用于检测李斯特氏菌的寡核苷酸及其应用的制作方法

专利名称：用于检测李斯特氏菌的寡核苷酸及其应用的制作方法
技术领域：
公开了用于检测李斯特氏菌(Listeria spp.)的寡核苷酸组和试剂盒以及通过使用该寡核苷酸组和试剂盒检测样品中李斯特氏菌的方法。
背景技术：
李斯特氏菌(Listeria spp.)的细菌为革兰氏阳性、无芽孢且为运动杆菌，并且可以在大约_4°C至大约45°C的宽的温度范围内以及大约彡5.5至大约9.5的宽的pH范围内生长。李斯特氏菌属(Listeria genus)包含六个种，包括Listeria monocytogenes (单核细胞增生性李斯特氏菌)、L.1nnocua (英诺克李斯特氏菌)、L.welshimeri (威尔斯李斯特氏菌)、L.seeligeri (西尔李斯特氏菌)、L.1vanovii (伊氏李斯特氏菌)和L.grayi (格氏李斯特氏菌)。在李斯特氏菌的这些种中，L.monocytogenes是大部分人类李斯特氏菌病病例的病源。免疫力低下者、孕妇、老年人、新生儿易被这些种感染。李斯特氏菌病的典型症状包括败血病、脑膜炎和流产。食用被污染的食物是李斯特氏菌感染的主要原因。已经存在由食用诸如未经高温消毒的牛奶、污染的奶酪、凉拌卷心菜等污染的食物导致的各种由李斯特氏菌引起的感染的流行病。因此，日益需要快速、灵敏并准确地检测诸如食物、表面拭样(surface wipe)或医学样品的样品中的李斯特氏菌的方法
发明内容
技术问题公开了一种适于快速、灵敏并准确地检测李斯特氏菌的组合物。组合物包括:第一寡核苷酸，序列为 seq id no: 19 =X1CcaagcagtgagtgtgagaaX2 (seq id no: 19)，其中，位置
I处的X1是T或者空缺，位置22处的X2是G或者空缺；以及第二寡核苷酸，序列为SEQ IDno:20 =X1X1GacagcgtgaaatcaggX3X3X4 (seq id N0:20)，其中，位置 1 和 2 处的 X1 均为 τ 或
者空缺，位置20和21处的X3是A或者空缺，位置22处的X4是C或空缺。在一个实施例中，SEQ ID NO: 19的第一寡核苷酸中的核苷酸残基的数目可以是20或21，SEQ ID N0:20的第二寡核苷酸中的核苷酸残基的数目是18-21。在另一个实施例中，第一寡核苷酸是从SEQ ID NO: 1-3:CCAAGCAGTGAGTGTGAGAAG(SEQ ID NO:1)、CCAAGCAGTGAGTGTGAGAA (SEQ ID NO:2)和 TCCAAGCAGTGAGTGTGAGAA (SEQID NO:3)的寡核苷酸的组中选择的一种或多种。在实施例中，第二寡核苷酸是从SEQ ID NO:5-9:TGACAGCGTGAAATCAGGAAC (SEQID NO:5)、TTGACAGCGTGAAATCAGG (SEQ ID NO:6)、TGACAGCGTGAAATCAGGA (SEQ ID NO:7)、TGACAGCGTGAAATCAGGA (SEQ ID NO:8)和 GACAGCGTGAAATCAGGA (SEQ ID NO:9)的寡核苷酸的组中选择的一种或多种。根据实施例，组合物还可以包含SEQ ID N0:21或SEQ ID NO:22的探针寡核苷酸:TGAGCTGrUrGATGG (SEQ ID NO: 21 )，其中，分别在位置8和9处的“rU”和“rG”中的至少一个是核糖核苷酸；以及CCATCACAGCrUrCrArUGCTTCGC(SEQ ID N0.22)，其中，分别在位置11、
12、13、14处的“rU”、“rC”、“rA”和“rU”中的至少一个是核糖核苷酸。在一个实施例中，探针寡核苷酸具有DNA序列和RNA序列，并且是从由SEQ ID NO: 10-14的寡核苷酸组成的组中选择的一种或多种:TGCGAAGCrATGAGCTGTGATGG (SEQ ID NO: 10)，其中，位置 9 处的“rA”是核糖核苷酸；TGCGAAGrCATGAGCTGTGATGG (SEQ ID NO: 11)，其中，位置8处的“rC”是核糖核苷酸；CCATCACAGCTCArUGCTTCGC (SEQ ID NO: 12)，其中，位置 14 处的 “rU” 是核糖核苷酸；CCATCACAGCTrCrArUGCTTCGC(SEQ ID NO: 13)，其中，分别在位置 12、13 和 14 处的“rC”、“rA” 和 “rU” 是核糖核苷酸；以及 CCATCACAGCrUrCrArUGCTTCGC (SEQ ID N0:14)，其中，分别在位置11、12、13和14处的“rU”、“rC”、“rA”和“rU”是核糖核苷酸。探针寡核苷酸用例如荧光共振能量转移(FRET)对的可检测标记物标记。在另一个实施例中，提供了用于检测样品中的李斯特氏菌的试剂盒，该试剂盒包含上面的组合物。试剂盒还可以包括扩增活性和RNA酶H。在实施例中，试剂盒还可以包括用于靶李斯特氏菌RNA序列的反转录的逆转录酶活性。在另一个实施例中，提供了检测样品中的李斯特氏菌的方法。该方法包括:(a)扩增样品中的李斯特氏菌的靶核酸，以产生拷贝数目增加的靶核酸，扩增包括将SEQ IDNO: 19的第一引物和SEQ ID NO:20的第二引物杂交到样品中的靶核酸以获得靶核酸与引物的杂交产物，以及使用依赖模板的核酸聚合酶延伸杂交产物的第一引物和第二引物以产生延伸的引物产物；(b)使靶核酸与能够杂交到靶核酸的至少一种探针寡核苷酸杂交，以获得靶核酸:探针寡核苷酸的杂交产物，探针包含DNA序列和RNA序列并结合到可检测标记物；(c)使靶核酸:探针的杂交产物与RNA酶H接触以切割探针，导致探针片段从靶核酸分离；以及(d)检测可检·测标记物。探针寡核苷酸可以是SEQ ID N0:21或22的寡核苷酸。探针寡核苷酸可以是SEQ ID NO: 10-14的寡核苷酸中的一种。探针寡核苷酸可以用例如荧光共振能量转移对的可检测标记物标记。在另一个实施例中，提供了检测样品中的李斯特氏菌的靶RNA序列的方法。该方法包括:Ca)在逆转录酶活性和逆扩增引物的存在下逆转录李斯特氏菌的靶RNA，以产生靶RNA的靶cDNA ；(b)扩增靶cDNA序列以产生拷贝数目增加的靶核酸，扩增包括将SEQ IDNO: 19的第一引物和SEQ ID NO:20的第二引物杂交到靶cDNA以获得靶核酸与引物的杂交产物，以及使用依赖模板的核酸聚合酶延伸杂交产物的第一引物和第二引物以产生延伸的引物产物；(c)使靶核酸杂交到基本上与靶cDNA互补的至少一种探针寡核苷酸以获得靶核酸:探针寡核苷酸的杂交产物，其中，探针包含DNA序列和RNA序列并结合到可检测标记物；(d)使靶核酸:探针寡核苷酸的杂交产物与RNA酶H接触以切割探针；以及(e)检测来自探针上的可检测标记物的信号发射的增加，其中，信号的增加表示样品中存在李斯特氏菌的靶RNA。可以通过使用诸如聚合酶链式反应(第4，683，195号、第4，683，202号和第4，800，1590号美国专利)的任何核酸扩增方法，或者通过使用诸如连接酶链式反应(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA88:189-193)、自主维持序列复制(Self-Sustained SequenceReplication) (GuatelIi 等人,1990, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA87:1874-1878)、链替代扩增(第5，270，184号、第5,455, 166号美国专利)、转录扩增系统(Kwoh等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA86:1173-1177),Q-β 复制酶(Lizardi 等人，1988，Bio/Technology6:1197)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、切割片段长度多态性(第5，719，028号美国专利)、等温和嵌合引物起始的核酸扩增(Isothermal and Chimeric Primer-1nitiated Amplification ofNucleic Acid)(第 6, 951, 722 号美国专利)、分支延伸扩增法(Ramification-extensionAmplification Method)(第5，719，028号和第5，942，391号美国专利)或用于核酸扩增的其他的合适的方法的扩增反应来执行样品中的靶序列的扩增。可以同时或顺序地执行扩增、杂交和接触的步骤。在实施例中，可以在扩增之前在富集培养基中培养包含李斯特氏菌的样品，以增强李斯特氏菌的生长。这样的富集培养基可以包含每IL蒸馏水大约IOg至大约40g的胰蛋白胨大豆肉汤(tryptic soy broth)、大约Ig至大约IOg的酵母提取物以及大约Ig至大约IOg的氯化锂。富集培养基还可以包含从由以下组分组成的组中选择的至少一种组分:大约Ig至大约IOg的牛肉膏(beef extract)和/或包含大约0.0lmg至大约0.5mg的核黄素、大约0.5mg至大约1.5mg的硫胺素和大约0.0lmg至大约1.5mg的生物素的维生素混合物；大约Ig至大约5g的丙酮酸；以及大约0.0lg至大约Ig的柠檬酸铁铵。富集培养基还可以包含例如3-(N-吗啉基)丙磺酸(MOPS)及其钠盐的缓冲化合物。在另一个实施例中，富集培养基可以包含每IL蒸懼水大约Img至大约IOmg的口丫唳黄、大约5mg至大约15mg的多粘菌素B、大约IOmg至大约30mg的头孢他卩定。例如，富集培养基可以包含每IL蒸馏水:大约IOg至大约40g的胰蛋白胨大豆肉汤、大约Ig至大约IOg的酵母提取物、大约Ig至大约IOg的氯化锂；大约Ig至大约IOg的牛肉膏和/或包含大约0.0lmg至大约0.5mg的核黄素、大约0.5mg至大约1.5mg的硫胺素和大约0.0lmg至大约1.5mg的生物素的维生素混合物；大约Ig至大约5g的丙酮酸或丙酮酸盐；大约0.1g至大约Ig的柠檬酸铁铵；大约4g的3-(N-吗啉基)丙磺酸(MOPS)和大约7.1g的MOPS钠；以及大约Img至大约IOmg的B丫唳黄、大约5mg至大约15mg的多粘菌素B和大约IOmg至大约30mg的头孢他啶。在实施例中，富集培养基不包含七叶苷和蛋白胨中的一种或两种。在另一个实施例中，富集培养基可以包含每IL蒸馏水:大约30g的胰蛋白胨大豆肉汤、大约6g的酵母提取物、大约Ig至大约IOg的氯化锂；大约5g的牛肉膏和/或包含大约0.1mg的核黄素、大约1.0mg的硫胺素和大约1.0mg的生物素的维生素混合物；大约2g的丙酮酸钠 ’大约0.2g的柠檬酸铁铵；大约4g的3-(N-吗啉基)丙磺酸(MOPS)和大约7.1g的MOPS钠；以及大约5mg的吖啶黄、大约IOmg的多粘菌素B和大约20mg的头孢他啶。在另一个实施例中，富集培养基可以是脑心浸出肉汤(brain-heart infusionbroth)或者含有0.6%的酵母提取物的胰蛋白胨大豆肉汤。样品可以是食物样品、医学样品或表面拭样。技术方案除非另有说明，否则这里描述的实施例的实践采用本领域内常规的分子生物学技术。这样的技术对本领域 技术人员来讲是公知的，并且在文献中被充分地解释。参见，例如，Ausubel 等人，Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley&Sons 公司，NY, N.Y.(1987-2008),包括所有增刊；Sambrook 等人，Molecular Cloning:A LaboratoryManual,第二版，Cold Spring Harbor, N.Y.(1989)。除非另有定义，否则这里使用的所有技术术语和科学术语具有与本领域技术人员所通常理解的意思相同的意思。本说明书也提供了对术语的定义，以有助于解释本申请的公开内容和权利要求书。如果定义与别处的定义不一致，则将以本申请中所阐述的定义为准。这里使用的术语“扩增”是指增加核苷酸序列的拷贝数的任何过程。核酸扩增描述了核苷酸由此包含到例如DNA或RNA的核酸中的过程。这里使用的术语“核苷酸”是指碱基-糖-磷酸的结合体。核苷酸是核酸的单体单元，例如，DNA或R NA。术语“核苷酸”包括诸如rATP、rCTP、rGTP或rUTP的核糖核苷三磷酸和诸如dATP、dCTP、dGTP或dTTP的脱氧核糖核苷三磷酸。这里使用的术语“核苷”是指碱基-糖的结合体，S卩，缺少磷酸配基的核苷酸。术语“核苷”和“核苷酸”在本领域中可交换地使用。例如，脱氧尿苷核苷酸-dUTP是脱氧核苷三磷酸。它用作DNA单体，例如，在被插入到DNA中之后成为dUMP或脱氧尿苷酸。就这一点而言，即使在得到的DNA中不存在dUTP配基，也可以认为dUTP已经被插入。术语“聚合酶链式反应(PCR)”通常是指增加样品中靶核酸的拷贝数目的扩增方法。在第4，683，202号、第4，683，195号、第4，800，159号和第4，965，188号美国专利中详细地描述了该程序，它们内容全部包含于此。样品可以包括一种核酸或多种核酸。通常，PCR包括将至少两种可延伸的引物核酸混合到包含靶核酸的反应混合物中。引物与双链靶序列的相反链互补。在核酸聚合酶和核酸单体的存在下，例如，在dNTP和/或rNTP的存在下，对反应混合物进行热循环以通过引物的延伸扩增靶核酸。通常，热循环可以包括:退火以杂交引物和靶核酸；使用核酸聚合酶延伸引物；以及使杂交的引物延伸产物和靶核酸变性。术语“逆转录-PCR (RT-PCR)”是使用RNA模板以及逆转录酶或具有逆转录酶活性的酶在依赖DNA的DNA聚合酶引物延伸的多个循环之前首先产生单链cDNA分子的PCR。术语“多重PCR”是指在单一反应中产生多于两种的扩增目标产物的PCR，典型地通过包含两种以上的引物。这里使用的术语“核酸”是指包括两个以上的核苷酸的聚合物。术语“核酸”与“多核苷酸”或“寡核苷酸”可交换地使用。核酸包括DNA和RNA。核酸的结构可以是双链和/或单链。这里使用的术语“核酸类似物”是指包含至少一种核苷酸类似物和/或至少一种磷酸酯类似物和/或至少一种戊糖类似物的核酸。核酸类似物的示例包括其中磷酸酯和/或糖磷酸酯键被诸如N- (2-氨乙基)-甘氨酰胺和其他酰胺的其他类型的键取代的核酸。核酸类似物是指包含至少一种核苷酸类似物和/或至少一种磷酸酯类似物和/或至少一种戊糖类似物并且可以通过杂交形成双螺旋的核酸。这里使用的术语“退火”和“杂交”是可交换的，并且指一个核酸与另一个核酸的碱基对的相互作用，导致形成双链体、三链体或其他更高级的结构。在某些实施例中，主要的相互作用是通过沃森/克里克以及胡斯坦型氢键的碱基特异性，例如，A/T和G/C。在某些实施例中，碱基堆积和输水相互作用也可以有助于双链体的稳定。
这里使用的术语“探针”是指具有与靶核酸序列互补的序列并且能够与靶核酸杂交形成双链体的核酸。探针的序列可以与靶核酸序列充分或完全互补。可以标记探针使得可以使用PCR同时检测靶核酸。这里使用的术语“靶核酸”或“靶序列”包括可以被扩增和/或检测的靶核酸的全长或片段。靶核酸可以存在于用于扩增的两个引物之间。就寡核苷酸而言，这里使用的术语“杂交寡核苷酸”指在单个分子内包含DNA部分和RNA部分的寡核苷酸分子。杂交寡核苷酸可以包含一个以上的DNA部分和一个RNA部分，例如 DNA-RNA、RNA-DNA 或 DNA-RNA-DNA 寡核苷酸。在实施例中，用于检测李斯特氏菌的寡核苷酸组包括:至少一个第一引物，从由SEQ ID N0.1-3组成的组中选择；至少一个第二引物，从由SEQ ID N0.5_9组成的组中选择；以及至少一个探针，从由SEQ ID N0.10-14组成的组中选择。包含从SEQ ID N0.1-3中选择的至少一种第一引物和从SEQ ID N0.5-9中选择的至少一种第二引物的引物对具有与靶核酸的各个相反链互补的序列，并且可以限定靶核酸。引物对与李斯特氏菌的23S rRNA基因互补，并且可以用于特异性地扩增23S rRNA基因中的靶核酸。23S rRNA基因的长度可以是大约3000bp。当用于扩增时，引物对可以扩增李斯特氏菌属的任何李斯特氏菌种的靶核酸序列，但不扩增非李斯特氏菌的靶核酸序列。因此，引物对特异性地扩增李斯特氏菌的靶核酸，并具有单拷贝灵敏度。在一个实施例中，探针可以具有DNA-RNA-DNA的杂交结构。探针可以是核酸或核酸类似物。探针也可以是被保护的核酸。例如，探针的DNA或RNA部分可以被部分地甲基化，以抵抗被例如RNA酶H的RNA-特 异酶降解。可以修饰探针。例如，可以将探针的碱基部分部分地或完全地甲基化。这样的修饰可以抑制酶或化学降解。可以封闭核酸探针的5’端或3’端-OH基。可以封闭核酸探针的3’端OH基，由此导致不能通过依赖模板的核酸聚合酶延伸。探针可以具有可检测标签。可检测标签可以是通过本领域内已知的任何方法可检测的任何化学配基。可检测标签的示例包括通过光谱学、光化学或者通过生物化学、免疫化学或化学的方法可检测的任何配基。可以根据标签的类型以及标签和探针的位置来选择标记核酸探针的合适方法。标签的示例包括酶、酶底物、放射性物质、荧光染料、发色团、化学发光标签、电化学发光标签、具有特异性结合部分的配体以及相互作用以增加、改变或减小检测信号强度的其他标签。这些标签在PCR热循环的整个过程中始终是稳定的。可检测标签可以是荧光共振能量转移(FRET)对。可检测标签是包括通过合适距离分开的荧光供体和荧光受体的FRET对，其中，供体的荧光发射通过受体淬灭。然而，当供体-受体对通过切割分离时，供体的荧光发射增强。当供体-受体对接近时，处于其激发态的供体发色团可以将能量转移给受体发色团。这种转移常常是非辐射的，并通过偶极-偶极结合发生。充分地增加发色团之间的距离的任何过程将降低FRET的效率，从而可以辐射地检测供体发色团的发射。供体发色团的示例包括FAM、TAMRA, VIC、JOE、Cy3、Cy5和德克萨斯红。选择受体发色团使得它们的激发光谱与供体的发射光谱重叠。这样的供体-受体对的示例是FAM-TAMRA。另外，可检测标签的示例是将淬灭宽范围供体的非荧光受体。合适的供体-受体FRET对的其他示例对本领域技术人将是已知的。在实施例中，寡核苷酸探针在溶液中可以以可溶性形式或自由形式存在。在一个实施例中，寡核苷酸探针可以附着到固体支撑。不同的探针可以附着到固体支撑并且可以用于同时检测样品中不同的靶序列。可以在不同的探针上使用具有不同荧光波长的报告分子，因此能够杂交到不同的探针以单独地检测。用于固定寡核苷酸探针的优选类型的固体支撑的示例包括聚苯乙烯、抗生物素蛋白涂覆聚苯乙烯珠纤维素(avidin coated polystyrene beads cellulose)、尼龙、丙烯酰胺凝胶和激活右旋糖酐、可控孔度玻璃(CPG)、玻璃板和高度交联的聚苯乙烯。由于这些固体支撑化学稳定、易于功能化且表面积好限定，所以它们优选用于杂交和诊断研究。考虑到
它们与寡核苷酸合成的兼容性，特别优选的是诸如可控孔度玻璃(500 A、1000 A)和非膨胀高度交联聚苯乙烯(1000 A )的固体支撑。寡核苷酸探针可以以各种方式附着到固体支撑。例如，探针可以通过将探针的3’端或5’端核苷酸附着到固体支撑而附着到固体支撑。然而，探针可以通过用于使探针与固体支撑分开的连接物附着到固体支撑。连接物最优选地是至少30个原子长，更优选地是至少50个原子长。固定到固体支撑的探针的杂交通常需要探针与固体支撑分开至少30个原子，更优选至少50个原子。为了实现这种分开，连接物通常包括位于连接物和3’核苷酸之间的空间。对于寡核苷酸的合成，通常通过酯键将连接臂附着到3’核苷酸的3’ -0H，可以使用碱性试剂切割酯键以从固体支撑释放寡核苷酸。可以用于将寡核苷酸探针附着到固体支撑的各种连接物在本领域内是已知的。连接物可以由不显著干扰靶序列和附着到固体支撑的探针的杂交的任何化合物形成。连接物可以由能够通过自动合成而容易地添加到连接物上的同聚物寡核苷酸形成。可选择地，诸如功能化聚乙二醇的聚合物可以被用作连接物。与同聚物寡核苷酸相比，优选这样的聚合物，这是由于它们不显著干扰探针与靶寡核苷酸的杂交。特别优选聚乙二醇，因为其可以购得、在有机介质和水介质中都可溶、易于功能化并且在寡核苷酸合成和合成之后的条件下完全稳定。固体支撑、连接物和探针之间的键优选地在高温下在碱性条件下除去碱基保护基团的过程中不被切割。优选的键的示例包括氨基甲酸酯键和酰胺键。探针的固定在本领域内是公知的，本领域技术人员可以确定固定条件。根据本方法的一个实施例，将杂交探针固定在固体支撑上。在有利于杂交的条件下，将寡核苷酸探针与核酸的样品接触。在未杂交的状态下，受体淬灭荧光标签。在与目标杂交时，突光标签与淬灭剂分离而使突光发射增强。杂交探针固定到固体支撑也能够使与探针杂交的靶序列容易地从样品分离。在后面的步骤中，可以将分离出的靶序列与固体支撑分开，并且可以基于研究者的具体需求根据本领域公知的方法(例如，纯化、扩增)处理靶序列。在实施例中，适于检测李斯特氏菌的寡核苷酸组可以包括SEQ ID N0.3的引物、SEQ ID N0.7的引物以及SEQ ID N0.12的探针。寡核苷酸组可以用于靶核酸的扩增和检测。扩增可以包括使用依赖模板的聚合酶来延伸引物，从而形成PCR片段或扩增 子。可以通过从由聚合酶链式反应组成的组中选择的任何方法或者通过使用诸如连接酶链式反应、自主维持序列复制、链替代扩增、转录扩增系统、Q-β复制酶、基于核酸序列的扩增(NASBA)、切割片段长度多态性、等温和嵌合引物起始的核酸扩增、分支延伸扩增法或用于核酸扩增的其他的合适方法的扩增反应来实现扩增。扩增可以包括靶核酸的同步实时检测。术语“PCR片段”或“扩增子”指特定的靶核酸扩增之后产生的多核苷酸分子(或多个分子的集合)。PCR片段典型地是但不限于DNA PCR片段。PCR片段可以是单链或双链或者它们任意浓度比的混合物。PCR片段可以是100-500个核苷酸长或更长。扩增“缓冲液”是添加到扩增反应中的化合物，它通过调节扩增反应来改变扩增反应的一种或多种组分的稳定性和/或活性。本发明的缓冲剂与PCR扩增和RNA酶H的切割活性兼容。缓冲液的示例包括但不限于HEPES (4-(2-羟乙基)-1_哌嗪乙磺酸)、MOPS(3-0-吗啉基)-丙磺酸)以及含有缓冲液的乙酸或磷酸等。另外，PCR缓冲液可通常包含高达大约70mM KCl和大约1.5mM或更高的MgCl2以及大约50-200 μ M dATP、dCTP、dGTP和dTTP中的每一种。本发明的缓冲液可以包含添加剂以优化逆转录PCR或PCR反应的效率。添加剂是加入组合物的化合物，其改变组合物的一种或多种组分的稳定性和/或活性。在某些实施例中，组合物是扩增反应组合物。在某些实施例中，添加剂使污染物酶失活、稳定蛋白质折叠和/或减少聚集。在扩增反应中可以包含的示例性添加剂包括但不限于三甲铵乙内酯、甲酰胺、KCl、CaCl2、MgOAc、MgCl2、NaCl、NH4OAc、Na1、Na(CO3)2、LiCl, MnOAc, NMP、海藻糖、二甲基亚砜(“DMS0”)、丙三醇、乙二醇、二硫苏糖醇(“DTT”)、焦磷酸酶(包括但不限于嗜酸热原体无机焦磷酸酶(Thermoplasma acidophilum inorganicpyrophosphatase ) (“ TAP，，))、牛血清白蛋白(“BSA”)、丙二醇、甘氨酰胺、CHES、Perco11、金精三羧酸、Tween20> Tween21、Tween40> Tween60> Tween85、Bri j30> NP-40、Triton X-100、CHAPS、CHAPS0、Mackernium、LDA0(N-十二烷基-N，N-二甲胺-N-氧化物)、两性洗涤剂 3-10、Xwittergent3-14> Xwittergent SB3-16、Empigen、NDSB-20、T4G32、大肠杆菌 SSB、RecA、切口内切酶(nicking endonuclease)、7_deazaG、dUTP、阴离子洗漆剂、阳离子洗漆剂、非离子洗涤剂、两性洗涤剂、固醇、渗透剂、阳离子以及任何其他可以改变扩增效率的化学制品、蛋白质或辅因子。在某些实施例中，两种或多种添加剂包括在扩增反应中。如果添加剂不干扰RNA酶H的活性，则可以选择地添加该添加剂以改善引物退火的选择性。如这里所使用，应用于酶的术语“热稳定”是指在升高的温度下(例如，在55°C或更高)保持其生物活性或者在加热和冷却的重复循环之后保持其生物活性的酶。热稳定的多核苷酸聚合酶特别适用于PCR扩增反应。如这里所使用，“热稳定聚合酶”是对热相对稳定并且不需要在每个PCR循环之前添加的酶。热稳定聚合酶的非限制性示例可以包括从Thermus aquaticus (栖热水生菌)(Taq聚合酶)、Thermus thermophiIus(嗜热栖热菌)(Tth聚合酶)、Thermococcus Iitoralis(嗜热高温球菌)(Tli 或 VENT 聚合酶)、Pyrococcus furiosus (Pfu 或 DEEPVENT 聚合酶)、Pyrococcus woosii (Pwo 聚合酶)和其他火球菌种、Bacillus stearothermophiIus (嗜热脂肪芽孢杆菌)(Bst聚合酶)、Sulfolobus acidocaldarius (嗜酸热硫化叶菌)(Sac聚合酶)、Thermoplasma acidophilum (嗜酸热原体)(Tac 聚合酶)、Thermus rubber (Tru 聚合酶)、Thermus brockianus (DYNAZYME 聚合酶)、Thermotoga neapolitana (新阿波罗栖热袍菌)(Tne聚合酶)、T hermotoga maritime (海栖热袍菌)(Tma)和Thermotoga属的其他种(Tsp 聚合酶)以及 Methanobacterium thermoautotrophicum (甲烧杆菌)(Mth 聚合酶)的嗜热细菌分离的聚合酶。PCR反应可以包含多于一种的具有互补性质的热稳定聚合酶，以对靶序列进行更有效的扩增。例如，具有高持续合成性(复制大核苷酸片段的能力)的核苷酸聚合酶可以与具有校正功能(在靶核酸序列延伸过程中改正错误的能力)的另一种核苷酸聚合酶互补，因此产生能够高保真地复制长的靶序列的PCR反应。热稳定聚合酶可以以其原型形式使用。可选择地，可以修改聚合酶以包含酶的片段或者包含提供有利于PCR反应的有益性质的突变。在一个实施例中，热稳定聚合酶可以是Taq聚合酶。已知许多性质提高的 Taq 聚合酶的变异体,包括 AmpliTaq、AmpliTaq Stoffel 片段、SuperTaq、SuperTaqplus、LA Taq、LApro Taq和 EX Taq0研究基因表达的最广泛使用的技术之一是利用mRNA序列的第一链cDNA作为模板进行通过PCR的扩增。该方法通常被称作逆转录-PCR，其利用了 PCR程序的高灵敏度和高特异性并被广泛用于RNA的检测和定量。执行为终点测定或实时测定的逆转录-PCR程序包括两个独立的分子合成:(i)从RNA模版合成cDNA ;以及(ii)通过PCR扩增复制新合成的cDNA。为试图解决经常与逆转录-PCR相关的 技术问题，考虑到该程序的三个基本步骤，已经形成了一些操作规程:(a)RNA的变性和反向引物的杂交；(b)cDNA的合成；以及(c)PCR扩增。在所谓的“未结合”逆转录-PCR程序(例如，两步逆转录-PCR)中，使用对逆转录酶活性来讲最佳的缓冲液条件，作为单独的步骤来执行逆转录。合成cDNA之后，稀释反应物以将MgCl2和脱氧核苷三磷酸(dNTP)的浓度降低到对Taq DNA聚合酶活性来讲最佳的条件，根据标准条件执行PCR (参见第4，683，195号和第4，683，202号美国专利)。相反，“结合”逆转录PCR方法使用对于逆转录酶和Taq DNA聚合酶的活性来讲通用的缓冲液。在一种情况下，反向引物的退火是加酶之前的单独步骤，然后将酶加到单独的反应器中。在另一种情况下，逆转录酶活性是热稳定Tth DNA聚合酶的组成部分。在Mn2+的存在下执行退火和cDNA合成，然后，在通过螯合剂除去Mn2+之后，在Mg2+的存在下执行PCR。最后，“连续”方法(例如，一步逆转录-PCR)将三个逆转录-PCR步骤整合为单个连续反应，避免了为加入组分或酶而打开反应管。连续逆转录-PCR已经被描述为使用热稳定Taq DNA聚合酶和Tth聚合酶的逆转录酶活性的单酶体系以及使用AMV逆转录酶和Taq DNA聚合酶的二酶体系，其中，省略了初始的65°C RNA变性的步骤。实时逆转录PCR的第一步是使用模板特异DNA引物中的一个来产生互补DNA链。在传统PCR反应中，将该产物变性，将第二模板特异引物键合到cDNA，并延伸以形成双链DNA。在后续的温度循环中扩增该产物。为了维持最高的灵敏度，重要的是在cDNA合成之前使RNA不被降解。由于在该程序的第一步中形成的RNA = DNA杂交物可以用作RNA酶H的底物，所以在反应缓冲液中存在RNA酶H将导致在该程序的第一步中形成的RNA = DNA杂交物被不希望地降解。防止该问题有两种主要的方法。一种方法是使用诸如蜡的屏障将RNA酶H与其余的逆转录反应物物理地隔开，其中，蜡将在开始的高温DNA变性步骤中熔化。第二种方法是改进RNA酶H，使其在典型地为45°C -550C的逆转录温度下失活。本领域内已知的几种方法包括使RNA酶H与抗体反应或者进行可逆的化学修饰。例如，如这里所使用的热启动RNA酶H活性可以是在碱性条件下RNA酶H与顺式乌头酸酐反应之后产生的具有可逆化学修饰的RNA酶H。当将改进的酶用在利用Tris基缓冲液的反应中并将温度升高至95°C时，溶液的pH下降并且RNA酶H活性恢复。该方法允许在逆转录开始之前将RNA酶H包含于反应混合物中。Walder等人的第2009/0325169号美国专利申请中描述了可以在本发明中使用的RNA酶H酶和热启动RNA酶H酶的另外的示例，通过弓丨用将该美国专利申请的内容全部包含于此。一步逆转录-PCR相比于未结合逆转录-PCR具有几点优点。一步逆转录-PCR对反应混合试剂和核酸产物的处理比未结合逆转录-PCR (例如，在两个反应步骤之间为了加入组分或酶打开反应管)更少，因此劳动强度更小，减少了所需的人时(person hour)数。一步逆转录-PCR还降低了被污染的风险。已经证明一步逆转录-PCR的灵敏度和特异性非常适合研究给定样品中的一个到若干个基因的表达水平或病原体RNA的检测。典型地，这种程序已经被限于使用基因特异引物来开始cDNA合成。结合这些逆转录-PCR技术通过实时检测来测量PCR反应动力学的能力使得能够以高灵敏度准确且精确地确定RNA的拷贝数。通过在扩增过程中通过荧光双重标记杂交探针技术(例如，下面讨论的5’荧光核酸酶测定(“Taq-Man”)或核酸内切酶测定(有时被称作“CataCleave”))荧光监测和测量PCR产物来检测逆转录PCR产物，使以上技术变得可能。后扩增扩增子的检测费时费力。已经开发了实时方法来对PCR程序中的扩增进行监测。这些方法典型地使用键合到新合成DNA的荧光标记探针或在插入双链DNA时荧光发射增加的染料。通常将探针设计成在没有目标的情况下，通过两个发色团之间的荧光共振能量转移(FRET)使供体发射淬灭。当供体发色团和受体发色团非常接近时，处于激发态的供体发色团可以将能量转移给受体发色团。这种转移常常是非辐射的，并通过偶极-偶极结合发生。充分地增加发色团之 间的距离的任何过程将降低FRET的效率，从而可以辐射地检测到供体发色团的发射。常见供体发色团包括？41^八1狀、￥1(:、1(^工73工75和德克萨斯红。选择受体发色团使得它们的激发光谱与供体的发射光谱重叠。这样的供体发色团和受体发色团的示例是FAM-TAMRA。也存在将淬灭宽范围供体的非荧光受体。合适的供体_受体FRET对的其他示例对本领域技术人将是已知的。能够用于PCR实时检测的FRET探针的常见示例包括分子信标(例如，第5，925，517号美国专利)、TaqMan探针(例如，第5，210，015号和第5，487，972号美国专利)和CataCleave探针(例如，第5，763，181号美国专利)。分子信标是单链寡核苷酸，其被设计成使得在未结合状态下探针形成供体发色团和受体发色团非常接近并且供体发射减少的二级结构。在合适的反应温度下，信标展开并特异性地结合到扩增子。一旦展开，供体发色团和受体发色团之间的距离增加，从而FRET反转并且可以使用专用设备来监测供体的发射。TaqMan和CataCleave技术与分子信标不同之处在于:使用的FRET探针被切割,从而供体发色团和受体发色团变得充分分开以使FRET反转。TaqMan技术使用5’端标记有供体发色团并且3’端标记有受体发色团的单链寡核苷酸探针。用于扩增的DNA聚合酶必须包含5’->3’的核酸外切酶活性。TaqMan探针结合到扩增子的一条链，同时引物结合。随着DNA聚合酶延伸引物，聚合酶将最终与结合的TaqMan探针相遇。这时,聚合酶的核酸外切酶活性将从5’端开始顺序地降解TaqMan探针。随着探针被消化，包含探针的单核苷酸被释放到反应缓冲液中。供体扩散离开受体，而FRET被反转。监测来自供体的发射以确定探针的切割。由于TaqMan的作用方式，对于每个PCR循环，只可以监测到一次特异扩增子。引物通过TaqMan靶位点的延伸产生了双链产物，其防止了 TaqMan探针的再次结合，直到扩增子在下一个PCR循环中被变性。第5，763，181号美国专利描述了另一实时检测方法(称作“CataCleave”)，通过引用将该美国专利的内容包含于此。CataCleave技术与TaqMan不同之处在于:由不具有聚合酶活性的第二酶完成探针的切割。CataCleave探针在分子内具有作为诸如限制酶或RNA酶的核酸内切酶的目标的序列。在一个实施例中，CataCleave探针具有嵌合结构，其中，探针的5’端和3’端由DNA构成并且切割位点包含RNA。探针的DNA序列部分在端部或内部标记有FRET对。PCR反应包括将RNA-DNA双链体的RNA序列部分特异性切割的RNA酶H酶。切割之后，探针的两段在反应温度下从靶扩增子分离下来并扩散到反应缓冲液中。随着供体和受体分开，FRET以与TaqMan探针相同的方式反转，并可以监测供体的发射。切割和分离再次产生用于CataCleave再次结合的位点。以这种方式，单个扩增子能够用作探针切割的多次循环或目标，直到引物延伸通过CataCleave探针结合位点。在实施例中，本方法中使用的探针是CataCleave探针。合适的CataCleave探针的示例包括包含SEQ ID N0:21、22、10、ll、12、13和14中一个序列的寡核苷酸。在实施例中，用于检测样品中的李斯特氏菌的试剂盒包括上述寡核苷酸。试剂盒还可以包括用于核酸扩增的试剂。该试剂还可以包括从由dNTP、rNTP、核酸聚合酶、尿嘧啶N-糖基化(UNG)酶、缓冲液和辅因子(例如，Mg2+)组成的组中选择的至少一种。核酸聚合酶可以选自于由DNA聚合酶、RNA聚合酶和逆转录酶组成的组。核酸聚合酶可以是热稳定的。核酸聚合酶可以在升高的温度下，例如在95°C或更高的温度下维持其活性。热稳定DNA聚合酶可以从由Thermus aquaticus、Thermus fIavus> Thermusruber、Thermus thermophiIus'Bacillus stearothermophiIus、Thermus lacteus、Thermusrubens、Thermotoga maritima、Thermococcus littoralis 和 Methanothermus fervidus组成的组中选择的耐热细菌中分离。热稳定DNA聚合酶的示例是Taq聚合酶。已知Taq聚合酶在大约70°C具有最佳活性。当探针与靶DNA杂交时， 李斯特氏菌检测试剂盒还可以包括特异性切割DNA-RNA杂交体的RNA部分的因子。切割因子可以是RNA酶H。切割因子可以特异性或非特异性切割RNA部分。特异性RNA切割因子可以是RNA酶HI。非特异性RNA切割因子可以是RNA酶HII。RNA酶H可以水解RNA-DNA杂交体中的RNA。对RNA酶H活性而言，需要二价离子(例如，Mg2+、Mn2+)。RNA酶H切割RNA3’ -O-P键以产生3’ -羟基端和5’ -磷酸端的产物。RNA 酶 H 可以选自于由 Pyrococcus furiosus RNA 酶 HI1、Pyrococcus horikoshi RNA 酶HII> Thermococcus litoralis RNA 酶 HI 和 Thermus thermophiIus RNA 酶 HI 组成的组。Pyrococcus furiosus RNA酶HII可以具有SEQ ID N0.15的氨基酸序列。RNA酶H可以是热稳定的。例如，RNA酶H可以在PCR的变性程序中保持其活性。切割因子可以是热稳定RNA酶HII的可逆的修饰形式，其处于其修饰形式时失活，而处于其未修饰形式时具有活性，其中，修饰是RNA酶HII与配体的结合、RNA酶HII的交联或RNA酶HII中的氨基酸残基的化学反应，其中，通过加热包含RNA酶HII的样品或者调节包含RNA酶HII的样品的pH使修饰的RNA酶HII的酶活性恢复。当包含DNA序列和RNA序列的探针的RNA部分被切割因子切割时，可以发生分离。这样的分离可以由于切割的复合体的解链温度的降低而自然发生，或者可以通过诸如温度升高的因素促进这样的分离。可以通过本领域内已知的任何方法检测分离的片段。在实施例中，检测样品中的李斯特氏菌的方法包括:(a)扩增样品中李斯特氏菌的靶核酸以产生拷贝数目增加的靶核酸，扩增包括将SEQ ID NO: 19的第一引物和SEQ IDNO:20的第二引物杂交到样品中的靶核酸以获得靶核酸与引物的杂交产物，以及使用依赖模板的核酸聚合酶延伸杂交产物的第一引物和第二引物以产生延伸的引物产物；(b)使靶核酸与能够杂交到靶核酸的至少一种探针寡核苷酸杂交，以获得靶核酸:探针寡核苷酸的杂交产物，其中，探针包含RNA序列和DNA序列并结合到可检测标记物；(c)使靶核酸:探针的杂交产物与RNA酶H接触以切割探针，导致探针片段从靶核酸分离；以及(d)检测可检测标记物。可以通过使用诸如聚合酶链式反应的任何核酸扩增方法或者通过使用诸如连接酶链式反应、自主维持序列复制、链替代扩增、转录扩增系统、Q-β复制酶、基于核酸序列的扩增(NASBA)、切割片段长度多态性、等温和嵌合引物起始的核酸扩增、分支延伸扩增法或用于核酸扩增的其他的合适方法的扩增反应来执行样品中靶序列的扩增。在实施例中，本方法包括:扩增李斯特氏菌的靶核酸片段，扩增包括将从SEQ IDNO: 1-3中选择的至少一种弓I物和从SEQ ID NO: 5-9中选择的至少一种弓I物杂交到样品中的靶核酸以获得杂交产物，以及使用依赖模板的核酸聚合酶延伸杂交产物的引物以产生延伸的引物产物；将靶核酸片段杂交到从由SEQ ID NO: 10-14的寡核苷酸组成的组中选择的至少一种探针，以获得杂交产物；使来自靶核酸片段与探针的杂交产物与RNA酶H接触以切割探针，导致探针片段从杂交产物分离；以及检测可检测标记物。现在将在下文中更详细地描述本方法。本方法包括扩增李斯特氏菌的靶核酸片段，扩增包括:将从SEQ ID NO: 1-3中选择的至少一种引物和从SEQ ID N0:5_9中选择的至少一种引物杂交到样品中的靶核酸以获得杂交产物；以及使用依赖模板的核酸聚合酶基于模板延伸杂交产物的引物以产生延伸的弓I物产物。杂交可以在液体介质中进行。`可以根据需要选择合适的液体介质。例如，液体介质可以是水、缓冲液或PCR混合物。缓冲液的非限制性示例包括PBS、Tris, MOPS和三甲基甘氨酸(Tricine)。可以在有助于引物与靶核酸结合的条件下，例如在低温和低盐浓度下进行杂交。有助于杂交的那些条件在本领域内已知。靶核酸可以是单链核酸或双链核酸。例如，双链靶核酸可以变性成为分离的单链。靶核酸可以是DNA或RNA。引物基于模板的延伸是指本领域内已知的聚合。核酸聚合酶可以是热稳定的。检测李斯特氏菌的方法包括将靶核酸片段杂交到从由SEQ ID N0:10_14的寡核苷酸组成的组中选择的至少一种探针以获得杂交产物。可以使用如上所述的探针。可以用诸如光学可检测标记物的可检测标记物来标记探针。可检测标记物在本领域内已知，并且可以合适地选择可检测标记物。例如，在本发明的实施例中，FRET对可以用于检测靶序列的目的。可以在液体介质中进行杂交。可以根据需要选择合适的液体介质。例如，液体介质可以是水、缓冲液或PCR混合物。缓冲液的非限制性示例包括PBS、Tris、M0PS (3-(N-吗啉基)丙磺酸)和三甲基甘氨酸。可以在有助于单链核酸探针与靶核酸结合的条件下，例如在低温和低盐浓度下进行杂交。有助于杂交的那些条件在本领域内已知。靶核酸可以是单链核酸或双链核酸。例如，如上所述，双链靶核酸可以变性成为分离的单链。靶核酸可以是DNA 或 RNA。检测李斯特氏菌的方法包括使来自靶核酸片段与探针的杂交产物与RNA酶H接触以切割探针，导致探针片段从杂交产物分离。杂交产物和RNA酶H可以在液体介质中彼此接触。可以根据需要选择合适的液体介质。例如，液体介质可以是水、缓冲液或PCR混合物。缓冲液的非限制性示例包括PBS、Tris、MOPS (3_(N_吗啉基)丙磺酸)和三甲基甘氨酸。可以在与PCR条件基本相同的条件下或在PCR混合物中进行接触。RNA酶H可以是RNA酶HI或RNA酶HII。RNA酶H可以水解RNA-DNA杂交体中的RNA。对RNA酶H活性而言，需要二价离子(例如，Mg2+、Mn2+)。RNA酶H切割RNA3’ -O-P键以产生3’ -羟基端和5’ -磷酸端的产物。RNA 酶 H 可以选自于由 Pyrococcus furiosus RNA 酶 HI1、Pyrococcus horikoshiRNA 酶 HI1、Thermococcus litoralis RNA 酶 HI 和 Thermus thermophiIus RNA 酶 HI 组成的组。Pyrococcus furiosus RNA酶HII可以具有SEQ ID N0.15的氨基酸序列。RNA酶H可以是热稳定的。例如，RNA酶H可以在PCR的变性程序中保持其活性。RNA酶H可以是热稳定RNA酶HII的可逆修饰形式，其处于其修饰形式时失活，而处于其未修饰形式时具有活性，其中，修饰是RNA酶HII与配体的结合、RNA酶HII的交联或RNA酶HII的化学修饰，其中，通过加热包含RNA 酶HII的样品或者调节包含RNA酶HII的样品的pH使修饰的RNA酶HII的酶活性恢复。这样的分离可以是由于切割使链的结合力减弱而自然发生，或者可以通过诸如温度升高的因素促进这样的分离。例如，PCR混合物可以包括将特异性切割RNA-DNA双链体的RNA序列部分的RNA酶H。切割之后，探针的两段在反应温度下从靶扩增子分离下来并扩散到反应缓冲液中。由于供体和受体分开，FRET反转，并且可以监测供体的发射。切割和分离再次产生用于探针再次结合的位点。以这种方式，单个扩增子能够用作探针切割的多次循环或目标，直到引物延伸通过探针结合位点。检测李斯特氏菌的方法包括检测探针核酸片段。可以通过根据可检测标记物合适地选择的各种方法中的任何方法进行探针核酸片段的检测。在整个说明书中，术语“可检测标记物”与“可检测标签”可交换地使用。例如，可以分析反应产物的尺寸来检测标记的探针片段。可以通过任何已知的方法，例如凝胶电泳、梯度沉降、尺寸排阻色谱法或同系层析法执行对探针核酸片段大小的分析。当使用的可检测标签是FRET对时，可以通过光谱学原位鉴定标记的探针片段，无需执行尺寸分析。因此可以实现标记的探针片段的实时检测。检测李斯特氏菌的方法还可以包括在扩增程序之前，在富集培养基中培养包含李斯特氏菌种的样品以增强李斯特氏菌种的生长。用于培养的富集培养基可以具有以下特征。富集培养基可以不包含从七叶苷和蛋白胨中选择的至少一种。在另一个实施例中，只要七叶苷不干扰根据本发明的实施例执行的任何步骤，例如，靶序列的扩增或通过切割标记探针检测靶序列以及检测切割的标记探针，则富集培养基可以包含七叶苷。富集培养基可以是用于增强李斯特氏菌种生长的培养基，其包含每IL蒸馏水大约IOg至大约40g的胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)、大约Ig至大约IOg的酵母提取物(YE)以及大约Ig至大约15g的氯化锂。富集培养基还可以包含从由以下组分组成的组中选择的至少一种组分:大约Ig至大约IOg的牛肉膏(BE)或包含大约0.0lmg至大约0.5mg的核黄素、大约0.5mg至大约1.5mg的硫胺素和大约0.0lmg至大约1.5mg的生物素的维生素混合物；大约Ig至大约5g的丙酮酸或丙酮酸盐；以及大约0.0lg至大约Ig的柠檬酸铁铵。富集培养基还可以包含缓冲化合物。缓冲化合物可以包括3-(N-吗啉基)丙磺酸(MOPS)游离酸及钠盐。例如，富集培养基可以包含大约4g的MOPS游离酸和大约7.1g的MOPS钠。可选择地，富集培养基可以包含大约Img至大约IOmg的吖啶黄、大约5mg至大约15mg的多粘菌素B、大约IOmg至大约30mg的头孢他唳以及大约IOmg至大约60mg的萘唳酸。富集培养基可以是这样的培养基，其包含每IL蒸馏水:大约IOg至大约40g的胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)、大约Ig至大约IOg的酵母提取物(YE)、大约Ig至大约IOg的氯化锂；大约Ig至大约IOg的牛肉膏(BE)和/或包含大约0.0lmg至大约0.5mg的核黄素、大约0.5mg至大约1.5mg的硫胺素和大约0.0lmg至大约1.5mg的生物素的维生素混合物；大约Ig至大约5g的丙酮酸或丙酮酸盐；大约0.0lg至Ig的柠檬酸铁铵；大约4g的MOPS游离酸和大约7.1g的MOPS钠；以 及大约Img至大约IOmg的B丫唳黄、大约5mg至大约15mg的多粘菌素B和大约IOmg至大约30mg的头孢他啶。例如，富集培养基可以是包含30g的胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)、6g的酵母提取物、Ig的七叶苷、IOg的LiCl、2g的丙酮酸钠、0.1g的柠檬酸铁铵、4g的MOPS游离酸、7.1g的MOPS钠、5g的牛肉膏以及包含大约0.1mg的核黄素、大约1.0mg的硫胺素和大约1.0mg的生物素的大约0.5%至大约3%的维生素混合物的培养基；或者可以是这样的培养基(有时称作A2.2培养基)，其包含每IL蒸馏水:大约30g的胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)、大约6g的酵母提取物(YE)、大约Ig至大约IOg的氯化锂；5g的牛肉膏(BE)和/或包含大约0.1mg的核黄素、大约1.0mg的硫胺素和大约1.0mg的生物素的维生素混合物；2g的丙酮酸钠；大约0.1g的柠檬酸铁铵；大约4g的MOPS游离酸和大约7.1g的MOPS钠；大约5mg的吖啶黄、大约IOmg的多粘菌素B和大约20mg的头孢他啶。使用这样的富集培养基可以消除或减少培养产物中的PCR抑制剂并且在抑制背景微生物群生长的同时促进李斯特氏菌种的生长，由此能够有效地检测样品中的李斯特氏菌。富集培养基可以是BHI (脑心浸出)肉汤，BHI肉汤可以以其原成分使用或者补充
有诸如氯化钠和/或磷酸二钠的微量成分。BHl可以在诸如BACTO*、BBL 或Difco*
的不同的商品名下从不同的来源购得。富集培养基也可以是补充或未补充0.6%的酵母提取物的胰蛋白胨大豆肉汤(TSB )。检测靶李斯特氏菌序列的示例性方案可以包括以下步骤:提供食物样品或表面拭样，将样品或拭样与生长培养基混合并温育以增加李斯特氏菌的数量或种群(“富集”)，破碎李斯特氏菌细胞(“裂解”)，以及将获得的裂解物进行扩增并检测靶Salmonella (沙门氏菌)序列。食物样品可以包括但不限于诸如烟熏三文鱼的鱼、乳制品(例如，牛奶和奶酪)和液蛋、家禽、果汁、肉(例如，猪肉糜、猪肉、牛肉糜或牛肉)或熟肉、诸如菠菜的蔬菜或者诸如不锈钢、橡胶、塑料和陶瓷的环境表面。根据菌落形成单位(CFU)的数目描述食品污染物的检测极限(L0D)，可以在25g固体食物或25mL液体食物中或者在限定面积的表面上检测CFU。根据定义，菌落形成单位是活菌数目的测量。与对死亡和存活的所有细胞计数的间接显微计数不同，CFU测量活细胞。一个CFU (—个细菌细胞)将在允许的条件下在琼脂板上生长形成单个菌落。美国食品检测检验部门(United States Food Testing InspectionService)将最小LOD限定为lCFU/25g固体食物或25mL液体食物或者ICFU/表面积。在实践中，不可能用单个CFU再接种食物样品或表面并确保细菌在富集过程中存活。通过以一个或多个目标水平接种样品并使用称作最可能数(MNP)的污染物的统计学评估分析该结果来克服这个问题。作为示例，可以通过在分光光度计中测量吸光度使李斯特氏菌培养菌生长到特定细胞密度。将十倍连续稀释的对象涂布到琼脂培养基上并对活细菌计数。使用该数据绘制CFU/涂布量相对于细胞密度的标准曲线。为了使MPN有意义，分析多个接种水平的试样。富集和提取之后，取出少量的样品用于实时分析。最终目标是获得25%和75%之间的部分回收(fractional recovery)(即，在使用采用CataCleave探针的RT-PCR的测定中，样品测试阳性在25%和75%之间，这将在下面进行描述)。选择这些部分回收百分比的原因在于，这些部分回收百分比转换为对于25g固体食物样品、25mL液体食物样品或表面的限定面积而言在0.3CFU和1.375CFU之间的MPN值。这些MPN值涵盖了所需的ICFU/样品的L0D。通过实践，能够评估稀释接种物的量(基于标准曲线)以获得这些部分回收。


图1是示出了对于李斯特氏菌核酸的浓度的实时聚合酶链式反应(PCR)的结果的曲线图；图2是示出了实时PCR扩增产物的Cp值与李斯特氏菌核酸的浓度的相关性的曲线图； 图3是对于扩增内标(IAC)靶核酸的浓度的实时PCR扩增结果的曲线图；图4是示出了实时PCR扩增产物的Cp值与IAC靶核酸的浓度的相关性的曲线图；图5是示出了对92株李斯特氏菌种的实时PCR结果(包容性测试)的曲线图；图6是示出了对非李斯特氏菌种的实时PCR结果(排他性测试)的曲线图；图7是示出了实时PCR产物与L.monocytogenes (单核细胞增生性李斯特氏菌)的细胞数目的相关性的曲线图；图8是示出了在不同的缓冲液中通过使用RNA酶H的一步RT-PCR扩增李斯特氏菌23S rRNA的结果的曲线图；图9是示出了使用Tfi缓冲液和AgPath缓冲液执行RT-PCR的结果的曲线图；图10 (A)-图10 (C)示出了当通过在RT-PCR之前对样品进行培养而使其富集时检测靶RNA的敏感度的增加。
具体实施例方式将参照以下示例更详细地描述各种实施例。这些示例仅为了说明性目的而不意图限制本发明的范围。示例1:使用SEQ ID N0.3和7的引物对以及SEQ ID N0.12的探针对李斯特氏菌(Listeria spp.)进行的实时PCR扩增使用SEQ ID N0.3和7的引物对以及SEQ ID N0.12的探针根据实时PCR扩增对样品中的李斯特氏菌的靶核酸进行扩增和检测。(I)标准曲线和检测极限确定使用SEQ ID N0.3和7的引物对以及SEQ ID N0.12的探针对李斯特氏菌进行的实时PCR扩增与李斯特氏菌的浓度的相关性。在PCR中将用缓冲液从IO4倍至101°倍连续10倍稀释的包括Listeriamonocytogenes (单核细胞增生性李斯特氏菌)的23S rDNA的IO13拷贝/ml的质粒用作模板。在RNA酶H的存在下执行PCR以在PCR过程中引起探针的切割。实时测量得到的探针片段。PCR混合物的组分和PCR条件如下。表I是反应混合物的组分:表I
权利要求
1.一种组合物，所述组合物包括 第一寡核苷酸，序列为 SEQ ID NO: 19 ^CCAAGCAGTGAGTGTGAGAAXs (SEQ ID NO: 19)，其中，位置I处的X1是T或者空缺，位置22处的X2是G或者空缺； 第二寡核苷酸，序列为 seq id Nojo=X1X1GacagcgtgaaatcaggX3X3X4 (seq id N0:20)，其中，位置I和2处的X1均为T或者空缺，位置20和21处的X3是A或者空缺，位置22处的X4是C或者空缺。
2.根据权利要求I所述的组合物，其中，第一寡核苷酸是从SEQID NO: 1-3的寡核苷酸的组中选择的一种或多种CCAAGCAGTGAGTGTGAGAAG (SEQ ID N0:1),CCAAGCAGTGAGTGTGAGAA (SEQ ID NO:2)，以及TCCAAGCAGTGAGTGTGAGAA (SEQ ID NO:3)。
3.根据权利要求I所述的组合物，其中，第二寡核苷酸是从SEQID NO: 5-9的寡核苷酸的组中选择的一种或多种TGACAGCGTGAAATCAGGAAC (SEQ ID NO:5)，TTGACAGCGTGAAATCAGG (SEQ ID NO:6)，TGACAGCGTGAAATCAGGA (SEQ ID NO:7)， TGACAGCGTGAAATCAGGA (SEQ ID NO:8)以及 GACAGCGTGAAATCAGGA (SEQ ID NO:9)。
4.根据权利要求I所述的组合物，其中，所述组合物还包括具有DNA序列和RNA序列的第三寡核苷酸，所述第三寡核苷酸的序列是SEQ ID N0:21或SEQ ID NO:22 TGCGAAGACTGAGCTGTGATGG (SEQ ID NO:21 )，其中，位置8和9处的核苷酸中至少有一个是核糖核苷酸，以及 CCATCACAGCrUrCrArUGCTTCGC (SEQ ID NO. 22)，其中，分别在位置 11、12、13 和 14 处的“rU”、“rC”、“rA”和“rU”中的至少一个是核糖核苷酸。
5.根据权利要求6所述的组合物，其中，第三寡核苷酸是从由SEQID NO: 10-14的寡核苷酸组成的组中选择的一种或多种 TGCGAAGCrATGAGCTGTGATGG (SEQ ID NO: 10)，其中，位置 9 处的 “rA” 是核糖核苷酸，TGCGAAGrCATGAGCTGTGATGG (SEQ ID NO: 11 )，其中，位置 8 处的 “rC” 是核糖核苷酸，CCATCACAGCTCArUGCTTCGC (SEQ ID N0:12)，其中，位置 14 处的 “rU” 是核糖核苷酸，CCATCACAGCTrCrArUGCTTCGCCSEQ ID NO: 13)，其中，分别在位置 12、13和 14处的“rC”、“rA”和“rU”是核糖核苷酸，以及 CCATCACAGCrUrCrArUGCTTCGC (SEQ ID NO: 14)，其中，分别在位置 11、12、13 和 14 处的“ rU ”、“ rC ”、“ rA ”和“ rU ”是核糖核苷酸。
6.根据权利要求4或5所述的组合物，其中，第三寡核苷酸标记有可检测标记物。
7.根据权利要求4所述的组合物，其中，所述组合物包括SEQID NO. 3的第一寡核苷酸、SEQ ID NO. 7的第二寡核苷酸和SEQ ID NO. 12的第三寡核苷酸。
8.—种检测样品中的李斯特氏菌的试剂盒，所述试剂盒包括 (a)序列为 SEQ ID NO: 19 X1CCAAGCAGTGAGTGTGAGAAX2 (SEQ ID NO: 19)的第一引物，其中，位置I处的X1是T或者空缺，位置22处的X2是G或者空缺；(b)序列为SEQ ID NO:20 AAGACAGCGTGAAATCAGGXJA (SEQ ID N0:20)的第二引物，其中，位置I和2处的X1均为T或者空缺，位置20和21处的X3是A或者空缺，位置22处的X4是C或空缺；以及 (c)包括RNA序列和DNA序列的探针，所述RNA序列和DNA序列与靶李斯特氏菌基因基本上互补并结合到可检测标签，其中，探针包括SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22的序列 TGCGAAGACTGAGCTGTGATGG (SEQ ID NO:21 )，其中，位置8和9处的核苷酸中的至少一个是核糖核苷酸，以及 CCATCACAGCrUrCrArUGCTTCGC (SEQ ID NO. 22)，其中，分别在位置 11、12、13 和 14 处的“rU”、“rC”、“rA”和“rU”中的至少一个是核糖核苷酸。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，所述试剂盒还包括 Cd)扩增活性，用于靶DNA序列的PCR扩增，以产生李斯特氏菌PCR片段；以及 (e) RNA酶H活性。
10.根据权利要求11所述的试剂盒，其中，探针在其3’端和5’端结合到可检测标签。
11.根据权利要求9所述的试剂盒，其中，RNA酶H活性是热稳定RNA酶H的活性。
12.根据权利要求8所述的试剂盒，其中，第一引物是从SEQID NO: 1-3的寡核苷酸的组中选择的一种或多种CCAAGCAGTGAGTGTGAGAAG (SEQ ID ΝΟ:1),CCAAGCAGTGAGTGTGAGAA (SEQ ID NO:2)，以及TCCAAGCAGTGAGTGTGAGAA (SEQ ID NO:3)。
13.根据权利要求8所述的试剂盒，其中，第二引物是从SEQID NO:5-9的寡核苷酸的组中选择的一种或多种TGACAGCGTGAAATCAGGAAC (SEQ ID NO:5)，TTGACAGCGTGAAATCAGG (SEQ ID NO:6)，TGACAGCGTGAAATCAGGA (SEQ ID NO:7)， TGACAGCGTGAAATCAGGA (SEQ ID NO:8)，以及 GACAGCGTGAAATCAGGA (SEQ ID NO:9)。
14.根据权利要求8所述的试剂盒，其中，探针是从由SEQID NO: 10-14的寡核苷酸组成的组中选择的一种或多种 TGCGAAGCrATGAGCTGTGATGG (SEQ ID NO: 10)，其中，位置 9 处的 “rA” 是核糖核苷酸，TGCGAAGrCATGAGCTGTGATGG (SEQ ID NO: 11 )，其中，位置 8 处的 “rC” 是核糖核苷酸，CCATCACAGCTCArUGCTTCGC (SEQ ID NO:12)，其中，位置 14 处的 “rU” 是核糖核苷酸，CCATCACAGCTrCrArUGCTTCGCCSEQ ID NO: 13)，其中，分别在位置 12、13和 14处的“rC”、“rA”和“rU”是核糖核苷酸，以及 CCATCACAGCrUrCrArUGCTTCGC (SEQ ID NO: 14)，其中，分别在位置 11、12、13 和 14 处的“ rU ”、“ rC ”、“ rA ”和“ rU ”是核糖核苷酸。
15.—种检测样品中的李斯特氏菌的方法，所述方法包括 (a)扩增样品中的李斯特氏菌的靶核酸以产生拷贝数目增加的靶核酸，扩增包括将SEQID NO: 19的第一引物和SEQ ID N0:20的第二引物杂交到样品中的靶核酸以获得靶核酸与引物的杂交产物，以及使用依赖模板的核酸聚合酶延伸杂交产物的第一引物和第二引物以产生延伸的引物产物； (b)使靶核酸与能够杂交到靶核酸的至少一种探针寡核苷酸杂交，以获得靶核酸探针寡核苷酸的杂交产物，其中，探针包括DNA序列和RNA序列并结合到可检测标签，探针包括 SEQ ID NO:21 或 SEQ ID NO:22 的序列 TGCGAAGACTGAGCTGTGATGG (SEQ ID NO:21 )，其中，位置8和9处的核苷酸中的至少一个是核糖核苷酸，以及 CCATCACAGCrUrCrArUGCTTCGC (SEQ ID NO. 22)，其中，分别在位置 11、12、13 和 14 处的“rU”、“rC”、“rA”和“rU”中的至少一个是核糖核苷酸； (c)使靶核酸探针寡核苷酸的杂交产物与RNA酶H接触以切割探针；以及 (d)检测来自探针上的标签的信号发射的增加，其中，信号的增加表示样品中存在李斯特氏菌的靶核酸。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，探针寡核苷酸选自于由SEQID N0:10_14的寡核苷酸组成的组。
17.根据权利要求15所述的方法，其中，可检测标记物是荧光共振能量转移对。
18.根据权利要求15所述的方法，其中，所述方法还包括在扩增之前在富集培养基中培养包含李斯特氏菌的样品以增强李斯特氏菌的生长。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述富集培养基包括每IL蒸馏水大约IOg至大约40g的胰蛋白胨大豆肉汤、大约Ig至大约IOg的酵母提取物以及大约Ig至大约IOg的氯化锂。
20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述富集培养基还包括从以下组分组成的组中选择的至少一种组分大约Ig至大约IOg的牛肉膏和/或包含大约O. Olmg至大约O. 5mg的核黄素、大约O. 5mg至大约I. 5mg的硫胺素和大约O. Olmg至大约I. 5mg的生物素的维生素混合物；大约Ig至大约5g的丙酮酸或丙酮酸盐；以及大约O. Olg至大约Ig的柠檬酸铁铵。
21.根据权利要求20所述的方法，其中，所述富集培养基还包括缓冲化合物，缓冲化合物包括3-(N-吗啉基)丙磺酸及其钠盐。
22.根据权利要求18所述的方法，其中，所述富集培养基包括大约Img至大约IOmg的口丫唳黄、大约5mg至大约15mg的多粘菌素B、大约IOmg至大约30mg的头孢他唳。
23.根据权利要求18所述的方法，其中，所述富集培养基包括每IL蒸馏水大约IOg至大约40g的胰蛋白胨大豆肉汤、大约Ig至大约IOg的酵母提取物、大约Ig至大约IOg的氯化锂；大约Ig至大约IOg的牛肉膏和/或包含大约O. Olmg至大约O. 5mg的核黄素、大约O. 5mg至大约I. 5mg的硫胺素和大约O. Olmg至大约I. 5mg的生物素的维生素混合物；大约Ig至大约5g的丙酮酸或丙酮酸盐；大约O. Ig至大约Ig的柠檬酸铁铵；大约48的3-0-吗啉基)丙磺酸和大约7. Ig的3-(N-吗啉基)丙磺酸钠；以及大约Img至大约IOmg的Π丫唳黄、大约5mg至大约15mg的多粘菌素B和大约IOmg至大约30mg的头孢他唳。
24.根据权利要求18所述的方法，其中，所述富集培养基包括每IL蒸馏水大约30g的胰蛋白胨大豆肉汤、大约6g的酵母提取物、大约Ig至大约IOg的氯化锂；大约5g的牛肉膏和/或包含大约O. Img的核黄素、大约I. Omg的硫胺素和大约I. Omg的生物素的维生素混合物；大约2g的丙酮酸钠；大约O. 2g的柠檬酸铁铵；大约4g的3-(N-吗啉基)丙磺酸和大约7. Ig的3-(N-吗啉基)丙磺酸钠；以及大约5mg的吖啶黄、大约IOmg的多粘菌素B和大约20mg的头孢他唳。
25.—种检测样品中的李斯特氏菌的方法，所述方法包括 Ca)在逆转录酶活性和逆扩增引物的存在下逆转录李斯特氏菌的靶RNA以产生靶RNA的靶cDNA ； (b)扩增靶cDNA序列以产生拷贝数目增加的靶核酸，扩增包括将SEQID NO:19的第一引物和SEQ ID NO:20的第二引物杂交到靶cDNA以获得靶核酸与引物的杂交产物，以及使用依赖模板的核酸聚合酶延伸杂交产物的第一引物和第二引物以产生延伸的引物产物； (c)使靶核酸杂交到基本上与靶cDNA互补的至少一种探针寡核苷酸以获得靶核酸探针寡核苷酸的杂交产物，其中，探针包含DNA序列和RNA序列并结合到可检测标签，探针包含 SEQ ID NO:21 或 SEQ ID NO:22 的序列 TGCGAAGACTGAGCTGTGATGG (SEQ ID NO:21 )，其中，位置8和9处的核苷酸中的至少一个是核糖核苷酸，以及 CCATCACAGCrUrCrArUGCTTCGC (SEQ ID NO. 22)，其中，分别在位置 11、12、13 和 14 处的“rU”、“rC”、“rA”和“rU”中的至少一个是核糖核苷酸； (d)使靶核酸探针寡核苷酸的杂交产物与RNA酶H接触以切割探针；以及 (e)检测来自探针上的标签的信号发射的增加，其中，信号的增加表示样品中存在李斯特氏菌的靶RNA。
26.根据权利要求25所述的方法，其中，探针寡核苷酸选自于由SEQID N0:10_14的寡核苷酸组成的组。
27.根据权利要求25所述的方法，其中，可检测标记物是荧光共振能量转移对。
28.根据权利要求25所述的方法，其中，所述方法还包括在扩增之前在富集培养基中培养包含李斯特氏菌的样品以增强李斯特氏菌的生长。
29.根据权利要求28所述的方法，其中，所述富集培养基包括每IL蒸馏水大约IOg至大约40g的胰蛋白胨大豆肉汤、大约Ig至大约IOg的酵母提取物以及大约Ig至大约IOg的氯化锂。
30.根据权利要求29所述的方法，其中，所述富集培养基还包括从以下组分组成的组中选择的至少一种组分大约Ig至大约IOg的牛肉膏和/或包含大约O. Olmg至大约O. 5mg的核黄素、大约O. 5mg至大约I. 5mg的硫胺素和大约O. Olmg至大约I. 5mg的生物素的维生素混合物；大约Ig至大约5g的丙酮酸或丙酮酸盐；以及大约O. Olg至大约Ig的柠檬酸铁铵。
31.根据权利要求30所述的方法，其中，所述富集培养基还包括缓冲化合物，缓冲化合物包括3-(N-吗啉基)丙磺酸及其钠盐。
32.根据权利要求28所述的方法，其中，所述富集培养基包括大约Img至大约IOmg的口丫唳黄、大约5mg至大约15mg的多粘菌素B、大约IOmg至大约30mg的头孢他唳。
33.根据权利要求28所述的方法，其中，所述富集培养基包括每IL蒸馏水大约IOg至大约40g的胰蛋白胨大豆肉汤、大约Ig至大约IOg的酵母提取物、大约Ig至大约IOg的氯化锂；大约Ig至大约IOg的牛肉膏和/或包含大约O. Olmg至大约O. 5mg的核黄素、大约O.5mg至大约I. 5mg的硫胺素和大约O. Olmg至大约I. 5mg的生物素的维生素混合物；大约1g至大约5g的丙酮酸或丙酮酸盐；大约0. 1g至大约1g的柠檬酸铁铵；大约48的3-(N-吗啉基)丙磺酸和大约7. 1g的3-(N-吗啉基)丙磺酸钠；以及大约1mg至大约10mg的吖啶黄、大约5mg至大约15mg的多粘菌素B和大约10mg至大约30mg的头孢他唳。
34.根据权利要求28所述的方法，其中，所述富集培养基包括每1L蒸馏水大约30g的胰蛋白胨大豆肉汤、大约6g的酵母提取物、大约1g至大约10g的氯化锂；大约5g的牛肉膏和/或包含大约0. 1mg的核黄素、大约1. 0mg的硫胺素和大约1.0mg的生物素的维生素混合物；大约2g的丙酮酸钠；大约O. 2g的柠檬酸铁铵；大约4g的3-(N-吗啉基)丙磺酸和大约7. 1g的3-(N-吗啉基)丙磺酸钠；以及大约5mg的吖啶黄、大约10mg的多粘菌素B和大约20mg的头孢他唳。
全文摘要
提供了一种特异性结合到李斯特氏菌的23S rRNA基因的寡核苷酸以及通过使用该寡核苷酸有效地检测样品中的李斯特氏菌的试剂盒和方法。
文档编号C12N15/11GK103237892SQ201180042101
公开日2013年8月7日 申请日期2011年8月30日 优先权日2010年8月30日
发明者李俊 申请人:三星泰科威株式会社