含硫醚桥的肽的细菌表面展示和筛选的制作方法
专利名称：含硫醚桥的肽的细菌表面展示和筛选的制作方法
技术领域：
本发明涉及蛋白质工程和筛选治疗性相关肽的领域。更具体地，涉及翻译后修饰的异源性蛋白质的细胞表面展示。在微生物(例如细菌)表面的蛋白质或肽的异源展示是有用的研究手段，并已经与宽范围的有趣的应用相关联。将蛋白质或肽功能与编码的基因相连接能够从大的组合的文库中筛选和/或最优化具有期望性质的肽。已经开发了多种展示形式，包括核糖体展示、噬菌体展示、细菌表面展示和酵母展示。噬菌体展示或许是最为熟知的系统。
背景技术：
细胞表面展示的一个最有趣的应用是从大文库中选择对感兴趣的治疗性的靶分子高亲合的配体。迄今，只展示过线性肽、二硫键连接的环肽和与有机核耦合的肽。这导致了多种有用的肽的鉴定，包括治疗有效性(前导)肽。然而，已经认识到这些肽对蛋白质水解的敏感性和不稳定性为其治疗应用的主要缺点。转译后向肽中引入环状结构，例如硫醚交联，可避免这些稳定性问题。然而，目前，仍然难于有效地将这样的结构引入到合成肽中，尤其是大的肽中。
发明内容
本发明旨在提供允许脱氢氨基酸和或含硫醚肽的细胞表面展示的新型展示系统。为此，构建了独特的重组核酸构建体，其编码融合肽，所述融合肽除了包含将被环化的肽序列外，还包含特异性功能元件的组合。惊奇地发现环状结构易于被表达所述构建体并包含用于抗生素的生物合成和输出的装置的宿主细胞，例如乳酸菌(Lactococcus lactis)的表面制造或展示。更具体地，本发明提供了编码融合肽的分离的核酸序列，所述融合肽从N端到C端至少包含如下元件:(a) N端羊毛硫抗生素前导序列(b)将被翻译后修饰成含脱氢残基或硫醚的多肽的感兴趣的氨基酸序列(c)亲水跨细胞壁结构域(d)分选酶识别基序(e)疏水跨膜结构域(f)C端带电荷的膜锚定结构域。本发明的其它方面涉及包括所述分离的核酸的表达载体、包括所述表达载体的宿主细胞和包括多个宿主细胞的宿主细胞文库。本发明还可应用于生产表达含脱氢残基的肽的宿主细胞(的文库)。所述特异性核酸构建体允许开发同时用于编码的肽的转译后酶修饰及修饰的(环化)肽的展示的细菌宿主细胞。本领域中已知的其它展示系统如噬菌体展示理论上可适于表达和展示可被化学手段环化 的肽，例如二硫桥肽的碱辅助脱硫(Galande等，2003Biopolymers71，534-551)。然而，观察到碱性环境严重地减小了噬菌体的存活率和感染性。相反，本发明允许使用高度有活力的革兰氏阳性宿主细胞，尤其是乳酸菌，所述宿主细胞可例如在筛选期间抵抗严酷环境。此外，通过化学手段的环封闭不是立体和区域特异的；具有形成二硫键桥的两个L-Cys残基的特定的肽将产生3种非对映的含羊毛硫氨酸的肽的混合物，羊毛硫氨酸的的构型为LL、LD和DL。相反，羊毛硫氨酸酶装置只产生DL-立体异构体，并且在多个环的情况下，只有一个环模式。此外，不需要进行具有不确定的产率的使成本上升的反应步骤；修饰和展示全部为细菌系统所固有。再进一步，(乳酸)细菌的尺寸足够大以使用FACS分析来筛选。已经说明羊毛硫抗生素合成酶在膜结合复合物中被组织(Siegers等，1996.J.Biol.Chem.271，12294-12301 ；Kiesau 等，1997.J.Bacteriol.179，1475-1481 ；Sahl 等1998.Annu.Rev.Microbiol.52:41-7)。这个复合物由羊毛硫抗生素转运体(LanT)、脱水酶(dehydrating enzyme) (LanB,也称为脱水酶(dehydratase))和环化酶(LanC)组成。在一些羊毛硫抗生素的情况中，由双官能酶(LanM)进行脱水和环化步骤。在核糖体中合成的前多肽原的N端羊毛硫抗生素的前导序列为羊毛硫抗生素酶的识别序列，开始于脱水酶或同时进行脱水和环化的酶。认为所述前导序列结合到所述羊毛硫抗生素复合体上以使所述前多肽原接近所述羊毛硫抗生素酶。所述酶复合体暗示所述脱水和环化酶需要附着到转运体上，否则羊毛硫抗生素前多肽原将不经修饰被输出，或者修饰的肽将在细胞内聚集。在多数情况下，羊毛硫抗生素的转运完全依赖于专用的羊毛硫抗生素转运体。显示乳链菌肽转运体(NisT)的破坏引起完全修饰的乳链菌肽前体在细胞内的积累(Qiao等1996.FEMS Microbiol.Lett.144，89-93)。Kuipers等以前证明羊毛硫抗生素转运体NisT可分泌未修饰的羊毛硫抗生素和前导肽与非羊毛硫抗生素肽的融合体，并且在无环化酶的情况下，脱水酶和羊毛硫抗生素转运体的结合也是功能性的(2004.J.Biol.Chem.279，22176-22182)。上述六个不同的元件在单个融合蛋白中的具体组合和相对顺序在现有技术中未知或不可从现有技术中推导出来。申请人:名下的W02006/062398公开了几种羊毛硫抗生素前导肽及它们的应用，例如在融合蛋白中生 产将被脱水酶转译后脱水的感兴趣的肽。根据W02006/062398，所述前导肽和将被修饰的肽前面有非羊毛硫抗生素输出信号，例如SEC输出信号。所述输出信号和前导肽可被细胞锚定序列分离，例如LPTX-分选酶识别基序。W02006/062398没有公开元件
(c)、(e)和(f)。Moll 等，Antonie van Leeuwenhoe Vol.97, N0.4, 2010, 319 333 页为非羊毛硫抗生素肽中脱氢氨基酸和羊毛硫氨酸的微生物工程的综述。通常教导肽中羊毛硫氨酸的微生物工程可允许产生独特文库和伴随的展示系统。没有提及如何技术上获得这样含羊毛硫氨酸的肽的文库，更没有提出本发明的涉及展示具有转译后引入的环状结构的肽的独特的方法。相反，本领域技术人员将选择更常规的方法，例如含二硫键的肽的噬菌体展示，然后化学环闭合。Rink 等(2010) J.0f Pharmac.And Toxic.Methods, Vol.61, N0.2, 210 218 页涉及通过D氨基酸和环化来稳定多肽药物。将感兴趣的肽直接或通过间隔子遗传地融合到羊毛硫抗生素前导肽上。未提及转译后环化的肽的细胞表面展示。Leenhouts 等(1999) Antonie van Leeuwenhoe, Vol.76, N0.1-4, 367 376 页公开了几种将蛋白质锚定到细胞壁的方法，包括LPXTG锚定基序。还教导带电荷的尾部和疏水结构域可作用为定位所述用于蛋白质裂解的靶定基序的临时终止子。如在W02006/062398中，结合所述Sec信号序列和SEC介导的输出讨论了所述元件。Leenhouts未提及任何革巴定基序与将被所述羊毛硫抗生素装置识别的元件的组合。任何类型的羊毛硫抗生素前导序列可被用于实践本发明，只要其可被至少一种羊毛硫抗生素脱水酶识别，还优选可被可形成羊毛硫氨酸桥的环化酶识别。在一个实施方式中，本发明的多肽中的前导肽具有羊毛硫抗生素前导共有基序，所述前导共有基序可源自已知羊毛硫抗生素前导肽的氨基酸序列比对。羊毛硫抗生素前导肽的氨基酸序列可从公共文库获得。例如，申请人名下的W02006/062398的表IA和表IB展示了羊毛硫抗生素前导肽的示例性比对。本领域技术人员能够从比对的序列得到共有基序，例如用公共或商购的比对软件，例如Vector NTI的AlignX。AlignX用ClustalW算法同时对蛋白质和核酸序列进行多序列比对。其绘出同源、序列复杂性、系统树和点矩阵同源图。AlignX接受标准的、富含特征的、序列的文本文件，例如GenBank、EMBL和GenP印t文件。在一个实施方式中，使用ClustalW算法表I中的序列推导出所述共有基序。优选前导肽共有基序源自至少5种、更优选至少10种、最优选至少15种已知前导肽序列的比对。然后，用本领域中已知的方法验证由此获得的共有基序的前导肽活性，即被羊毛硫抗生素脱水酶识别和丝氨酸或苏氨酸的脱水。可使用Mald1-TOF MS监控给定的靶序列，例如ITSISRASVA的脱水。
所述前导肽共有序列可包含各种共有序列，例如共有基序X1-D/E-E-V/L-S/T-D/E-X2-E-L-D/E，其中，Xl为任何疏水氨基酸，并且其中X2为任何氨基酸。例如，它包含序列LEEVSEQELD。在另一个实施方式中，前导肽包含共有基序F-D/E/N-L-D/E/N-X3，其中，X3为L、I或V。例如，它包含序列LFDLDL或FNLDV。例如，所述前导序列还可包括共有的包含 ILELQNLD 的 I/L-L/F-D/E/N-L-Q-D/N/A/S/T-L/M-D/E。所述前导肽可由共有序列，例如FNLDV组成，后面是所述共有序列和修饰前肽之间的间隔序列。需要该间隔序列在羊毛硫抗生素修饰酶的催化中心可及的范围内带来可修饰的部分(Annechien Plat, LeonD.Kluskens, Anneke Kuipers, Rick Rink, Gert N.Moll (2010))。N 端结构域和间隔子对乳链菌肽前导肽的功能来说是充足的(Appl.Environ.Microbiol.77, 604-611)。另一方面，已经报道对于羊毛硫抗生素诱变素(Chen P等，FEMS MicrobiolLett.2001; 195 (2): 139)、P印5 (Neis S 等，FEMS Microbiol Lett.1997; 149 (2): 249)和乳链菌肽(Van der Meer 等，(1994) J.Biol.Chem.269，3555-3562.)，一些保守的前导肽残基对所述羊毛硫抗生素的生物合成是必需的，而其它残基对最佳生物合成速率来说重要。在优选的实施方式中，核酸序列编码羊毛硫抗生素的前导肽，例如选自由细菌素J46、乳链球菌素481、唾液素B、Macedonin、乳杆菌素AM49、乳杆菌素AFF22、唾液素G32、唾液素9、诱变素I1、Variacin, MukAU MukA2/A3、MukA’、乳链球菌素3147A1、葡萄球菌素C55a、Butyri vibriocin0R79> RuminococcinA、BovicinHJ50> Thermophi I in 1277 > 溶细胞素 LL、溶细胞素 LS> Sublancinl68、LichenicidinBeta、NukacinISK-K NukacinKQU-131、唾液素A4、唾液素A5、唾液素A2、唾液素A、唾液素A3、唾液素Al、植物乳杆菌素Wb、HaloduracinA2、乳链球菌素3147A2、葡萄球菌素C55b、Gallidermin、葡萄球菌素T、表皮素、乳链菌肽Z、乳链菌肽Q、乳链菌肽F、乳链菌肽A、EricinA, EricinS,枯草菌素、乳链菌月太 U、Epicidin280、Pep5、EpilancinK7、SffLPK Streptin、LichenicidinAlphaMersacidin、Actagardine、BHT-A2、SmbB> BHT-AK SmbA、植物乳杆菌素 ASMl、植物乳杆菌素ffa> HaloduracinAl、诱变素 1140/111、诱变素1、MichiganinA、肉桂霉素、乳杆菌素 S、AmfS(灰色链霉菌(S.griseus) )、SapB> AmfS (除虫链霉菌(S.avermitilis)) RamS2> RamSl、迷宫肽素A1/A3、迷宫肽素A2或允许被期望的羊毛硫抗生素修饰酶识别和修饰的感兴趣的下游定位肽的这些前导肽的任何同系物组成的组中的所述羊毛硫抗生素的前导肽。所述同系物显示与W02006/062398的表I和表2中展示的前导肽序列的一个，Plat等(2010) Appl.Environ.Microbiol.77，604-611显示的前导肽序列的一个，或Li等(2010)，美国科学院院干IJ，107 =10430-5.)提到的前导肽至少70%、优选至少80%、更优选至少90%，像92%、95%或甚至98%的序列一致性。例如，所述前导肽可为仍能够诱导感兴趣的肽的翻译后修饰的被截的和突变的羊毛硫抗生素前导肽。所述前导不需要具有被例如LanT的羊毛硫抗生素转运体诱导移位的能力，因为这个功能可被可存在于本发明的多肽中的非羊毛硫抗生素输出信号接替。在具体的方面，所述前导肽为乳链菌肽前导肽或其被截的或突变形式，其中在N端的多达4个氨基酸和/或其中在C端的多达5个氨基酸的任一个突变。所述羊毛硫抗生素前导序列后面为将要被修饰的肽。所述修饰包括脱水，优选跟随环化。只要相关的酶装置存在，可由所述宿主细胞自身进行环化。或者，脱水的肽可通过在高PH下脱氢氨基酸与半胱氨酸的反应参与环化。将明确感兴趣的肽可为任何期望通过脱水和环化羊毛硫抗生素酶来修饰的肽。典型地，设计感兴趣的肽，以便在一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基转译后脱水后，所述脱水残基可被连接至半胱氨酸(通过宿主细胞或体外)，以便形成硫醚环状结构。同时，在肽中的必需的任何期望位点可引入稳定化的环状结构。特别感兴趣的是具有生物活性的肽，例如用于治疗用途的肽，因为一个或多个硫醚环的引入通常提高肽的生物稳定性。此外，可使用环状结构以肽的改变生物活性，例如，受体结合亲和性或酶的特异性。感兴趣的肽为，例如激素，酶抑制剂，酶激活剂，受体配体，抑制肽，羊毛硫抗生素蛋白，病毒蛋白，真核蛋白，其突变体(例如特定地设计以允 许在特定位点上的修饰)，其相似、同源或功能性等价片段。这样的肽的实例为胰高血糖素-(1-29)、肠促胰岛素/胃泌激素抑制肽、肠抑素、nesfatin-Ι、血管紧缩素-(1-9)、apelinl2、ACTH-(1-24)、瘦素 22-56、IL-1 α (223-250)、IL-1 β (208-240)、胰高血糖素样肽1、胰高血糖素样肽2(1-33)、神经肽S、δ睡眠肽、甘丙肽样肽、黑色素浓缩激素、小脑肽、神经肽W-23、神经肽W-30、运动升压素、甘丙肽、CART-(62-76)、皮质抑素17、促黑激素的增效因子、心血管调节肽-β、神经肽Y、心钠素、脑钠素、树眼镜蛇利钠肽、c型利钠肽(32-53)、C型利钠肽(1-53)、血管钠、降钙素、C-原降钙素、N-原降钙素、骨钙素、ρΤΗ(1-38)、ρΤΗ相关蛋白质(1-40)、pr印tin、骨抑素(1-5)、生长激素释放因子、W3R5脑肠肽1-5、人生长激素(1-43)、KGF受体肽、表皮有丝分裂抑制五肽、BPP金枪鱼肌肉、水蛭素(54-65)、缓激肽、尾加压素I1、血管紧缩素A、肾抑制剂、血管生成素-(118-123)、血小板因子4-(58-70)、内皮缩血管肽1-(11-21)、大内皮缩血管肽-(19-37)、胸腺素￠4(16-38)、心血管调节肽-β、alloferonl、皮质抑素29、促吞噬肽、C-反应性蛋白质-(174-185)、CKS17、pseudin2、抗炎肽1、典型的MSH-四肽、原骨胶原类型1、凝血酶受体结合肽、血小板凝集素-1片段、基板糖蛋白质片段、IFN-α受体识别肽1、天青蛋白质片段、valorphin、痛敏肽、α酪蛋白质90_96、β酪啡肽、α_新内啡肽、筋外啡肽A5、筋外啡肽B5、筋外啡肽C、强啡肽Α、α内啡肽、β内啡肽、hemopressin、甘丙素-(1-19)、生长激素抑制素、肾上腺髓质素、膜联蛋白质Al、铃蟾肽、bradikinin增效剂B、bradikinin增效剂C、脱硫的雨娃肽、降I丐素基因相关肽、缩胆囊肽、exendin3、exendin4、acetalin、P物质、促皮质素释放因子、δ啡肽I1、皮啡肽、水蛭蛋白酶抑制剂C、章鱼唾腺精、内吗啡肽1、内吗啡肽I1、GMAP16-41、GIP6-30、毒蜥素、血细胞激肽1、援木蛙肽、促黑激素、肛褶蛙肽、抑咽侧体神经肽、钙蛋白酶抑素-(184-210)、kinogen类凝血酶抑制剂、吻素、LL37、黄峰毒素、神经肽E1、蜂毒肽、吗啡调节肽、α-促黑细胞激素(MSH)、神经内分泌egulatory肽-1/2、神经激肽A/B/C、neurostatin、神经肽FF、神经肽Y、神经降压素、肥胖抑制素、催产素、orphan GPCR SP9155agonist p518、胰抑素、胰腺多肽、肽T、肽YY、泡蛙肽、PACAP_27、pneumadin、催乳素释放肽、心血管调节肽-α、娃皮降压肽、scyliorhinin 1/11、分泌素、P物质、胸腺素ct1、胸腺素β4、胸腺素β 10、trail mimetics、尿皮素I/II/II1、尾加压素1/11、血管加压素、PHM-27、VIP、淀粉不溶素、抗纤维蛋白质polymerant、GHRH、IGF-U IGF-2、RELAXIN-1/2/3、胰岛素样肽_3/4/5/6、富组蛋白_5、碱性抗生胜肽、蛙皮素1、C型利钠肽、vasonatrin、δ睡眠肽诱导肽、α树眼睛蛇毒素、锯鳞蝰素、抵御素1、尿皮素、小心脏活性肽A和B、ceratotoxinA、小脑肽、北非蝎毒素、芋螺升压肽G、α -芋螺毒素El、corazonin、亮氨酸脑啡肽、蛋内啡肽、促性腺素释放素I1、tocinoic acid、促肾上腺皮质激素抑制肽、促肾上腺皮质激素释放因子、肽XY、脑源性酸性成纤维细胞生长因子、脑源性碱性成纤维细胞生长因子、人生长激素、生长激素释放因子、鸟苷素、细胞间粘附分子、HIV抗原肽gpl20、HIV抗原肽I片段(gp41)、HIV抗原肽5、HIV蛋白酶抑制剂、胰岛素样生长因子-1、IGF 1169-84、白细胞介素片段、白细胞介素II片段、白细胞激肽1、白细胞焦激肽、蠕动素、神经肽Y、内啡肽、ras致癌基因相关肽、促红细胞生成素片段、表皮生长因子、转化生长因子、白灰制菌素、神经生长因子、筋外啡肽、豹鳎剂、短杆菌酪肽、肥大细胞脱粒肽、肿瘤坏死因子、RGD肽、促胸腺生成素、速激肽、杀菌肽、任何病毒多肽或使用其中存在丝氨酸/苏氨酸及如果希望，半胱氨酸的半随机引物获得的肽。 所述肽也可为羊毛硫抗生素(的上述突变体)，非羊毛硫抗生素(的突变体)，例如 bavaricin MN、肠球菌素 P(enterocin P)、mesentericin Y105、片球菌素PA-1 (Pediocin PA-1)、萬苣苦索 F(lactacin F)、乳球菌素 G(LactococcinG)、植物乳杆菌菌素EF、植物乳杆菌菌素JK、乳球菌素A、乳球菌素972、植物乳杆菌菌素A、curvacin A、divercinV41、肠球菌素 A (enterocin A)、muntcidin、sakacin P> leukocin A、肉食杆菌素(Carnobacteriocin) B2 > c lost icin574> circular in A、小菌素(microcin) J25、乳酸菌素 A或AS48。所述羊毛硫抗生素或细菌素可包含或不包含它们自己的前导肽。当然，如果它除了上面定义的羊毛硫抗生素前导肽外还包含其自身的前导肽，将被脱水酶识别的前导肽和被修饰的残基之间的距离将变得相对较大。因为这个原因，优选可去除它自身的前导肽，以便在整个多肽构建体中，只存在一个羊毛硫抗生素前导子。在特定情况下，例如，如果自身的前导肽小，例如在circularin A、小菌素J25、乳酸菌素A和AS48的情况，另外的前导序列的存在可能不会消极影响感兴趣的肽的修饰。甚至可设想不同的前导肽(例如羊毛硫抗生素前导肽及细菌素前导肽)的存在是有益的，因为这允许不同的修饰酶的识别和修饰。这里提供的核酸构建体的进一步以将被修饰的编码的肽序列中的3’的存在为特征，这是编码所述跨细胞壁的结构域的序列。这个结构域可跨例如革兰氏阳性宿主细胞的肽聚糖层，并从而确保修饰的氨基酸序列在宿主细胞的细胞表面展示。非常合适的间隔结构域可衍生自或基于乳酸菌的多域细胞膜蛋白酶的跨细胞壁结构域。典型地，所述间隔子结构域包含相似或甚至相同的氨基酸拉伸物的几个重复。在一个实施方式中，所述跨细胞壁结构域包含金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的蛋白质A(PrtA)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)的 prtH、酿胺链球菌(Streptococcus pyogenes)的 scpA 或无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)的csp的跨细胞壁结构域的氨基酸序列，或能够跨在其上展示它们的宿主细胞的细胞壁的其功能类似物或片段(Siezen，1999，乳酸菌的多域细胞膜蛋白酶，A.van Leeuwenhoek76:139-155)的氨基酸序列。在具体的方面,所述核酸构建体仅包括负责跨细胞壁和膜靶定的葡萄球菌蛋白质A或链球菌蛋白质G的编码区(参考，例如Navarre和Schneewind，1999，革兰氏阳性细菌的表面蛋白质和它们靶定到细胞壁膜的机制，Microbiol.Molecul.Biol.Rev.，63:174-229)。跨细胞壁结构域后面为分选酶基序。分选酶，即参与将金黄色葡萄球菌的一些表面蛋白质共价连接到肽聚糖上的酶，在表面蛋白质的展示和在该重要的人类病原体的毒性中起重要的作用(Marraffini 等，2006:Microbiol.Mol.Biol.Rev.70:192-221)。共价连接由被称为“分选酶识别基序”或“分选酶基序”的类别信号决定，该类别信号后面为由约20个氨基酸组成的疏水结构域和正电荷氨基酸尾部组成的疏水域。分选酶基序在本领域中已知，参考(1999)Microbiol Mol Biol Rev63:174 - 229，pmid: 10066836 或US7, 238，489。在许多革兰氏阳性细菌中已经报道了这个机制。最优的基序可取决于将使用的宿主细胞。图1C显示了乳酸乳球菌(A面)和金黄色葡萄球菌N315 (B面)的分选酶基序的共有序列。在一个实施方式中，所述分选酶识别基序包含氨基酸序列LPXTG，其中X可为氨基酸D、E、A、N、Q或K，优选地，其中，所述分选酶识别基序由LPKTG组成。分选酶识别基序后 面为能够跨宿主细胞双层脂膜的疏水结构域，可选择通过间隔子序列连接。跨膜结构域通常具有20至30个氨基酸的长度。优选的残基包括Ala、Pro、Gly、Phe, Leu、lie、Val、Met。在一个实施方式中，所述跨膜结构域包含序列PAFG、FGFL,LGVIV、VIVVIL、ILMGV 和 / 或 GVLGL。在具体的方面，它包含序列 PAFGFLGVIVVILMGVLGL。所述前导构建体的修饰和输出在几个方面高度出人意料:I)这个C端固定化多肽的修饰出人意料。先前没有通过羊毛硫抗生素酶修饰N端或C端固定化肽的报道。该多肽通过接近于C端的疏水部分锚定到膜上。这意味着C端是不游离的，并且肽被固定。在天然乳链菌肽中，有8个位置被脱水，并且安装了 5个环。因此，肽必须沿酶移动，或酶沿着肽移动。由于膜锚定，肽和修饰酶彼此之间移动可被C端固定所阻碍，所以这个修饰出人意料。由于8个脱水的质量峰完全缺失，这与在10%的情况下只有Ser33免于脱水的8倍脱水的天然乳链菌肽形成对比(乳链菌肽的翻译后修饰。NisB参与脱水过程。Karakas Sen A等，Eur J Biochem.1999261:524-32),所以确实发生了阻碍。尽管有这个阻碍，仍出人意料地发生7倍、6倍和5倍的脱水(图7C)。2)由于多肽的长度，输出出人意料。在科学文献中，被羊毛硫抗生素酶修饰的最长的肽为48个氨基酸(通过乳酸乳球菌的含脱氢氨基酸的肽的制备，Rink R等，EnvironMicrobiol.200773:1792 6)。本修饰和输出的构建体的长度为186至210个氨基酸，几乎是截至目前报道的最长的羊毛硫抗生素酶修饰的肽的4倍长。3)输出未被接近于C端的疏水部分阻碍。乳链菌肽前导肽为亲水性，并且如果存在前导肽酶，那么会在培养基中发现前导肽，即该前导肽不会保持附着在膜或细胞壁上。这表明乳链菌肽转运体形成水通道。这与其它信号肽例如sec和tat信号肽相反，这些信号肽具有疏水片段，这样它们保持在膜中。在后面的情况下，需要信号肽酶以将所述转运的肽或蛋白质释放到培养基中。通过使用具有与C端接近的疏水序列的构建体，将预期这种将多肽锚定在膜中的疏水序列阻碍了通过羊毛硫抗生素转运体的转运。令人意外的是，多肽的输出完全没有被疏水膜锚定阻碍，而是通过羊毛硫抗生素转运系统发生。由于识别LPXTG基序的分选酶位于细胞膜的外面，同样出人意料的是，多肽显然为将多肽连接到细胞壁上的分选酶作用的底物。4)完整多肽的输出出人意料地在羊毛硫抗生素转运体、接近于C端的疏水部分和带电荷的C端氨基酸KRKQREE的联合作用下增强。实施例4中清楚的证明，C端的切断导致降解。这可能由允许细胞内肽酶降解多肽阻碍其完整转运的不充分的输出引起的。编码蛋白质底物的C端由用于膜靶定的带电荷的尾部组成。在一个实施方式中，所述带电荷的膜靶定结构域具有至少4个氨基酸残基的长度，优选其中至少50%的残基为带正电荷的氨基酸、更优选为赖氨酸和/或精氨酸残基。融合肽包含一种或多种另外的序列基序可以是有益的。例如，可在元件(b)和(C)之间引入至少一个蛋白水解裂解位点，这样可以在翻译后修饰及表面展示后可释放修饰的肽。有效的裂解位点在本领域中已知，并且包括因子Xa蛋白酶识别位点，如氨基酸序列IEGR0另一方面涉及包含根据本发明的核酸构建体的表达载体。优选地，设计载体以用于在革兰氏阳性宿主细胞中表达所述构建体。例如，该载体包含一个或多个以下元件:可诱导的NisA启动子、乳链菌肽前导肽、乳链菌肽和乳酸乳球菌PrtP蛋白酶的LPXTG细胞壁锚定基序的序列。还包括革兰氏阳性宿主细胞，所述革兰氏阳性宿主细胞包含这样的表达载体并能够将所述感兴趣的多肽翻译 后修饰为含脱氢残基或硫醚桥的多肽。所述宿主细胞为，例如乳酸菌，优选地选自包含相关的羊毛硫抗生素生物合成酶和转运体，例如NisB、C、T或SpaB、C、T 的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)、化胺性链球菌(Streptococcus pyogenes)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermis)、鸡葡萄球菌(Staphylococcus gallinarium)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、变形链球菌(Streptococcus mutans)、瓦氏葡萄球菌(Staphylococcus warneri)、唾液链球菌(Streptococcus salivarius)、清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)、胚牙乳杆菌(Lactobacillus piantarum)> 鱼肉杆菌(Carnobacterium piscicola)、幾肠球菌(Enterococcus faecalis)、变异微球菌(Micrococcus varians)、链霉菌0H-4156 (Streptomyces 0H-4156)、肉桂地链霉菌(Streptomyces cinnamoneus)、灰藤黄链霉菌(Streptomyces griseoluteus)、溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibrio fibriosolvens)、同八丈岛链轮丝菌(Streptoverticillium hachijoense)、Actinoplanes linguriae、活泼瘤胃球菌(Ruminococcus gnavus)、马其顿链球菌(Streptococcus macedonicus)、波比斯链球菌(Streptococcus bovis)。特别感兴趣的是包含多个根据本发明的宿主细胞的宿主细胞文库，其中，所述文库的每种细胞都在其细胞表面展示不同的含脱氢残基或硫醚桥的多肽。这个文库非常利于用于筛选新型有用的环肽，如新型环状亲和标签、例如肽药物的环状生物活性肽、受体配体、环状抑制肽。有利地，文库的构建包含在包括核苷酸的混合物的寡核苷酸合成中在每个位置整合的简并密码子的使用。例如，整套标准氨基酸用NNK或NNS密码子编码，其中N为A、T、C或G，并且K=G或T，且S=C或G，因而排除了 TAA或TGA终止密码子。表达候选亲和标签的宿主细胞可与固定结合配体接触以选择高亲和度结合序列。因此，还提供了用于识别能够结合到感兴趣的靶实体的含脱氢残基或硫醚的多肽的方法，所述方法包括步骤:(a)提供上述文库；(b)从所述文库选择至少一种展示能够结合到感兴趣的靶实体的含脱氢残基或硫醚的多肽的宿主细胞；和(c)识别在所述至少一种选定的宿主细胞上展示的多肽序列。在具体的方面，所述文库包含多个候选环状亲和标签序列，例如环状链霉亲和素标签(Strep标签)的变体。提供了识别能够结合到生物素的包含硫醚桥的环状链霉亲和素标签(Strep标签)的方法，所述方法包含步骤:(a)提供包含多个含有根据本发明的表达载体并能够将感兴趣的多肽翻译后修饰成含硫醚桥的多肽的革兰氏阳性宿主细胞的文库，其中，所述多肽包含氨基酸序列Ser/Thr-(Xaa)n-Cys或Cys-(Xaa)n_Ser/Thr,其中Xaa为任何氨基酸，并且η为I至5，优选η为3 ; (b)用固定化链霉亲和素从所述文库中选择至少一种展示链霉亲和素(Strep标签)具有亲和度的硫醚桥肽的宿主细胞；和(c)识别在所述至少一种选定的宿主细胞上展示的多肽序列。例如，两轮使用涂布链霉亲和素的磁珠的磁选(MACS)后，所选择的细菌可被放在板上(plated)用于分析。宿主细胞也可被用作用于评估羊毛硫抗生素生物合成酶和/或转运体活性的报告系统，其中，含硫醚桥的肽的有效细胞表面表达仅用作读出。可通过本领域中已知的方法检测细胞表面表达，包括抗 体检测和固定到固体载体上。
MJA:本研究中使用的展示载体的遗传组织。PnisA，乳链菌肽可诱导启动子；前导子，乳链菌肽前导肽；NisA，乳链菌肽前体编码序列；FXa，因子Xa识别位点；Strep-标签，链霉亲和素识别序列；3C，人鼻病毒蛋白酶识别序列。乳酸乳球菌PrtP蛋白酶的细胞壁间隔子和细胞壁锚(cell wall anchor)(氨基酸1789 1912)。(a)N端羊毛硫抗生素前导序列；(b)将被翻译后修饰成含脱氢残基或硫醚桥的多肽的感兴趣的氨基酸序列；(C)亲水跨细胞壁结构域；(d)分选酶识别基序；(e)跨疏水膜的结构域；和(f)C端带电荷的膜靶定结构域。相应的(多)肽产物被称作相同的名字，没有前面的“P”。SIB:截短的PTB5变体的遗传组织。aa##表示乳酸乳球菌PrtP蛋白酶的细胞壁锚的氨基酸数目。(a) N端羊毛硫抗生素前导序列；(b)将被翻译后修饰成含脱氢残基或硫醚桥的多肽的感兴趣的氨基酸序列；(C)亲水跨细胞壁结构域；(d)分选酶识别基序；(e)疏水的跨膜结构域；和(f) C端带电荷的膜锚定结构域。图1C:LPXTG基序的共有序列。上面:乳酸乳球菌的共有序列；下面:金黄色匍萄球菌N315的共有序列。M2:融合肽构建体的表达。A)考马斯亮蓝染色12%SDS_PAA凝胶和B)用抗乳链菌肽前导抗体对乳酸乳球菌NZ9000的细胞提取物的免疫印迹，其中所述细胞提取物具有质粒:1，ρΤΒ5，未诱导;2，pTB5 诱导；3，pTB5/pIL3BTC，未诱导；4，pTB5/pIL3BTC，诱导。:融合肽构建体的细胞表面位置。在乳酸乳球菌NZ9000细胞上进行全细胞ELISA以用于检测表面展示的乳链菌肽前体锚定融合蛋白。允许兔子抗-乳链菌肽前导抗体结合到展示TB5的乳酸乳球菌细胞上。加入与山羊抗兔子IgG共轭的碱性磷酸酶，并通过加入对硝基苯基磷酸盐产生颜色。白色条，未诱导的细胞；灰色条，诱导的细胞。M4.在细胞表面展示修饰的乳链菌肽前体。AB面:对两个具有或不具有修饰的酶的乳酸乳球菌NZ9000的细胞提取物的SDS-PAA凝胶平行分析。1，ρΤΒ5，未诱导；2，pTB5，诱导；3，pTB5/pIL3BTC，未诱导；4，pTB5/pIL3BTC，诱导；5，乳链菌肽前体。A)面:考马斯亮蓝染色12%SDS-PAA凝胶。B)面:用0.lmg/ml的胰蛋白酶覆盖的对乳链菌肽敏感的乳酸乳球菌NZ9000菌株的12%SDS-PAA凝胶。在诱导依赖的考马斯亮蓝染色蛋白条带的位点的凝胶B的泳道4的亮点证明融合蛋白的乳链菌肽前体部分被NisB和NisC修饰。C面):对展示活性乳链菌肽的乳酸乳球菌细胞的分析，其中所述乳酸乳球菌细胞具有含胰蛋白酶的对乳链菌肽敏感的乳酸乳球菌NZ9000菌株的覆盖培养物(左面)，或具有用NisP生产的乳酸乳球菌菌株(右面)。NisP特异性切割产生活性乳链菌肽的乳链菌肽前导子。看作亮点的(图C中白色圆圈/边缘)该菌株的生长抑制清楚地证明了 NisB和NisC正确地修饰乳链菌肽前体，并至少形成TB5的环A、B和C (图4C中的TB5表示为N15)。Ml.NisBC修饰的cAng-(l-7)的细胞表面展示。A:用于检测表面展示的前导血管紧缩素(1-7)融合蛋白的在乳酸乳球菌NZ9000细胞上的全细胞ELISA。允许兔子抗-乳链菌肽前导抗体结合到展示TB2的乳酸乳球菌细胞。加入与山羊抗兔子IgG共轭的碱性磷酸酶，并通过加入对硝基苯基磷酸盐产生颜色。白色条，未诱导的细胞；灰色条，诱导的细胞。B:考马斯亮蓝染色12%SDS_PAA凝胶，以及用抗环状血管紧缩素(1_7)抗体对乳酸乳球菌NZ9000的全蛋白提取物的免疫印迹分析，其中所述全蛋白提取物具有质粒:泳道1，pTB2 ;泳道 2，pTB2 和 pIL3BTC。C:硫醚桥血管紧缩素(1-7)锚定融合肽TB3的MALD1-T0F光谱显示单个脱水。示意性显示相关的肽片段(STKDFNLDLVSVSKKDSGASPRIEGRDRVSIHCGGGWSHPQFEKEALFQ)。5398.83 的质量峰对应于单个脱水N端TB3片段。D =MALD1-TOf光谱显示没有CDAP加到硫醚桥血管紧缩素(1_7)锚定融合肽TB3中。上面两个图显示了对照肽25Da的清楚的质量偏移，这表明有CDAP加入到该肽中。未发现TB3的质量偏移(下面两个图)，表明无游离半胱氨酸残基，并且因此证明了 TB3中硫醚桥的存在。M6:乳链菌肽锚定融合肽TBl的MALD1-T0F光谱。A)纯化的TBl。B)用胰蛋白酶处理的纯化的TB1。C)更详细的B中的盒状区域。TBl的乳链菌肽部分。脱水的数目表示为-7、-6等。D)用胰蛋白酶处理的乳酸乳球菌NZ9000(pIL3BTC/pNZe3)的上清液。脱水的数目表示为_8、-7等。在图A和图B中，示意性显示了相关肽的片段。Ml:结合肽RND-X3-1的选定的链霉亲和素的展示pRND-X3-l示于图1A中。在与生物素共培养或不与生物素共培养的展示RND_X3_1的乳酸乳球菌NZ9000 (pIL3BTC)上进行全细胞ELISA。用以ABTS/H202作为底物溶液的与HRP共轭的链霉亲和素检测展示的肽。在多于3次的独立实验中重复实验，差异< 15%。
M8:对加入1-氰基-4- 二甲基氨基吡啶嗡四氟硼酸盐(CDAP)的链霉亲和素选择的硫醚桥肽(参看实施例7)的MALD1-TOF的光谱分析。为了分析，将转译终止子插入PRND-X3-1中的肽和锚定序列之间(图1A)，并将所得质粒称为pTB9 (图1A)。终止密码子前面的N端部分因而编码融合到可修饰的肽ISNMVCNMKTATCHCSIHVSK的乳链菌肽前导肽MSTKDFNLDLVSVSKKDSGASPR。将包含具有终止密码子的编码该构建体的质粒pTB9和包含PIL3BTC的细胞的生长培养基涂到MALDI靶板上，并通过Maldi TOF分析。具有包含游离半胱氨酸的对照肽的对照实验显示对照肽的25Da的清楚的质量偏移，这表示有CDAP加入到对照肽。该实验显示产生了 4572.94Da质量的肽，这对应于4倍脱水肽(无N端甲硫氨酸的理论平均质量:4570.346Da)。很可能，在该乳链菌肽相关肽中的倒数第二个丝氨酸未脱水，这与在乳链菌肽自身中的Ser29情况类似。在CDAP的存在下，没有发现选定的TB9肽的25Da的质量偏移，表明游离半胱氨酸的缺失，并且因而证明硫醚桥的存在。
具体实施例方式实施例1:用于含硫醚和脱氢残基的肽在乳酸乳球菌上的细胞表面展示的表达载体I遍:该实施例是关于用于含硫醚的肽在乳酸乳球菌的表面展示的表达载体的构建。所述乳酸乳球菌宿主有机体提供用于在期望的肽及其输出物中引入硫醚连接的乳链菌肽生物合成和输出装置。所述肽被转译融合到LPXTG细胞壁锚定基序中，例如，乳酸乳球菌PrtP蛋白酶。这个锚定机制需要用于将肽共价锚定到细菌细胞壁的肽聚糖上的分选酶的加工。这样，肽和编码的DNA被连接，允许选择/筛选具有期望性质的翻译后修饰肽。乳链菌肽将用作用于展示系统的开发和验证的模型肽。材料和方法通过PCR将乳酸乳球菌PrtP蛋白酶的LPXTG细胞壁锚定基序转译融合到pNZE3中的nisA基因上，pNZE3为乳酸乳球菌表达载体pNG8048的衍生物。所述展示载体的相关部分包含可诱导NisA启动子、乳链菌肽前导肽、乳链菌肽和乳酸乳球菌PrtP蛋白酶的LPXTG细胞壁锚定基序的 序列(图2A)。将展示载体电穿孔到乳酸乳球菌NZ9000(pIL3BTC)中。后者提供乳链菌肽生物合成酶Ni SB、Ni SC和转运体NisT。通过SDS-PAGE和用抗乳链菌肽前导的抗体的免疫印迹(Western blotting)分析乳链菌肽锚定蛋白的制备。结里在NisA启动子控制下用正确的乳链菌肽锚定序列构建乳酸乳球菌展示载体。该展示载体被命名为PTB5。使乳酸乳球菌NZ9000(pIL3BTC/pTB5)细胞在乳链菌肽的存在或缺失下生长以允许产生TB5。将等量的细胞用溶菌酶消化并溶解于SDS-PAGE样品缓冲液中。通过SDS-PAGE分离细胞提取物中的蛋白质，并用考马斯亮蓝染色显示(图2，左面)。对来自非诱导和诱导的培养基中的细胞培养物的比较显示在诱导的培养基中存在约26至28kDa的蛋白质条带。用抗乳链菌肽前导的抗体的免疫印迹分析证明该蛋白质为乳链菌肽锚定融合蛋白TB5，如通过强免疫反应信号所看到的那样(图2，右面)。观测到的TB5的分子量不同于理论计算的分子量18kDa。该迁移差异最可能由于肽聚糖片段对TB5的共价附着。在非诱导的培养基中的可测量但不那么强的免疫反应信号是由于乳链菌肽启动子的少量泄露。总之，当用乳链菌肽诱导时，包含构建体的展示载体PTB5的乳酸乳球菌细胞引发TB5的产生。实施例2:抗前导肽的抗体证明附着乳链菌肽前体靶定融合蛋白TB5的细胞壁的细胞表面位置。MM:用使用抗乳链菌肽前导肽的全细胞ELISA评估在乳酸乳球菌的细胞表面的
TB5的展示
_5] 材料和方法在存在或不存在乳链菌肽的情况下培养乳酸乳球菌NZ9000(pTB5)和乳酸乳球菌NZ9000(pIL3BTC/pTB5)细胞以诱导TB5。制备后，通过离心收集生产的细胞后，用pH7.4的磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)洗三次。在室温下，在搅拌下，将等量的展示TB5的细胞用含
0.5%BSA最终体积为Iml的PBS中的1000倍稀释的兔子抗乳链菌肽前导抗体溶液培养I小时。用PBS洗三次后，通过使用与碱性磷酸酶共轭的山羊抗兔子IgG(l: 10000)和作为底物的对硝基苯基磷酸盐(0.5mg/ml)培养来显示所展示的TB5。在410nm确定吸光率，该吸光率用于测量所展示的TB5的量。结果结果被总结于图3中，该结果显示了诱导的乳酸乳球菌NZ9000(pIL3BTC/pTB5)细胞的阳性颜色反应。未诱导的乳酸 乳球菌培养看到较低水平的颜色响应。这证明在乳酸乳球菌的细胞表面可获得乳链菌肽前导子。实施例3:在细胞表面展示前，已经用NisB和NisC细胞内修饰了乳链菌肽前体靶定融合蛋白。通过在前导肽裂解后的对重叠细胞的抗菌活性证明通过NisB-和NisC-修饰的乳链菌肽前体锚定融合蛋白的修饰。I遍:实施例2显示TB5的产生导致乳链菌肽前体在乳酸乳球菌细胞表面的展示。在这个实施例中，用对乳链菌肽敏感的乳酸乳球菌菌株的覆盖层评估通过NisB和NisC的乳链菌肽修饰。对该菌株的生长抑制表明NisB和NisC正确地修饰了 TB5并至少形成了环A、B 和 C。材料和方法用在含0.lmg/ml胰蛋白酶的0.5%顶层琼脂中的200倍稀释的乳酸乳球菌MG1363或NZ9000菌株覆盖具有充分清洗的SDS-PAA凝胶或产生pTB5的乳酸乳球菌NZ9000细胞的菌斑的GM17琼脂板。需要胰蛋白酶用于裂解产生活性乳链菌肽的乳链菌肽前导子。琼脂板在30°C下过夜培养。结果图4显示了对来自具有或不具有修饰的酶的乳酸乳球菌NZ9000的细胞提取物的两个相似的SDS-PAA凝胶分析。考马斯亮蓝染色凝胶(图4A)显示在诱导培养基中产生TB5，与修饰的酶的存在无关。只有TB5/BTC抑制了菌株的生长，表现为覆盖层中的空带(亮点)(图4B)。这表明NisB和NisC正确地修饰产生活性乳链菌肽的TB5。在全细胞上的重叠分析获得相似的结果(图4C)。在包含修饰和(en)转运酶的产生TB5的乳酸乳球菌细胞中发现活性乳链菌肽。由于乳链菌肽前导子只能接触来自外部的胰蛋白酶，因此在乳酸乳球菌细胞表面展示活性乳链菌肽。此外，用NisP对乳链菌肽前导子特异性裂解导致了生长抑制，这暗示固定化乳链菌肽仍然为抗菌活性。总之，由于在SDS-PAA凝胶的覆盖层中和全细胞中用乳链菌肽敏感菌株观测到了活性的乳链菌肽，因此NisB和NisC正确地修饰了乳链菌肽锚定融合蛋白TB5。因此，TB5的锚定部分提供了用于将TB5共价附着到肽聚糖层的信号，从而在乳酸乳球菌细胞表面展示活性乳链菌肽。实施例4 =NisB和NisC修饰肽的稳定展示需要完整的膜锚定MM:释放截短的乳链菌肽前体锚定构建体以促进质谱分析。通186 个氨基酸的完整蛋白质:MSTKDFNLDLVSVSKKDSGASPRITSISLCTPGCKTGALMGCNMKTATCHCSIHVSKIEGRGQSLKTKVAAAVEAAKTVGKGDGTTGTSDKGGGQGTPAPAP⑶IGKDKGDEGSQPSSGGNIPTNPATTTSTSTDDTTDRNGQLTSGKGALPKTGETTERPAFGFLGVIVVILMGVLGLKRKQREE参照图1B制备4个截短的变体:pTB5-trl带电荷膜尾部(KRKQREE)的直接上游(immediatelyupstream)MSTKDFNLDLVSVSKKDSGASPRITSISLCTPGCKTGALMGCNMKTATCHCSIHVSKIEGRGQSLKTKVAAAVEAAKTVGKGDGTTGTSDKGGGQGTPAPAP⑶IGKDKGDEGSQPSSGGNIPTNPATTTSTSTDDTTDRNGQLTSGKGALPKTGETTERPAFGFLGVIVVILMGVLGL179氨基酸pTB5~tr2LPKTG序列的直接上游MSTKDFNLDLVSVSKKDSGASPRITSISLCTPGCKTGALMGCNMKTATCHCSIHVSKIEGRGQSLKTKVAAAVEAAKTVGKGDGTTGTSDKGGGQGTPAPAP⑶IGKDKGDEGSQPSSGGNIPTNPATTTSTSTDDTTDRNGQLTSGKGA150氨基酸pTB5~tr3MSTKDFNLDLVSVSKKDSGASPRITSISLCTPGCKTGALMGCNMKTATCHCSIHVSKIEGRGQSLKTKVAAAVEAAKTVGKGDGTTGTSDKGGGQGTPAPAP⑶I105氨基酸pTB5~tr4MSTKDFNLDLVSVSKKDSGASPRITSISLCTPGCKTGALMGCNMKTATCHCSIHVSKIEGRGQSLKTKVAAAVEAAKTVGKGDGT85氨基酸
表达了截短的乳链菌肽前体锚定TB5变体。通过TCA沉淀来沉淀在上清液中的肽并在SDS PAGE上分析所述肽。MS-杀菌活性对于截短的变体2、3和4，上清液似乎对指示菌株MG1363的生长有影响。这表明肽被修饰和释放。关于这些变体还存在一些自体诱导。没有发现与截短的变体I相关的生长抑制。该变体包括跨膜的膜部分，并且可能至少在很大程度上保持与细胞相关。在SDS PAA凝胶上，观察到一个与所有截短的变体相同迁移的条带。这个肽的带似乎以乳链菌肽的分子量迁移。如在考马斯亮蓝染色的SDS-PAA凝胶中显示的一样，在TCA沉淀的上清液中，观察到单个肽的条带。叠加分析证明该肽抑制了指示菌株的生长。当截短的肽更短时，产生更多的该乳链菌肽条带(数据未显示)。
TB5的锚定部分稳定了 TB5乳链菌肽前体锚定融合蛋白。缺少该部分时，出现降解，并且释放活性的乳链菌肽。实施例5:环状血管紧缩素类似物的表面展示MM:证明血管紧缩素(1-7)的表面展示和修饰。用全细胞ELISA评估表面展示。用抗环状血管紧缩素(1-7)的特异性抗体证明血管紧缩素(1-7)的修饰，其中将钥孔虫戚血蓝蛋白质(KLH)作为载体蛋白质。材料和方法将血管紧缩素(1-7)的编码序列(DRVSHIC)转译融合到乳链菌肽前导肽序列中，用因子Xa识别序列(IEGR)隔开。这产生了血管紧缩素(1-7)表面展示载体pTB2(图1A)。在具有或不具有TB2的诱导下培养具有pTB2的乳酸乳球菌NZ9000和NZ9000 (pIL3BTC)细胞。收集来自这些生产培养基的细胞，用PBS清洗，并最终在PBS中再次悬浮直至0D_ 20至30。如实施例2中所说明的那样进行全细胞ELISA。此外，通过SDS-PAGE和抗环状血管紧缩素(1_7)抗体免疫印迹分析前导肽血管紧缩素(1-7)锚定蛋白的生产。MS来自诱导培养基的细胞对修饰的TB2及未修饰的TB2都产生阳性颜色反应(图5A)。这证明前导肽可由外部接近，并且因此在乳酸乳球菌的细胞表面展示血管紧缩素(1-7)。 对来自展示TB2的乳酸乳球菌细胞的细胞提取物的SDS-PAGE分析清楚地显示蛋白质条带迁移至大约24.9kDa的标记条带。用抗环状血管紧缩素(1-7)抗体的免疫印迹识别该蛋白质条带为TB2 (图5B)。用KLH作为载体蛋白质，在小鼠中用纯化的环状血管紧缩素(1-7)培养所使用的环状血管紧缩素(1-7)抗体。在标准的ELISA中，该抗体对环状血管紧缩素(1-7)的特异性是其线状等价物的至少IO4倍。因此，抗环状血管紧缩素(1-7)抗体特异性识别修饰的血管紧缩素(1-7)。免疫印迹清楚地显示了抗环状血管紧缩素(1-7)抗体对修饰的TB2的免疫反应信号(图5B，泳道2)，而对于未修饰的TB2未发现信号(图5B，泳道I)。这表明展示的血管紧缩素(1-7)被NisB和NisC修饰。Maldi TOF分析显示展示的血管紧缩素(1-7)为脱水的(图5C)和环化的(图OT)。实施例6:修饰的TB I的质谱分析MM:通过MALD1-T0F分析证明TBl内乳链菌肽的修饰材料和方法构建乳酸乳球菌表面展示载体以促进纯化和分析。质粒pTBl编码人鼻病毒3C蛋白酶识别序列(PreScission蛋白酶，GE Healthcare),以便从乳酸乳球菌细胞表面的释放编码前导肽的N端部分、乳链菌肽和Str印标签II。为了纯化的目的加入Str印标签II序列。在冰上用16%的三氯乙酸提取展示TBl的乳酸乳球菌NZ9000细胞30分钟。用Iml的丙酮洗细胞两次，在高速真空中干燥，并在pH8.0下在0.25ml的IOmM Tris-HCl,ImM EDTA、lmg溶菌酶和0.1mg变溶菌素中再悬浮。在37°C进行细胞壁消化I小时。离心收集细胞，用PBS洗两次。将细胞在Iml的PreScission蛋白酶裂解缓冲液(50mMTris-HCl,pH7.0, 150mM NaCl, ImM EDTA, ImM DTT)中用 40UPreScission 蛋白酶(GEHealthcare)再悬浮,并在搅拌下于4°C培养24至48小时。用蛋白酶消化后,收集上清液,并根据生产商的操作指南用Strep-tactin离心柱纯化试剂盒(IBA，GmbH)纯化TBl肽的str印标签的N端部分。用10%TCA沉淀洗出液中的肽，并将其溶于水中。在线性模型中用Voyager DE PRO基质辅助激光解析电离飞行时间(MALD1-T0F)质谱记录质谱。益果通过MALD1-T0F分析纯化的TBl的N端部分(图6)。图6A中的光谱显示在7975Da附近的质量峰，这相应于在图中示意性指出的全长N端TBl部分。当用胰蛋白酶处理样品时，该峰消失，而在3389Da附近出现质量峰(图6B)。后一个质量峰对应于TBl的乳链菌肽部分。由于该片段免受胰蛋白酶的消化，该片段出现的事实已经证明乳链菌肽的修饰。图6C显示对来自TBl的乳链菌肽质量峰的更详细分析。在TBl乳链菌肽光谱中清楚地出现至少7倍和6倍的脱水峰。与分泌的乳链菌肽相比，缺少了 8倍的脱水峰(图6D)。益论:这些数据证明TBl内的乳链菌肽被修饰并包含至少7个脱水。实施例7:目标:通过展示和筛选选择链霉亲和素结合肽材料和方法
为证明展示和筛选的原理的证据，以从包含ISXXXCNMKTATCHCSIHVSK的文库中选择链霉亲和素结合肽为目的进行实验，其中，X为任何氨基酸。将丝氨酸和半胱氨酸放在三个随机的氨基酸两侧，这样允许酶催化的丝氨酸脱水及环化酶催化将产生的脱氢丙氨酸与半胱氨酸耦合。在文库构建中使用NNS密码子允许所有可能的氨基酸位于丝氨酸和半胱氨酸之间的每个位点上，产生理论上8000个变体的蛋白质多样性的文库。估计的文库大小为约11000独立的克隆。编码该乳酸乳球菌硫醚肽展示文库的构建体被称为PRND-X3 (图W。我们筛选文库中的链霉亲和素结合体(binder)。两轮使用涂布链霉亲和素的磁珠的磁选(MACS)后,将选定的细菌放在板上用于分析。益果对选定的克隆的专门分析产生一个单一的序列:S-MNV-C(pRND-X3-1)，已知其为二硫桥基序而非硫醚环化基序。在所分析的选定的肽中序列变异的缺失可能是由于与对链霉亲和素结合的需要相结合的硫醚桥所施加的构象限制。展示这种含MNV的多肽的乳酸乳球菌细胞在全细胞ELISA中产生阳性颜色反应，从而提供与链霉亲和素的结合。此外，在生物素的存在下无结合，证明对生物素结合位点的特异性(图7)。用Maldi TOF的分析揭示CDAP没有添加到含MNV的肽中，这排出了未修饰的半胱氨酸的存在，从而证明存在硫醚桥(图8)。因此，从乳酸乳球菌硫醚肽展示文库可以容易地选择对链霉亲和素具有亲和性的硫醚桥肽。结论:可从细胞表面展示的硫醚桥肽的乳酸乳球菌文库中成功地筛选特异性配体。
权利要求
1.一种编码融合肽的分离的核酸构建体，所述融合肽从N端到C端至少包含以下序列元件: (a)N端羊毛硫抗生素前导序列； (b)将被翻译后修饰成含脱氢残基或硫醚桥的多肽的感兴趣的氨基酸序列； (C)亲水跨细胞壁结构域； (d)分选酶识别基序； (e)疏水跨I吴结构域；和 (f)C端带电荷的膜锚定结构域。
2.根据权利要求1所述的核酸构建体，其中，所述羊毛硫抗生素前导序列为乳链菌肽前导序列。
3.根据权利要求1或2所述的核酸构建体，其中，所述跨细胞壁结构域衍生自乳酸菌的多域细胞膜蛋白酶的跨细胞壁结构域。
4.根据权利要求3所述的核酸构建体，其中，所述跨细胞壁结构域包含瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)的 prtH、乳酸乳球菌(Lactococcus Iactis)的 prtP、化胺性链球菌(Streptococcus pyogenes)的 scpA或无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)的csp的跨细胞壁结构域的氨基酸序列或它们的功能类似物或片段。
5.根据前述任一项权利要求所述的核酸构建体，其中，所述分选酶识别基序包含氨基酸序列LPXTG，其中X可为氨基酸D、E、A、N、Q或K，优选地，其中所述分选酶识别基序由LPKTG组成。
6.根据前述任一项权利要求所述的核酸构建体，其中，所述疏水跨膜结构域具有20至30个氨基酸的长度。
7.根据前述任一项权利要求所述的核酸构建体，其中，所述带电荷的膜锚定结构域具有至少四个氨基酸残基的长度，优选地，其中，至少50%的所述残基为带正电荷氨基酸，更优选赖氨酸和/或精氨酸残基。
8.根据前述任一项权利要求所述的核酸构建体，其中，所述蛋白质物质在元件(a)和(b)之间和/或元件(b)和(c)之间进一步包含至少一个蛋白水解裂解位点。
9.根据权利要求8所述的核酸构建体，在元件(a)和(b)之间包含因子Xa蛋白酶识别位点，优选氨基酸序列IEGR。
10.根据权利要求8或9所述的核酸构建体，在元件(b)和(c)之间包含人鼻病毒3C蛋白酶识别位点，优选氨基酸序列EALFQGP。
11.根据前述任一项 权利要求所述的核酸构建体，其中，所述感兴趣的氨基酸序列为治疗相关的肽，优选地选自由激素、酶抑制剂、酶活化剂、受体配体、抑制肽、羊毛硫抗生素蛋白和病毒蛋白组成的组中。
12.—种表达载体，包含根据权利要求1至11的任一项所述的核酸。
13.—种革兰氏阳性宿主细胞，包含根据权利要求12所述的表达载体，并能够将所述感兴趣的多肽翻译后修饰为含脱氢残基或硫醚桥的多肽。
14.根据权利要求13所述的宿主细胞，为乳酸菌，优选地选自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)、化胺性链球菌(Streptococcus pyogenes)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermis)、鸡葡萄球菌(Staphylococcus gallinarium)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、变形链球菌(Streptococcus mutans)、瓦氏葡萄球菌(Staphylococcus warneri)、唾液链球菌(Streptococcus salivarius)、清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)、胚牙乳杆菌(Lactobacillus piantarum)Λ 鱼肉杆菌(Carnobacterium piscicola)、类肠球菌(Enterococcus faecalis)、变异微球菌(Micrococcus varians)、链霉菌OH-4156 (Streptomyces 0H-4156)、肉桂地链霉菌(Streptomyces cinnamoneus)、灰藤黄链霉菌(Streptomyces griseoluteus)、溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibrio f ibriosolvens)、同八丈岛链轮丝菌(Streptoverticillium hachijoense)、Actinoplanes linguriae、活泼瘤胃球菌(Ruminococcus gnavus)、马其顿链球菌(Streptococcus macedonicus)、波比斯链球菌(Streptococcus bovis)。
15.—种宿主细胞文库，包含多个根据权利要求13或14所述的宿主细胞，其中，所述文库的每个成员在它的细胞表面展示不同的含脱氢残基或硫醚桥的多肽。
16.—种鉴定能够结合到感兴趣的靶实体上的含脱氢残基或硫醚的多肽的方法，所述方法包含步骤: (a)提供根据权利要求15的文库； (b)从所述文库选择展示能够结合到所述感兴趣的靶实体上的含脱氢残基或硫醚桥的多肽的至少一种宿主细胞；和 (c)识别在至少一种选择的所述宿主细胞上展示的所述多肽序列。
17.根据权利要求13或14的宿主细胞作为用于评估羊毛硫抗生素生物合成酶和/或转运活性的报告系统的 用途。
全文摘要
本发明涉及翻译后修饰的异源性蛋白的细菌细胞表面展示。提供了分离的编码蛋白质物质的核酸构建体，所述蛋白质物质从N端至C端包含至少(a)N端羊毛硫抗生素前导序列；(b)将被翻译后修饰成含脱氢残基或硫醚桥的多肽的感兴趣的氨基酸序列；(c)亲水跨细胞壁结构域；(d)分选酶识别基序；(e)疏水跨膜结构域；和(f)C端带电荷的膜锚定结构域。还提供了表达所述构建体的革兰氏阳性宿主细胞及宿主细胞的文库。
文档编号C12N15/62GK103080318SQ201180042020
公开日2013年5月1日 申请日期2011年7月6日 优先权日2010年7月6日
发明者芝贝·博斯姆 申请人:兰提欧派普有限公司
技术领域：
本发明涉及蛋白质工程和筛选治疗性相关肽的领域。更具体地，涉及翻译后修饰的异源性蛋白质的细胞表面展示。在微生物(例如细菌)表面的蛋白质或肽的异源展示是有用的研究手段，并已经与宽范围的有趣的应用相关联。将蛋白质或肽功能与编码的基因相连接能够从大的组合的文库中筛选和/或最优化具有期望性质的肽。已经开发了多种展示形式，包括核糖体展示、噬菌体展示、细菌表面展示和酵母展示。噬菌体展示或许是最为熟知的系统。
背景技术：
细胞表面展示的一个最有趣的应用是从大文库中选择对感兴趣的治疗性的靶分子高亲合的配体。迄今，只展示过线性肽、二硫键连接的环肽和与有机核耦合的肽。这导致了多种有用的肽的鉴定，包括治疗有效性(前导)肽。然而，已经认识到这些肽对蛋白质水解的敏感性和不稳定性为其治疗应用的主要缺点。转译后向肽中引入环状结构，例如硫醚交联，可避免这些稳定性问题。然而，目前，仍然难于有效地将这样的结构引入到合成肽中，尤其是大的肽中。
发明内容
本发明旨在提供允许脱氢氨基酸和或含硫醚肽的细胞表面展示的新型展示系统。为此，构建了独特的重组核酸构建体，其编码融合肽，所述融合肽除了包含将被环化的肽序列外，还包含特异性功能元件的组合。惊奇地发现环状结构易于被表达所述构建体并包含用于抗生素的生物合成和输出的装置的宿主细胞，例如乳酸菌(Lactococcus lactis)的表面制造或展示。更具体地，本发明提供了编码融合肽的分离的核酸序列，所述融合肽从N端到C端至少包含如下元件:(a) N端羊毛硫抗生素前导序列(b)将被翻译后修饰成含脱氢残基或硫醚的多肽的感兴趣的氨基酸序列(c)亲水跨细胞壁结构域(d)分选酶识别基序(e)疏水跨膜结构域(f)C端带电荷的膜锚定结构域。本发明的其它方面涉及包括所述分离的核酸的表达载体、包括所述表达载体的宿主细胞和包括多个宿主细胞的宿主细胞文库。本发明还可应用于生产表达含脱氢残基的肽的宿主细胞(的文库)。所述特异性核酸构建体允许开发同时用于编码的肽的转译后酶修饰及修饰的(环化)肽的展示的细菌宿主细胞。本领域中已知的其它展示系统如噬菌体展示理论上可适于表达和展示可被化学手段环化 的肽，例如二硫桥肽的碱辅助脱硫(Galande等，2003Biopolymers71，534-551)。然而，观察到碱性环境严重地减小了噬菌体的存活率和感染性。相反，本发明允许使用高度有活力的革兰氏阳性宿主细胞，尤其是乳酸菌，所述宿主细胞可例如在筛选期间抵抗严酷环境。此外，通过化学手段的环封闭不是立体和区域特异的；具有形成二硫键桥的两个L-Cys残基的特定的肽将产生3种非对映的含羊毛硫氨酸的肽的混合物，羊毛硫氨酸的的构型为LL、LD和DL。相反，羊毛硫氨酸酶装置只产生DL-立体异构体，并且在多个环的情况下，只有一个环模式。此外，不需要进行具有不确定的产率的使成本上升的反应步骤；修饰和展示全部为细菌系统所固有。再进一步，(乳酸)细菌的尺寸足够大以使用FACS分析来筛选。已经说明羊毛硫抗生素合成酶在膜结合复合物中被组织(Siegers等，1996.J.Biol.Chem.271，12294-12301 ；Kiesau 等，1997.J.Bacteriol.179，1475-1481 ；Sahl 等1998.Annu.Rev.Microbiol.52:41-7)。这个复合物由羊毛硫抗生素转运体(LanT)、脱水酶(dehydrating enzyme) (LanB,也称为脱水酶(dehydratase))和环化酶(LanC)组成。在一些羊毛硫抗生素的情况中，由双官能酶(LanM)进行脱水和环化步骤。在核糖体中合成的前多肽原的N端羊毛硫抗生素的前导序列为羊毛硫抗生素酶的识别序列，开始于脱水酶或同时进行脱水和环化的酶。认为所述前导序列结合到所述羊毛硫抗生素复合体上以使所述前多肽原接近所述羊毛硫抗生素酶。所述酶复合体暗示所述脱水和环化酶需要附着到转运体上，否则羊毛硫抗生素前多肽原将不经修饰被输出，或者修饰的肽将在细胞内聚集。在多数情况下，羊毛硫抗生素的转运完全依赖于专用的羊毛硫抗生素转运体。显示乳链菌肽转运体(NisT)的破坏引起完全修饰的乳链菌肽前体在细胞内的积累(Qiao等1996.FEMS Microbiol.Lett.144，89-93)。Kuipers等以前证明羊毛硫抗生素转运体NisT可分泌未修饰的羊毛硫抗生素和前导肽与非羊毛硫抗生素肽的融合体，并且在无环化酶的情况下，脱水酶和羊毛硫抗生素转运体的结合也是功能性的(2004.J.Biol.Chem.279，22176-22182)。上述六个不同的元件在单个融合蛋白中的具体组合和相对顺序在现有技术中未知或不可从现有技术中推导出来。申请人:名下的W02006/062398公开了几种羊毛硫抗生素前导肽及它们的应用，例如在融合蛋白中生 产将被脱水酶转译后脱水的感兴趣的肽。根据W02006/062398，所述前导肽和将被修饰的肽前面有非羊毛硫抗生素输出信号，例如SEC输出信号。所述输出信号和前导肽可被细胞锚定序列分离，例如LPTX-分选酶识别基序。W02006/062398没有公开元件
(c)、(e)和(f)。Moll 等，Antonie van Leeuwenhoe Vol.97, N0.4, 2010, 319 333 页为非羊毛硫抗生素肽中脱氢氨基酸和羊毛硫氨酸的微生物工程的综述。通常教导肽中羊毛硫氨酸的微生物工程可允许产生独特文库和伴随的展示系统。没有提及如何技术上获得这样含羊毛硫氨酸的肽的文库，更没有提出本发明的涉及展示具有转译后引入的环状结构的肽的独特的方法。相反，本领域技术人员将选择更常规的方法，例如含二硫键的肽的噬菌体展示，然后化学环闭合。Rink 等(2010) J.0f Pharmac.And Toxic.Methods, Vol.61, N0.2, 210 218 页涉及通过D氨基酸和环化来稳定多肽药物。将感兴趣的肽直接或通过间隔子遗传地融合到羊毛硫抗生素前导肽上。未提及转译后环化的肽的细胞表面展示。Leenhouts 等(1999) Antonie van Leeuwenhoe, Vol.76, N0.1-4, 367 376 页公开了几种将蛋白质锚定到细胞壁的方法，包括LPXTG锚定基序。还教导带电荷的尾部和疏水结构域可作用为定位所述用于蛋白质裂解的靶定基序的临时终止子。如在W02006/062398中，结合所述Sec信号序列和SEC介导的输出讨论了所述元件。Leenhouts未提及任何革巴定基序与将被所述羊毛硫抗生素装置识别的元件的组合。任何类型的羊毛硫抗生素前导序列可被用于实践本发明，只要其可被至少一种羊毛硫抗生素脱水酶识别，还优选可被可形成羊毛硫氨酸桥的环化酶识别。在一个实施方式中，本发明的多肽中的前导肽具有羊毛硫抗生素前导共有基序，所述前导共有基序可源自已知羊毛硫抗生素前导肽的氨基酸序列比对。羊毛硫抗生素前导肽的氨基酸序列可从公共文库获得。例如，申请人名下的W02006/062398的表IA和表IB展示了羊毛硫抗生素前导肽的示例性比对。本领域技术人员能够从比对的序列得到共有基序，例如用公共或商购的比对软件，例如Vector NTI的AlignX。AlignX用ClustalW算法同时对蛋白质和核酸序列进行多序列比对。其绘出同源、序列复杂性、系统树和点矩阵同源图。AlignX接受标准的、富含特征的、序列的文本文件，例如GenBank、EMBL和GenP印t文件。在一个实施方式中，使用ClustalW算法表I中的序列推导出所述共有基序。优选前导肽共有基序源自至少5种、更优选至少10种、最优选至少15种已知前导肽序列的比对。然后，用本领域中已知的方法验证由此获得的共有基序的前导肽活性，即被羊毛硫抗生素脱水酶识别和丝氨酸或苏氨酸的脱水。可使用Mald1-TOF MS监控给定的靶序列，例如ITSISRASVA的脱水。
所述前导肽共有序列可包含各种共有序列，例如共有基序X1-D/E-E-V/L-S/T-D/E-X2-E-L-D/E，其中，Xl为任何疏水氨基酸，并且其中X2为任何氨基酸。例如，它包含序列LEEVSEQELD。在另一个实施方式中，前导肽包含共有基序F-D/E/N-L-D/E/N-X3，其中，X3为L、I或V。例如，它包含序列LFDLDL或FNLDV。例如，所述前导序列还可包括共有的包含 ILELQNLD 的 I/L-L/F-D/E/N-L-Q-D/N/A/S/T-L/M-D/E。所述前导肽可由共有序列，例如FNLDV组成，后面是所述共有序列和修饰前肽之间的间隔序列。需要该间隔序列在羊毛硫抗生素修饰酶的催化中心可及的范围内带来可修饰的部分(Annechien Plat, LeonD.Kluskens, Anneke Kuipers, Rick Rink, Gert N.Moll (2010))。N 端结构域和间隔子对乳链菌肽前导肽的功能来说是充足的(Appl.Environ.Microbiol.77, 604-611)。另一方面，已经报道对于羊毛硫抗生素诱变素(Chen P等，FEMS MicrobiolLett.2001; 195 (2): 139)、P印5 (Neis S 等，FEMS Microbiol Lett.1997; 149 (2): 249)和乳链菌肽(Van der Meer 等，(1994) J.Biol.Chem.269，3555-3562.)，一些保守的前导肽残基对所述羊毛硫抗生素的生物合成是必需的，而其它残基对最佳生物合成速率来说重要。在优选的实施方式中，核酸序列编码羊毛硫抗生素的前导肽，例如选自由细菌素J46、乳链球菌素481、唾液素B、Macedonin、乳杆菌素AM49、乳杆菌素AFF22、唾液素G32、唾液素9、诱变素I1、Variacin, MukAU MukA2/A3、MukA’、乳链球菌素3147A1、葡萄球菌素C55a、Butyri vibriocin0R79> RuminococcinA、BovicinHJ50> Thermophi I in 1277 > 溶细胞素 LL、溶细胞素 LS> Sublancinl68、LichenicidinBeta、NukacinISK-K NukacinKQU-131、唾液素A4、唾液素A5、唾液素A2、唾液素A、唾液素A3、唾液素Al、植物乳杆菌素Wb、HaloduracinA2、乳链球菌素3147A2、葡萄球菌素C55b、Gallidermin、葡萄球菌素T、表皮素、乳链菌肽Z、乳链菌肽Q、乳链菌肽F、乳链菌肽A、EricinA, EricinS,枯草菌素、乳链菌月太 U、Epicidin280、Pep5、EpilancinK7、SffLPK Streptin、LichenicidinAlphaMersacidin、Actagardine、BHT-A2、SmbB> BHT-AK SmbA、植物乳杆菌素 ASMl、植物乳杆菌素ffa> HaloduracinAl、诱变素 1140/111、诱变素1、MichiganinA、肉桂霉素、乳杆菌素 S、AmfS(灰色链霉菌(S.griseus) )、SapB> AmfS (除虫链霉菌(S.avermitilis)) RamS2> RamSl、迷宫肽素A1/A3、迷宫肽素A2或允许被期望的羊毛硫抗生素修饰酶识别和修饰的感兴趣的下游定位肽的这些前导肽的任何同系物组成的组中的所述羊毛硫抗生素的前导肽。所述同系物显示与W02006/062398的表I和表2中展示的前导肽序列的一个，Plat等(2010) Appl.Environ.Microbiol.77，604-611显示的前导肽序列的一个，或Li等(2010)，美国科学院院干IJ，107 =10430-5.)提到的前导肽至少70%、优选至少80%、更优选至少90%，像92%、95%或甚至98%的序列一致性。例如，所述前导肽可为仍能够诱导感兴趣的肽的翻译后修饰的被截的和突变的羊毛硫抗生素前导肽。所述前导不需要具有被例如LanT的羊毛硫抗生素转运体诱导移位的能力，因为这个功能可被可存在于本发明的多肽中的非羊毛硫抗生素输出信号接替。在具体的方面，所述前导肽为乳链菌肽前导肽或其被截的或突变形式，其中在N端的多达4个氨基酸和/或其中在C端的多达5个氨基酸的任一个突变。所述羊毛硫抗生素前导序列后面为将要被修饰的肽。所述修饰包括脱水，优选跟随环化。只要相关的酶装置存在，可由所述宿主细胞自身进行环化。或者，脱水的肽可通过在高PH下脱氢氨基酸与半胱氨酸的反应参与环化。将明确感兴趣的肽可为任何期望通过脱水和环化羊毛硫抗生素酶来修饰的肽。典型地，设计感兴趣的肽，以便在一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基转译后脱水后，所述脱水残基可被连接至半胱氨酸(通过宿主细胞或体外)，以便形成硫醚环状结构。同时，在肽中的必需的任何期望位点可引入稳定化的环状结构。特别感兴趣的是具有生物活性的肽，例如用于治疗用途的肽，因为一个或多个硫醚环的引入通常提高肽的生物稳定性。此外，可使用环状结构以肽的改变生物活性，例如，受体结合亲和性或酶的特异性。感兴趣的肽为，例如激素，酶抑制剂，酶激活剂，受体配体，抑制肽，羊毛硫抗生素蛋白，病毒蛋白，真核蛋白，其突变体(例如特定地设计以允 许在特定位点上的修饰)，其相似、同源或功能性等价片段。这样的肽的实例为胰高血糖素-(1-29)、肠促胰岛素/胃泌激素抑制肽、肠抑素、nesfatin-Ι、血管紧缩素-(1-9)、apelinl2、ACTH-(1-24)、瘦素 22-56、IL-1 α (223-250)、IL-1 β (208-240)、胰高血糖素样肽1、胰高血糖素样肽2(1-33)、神经肽S、δ睡眠肽、甘丙肽样肽、黑色素浓缩激素、小脑肽、神经肽W-23、神经肽W-30、运动升压素、甘丙肽、CART-(62-76)、皮质抑素17、促黑激素的增效因子、心血管调节肽-β、神经肽Y、心钠素、脑钠素、树眼镜蛇利钠肽、c型利钠肽(32-53)、C型利钠肽(1-53)、血管钠、降钙素、C-原降钙素、N-原降钙素、骨钙素、ρΤΗ(1-38)、ρΤΗ相关蛋白质(1-40)、pr印tin、骨抑素(1-5)、生长激素释放因子、W3R5脑肠肽1-5、人生长激素(1-43)、KGF受体肽、表皮有丝分裂抑制五肽、BPP金枪鱼肌肉、水蛭素(54-65)、缓激肽、尾加压素I1、血管紧缩素A、肾抑制剂、血管生成素-(118-123)、血小板因子4-(58-70)、内皮缩血管肽1-(11-21)、大内皮缩血管肽-(19-37)、胸腺素￠4(16-38)、心血管调节肽-β、alloferonl、皮质抑素29、促吞噬肽、C-反应性蛋白质-(174-185)、CKS17、pseudin2、抗炎肽1、典型的MSH-四肽、原骨胶原类型1、凝血酶受体结合肽、血小板凝集素-1片段、基板糖蛋白质片段、IFN-α受体识别肽1、天青蛋白质片段、valorphin、痛敏肽、α酪蛋白质90_96、β酪啡肽、α_新内啡肽、筋外啡肽A5、筋外啡肽B5、筋外啡肽C、强啡肽Α、α内啡肽、β内啡肽、hemopressin、甘丙素-(1-19)、生长激素抑制素、肾上腺髓质素、膜联蛋白质Al、铃蟾肽、bradikinin增效剂B、bradikinin增效剂C、脱硫的雨娃肽、降I丐素基因相关肽、缩胆囊肽、exendin3、exendin4、acetalin、P物质、促皮质素释放因子、δ啡肽I1、皮啡肽、水蛭蛋白酶抑制剂C、章鱼唾腺精、内吗啡肽1、内吗啡肽I1、GMAP16-41、GIP6-30、毒蜥素、血细胞激肽1、援木蛙肽、促黑激素、肛褶蛙肽、抑咽侧体神经肽、钙蛋白酶抑素-(184-210)、kinogen类凝血酶抑制剂、吻素、LL37、黄峰毒素、神经肽E1、蜂毒肽、吗啡调节肽、α-促黑细胞激素(MSH)、神经内分泌egulatory肽-1/2、神经激肽A/B/C、neurostatin、神经肽FF、神经肽Y、神经降压素、肥胖抑制素、催产素、orphan GPCR SP9155agonist p518、胰抑素、胰腺多肽、肽T、肽YY、泡蛙肽、PACAP_27、pneumadin、催乳素释放肽、心血管调节肽-α、娃皮降压肽、scyliorhinin 1/11、分泌素、P物质、胸腺素ct1、胸腺素β4、胸腺素β 10、trail mimetics、尿皮素I/II/II1、尾加压素1/11、血管加压素、PHM-27、VIP、淀粉不溶素、抗纤维蛋白质polymerant、GHRH、IGF-U IGF-2、RELAXIN-1/2/3、胰岛素样肽_3/4/5/6、富组蛋白_5、碱性抗生胜肽、蛙皮素1、C型利钠肽、vasonatrin、δ睡眠肽诱导肽、α树眼睛蛇毒素、锯鳞蝰素、抵御素1、尿皮素、小心脏活性肽A和B、ceratotoxinA、小脑肽、北非蝎毒素、芋螺升压肽G、α -芋螺毒素El、corazonin、亮氨酸脑啡肽、蛋内啡肽、促性腺素释放素I1、tocinoic acid、促肾上腺皮质激素抑制肽、促肾上腺皮质激素释放因子、肽XY、脑源性酸性成纤维细胞生长因子、脑源性碱性成纤维细胞生长因子、人生长激素、生长激素释放因子、鸟苷素、细胞间粘附分子、HIV抗原肽gpl20、HIV抗原肽I片段(gp41)、HIV抗原肽5、HIV蛋白酶抑制剂、胰岛素样生长因子-1、IGF 1169-84、白细胞介素片段、白细胞介素II片段、白细胞激肽1、白细胞焦激肽、蠕动素、神经肽Y、内啡肽、ras致癌基因相关肽、促红细胞生成素片段、表皮生长因子、转化生长因子、白灰制菌素、神经生长因子、筋外啡肽、豹鳎剂、短杆菌酪肽、肥大细胞脱粒肽、肿瘤坏死因子、RGD肽、促胸腺生成素、速激肽、杀菌肽、任何病毒多肽或使用其中存在丝氨酸/苏氨酸及如果希望，半胱氨酸的半随机引物获得的肽。 所述肽也可为羊毛硫抗生素(的上述突变体)，非羊毛硫抗生素(的突变体)，例如 bavaricin MN、肠球菌素 P(enterocin P)、mesentericin Y105、片球菌素PA-1 (Pediocin PA-1)、萬苣苦索 F(lactacin F)、乳球菌素 G(LactococcinG)、植物乳杆菌菌素EF、植物乳杆菌菌素JK、乳球菌素A、乳球菌素972、植物乳杆菌菌素A、curvacin A、divercinV41、肠球菌素 A (enterocin A)、muntcidin、sakacin P> leukocin A、肉食杆菌素(Carnobacteriocin) B2 > c lost icin574> circular in A、小菌素(microcin) J25、乳酸菌素 A或AS48。所述羊毛硫抗生素或细菌素可包含或不包含它们自己的前导肽。当然，如果它除了上面定义的羊毛硫抗生素前导肽外还包含其自身的前导肽，将被脱水酶识别的前导肽和被修饰的残基之间的距离将变得相对较大。因为这个原因，优选可去除它自身的前导肽，以便在整个多肽构建体中，只存在一个羊毛硫抗生素前导子。在特定情况下，例如，如果自身的前导肽小，例如在circularin A、小菌素J25、乳酸菌素A和AS48的情况，另外的前导序列的存在可能不会消极影响感兴趣的肽的修饰。甚至可设想不同的前导肽(例如羊毛硫抗生素前导肽及细菌素前导肽)的存在是有益的，因为这允许不同的修饰酶的识别和修饰。这里提供的核酸构建体的进一步以将被修饰的编码的肽序列中的3’的存在为特征，这是编码所述跨细胞壁的结构域的序列。这个结构域可跨例如革兰氏阳性宿主细胞的肽聚糖层，并从而确保修饰的氨基酸序列在宿主细胞的细胞表面展示。非常合适的间隔结构域可衍生自或基于乳酸菌的多域细胞膜蛋白酶的跨细胞壁结构域。典型地，所述间隔子结构域包含相似或甚至相同的氨基酸拉伸物的几个重复。在一个实施方式中，所述跨细胞壁结构域包含金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的蛋白质A(PrtA)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)的 prtH、酿胺链球菌(Streptococcus pyogenes)的 scpA 或无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)的csp的跨细胞壁结构域的氨基酸序列，或能够跨在其上展示它们的宿主细胞的细胞壁的其功能类似物或片段(Siezen，1999，乳酸菌的多域细胞膜蛋白酶，A.van Leeuwenhoek76:139-155)的氨基酸序列。在具体的方面,所述核酸构建体仅包括负责跨细胞壁和膜靶定的葡萄球菌蛋白质A或链球菌蛋白质G的编码区(参考，例如Navarre和Schneewind，1999，革兰氏阳性细菌的表面蛋白质和它们靶定到细胞壁膜的机制，Microbiol.Molecul.Biol.Rev.，63:174-229)。跨细胞壁结构域后面为分选酶基序。分选酶，即参与将金黄色葡萄球菌的一些表面蛋白质共价连接到肽聚糖上的酶，在表面蛋白质的展示和在该重要的人类病原体的毒性中起重要的作用(Marraffini 等，2006:Microbiol.Mol.Biol.Rev.70:192-221)。共价连接由被称为“分选酶识别基序”或“分选酶基序”的类别信号决定，该类别信号后面为由约20个氨基酸组成的疏水结构域和正电荷氨基酸尾部组成的疏水域。分选酶基序在本领域中已知，参考(1999)Microbiol Mol Biol Rev63:174 - 229，pmid: 10066836 或US7, 238，489。在许多革兰氏阳性细菌中已经报道了这个机制。最优的基序可取决于将使用的宿主细胞。图1C显示了乳酸乳球菌(A面)和金黄色葡萄球菌N315 (B面)的分选酶基序的共有序列。在一个实施方式中，所述分选酶识别基序包含氨基酸序列LPXTG，其中X可为氨基酸D、E、A、N、Q或K，优选地，其中，所述分选酶识别基序由LPKTG组成。分选酶识别基序后 面为能够跨宿主细胞双层脂膜的疏水结构域，可选择通过间隔子序列连接。跨膜结构域通常具有20至30个氨基酸的长度。优选的残基包括Ala、Pro、Gly、Phe, Leu、lie、Val、Met。在一个实施方式中，所述跨膜结构域包含序列PAFG、FGFL,LGVIV、VIVVIL、ILMGV 和 / 或 GVLGL。在具体的方面，它包含序列 PAFGFLGVIVVILMGVLGL。所述前导构建体的修饰和输出在几个方面高度出人意料:I)这个C端固定化多肽的修饰出人意料。先前没有通过羊毛硫抗生素酶修饰N端或C端固定化肽的报道。该多肽通过接近于C端的疏水部分锚定到膜上。这意味着C端是不游离的，并且肽被固定。在天然乳链菌肽中，有8个位置被脱水，并且安装了 5个环。因此，肽必须沿酶移动，或酶沿着肽移动。由于膜锚定，肽和修饰酶彼此之间移动可被C端固定所阻碍，所以这个修饰出人意料。由于8个脱水的质量峰完全缺失，这与在10%的情况下只有Ser33免于脱水的8倍脱水的天然乳链菌肽形成对比(乳链菌肽的翻译后修饰。NisB参与脱水过程。Karakas Sen A等，Eur J Biochem.1999261:524-32),所以确实发生了阻碍。尽管有这个阻碍，仍出人意料地发生7倍、6倍和5倍的脱水(图7C)。2)由于多肽的长度，输出出人意料。在科学文献中，被羊毛硫抗生素酶修饰的最长的肽为48个氨基酸(通过乳酸乳球菌的含脱氢氨基酸的肽的制备，Rink R等，EnvironMicrobiol.200773:1792 6)。本修饰和输出的构建体的长度为186至210个氨基酸，几乎是截至目前报道的最长的羊毛硫抗生素酶修饰的肽的4倍长。3)输出未被接近于C端的疏水部分阻碍。乳链菌肽前导肽为亲水性，并且如果存在前导肽酶，那么会在培养基中发现前导肽，即该前导肽不会保持附着在膜或细胞壁上。这表明乳链菌肽转运体形成水通道。这与其它信号肽例如sec和tat信号肽相反，这些信号肽具有疏水片段，这样它们保持在膜中。在后面的情况下，需要信号肽酶以将所述转运的肽或蛋白质释放到培养基中。通过使用具有与C端接近的疏水序列的构建体，将预期这种将多肽锚定在膜中的疏水序列阻碍了通过羊毛硫抗生素转运体的转运。令人意外的是，多肽的输出完全没有被疏水膜锚定阻碍，而是通过羊毛硫抗生素转运系统发生。由于识别LPXTG基序的分选酶位于细胞膜的外面，同样出人意料的是，多肽显然为将多肽连接到细胞壁上的分选酶作用的底物。4)完整多肽的输出出人意料地在羊毛硫抗生素转运体、接近于C端的疏水部分和带电荷的C端氨基酸KRKQREE的联合作用下增强。实施例4中清楚的证明，C端的切断导致降解。这可能由允许细胞内肽酶降解多肽阻碍其完整转运的不充分的输出引起的。编码蛋白质底物的C端由用于膜靶定的带电荷的尾部组成。在一个实施方式中，所述带电荷的膜靶定结构域具有至少4个氨基酸残基的长度，优选其中至少50%的残基为带正电荷的氨基酸、更优选为赖氨酸和/或精氨酸残基。融合肽包含一种或多种另外的序列基序可以是有益的。例如，可在元件(b)和(C)之间引入至少一个蛋白水解裂解位点，这样可以在翻译后修饰及表面展示后可释放修饰的肽。有效的裂解位点在本领域中已知，并且包括因子Xa蛋白酶识别位点，如氨基酸序列IEGR0另一方面涉及包含根据本发明的核酸构建体的表达载体。优选地，设计载体以用于在革兰氏阳性宿主细胞中表达所述构建体。例如，该载体包含一个或多个以下元件:可诱导的NisA启动子、乳链菌肽前导肽、乳链菌肽和乳酸乳球菌PrtP蛋白酶的LPXTG细胞壁锚定基序的序列。还包括革兰氏阳性宿主细胞，所述革兰氏阳性宿主细胞包含这样的表达载体并能够将所述感兴趣的多肽翻译 后修饰为含脱氢残基或硫醚桥的多肽。所述宿主细胞为，例如乳酸菌，优选地选自包含相关的羊毛硫抗生素生物合成酶和转运体，例如NisB、C、T或SpaB、C、T 的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)、化胺性链球菌(Streptococcus pyogenes)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermis)、鸡葡萄球菌(Staphylococcus gallinarium)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、变形链球菌(Streptococcus mutans)、瓦氏葡萄球菌(Staphylococcus warneri)、唾液链球菌(Streptococcus salivarius)、清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)、胚牙乳杆菌(Lactobacillus piantarum)> 鱼肉杆菌(Carnobacterium piscicola)、幾肠球菌(Enterococcus faecalis)、变异微球菌(Micrococcus varians)、链霉菌0H-4156 (Streptomyces 0H-4156)、肉桂地链霉菌(Streptomyces cinnamoneus)、灰藤黄链霉菌(Streptomyces griseoluteus)、溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibrio fibriosolvens)、同八丈岛链轮丝菌(Streptoverticillium hachijoense)、Actinoplanes linguriae、活泼瘤胃球菌(Ruminococcus gnavus)、马其顿链球菌(Streptococcus macedonicus)、波比斯链球菌(Streptococcus bovis)。特别感兴趣的是包含多个根据本发明的宿主细胞的宿主细胞文库，其中，所述文库的每种细胞都在其细胞表面展示不同的含脱氢残基或硫醚桥的多肽。这个文库非常利于用于筛选新型有用的环肽，如新型环状亲和标签、例如肽药物的环状生物活性肽、受体配体、环状抑制肽。有利地，文库的构建包含在包括核苷酸的混合物的寡核苷酸合成中在每个位置整合的简并密码子的使用。例如，整套标准氨基酸用NNK或NNS密码子编码，其中N为A、T、C或G，并且K=G或T，且S=C或G，因而排除了 TAA或TGA终止密码子。表达候选亲和标签的宿主细胞可与固定结合配体接触以选择高亲和度结合序列。因此，还提供了用于识别能够结合到感兴趣的靶实体的含脱氢残基或硫醚的多肽的方法，所述方法包括步骤:(a)提供上述文库；(b)从所述文库选择至少一种展示能够结合到感兴趣的靶实体的含脱氢残基或硫醚的多肽的宿主细胞；和(c)识别在所述至少一种选定的宿主细胞上展示的多肽序列。在具体的方面，所述文库包含多个候选环状亲和标签序列，例如环状链霉亲和素标签(Strep标签)的变体。提供了识别能够结合到生物素的包含硫醚桥的环状链霉亲和素标签(Strep标签)的方法，所述方法包含步骤:(a)提供包含多个含有根据本发明的表达载体并能够将感兴趣的多肽翻译后修饰成含硫醚桥的多肽的革兰氏阳性宿主细胞的文库，其中，所述多肽包含氨基酸序列Ser/Thr-(Xaa)n-Cys或Cys-(Xaa)n_Ser/Thr,其中Xaa为任何氨基酸，并且η为I至5，优选η为3 ; (b)用固定化链霉亲和素从所述文库中选择至少一种展示链霉亲和素(Strep标签)具有亲和度的硫醚桥肽的宿主细胞；和(c)识别在所述至少一种选定的宿主细胞上展示的多肽序列。例如，两轮使用涂布链霉亲和素的磁珠的磁选(MACS)后，所选择的细菌可被放在板上(plated)用于分析。宿主细胞也可被用作用于评估羊毛硫抗生素生物合成酶和/或转运体活性的报告系统，其中，含硫醚桥的肽的有效细胞表面表达仅用作读出。可通过本领域中已知的方法检测细胞表面表达，包括抗 体检测和固定到固体载体上。
MJA:本研究中使用的展示载体的遗传组织。PnisA，乳链菌肽可诱导启动子；前导子，乳链菌肽前导肽；NisA，乳链菌肽前体编码序列；FXa，因子Xa识别位点；Strep-标签，链霉亲和素识别序列；3C，人鼻病毒蛋白酶识别序列。乳酸乳球菌PrtP蛋白酶的细胞壁间隔子和细胞壁锚(cell wall anchor)(氨基酸1789 1912)。(a)N端羊毛硫抗生素前导序列；(b)将被翻译后修饰成含脱氢残基或硫醚桥的多肽的感兴趣的氨基酸序列；(C)亲水跨细胞壁结构域；(d)分选酶识别基序；(e)跨疏水膜的结构域；和(f)C端带电荷的膜靶定结构域。相应的(多)肽产物被称作相同的名字，没有前面的“P”。SIB:截短的PTB5变体的遗传组织。aa##表示乳酸乳球菌PrtP蛋白酶的细胞壁锚的氨基酸数目。(a) N端羊毛硫抗生素前导序列；(b)将被翻译后修饰成含脱氢残基或硫醚桥的多肽的感兴趣的氨基酸序列；(C)亲水跨细胞壁结构域；(d)分选酶识别基序；(e)疏水的跨膜结构域；和(f) C端带电荷的膜锚定结构域。图1C:LPXTG基序的共有序列。上面:乳酸乳球菌的共有序列；下面:金黄色匍萄球菌N315的共有序列。M2:融合肽构建体的表达。A)考马斯亮蓝染色12%SDS_PAA凝胶和B)用抗乳链菌肽前导抗体对乳酸乳球菌NZ9000的细胞提取物的免疫印迹，其中所述细胞提取物具有质粒:1，ρΤΒ5，未诱导;2，pTB5 诱导；3，pTB5/pIL3BTC，未诱导；4，pTB5/pIL3BTC，诱导。:融合肽构建体的细胞表面位置。在乳酸乳球菌NZ9000细胞上进行全细胞ELISA以用于检测表面展示的乳链菌肽前体锚定融合蛋白。允许兔子抗-乳链菌肽前导抗体结合到展示TB5的乳酸乳球菌细胞上。加入与山羊抗兔子IgG共轭的碱性磷酸酶，并通过加入对硝基苯基磷酸盐产生颜色。白色条，未诱导的细胞；灰色条，诱导的细胞。M4.在细胞表面展示修饰的乳链菌肽前体。AB面:对两个具有或不具有修饰的酶的乳酸乳球菌NZ9000的细胞提取物的SDS-PAA凝胶平行分析。1，ρΤΒ5，未诱导；2，pTB5，诱导；3，pTB5/pIL3BTC，未诱导；4，pTB5/pIL3BTC，诱导；5，乳链菌肽前体。A)面:考马斯亮蓝染色12%SDS-PAA凝胶。B)面:用0.lmg/ml的胰蛋白酶覆盖的对乳链菌肽敏感的乳酸乳球菌NZ9000菌株的12%SDS-PAA凝胶。在诱导依赖的考马斯亮蓝染色蛋白条带的位点的凝胶B的泳道4的亮点证明融合蛋白的乳链菌肽前体部分被NisB和NisC修饰。C面):对展示活性乳链菌肽的乳酸乳球菌细胞的分析，其中所述乳酸乳球菌细胞具有含胰蛋白酶的对乳链菌肽敏感的乳酸乳球菌NZ9000菌株的覆盖培养物(左面)，或具有用NisP生产的乳酸乳球菌菌株(右面)。NisP特异性切割产生活性乳链菌肽的乳链菌肽前导子。看作亮点的(图C中白色圆圈/边缘)该菌株的生长抑制清楚地证明了 NisB和NisC正确地修饰乳链菌肽前体，并至少形成TB5的环A、B和C (图4C中的TB5表示为N15)。Ml.NisBC修饰的cAng-(l-7)的细胞表面展示。A:用于检测表面展示的前导血管紧缩素(1-7)融合蛋白的在乳酸乳球菌NZ9000细胞上的全细胞ELISA。允许兔子抗-乳链菌肽前导抗体结合到展示TB2的乳酸乳球菌细胞。加入与山羊抗兔子IgG共轭的碱性磷酸酶，并通过加入对硝基苯基磷酸盐产生颜色。白色条，未诱导的细胞；灰色条，诱导的细胞。B:考马斯亮蓝染色12%SDS_PAA凝胶，以及用抗环状血管紧缩素(1_7)抗体对乳酸乳球菌NZ9000的全蛋白提取物的免疫印迹分析，其中所述全蛋白提取物具有质粒:泳道1，pTB2 ;泳道 2，pTB2 和 pIL3BTC。C:硫醚桥血管紧缩素(1-7)锚定融合肽TB3的MALD1-T0F光谱显示单个脱水。示意性显示相关的肽片段(STKDFNLDLVSVSKKDSGASPRIEGRDRVSIHCGGGWSHPQFEKEALFQ)。5398.83 的质量峰对应于单个脱水N端TB3片段。D =MALD1-TOf光谱显示没有CDAP加到硫醚桥血管紧缩素(1_7)锚定融合肽TB3中。上面两个图显示了对照肽25Da的清楚的质量偏移，这表明有CDAP加入到该肽中。未发现TB3的质量偏移(下面两个图)，表明无游离半胱氨酸残基，并且因此证明了 TB3中硫醚桥的存在。M6:乳链菌肽锚定融合肽TBl的MALD1-T0F光谱。A)纯化的TBl。B)用胰蛋白酶处理的纯化的TB1。C)更详细的B中的盒状区域。TBl的乳链菌肽部分。脱水的数目表示为-7、-6等。D)用胰蛋白酶处理的乳酸乳球菌NZ9000(pIL3BTC/pNZe3)的上清液。脱水的数目表示为_8、-7等。在图A和图B中，示意性显示了相关肽的片段。Ml:结合肽RND-X3-1的选定的链霉亲和素的展示pRND-X3-l示于图1A中。在与生物素共培养或不与生物素共培养的展示RND_X3_1的乳酸乳球菌NZ9000 (pIL3BTC)上进行全细胞ELISA。用以ABTS/H202作为底物溶液的与HRP共轭的链霉亲和素检测展示的肽。在多于3次的独立实验中重复实验，差异< 15%。
M8:对加入1-氰基-4- 二甲基氨基吡啶嗡四氟硼酸盐(CDAP)的链霉亲和素选择的硫醚桥肽(参看实施例7)的MALD1-TOF的光谱分析。为了分析，将转译终止子插入PRND-X3-1中的肽和锚定序列之间(图1A)，并将所得质粒称为pTB9 (图1A)。终止密码子前面的N端部分因而编码融合到可修饰的肽ISNMVCNMKTATCHCSIHVSK的乳链菌肽前导肽MSTKDFNLDLVSVSKKDSGASPR。将包含具有终止密码子的编码该构建体的质粒pTB9和包含PIL3BTC的细胞的生长培养基涂到MALDI靶板上，并通过Maldi TOF分析。具有包含游离半胱氨酸的对照肽的对照实验显示对照肽的25Da的清楚的质量偏移，这表示有CDAP加入到对照肽。该实验显示产生了 4572.94Da质量的肽，这对应于4倍脱水肽(无N端甲硫氨酸的理论平均质量:4570.346Da)。很可能，在该乳链菌肽相关肽中的倒数第二个丝氨酸未脱水，这与在乳链菌肽自身中的Ser29情况类似。在CDAP的存在下，没有发现选定的TB9肽的25Da的质量偏移，表明游离半胱氨酸的缺失，并且因而证明硫醚桥的存在。
具体实施例方式实施例1:用于含硫醚和脱氢残基的肽在乳酸乳球菌上的细胞表面展示的表达载体I遍:该实施例是关于用于含硫醚的肽在乳酸乳球菌的表面展示的表达载体的构建。所述乳酸乳球菌宿主有机体提供用于在期望的肽及其输出物中引入硫醚连接的乳链菌肽生物合成和输出装置。所述肽被转译融合到LPXTG细胞壁锚定基序中，例如，乳酸乳球菌PrtP蛋白酶。这个锚定机制需要用于将肽共价锚定到细菌细胞壁的肽聚糖上的分选酶的加工。这样，肽和编码的DNA被连接，允许选择/筛选具有期望性质的翻译后修饰肽。乳链菌肽将用作用于展示系统的开发和验证的模型肽。材料和方法通过PCR将乳酸乳球菌PrtP蛋白酶的LPXTG细胞壁锚定基序转译融合到pNZE3中的nisA基因上，pNZE3为乳酸乳球菌表达载体pNG8048的衍生物。所述展示载体的相关部分包含可诱导NisA启动子、乳链菌肽前导肽、乳链菌肽和乳酸乳球菌PrtP蛋白酶的LPXTG细胞壁锚定基序的 序列(图2A)。将展示载体电穿孔到乳酸乳球菌NZ9000(pIL3BTC)中。后者提供乳链菌肽生物合成酶Ni SB、Ni SC和转运体NisT。通过SDS-PAGE和用抗乳链菌肽前导的抗体的免疫印迹(Western blotting)分析乳链菌肽锚定蛋白的制备。结里在NisA启动子控制下用正确的乳链菌肽锚定序列构建乳酸乳球菌展示载体。该展示载体被命名为PTB5。使乳酸乳球菌NZ9000(pIL3BTC/pTB5)细胞在乳链菌肽的存在或缺失下生长以允许产生TB5。将等量的细胞用溶菌酶消化并溶解于SDS-PAGE样品缓冲液中。通过SDS-PAGE分离细胞提取物中的蛋白质，并用考马斯亮蓝染色显示(图2，左面)。对来自非诱导和诱导的培养基中的细胞培养物的比较显示在诱导的培养基中存在约26至28kDa的蛋白质条带。用抗乳链菌肽前导的抗体的免疫印迹分析证明该蛋白质为乳链菌肽锚定融合蛋白TB5，如通过强免疫反应信号所看到的那样(图2，右面)。观测到的TB5的分子量不同于理论计算的分子量18kDa。该迁移差异最可能由于肽聚糖片段对TB5的共价附着。在非诱导的培养基中的可测量但不那么强的免疫反应信号是由于乳链菌肽启动子的少量泄露。总之，当用乳链菌肽诱导时，包含构建体的展示载体PTB5的乳酸乳球菌细胞引发TB5的产生。实施例2:抗前导肽的抗体证明附着乳链菌肽前体靶定融合蛋白TB5的细胞壁的细胞表面位置。MM:用使用抗乳链菌肽前导肽的全细胞ELISA评估在乳酸乳球菌的细胞表面的
TB5的展示
_5] 材料和方法在存在或不存在乳链菌肽的情况下培养乳酸乳球菌NZ9000(pTB5)和乳酸乳球菌NZ9000(pIL3BTC/pTB5)细胞以诱导TB5。制备后，通过离心收集生产的细胞后，用pH7.4的磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)洗三次。在室温下，在搅拌下，将等量的展示TB5的细胞用含
0.5%BSA最终体积为Iml的PBS中的1000倍稀释的兔子抗乳链菌肽前导抗体溶液培养I小时。用PBS洗三次后，通过使用与碱性磷酸酶共轭的山羊抗兔子IgG(l: 10000)和作为底物的对硝基苯基磷酸盐(0.5mg/ml)培养来显示所展示的TB5。在410nm确定吸光率，该吸光率用于测量所展示的TB5的量。结果结果被总结于图3中，该结果显示了诱导的乳酸乳球菌NZ9000(pIL3BTC/pTB5)细胞的阳性颜色反应。未诱导的乳酸 乳球菌培养看到较低水平的颜色响应。这证明在乳酸乳球菌的细胞表面可获得乳链菌肽前导子。实施例3:在细胞表面展示前，已经用NisB和NisC细胞内修饰了乳链菌肽前体靶定融合蛋白。通过在前导肽裂解后的对重叠细胞的抗菌活性证明通过NisB-和NisC-修饰的乳链菌肽前体锚定融合蛋白的修饰。I遍:实施例2显示TB5的产生导致乳链菌肽前体在乳酸乳球菌细胞表面的展示。在这个实施例中，用对乳链菌肽敏感的乳酸乳球菌菌株的覆盖层评估通过NisB和NisC的乳链菌肽修饰。对该菌株的生长抑制表明NisB和NisC正确地修饰了 TB5并至少形成了环A、B 和 C。材料和方法用在含0.lmg/ml胰蛋白酶的0.5%顶层琼脂中的200倍稀释的乳酸乳球菌MG1363或NZ9000菌株覆盖具有充分清洗的SDS-PAA凝胶或产生pTB5的乳酸乳球菌NZ9000细胞的菌斑的GM17琼脂板。需要胰蛋白酶用于裂解产生活性乳链菌肽的乳链菌肽前导子。琼脂板在30°C下过夜培养。结果图4显示了对来自具有或不具有修饰的酶的乳酸乳球菌NZ9000的细胞提取物的两个相似的SDS-PAA凝胶分析。考马斯亮蓝染色凝胶(图4A)显示在诱导培养基中产生TB5，与修饰的酶的存在无关。只有TB5/BTC抑制了菌株的生长，表现为覆盖层中的空带(亮点)(图4B)。这表明NisB和NisC正确地修饰产生活性乳链菌肽的TB5。在全细胞上的重叠分析获得相似的结果(图4C)。在包含修饰和(en)转运酶的产生TB5的乳酸乳球菌细胞中发现活性乳链菌肽。由于乳链菌肽前导子只能接触来自外部的胰蛋白酶，因此在乳酸乳球菌细胞表面展示活性乳链菌肽。此外，用NisP对乳链菌肽前导子特异性裂解导致了生长抑制，这暗示固定化乳链菌肽仍然为抗菌活性。总之，由于在SDS-PAA凝胶的覆盖层中和全细胞中用乳链菌肽敏感菌株观测到了活性的乳链菌肽，因此NisB和NisC正确地修饰了乳链菌肽锚定融合蛋白TB5。因此，TB5的锚定部分提供了用于将TB5共价附着到肽聚糖层的信号，从而在乳酸乳球菌细胞表面展示活性乳链菌肽。实施例4 =NisB和NisC修饰肽的稳定展示需要完整的膜锚定MM:释放截短的乳链菌肽前体锚定构建体以促进质谱分析。通186 个氨基酸的完整蛋白质:MSTKDFNLDLVSVSKKDSGASPRITSISLCTPGCKTGALMGCNMKTATCHCSIHVSKIEGRGQSLKTKVAAAVEAAKTVGKGDGTTGTSDKGGGQGTPAPAP⑶IGKDKGDEGSQPSSGGNIPTNPATTTSTSTDDTTDRNGQLTSGKGALPKTGETTERPAFGFLGVIVVILMGVLGLKRKQREE参照图1B制备4个截短的变体:pTB5-trl带电荷膜尾部(KRKQREE)的直接上游(immediatelyupstream)MSTKDFNLDLVSVSKKDSGASPRITSISLCTPGCKTGALMGCNMKTATCHCSIHVSKIEGRGQSLKTKVAAAVEAAKTVGKGDGTTGTSDKGGGQGTPAPAP⑶IGKDKGDEGSQPSSGGNIPTNPATTTSTSTDDTTDRNGQLTSGKGALPKTGETTERPAFGFLGVIVVILMGVLGL179氨基酸pTB5~tr2LPKTG序列的直接上游MSTKDFNLDLVSVSKKDSGASPRITSISLCTPGCKTGALMGCNMKTATCHCSIHVSKIEGRGQSLKTKVAAAVEAAKTVGKGDGTTGTSDKGGGQGTPAPAP⑶IGKDKGDEGSQPSSGGNIPTNPATTTSTSTDDTTDRNGQLTSGKGA150氨基酸pTB5~tr3MSTKDFNLDLVSVSKKDSGASPRITSISLCTPGCKTGALMGCNMKTATCHCSIHVSKIEGRGQSLKTKVAAAVEAAKTVGKGDGTTGTSDKGGGQGTPAPAP⑶I105氨基酸pTB5~tr4MSTKDFNLDLVSVSKKDSGASPRITSISLCTPGCKTGALMGCNMKTATCHCSIHVSKIEGRGQSLKTKVAAAVEAAKTVGKGDGT85氨基酸
表达了截短的乳链菌肽前体锚定TB5变体。通过TCA沉淀来沉淀在上清液中的肽并在SDS PAGE上分析所述肽。MS-杀菌活性对于截短的变体2、3和4，上清液似乎对指示菌株MG1363的生长有影响。这表明肽被修饰和释放。关于这些变体还存在一些自体诱导。没有发现与截短的变体I相关的生长抑制。该变体包括跨膜的膜部分，并且可能至少在很大程度上保持与细胞相关。在SDS PAA凝胶上，观察到一个与所有截短的变体相同迁移的条带。这个肽的带似乎以乳链菌肽的分子量迁移。如在考马斯亮蓝染色的SDS-PAA凝胶中显示的一样，在TCA沉淀的上清液中，观察到单个肽的条带。叠加分析证明该肽抑制了指示菌株的生长。当截短的肽更短时，产生更多的该乳链菌肽条带(数据未显示)。
TB5的锚定部分稳定了 TB5乳链菌肽前体锚定融合蛋白。缺少该部分时，出现降解，并且释放活性的乳链菌肽。实施例5:环状血管紧缩素类似物的表面展示MM:证明血管紧缩素(1-7)的表面展示和修饰。用全细胞ELISA评估表面展示。用抗环状血管紧缩素(1-7)的特异性抗体证明血管紧缩素(1-7)的修饰，其中将钥孔虫戚血蓝蛋白质(KLH)作为载体蛋白质。材料和方法将血管紧缩素(1-7)的编码序列(DRVSHIC)转译融合到乳链菌肽前导肽序列中，用因子Xa识别序列(IEGR)隔开。这产生了血管紧缩素(1-7)表面展示载体pTB2(图1A)。在具有或不具有TB2的诱导下培养具有pTB2的乳酸乳球菌NZ9000和NZ9000 (pIL3BTC)细胞。收集来自这些生产培养基的细胞，用PBS清洗，并最终在PBS中再次悬浮直至0D_ 20至30。如实施例2中所说明的那样进行全细胞ELISA。此外，通过SDS-PAGE和抗环状血管紧缩素(1_7)抗体免疫印迹分析前导肽血管紧缩素(1-7)锚定蛋白的生产。MS来自诱导培养基的细胞对修饰的TB2及未修饰的TB2都产生阳性颜色反应(图5A)。这证明前导肽可由外部接近，并且因此在乳酸乳球菌的细胞表面展示血管紧缩素(1-7)。 对来自展示TB2的乳酸乳球菌细胞的细胞提取物的SDS-PAGE分析清楚地显示蛋白质条带迁移至大约24.9kDa的标记条带。用抗环状血管紧缩素(1-7)抗体的免疫印迹识别该蛋白质条带为TB2 (图5B)。用KLH作为载体蛋白质，在小鼠中用纯化的环状血管紧缩素(1-7)培养所使用的环状血管紧缩素(1-7)抗体。在标准的ELISA中，该抗体对环状血管紧缩素(1-7)的特异性是其线状等价物的至少IO4倍。因此，抗环状血管紧缩素(1-7)抗体特异性识别修饰的血管紧缩素(1-7)。免疫印迹清楚地显示了抗环状血管紧缩素(1-7)抗体对修饰的TB2的免疫反应信号(图5B，泳道2)，而对于未修饰的TB2未发现信号(图5B，泳道I)。这表明展示的血管紧缩素(1-7)被NisB和NisC修饰。Maldi TOF分析显示展示的血管紧缩素(1-7)为脱水的(图5C)和环化的(图OT)。实施例6:修饰的TB I的质谱分析MM:通过MALD1-T0F分析证明TBl内乳链菌肽的修饰材料和方法构建乳酸乳球菌表面展示载体以促进纯化和分析。质粒pTBl编码人鼻病毒3C蛋白酶识别序列(PreScission蛋白酶，GE Healthcare),以便从乳酸乳球菌细胞表面的释放编码前导肽的N端部分、乳链菌肽和Str印标签II。为了纯化的目的加入Str印标签II序列。在冰上用16%的三氯乙酸提取展示TBl的乳酸乳球菌NZ9000细胞30分钟。用Iml的丙酮洗细胞两次，在高速真空中干燥，并在pH8.0下在0.25ml的IOmM Tris-HCl,ImM EDTA、lmg溶菌酶和0.1mg变溶菌素中再悬浮。在37°C进行细胞壁消化I小时。离心收集细胞，用PBS洗两次。将细胞在Iml的PreScission蛋白酶裂解缓冲液(50mMTris-HCl,pH7.0, 150mM NaCl, ImM EDTA, ImM DTT)中用 40UPreScission 蛋白酶(GEHealthcare)再悬浮,并在搅拌下于4°C培养24至48小时。用蛋白酶消化后,收集上清液,并根据生产商的操作指南用Strep-tactin离心柱纯化试剂盒(IBA，GmbH)纯化TBl肽的str印标签的N端部分。用10%TCA沉淀洗出液中的肽，并将其溶于水中。在线性模型中用Voyager DE PRO基质辅助激光解析电离飞行时间(MALD1-T0F)质谱记录质谱。益果通过MALD1-T0F分析纯化的TBl的N端部分(图6)。图6A中的光谱显示在7975Da附近的质量峰，这相应于在图中示意性指出的全长N端TBl部分。当用胰蛋白酶处理样品时，该峰消失，而在3389Da附近出现质量峰(图6B)。后一个质量峰对应于TBl的乳链菌肽部分。由于该片段免受胰蛋白酶的消化，该片段出现的事实已经证明乳链菌肽的修饰。图6C显示对来自TBl的乳链菌肽质量峰的更详细分析。在TBl乳链菌肽光谱中清楚地出现至少7倍和6倍的脱水峰。与分泌的乳链菌肽相比，缺少了 8倍的脱水峰(图6D)。益论:这些数据证明TBl内的乳链菌肽被修饰并包含至少7个脱水。实施例7:目标:通过展示和筛选选择链霉亲和素结合肽材料和方法
为证明展示和筛选的原理的证据，以从包含ISXXXCNMKTATCHCSIHVSK的文库中选择链霉亲和素结合肽为目的进行实验，其中，X为任何氨基酸。将丝氨酸和半胱氨酸放在三个随机的氨基酸两侧，这样允许酶催化的丝氨酸脱水及环化酶催化将产生的脱氢丙氨酸与半胱氨酸耦合。在文库构建中使用NNS密码子允许所有可能的氨基酸位于丝氨酸和半胱氨酸之间的每个位点上，产生理论上8000个变体的蛋白质多样性的文库。估计的文库大小为约11000独立的克隆。编码该乳酸乳球菌硫醚肽展示文库的构建体被称为PRND-X3 (图W。我们筛选文库中的链霉亲和素结合体(binder)。两轮使用涂布链霉亲和素的磁珠的磁选(MACS)后,将选定的细菌放在板上用于分析。益果对选定的克隆的专门分析产生一个单一的序列:S-MNV-C(pRND-X3-1)，已知其为二硫桥基序而非硫醚环化基序。在所分析的选定的肽中序列变异的缺失可能是由于与对链霉亲和素结合的需要相结合的硫醚桥所施加的构象限制。展示这种含MNV的多肽的乳酸乳球菌细胞在全细胞ELISA中产生阳性颜色反应，从而提供与链霉亲和素的结合。此外，在生物素的存在下无结合，证明对生物素结合位点的特异性(图7)。用Maldi TOF的分析揭示CDAP没有添加到含MNV的肽中，这排出了未修饰的半胱氨酸的存在，从而证明存在硫醚桥(图8)。因此，从乳酸乳球菌硫醚肽展示文库可以容易地选择对链霉亲和素具有亲和性的硫醚桥肽。结论:可从细胞表面展示的硫醚桥肽的乳酸乳球菌文库中成功地筛选特异性配体。
权利要求
1.一种编码融合肽的分离的核酸构建体，所述融合肽从N端到C端至少包含以下序列元件: (a)N端羊毛硫抗生素前导序列； (b)将被翻译后修饰成含脱氢残基或硫醚桥的多肽的感兴趣的氨基酸序列； (C)亲水跨细胞壁结构域； (d)分选酶识别基序； (e)疏水跨I吴结构域；和 (f)C端带电荷的膜锚定结构域。
2.根据权利要求1所述的核酸构建体，其中，所述羊毛硫抗生素前导序列为乳链菌肽前导序列。
3.根据权利要求1或2所述的核酸构建体，其中，所述跨细胞壁结构域衍生自乳酸菌的多域细胞膜蛋白酶的跨细胞壁结构域。
4.根据权利要求3所述的核酸构建体，其中，所述跨细胞壁结构域包含瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)的 prtH、乳酸乳球菌(Lactococcus Iactis)的 prtP、化胺性链球菌(Streptococcus pyogenes)的 scpA或无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)的csp的跨细胞壁结构域的氨基酸序列或它们的功能类似物或片段。
5.根据前述任一项权利要求所述的核酸构建体，其中，所述分选酶识别基序包含氨基酸序列LPXTG，其中X可为氨基酸D、E、A、N、Q或K，优选地，其中所述分选酶识别基序由LPKTG组成。
6.根据前述任一项权利要求所述的核酸构建体，其中，所述疏水跨膜结构域具有20至30个氨基酸的长度。
7.根据前述任一项权利要求所述的核酸构建体，其中，所述带电荷的膜锚定结构域具有至少四个氨基酸残基的长度，优选地，其中，至少50%的所述残基为带正电荷氨基酸，更优选赖氨酸和/或精氨酸残基。
8.根据前述任一项权利要求所述的核酸构建体，其中，所述蛋白质物质在元件(a)和(b)之间和/或元件(b)和(c)之间进一步包含至少一个蛋白水解裂解位点。
9.根据权利要求8所述的核酸构建体，在元件(a)和(b)之间包含因子Xa蛋白酶识别位点，优选氨基酸序列IEGR。
10.根据权利要求8或9所述的核酸构建体，在元件(b)和(c)之间包含人鼻病毒3C蛋白酶识别位点，优选氨基酸序列EALFQGP。
11.根据前述任一项 权利要求所述的核酸构建体，其中，所述感兴趣的氨基酸序列为治疗相关的肽，优选地选自由激素、酶抑制剂、酶活化剂、受体配体、抑制肽、羊毛硫抗生素蛋白和病毒蛋白组成的组中。
12.—种表达载体，包含根据权利要求1至11的任一项所述的核酸。
13.—种革兰氏阳性宿主细胞，包含根据权利要求12所述的表达载体，并能够将所述感兴趣的多肽翻译后修饰为含脱氢残基或硫醚桥的多肽。
14.根据权利要求13所述的宿主细胞，为乳酸菌，优选地选自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)、化胺性链球菌(Streptococcus pyogenes)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermis)、鸡葡萄球菌(Staphylococcus gallinarium)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、变形链球菌(Streptococcus mutans)、瓦氏葡萄球菌(Staphylococcus warneri)、唾液链球菌(Streptococcus salivarius)、清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)、胚牙乳杆菌(Lactobacillus piantarum)Λ 鱼肉杆菌(Carnobacterium piscicola)、类肠球菌(Enterococcus faecalis)、变异微球菌(Micrococcus varians)、链霉菌OH-4156 (Streptomyces 0H-4156)、肉桂地链霉菌(Streptomyces cinnamoneus)、灰藤黄链霉菌(Streptomyces griseoluteus)、溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibrio f ibriosolvens)、同八丈岛链轮丝菌(Streptoverticillium hachijoense)、Actinoplanes linguriae、活泼瘤胃球菌(Ruminococcus gnavus)、马其顿链球菌(Streptococcus macedonicus)、波比斯链球菌(Streptococcus bovis)。
15.—种宿主细胞文库，包含多个根据权利要求13或14所述的宿主细胞，其中，所述文库的每个成员在它的细胞表面展示不同的含脱氢残基或硫醚桥的多肽。
16.—种鉴定能够结合到感兴趣的靶实体上的含脱氢残基或硫醚的多肽的方法，所述方法包含步骤: (a)提供根据权利要求15的文库； (b)从所述文库选择展示能够结合到所述感兴趣的靶实体上的含脱氢残基或硫醚桥的多肽的至少一种宿主细胞；和 (c)识别在至少一种选择的所述宿主细胞上展示的所述多肽序列。
17.根据权利要求13或14的宿主细胞作为用于评估羊毛硫抗生素生物合成酶和/或转运活性的报告系统的 用途。
全文摘要
本发明涉及翻译后修饰的异源性蛋白的细菌细胞表面展示。提供了分离的编码蛋白质物质的核酸构建体，所述蛋白质物质从N端至C端包含至少(a)N端羊毛硫抗生素前导序列；(b)将被翻译后修饰成含脱氢残基或硫醚桥的多肽的感兴趣的氨基酸序列；(c)亲水跨细胞壁结构域；(d)分选酶识别基序；(e)疏水跨膜结构域；和(f)C端带电荷的膜锚定结构域。还提供了表达所述构建体的革兰氏阳性宿主细胞及宿主细胞的文库。
文档编号C12N15/62GK103080318SQ201180042020
公开日2013年5月1日 申请日期2011年7月6日 优先权日2010年7月6日
发明者芝贝·博斯姆 申请人:兰提欧派普有限公司
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