT或C122A c-myc-HSPC117的IP与[a-32P]-GTP-放射性标记的tRNA外显子半温育。将自非表达克隆制备的IP用作阴性对照。(B)由蛋白印迹确认亲和纯化的特异性和在比较的IP中等同量的WT和突变体c-myc-HSPC117的存在。(C)将tRNA外显子半在ATP的存在或缺失下与Clpl或T4Pnk温育。回收RNA,并在与免疫纯化的c-myc-HSPC117温育中用作底物。(D)例证用于在成熟tRNA和环状内含子中剪接连接的最近邻分析的过程的方案(Np,核苷3’ - 一磷酸酯;pN,核苷5’ - 一磷酸酯)。(E)通过变性凝胶电泳解析源于由T4Pnk/Rnll或亲和性纯化的c-myc-HSPC117产生的[a -32P]-UTP-放射性标记的成熟tRNA的RNA酶Tl片段。从凝胶分离6聚体,7聚体和8聚体,由RNA酶T2消化,及在溶剂D中由TLC分析。(F)从凝胶分离由T4Pnk/Rnll或亲和性纯化的c-myc-HSPC117产生的环状,[a -32P] -ATP-放射性标记的内含子,用RNA酶Pl消化,及在溶剂C中由TLC分析。图3.有活性的RNA>p连接酶复合物用SF3B复合物共纯化。(A)为自HeLa核提取物纯化SF3B-复合物建立的亲和性流程。在由固定的识别三甲基鸟苷(m32’2’7G)mRNA帽结构的单克隆抗体H20耗尽U2之后,HSPCl 17-及SF3B-复合物被固定的单克隆SF3B155-导向的抗体13E12结合。(B)在自抗-SF3B15513E12柱洗脱后,在Superose6上由尺寸排阻分离SF3B和RNA>p连接酶复合物。由SDS-PAGE分析级分,且蛋白用考马斯蓝色染色。(C)使用tRNA外显子半作为底物检定从Superose6柱洗脱的级分的RNA>p连接酶活性。通过变性凝胶电泳分析从反应回收的RNA。(D)RNA>p连接酶峰级分由SDS-PAGE分析,蛋白条带通过用考马斯蓝色染色来可视化。由质量光谱法鉴定标记的条带。(E)HSPC117而非RNA>p连接酶复合物的其他组分沉默后链间连接和tRNA成熟活性的丧失。用靶向C220RF28/HSPC117, DDXl, C140RF166/CG1-99,FAM98B, C20RF49/ASW 和 EGFP 的 siRNA 作为对照处理细胞。从这些细胞制备提取物及检定[5’ -32P]-pCp-放射性标记的dsRNA的链间连接,或(F) [a -32P]-GTP -放射性标记的前-tRNA的加工。(G)由定量PCR确认C220RF28/HSPC117,DDXl, C140RF166/CG1-99, FAM98B 和 C20RF49/ASW mRNA 的有效耗尽。结果表示三重 PCR 反应的平均值和标准偏差。(H) HSPC117,DDXl, FAM98B和β -肌动蛋白作为装载对照的蛋白印迹确认个体RNA>p复合成员的有效耗尽。图4.HSPCl 17的沉默消除活HeLa细胞中的链间连接,且部分损伤体内tRNA加工。(A)将[5’ -32P]-pCp-放射性标记的dsRNA转染进用靶向EGFP作为对照基因,HSPC117或RT⑶I的siRNA预转染的HeLa细胞。在指定的时间点停止转染。分离RNA及通过变性凝胶电泳分析。(B)用于siRNA和报告子构建体的转染和标记的tRNA转录的诱导的处理方案。(C)存在于标记的tRNA报告子构建体的元件的示意表示。(D)将表达Tet-阻遏物的HeLa细胞用靶向对照基因EGFP,HSPCl 17或TSEN2的siRNA及用表达标记的前-tRNA Ile的报告子构建体pSTet-1le共转染。在诱导之后,在指定的时间点分离RNA,及由RNA印迹分析。(E)多RNA印迹实验的定量。一式三份进行siRNA和报告子构建体的转染。自细胞回收RNA,由RNA印迹检测成熟tRNA,及由Phosphorimaging使用ImageQuant定量。误差条表不标准偏差。图5.由RNAi耗竭HSPC117的提取物中体外RNA连接缺陷的遗传拯救。(A)将稳定的小鼠-BAC转 基因HeLa细胞库或野生型HeLa细胞用靶向人HSPCl 17的非-保守的3’-UTR的siRNA或对照siRNA转染。检定从这些细胞制备的提取物的与[5’-32P]-pCp-放射性标记的dsRNA的链间连接。以上泳道的数指示连接产物的相对量。泳道I中的信号任意设置为1.0。(B)从相同的实验平行分离RNA,及由定量PCR分析小鼠和人HSPCl 17的水平。HeLa细胞中的人HSPCl 17和小鼠-BAC转基因HeLa细胞库中的人和鼠HSPCl 17的表达水平任意设置为100%。图6.HSPC117/RtcB蛋白的序列比对。HSPC117/RtcB蛋白在古细菌,细菌和动物中广泛分布,但不在植物和真菌中。星号指示在人/鼠HSPC117的假定的活性位点中特征性的C122A突变的位置。使用以下序列标识符:智人(H.sapiens):SEQ ID NO:1,小家鼠(M.musculus):SEQ ID N0:2,光滑爪蟾(X.laevis):SEQ ID N0:3,紫色球海胆(S.purpuratus):SEQ ID NO:4,黑腹果蚬(D.melanogaster):SEQ ID N0:5,秀丽隐杆线虫(C.elegans):SEQ ID NO:6,莱哈衣滴虫(C.reinhardtii):SEQ ID N0:7,詹氏甲烷球菌(M.jannaschii):SEQ ID NO:8,超嗜热火球菌(P.horikoshii):SEQ ID N0:9,嗜热栖热菌(T.thermophilus):SEQ ID NO: 10,大肠埃希氏菌(E.coli):SEQ ID NO: 11。图7.用于剪接连接磷酸酯的最近邻分析的流程详细解释。(A)描绘的前-tRNA是用[a -32P]-UTP身体-标记的。为简便起见,仅显示放射性标记的磷酸酯。用詹氏甲烷球菌(Methanocaldococcus jannaschii)的重组体剪接内切核酸酶(MjTSEN)的这前-tRNA的切割产生具有放射性标记的末端2’,3’-环磷酸的5’-外显子半。外显子半与c-myc-HSPC117的连接导致含有源于前体的剪接连接磷酸酯的成熟tRNA分子的形成。在相同的外显子半与T4Pnk和T4Rnll的混合物连接期间,剪接连接磷酸酯被由三磷酸核苷提供的外源磷酸酯取代。结果,放射性剪接连接标记物失。从二个连接反应分离成熟tRNA,及用RNA酶Tl消化。剪接连接现在含在RNA酶T17聚体中,其可由制备性变性凝胶电泳分离。RNA酶T17聚体用RNA酶T2的完全消化释放剪接连接磷酸酯,如鸟苷3’ - 一磷酸酯(Gp)。因此,放射性标记的Gp的检测指示源于前体的,放射性标记的末端2’,3’ -环磷酸并合进剪接连接体,如3’,5’-磷酸二酯。(B)描绘的前-tRNA是用[a-32P]-ATP身体-标记的。此前体的切割产生具有放射性标记的末端2’,3’ -环磷酸的线性内含子。此线性内含子与c-myc-HSPC117的连接产生含有放射性标记的末端磷酸酯的环化的内含子。在线性内含子与T4Pnk和Rnl I连接期间,此磷酸酯被移出,及由三磷酸核苷提供的外源磷酸酯落在线性内含子的第I尿嘧啶核苷核苷酸的5’-0H。由制备性变性凝胶电泳分离环化的内含子。在与c-myc-HSPC117连接期间,放射性标记的2’,3’-环磷酸成为线性内含子的第I尿嘧啶核苷核苷酸的5’-磷酸酯。因此,环化的内含子用RNA酶Pl的消化释放连接磷酸酯作为尿嘧啶核苷5’-一磷酸酯(PU)。因此,放射性标记的pU的检测指示线性内含子的放射性标记的末端2’,3’ -环磷酸作为3’,5’ -磷酸二酯并合进环状内含子。图8.由RNAi耗竭HSPC117的提取物中体外RNA连接缺陷的生物化学拯救。由RNAi耗竭HSPCl 17的细胞的提取物由用SF3B粒子共纯化的HSPCl 17-复合物的Superose6级分补充。就[a-32P ]-GTP-放射性标记的前-tRNA的加工来检定级分。图9.用RNA>p连接酶通过用十字形DNA特异性抑制来干扰。(A)将[5’ -32P]-pCp-放射性标记的dsRNA与HeLa细胞提取物在相比dsRNA底物2000倍摩尔过量的十字形(ScraPal)或对照DNA (ScraPal Λ )双联体存在下温育。在指定的时间点抽出等份的反应,及通过变性凝胶电泳分析。(B)在相比RNA底物2000倍摩尔过量的十字形或对照DNA双联体的存在下检定HeLa提取物的[a -32P]-GTP-放射性标记的前-tRNA的加工。在指定的时间点抽出等份的反应,及通过变性凝胶电泳分析。图10.用于体内tRNA加工实验的标记的tRNA Ile的设计和HSPC117和TSEN2的RNA1-介导的耗尽的验证。编码标记的前-tRNA IleTAT的pSTet插入子与源于标注的人基因组tRNA Ile座位的外显子序列的比对(Chan和Lowe, 2009)。底行的大写字母指示普遍地保守的残基,星号指示关于Chrl9/trnalO-1leTAT的突变的位置。
实施例实施例1:由新生物化学策略鉴定哺乳动物RNA>p连接酶检测RNA>p连接酶的新策略,如应用潜在地导致tRNA连接酶的鉴定。偶然发现3’ -磷酸化的(3’ -P),5’ -OH双链RNA分子(dsRNA)在与人细胞提取物温育后共价连接。在这些提取物中,3’ -P dsRNA由人RNA末端环化酶RT⑶I转变为2’,3’ -环磷酸终结的dsRNA。因此,我们决定使用3’-P dsRNA作为稳定的替代品底物用于难以捉摸的tRNA连接酶。链间连接需要与5’-0H互补链退火的3’-P单链RNA。通过与碱性磷酸酶(AP)温育的3’_P的移出或通过与噬菌体T4多核苷酸激酶(T4Pnk)在ATP的存在下温育的5’-OH的磷酸化或二者的组合抑制链间连接(图1B)。此结果导致由典型活性引导的蛋白层析鉴定RNA>p连接酶。监测链间连接,我们能通过4个纯化步骤跟踪RNA>p连接酶活性(图1C)。不能进一步分级分离链间连接活性,我们由在溶液胰蛋白酶消化中之后是串联质量光谱测量分析(MS)鉴定了最富集的MonoQ级分中含有的蛋白。91种(表SI)鉴定的多肽之一,HSPC117/C220RF28,由于以下原因呈现出具有特定兴趣。第1,HSPC117是由未知的功能的高度保守的结构域(UPR)027)和带有推定的金属离子结合位点的独特蛋白折叠表征的细菌/古细菌RtcB基因家族的人同源物。有趣的是,在大肠埃希氏菌(E.coli)中,RtcB与RtcA,RNA3’ -P末端环化酶一起在σ 54-调控的操纵子之内(Genschik等人,1998)。结果,RtcB/HSPC117蛋白已之前预测在RNA加工或修饰中具有功能(Galperin和Koonin, 2004)。第2,UPR)027蛋白形成直系同源基因(K0G3833)簇,在植物和真菌模型生物,拟南芥(Arabidopsis thaliana),酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)中无可检测的代表。此种系分布在动物和古细菌中高度暗示RNA>p连接酶活性的排他的发生(Abelson 等人,1998)。实施例2:链间连接和tRNA成熟需要HSPCl 17因此,测试是否HSPC117的确涉及链间连接和tRNA加工。用靶向HSPC117或EGFP作为对照的小干扰RNA(siRNA)转染HeLa细胞。从这些细胞制备提取物,及检定链间连接。显著地,HSPCl 17由RNA干涉(RNAi)的耗尽影响了链间连接(图1D,比较泳道2_4与泳道5-7)。3’-P dsRNA仅用作替代底物,且RNA>p连接推定为tRNA剪接所需要。接下来,体外检查沉默HSPCl 17对tRNA成熟的影响。适合的tRNA前体(前-tRNA)转录物在HeLa细胞质提取物中加工为成熟tRNA (Laski等人,1983)。因此,与由RNAi耗竭HSPCl 17的提取物包括[a -32Pl-GTP-放射性标记的前-tRNA转录物(图1E)。减少的HSPC117水平损伤成熟tRNA的形成,且导致外显子半的相伴的蓄积,与tRNA外显子的连接中的生物化学功能一致。由蛋白印迹分析确证提取物中HSPC117水平的有效减小(图1F)。用不同组的siRNA及由RNAi表型的拯救(图5)通过自源于小鼠基因组DNA的细菌人工染色体(BAC)的耐RNAi的形式的HSPC117的表达 确认HSPC117的siRNA-介导的耗尽的特异性。实施例3=HSPCl 17是哺乳动物RNA>p连接酶的催化性组分接下来研究是否HSPC117相关于RNA>p连接酶活性。因此,建立表达c-myc-标记的鼠HSPC117的稳定地转染的克隆HeLa细胞系。基于UPR)027蛋白的多序列比对(图6)及由出版的自超嗜热火球菌(Pyrococcus horikoshii)的RtcB的晶体结构的指导(Okada等人,2006),产生表达点突变c-myc-HSPC117C122A的稳定地转染的克隆细胞系。为了检测独立于RT⑶I和tRNA内切核酸酶的tRNA连接酶活性,通过用自詹氏甲烷球菌(Methanocaldococcus jannaschii)的重组体剪接内切核酸酶(MjTSEN)切割适合的[a -32P] -GTP放射性标记的杂交体前-tRNA来制备tRNA外显子半(Englert, 2005)。c-myc-HSPC117的亲和纯化产生了能连接tRNA外显子半的免疫沉淀(IP)。相反,点突变体c-myc-HSPC117C122A作为RNA连接酶无活性(图2A,比较泳道6和7与泳道8)。由蛋白印迹确认等同量的野生型(WT)和C122A突变体c-myc-HSPC117的比较(图2B,比较泳道2和3)。因此总结,HSPCl 17是tRNA连接酶的催化性组分。实施例4=HSPCl 17催化2’,3’ -环磷酸和5’ -OH RNA末端的直接连接RNA>p连接酶被预测需要其底物末端的5’ -0H。一贯地,当tRNA外显子半与重组5’ -OH RNA激酶CLPl在将3’ -外显子的5’ -OH转变为5’ -P的ATP的存在下预温育时,在c-myc-HSPC117IP中无连接酶活性可检测(图2C,比较泳道2和3)。除了其5’ -OH RNA激酶活性之外,T4Pnk已知包含2’,3’ -环状磷酸二酯酶和3’ -磷酸酶活性。如对于RNA>p连接酶预期,当我们使用与T4Pnk在ATP (为了移出2’,3’ -环磷酸及为了另外地将5’ -OH转变为5’ -P)缺失(为了移出2’,3’ -环磷酸)或存在下预温育的tRNA外显子半作为用于与c-myc-HSPC117IP连接的底物时,我们无法检测任何连接酶活性(图2C,泳道4和5)。由此,由描述的RNA>p连接酶的连接是对于5’ -OH (见也图1B)和2’,3’ -环磷酸有利的。由RNA>p连接酶的tRNA外显子半的连接的最特征性特征是在规范5’,3’ -磷酸二酯键中含有源于前体的剪接连接磷酸酯的成熟tRNA的产生(图1A,更下游)。为了测试是否此对于由c-myc-HSPC117IP催化的RNA连接是真的,实施剪接连接磷酸酯的最近邻分析(图2D)。通过用重组体剪接内切核酸酶切割[a-32P]-UTP-放射性标记的前-tRNA来制备在5’ -外显子半的末端具有放射性标记的2’,3’ -环磷酸的tRNA外显子半(图7)。通过与c-myc-HSPC117IP或与T4Pnk和噬菌体T4RNA连接酶l(T4Rnll)的混合物作为阴性对照温育来连接这些外显子半。从这些反应分离成熟tRNA,及由切割每鸟苷核苷酸的RNA3’和将其底物加工成由鸟苷3’- 一磷酸酯(Gp)终结的片段的RNA酶Tl消化。分离6 8个核苷酸长的片段,由RNA酶T2消化,及由薄层层析解析得到的核苷酸3’ - 一磷酸酯。通过此过程,仅在源于由c-myc-HSPC117产生的成熟tRNA的RNA7聚体中检测到放射性标记的Gp,指示源于前体的剪接连接磷酸酯的保留(图2E,泳道3)。如所预期,剪接连接磷酸酯在用T4Pnk和T4Rnll实施的对照连接中交换(图2E,泳道4)。由于无放射性标记的NTP加入任何连接反应,无放射性标记的Gp在源于成熟,T4Rnll-连接的tRNA的RNA酶T1-7聚体的RNA酶T2消化中可检测(图2E,泳道4)。在由c-myc-HSPC117IP转变成环化的内含子之后也用2’,3’ -环磷酸末端放射性标记的线性内含子实施类似最近邻域分析。由c-myc-HSPC117而非由T4Pnk/Rnll环化的内含子的Pl核酸酶消化中放射性标记的尿嘧啶核苷5’ - 一磷酸酯(PU)的检测支持了剪接连接磷酸酯的保留(图2F,比较泳道I和2)。其得出,鉴定的RNA>p连接酶通过将源于前体的剪接连接磷酸酯合并到成熟tRNA来在规范3’,5’-磷酸二酯键中接合tRNA外显子半。实施例5=HSPCl 17在稳·定的杂聚体蛋白复合物中醒目地,与我们的纯化RNA>p连接酶的努力平行,至今未知功能的稳定的和高度同质的含有HSPC117的复合物发现与自核HeLa细胞提取物制备的剪接体SF3B粒子共纯化。因此,测试SF3B-关联的和高度纯化的HSPC117-复合物,以呈现RNA>p连接酶活性。SF3B-关联的HSPC117-复合物通过SF3B和U2剪接体复合物的解离,之后是U2的选择性免疫耗竭来获得。自流通回收未结合的SF3B-及HSPC117-复合物,由抗-SF3B155-偶联的树脂捕获,和用抗体表位肽特别洗脱(图3A)。在自亲和性柱洗脱之后,SF3B-(图3B,级分12 19)和HSPCl 17-复合物(图3B,级分23 26)由尺寸排阻层析在Superose6上分离。一致于用c-myc-HSPC117IP获得的初始数据,含有HSPC117-复合物而非SF3B剪接体复合物的级分将tRNA外显子半和线性内含子分别转变为成熟tRNA及环化的内含子(图3C)。此外,相同的级分可生物化学地拯救HSPC117的RNA1-耗竭的提取物的tRNA剪接缺陷(图8)。在此含有HSPC117的复合物中鉴定的蛋白由自考马斯蓝染色的凝胶分离的单条带的胰蛋白酶消化之后是MS分析来分析。除了 C220RF28/HSPC117之外,鉴定的蛋白包含DEAD盒解螺旋酶DDXl及ninein相互作用蛋白C140RF166/CG1-99 (除了 FAM98B之外)和亚化学计量的ASW/C20RF49 (图3D)。此组蛋白与来自稳定的细胞克隆的c-myc_HSPC117 (表2)和MonoQ RNA>p连接酶级分中鉴定的蛋白(图1C和表I)的免疫沉淀的MS分析的结果重叠。
权利要求
1.HSPCl 17分子作为RNA连接酶的用途,优选用于将第IRNA端转移到第2RNA端,尤其优选的是其中第I端包含3’磷酸,优选2’,3’ -环磷酸,和/或其中第2端包含5’ -OH末端。
2.权利要求1的用途,用于链间或链内连接。
3.权利要求1或2的用途,其中RNA是双链。
4.权利要求1 3之任一项的用途,用于RNA剪接。
5.权利要求1 4之任一项的用途,其中RNA是mRNA或tRNA。
6.权利要求1 5之任一项的用途,其中RNA是2 3000个核苷酸或碱基对长。
7.权利要求1 6之任一项的用途,其中HSPCl17分子具有下列之任何一个:SEQ IDNO:1SEQ ID NO: 2,SEQ ID NO: 3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO: 5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO: 7,SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9,SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11,SEQ ID NO: 13,SEQ ID NO: 15,SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23。
8.连接至少2个RNA分子的方法, 包括使用根据权利要求1 7之任一项的HSPC117分子, 优选包括使至少2个RNA分子与所述HSPCl 17分子在细胞内接触,或 优选包括使至少2个RNA分子与所述HSPCl 17分子体外接触, 尤其优选的是还包括给复合物中的HSPC117分子提供,优选剪接体粒子,优选其中复合物包括DEAD盒解螺 旋酶DDXl分子,FAM98B分子,CG1-99分子,ASff或其任何组合。
9.适合于实施RNA连接的试剂盒,包含HSPCl 17 分子, RNA连接酶反应缓冲剂,其包含:缓冲剂组分及选自下列的一种或更多金属离子:Mg2+,Mn2+,Ni2+或其混合物,用于以ca0.1 20mM,优选I 10mM,尤其优选的是2 5mM的终浓度范围使用,任选地还包含具有2’,3’ -环磷酸,优选还具有标记物的RNA分子。
10.转基因细胞,其包含优选用诱导型启动子外源地表达的HSPC117分子。
11.HSPC117敲除细胞或具有减少的抑制的内源性HSPC117表达的细胞。
12.权利要求10或11的细胞,其为哺乳动物细胞。
13.减少细胞内的RNA连接酶活性,尤其是RNA>p连接酶活性的方法包括抑制细胞内的HSPCl 17分子,优选由敲除或RNAi。
14.权利要求13的方法,其特征在于抑制是通过减少所述细胞内的HSPC117分子,优选内源性HSPCl 17分子的表达。
15.权利要求13或14的方法,其用于减少所述细胞内的tRNA产生或加工。
16.权利要求10 12之任一项的细胞用于RNA连接或剪接研究的用途,优选以调节细胞内的tiRNA量。
17.减少肿瘤细胞生长或依赖于宿主聚合酶的疾病或感染,诸如丁型肝炎病毒感染的方法,包括给所述细胞施用HSPCl 17分子抑制物,或治疗与功能异常性tRNA剪接关联的受试者中的疾病,优选脑桥小脑发育不全的方法,包含给所述受试者施用HSPC117分子。
全文摘要
本发明涉及HSPC117分子作为RNA连接酶的用途,连接RNA分子的方法,用于这些方法和用途的试剂盒和转基因细胞。
文档编号C12N9/00GK103228783SQ201180041769
公开日2013年7月31日 申请日期2011年8月30日 优先权日2010年8月30日
发明者J·波宝, S·威泽尔, J·马蒂内, K·美希特勒, A·施勒费尔 申请人:分子生物技术院有限公司

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