整合编码催化丙酮酸至乙酰乳酸的转化的多肽的多核苷酸的制作方法
专利名称：整合编码催化丙酮酸至乙酰乳酸的转化的多肽的多核苷酸的制作方法
技术领域：
本发明涉及工业微生物和丁醇及其异构体的发酵生产领域。更具体地讲，本发明涉及具有一种或多种整合多核苷酸的重组宿主细胞，所述多核苷酸编码催化利用丙酮酸的生物合成途径中的步骤(例如丙酮酸至乙酰乳酸的转化)的多肽。
背景技术：
丁醇是重要的工业化学品，其用作燃料添加剂、塑料工业中的化学原料以及食品和香料工业中的食品级提取剂。每年由石油化学方法生产了 100至120亿磅的丁醇，并且对这种通用化学品的需求还很可能会增加。2-丁酮，也被称为甲基乙基酮(MEK)，是被广泛使用的溶剂，并且是继丙酮之后最重要的商品化生产的酮。它被用作用于漆料、树脂和粘合剂的溶剂，以及选择性提取剂、氧化反应的活化剂，并且它能够通过在催化剂的存在下与氢反应而以化学方法被转化为2- 丁醇(Nystrom等人，J.Am.Chem.Soc.,69:1198,1947)。2，3-丁二醇可被 用于丁烯和丁二烯(二者是重要的化工原料，目前由裂化石油获得)的化学合成中，并且2，3- 丁二醇的酯可被用作增塑剂(Voloch等人,“FermentationDerived2, 3-Butanediol,，，！Comprehensive Biotechnology, Pergamon Press Ltd.,England，第 2 卷，第 3 节，第 933-947 页，1986)。可工程化微生物以表达用于生产例如2，3-丁二醇、2-丁酮、2-丁醇和异丁醇的产物的生物合成途径。美国专利7，851，188公开了用于生产异丁醇的工程化重组微生物。美国专利申请公布20070259410和20070292927公开了用于生产2- 丁酮或2- 丁醇的工程化重组微生物。已知多个用于异丁醇和2-丁醇的生物合成的途径，它们全部从细胞的丙酮酸开始。丁二醇是2-丁醇途径中的中间体，所述途径在美国专利申请公布20070292927中公开。已经改变了酵母中的丙酮酸代谢以生产乳酸和甘油。美国专利申请公布20070031950公开了带有一种或多种丙酮酸脱羧酶或丙酮酸脱氢酶基因的破坏并且表达D-乳酸脱氢酶基因的酵母菌株，其被用于生产D-乳酸。Ishida等人(Biosc1.Biotech,and Biochem.，70:1148-1153，2006)描述了具有破坏的丙酮酸脱羧酶基因并表达乳酸脱氧酶的啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)。美国专利申请公布2005/0059136公开了没有丙酮酸脱水酶活性的葡萄糖耐受的不依赖C2碳源(GCSI)的酵母菌株，其可以具有外源乳酸脱氢酶基因。Nevoigt等人(Yeast，12:1331-1337，1996)描述了在啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)中降低的丙酮酸脱羧酶和提高的NAD-依赖的甘油_3_磷酸脱氢酶对甘油产量的影响。工业发酵生产醇或其它化合物需要酵母细胞稳定生产丙酮酸生物合成途径的多核苷酸。此外还需要在重组宿主细胞如酵母中生产异丁醇、2，3- 丁二醇、2- 丁醇或2- 丁酮的改善方法。
发明内容
本文提供了具有一种或多种整合多核苷酸的重组宿主细胞，所述多核苷酸编码催化利用丙酮酸的生物合成途径中的步骤(例如丙酮酸至乙酰乳酸的转化)的多肽。与不具有编码催化生物合成途径步骤(例如丙酮酸至乙酰乳酸的转化)的多肽的整合多核苷酸的宿主细胞相比，此类宿主细胞提供稳定和/或增加生物合成途径产物形成的方法，所述产物例如异丁醇、2，3- 丁二醇、2- 丁醇或2- 丁酮。本发明的一个方面涉及包含编码多肽的多核苷酸的重组宿主细胞，所述多肽催化丙酮酸至乙酰乳酸的转化，所述多核苷酸被整合到宿主细胞的染色体中。在另一方面，所述宿主细胞包含利用丙酮酸的生物合成途径和编码催化丙酮酸至乙酰乳酸的转化的多肽的多核苷酸，所述多核苷酸被整合到宿主细胞的染色体中。在另一方面，所述多核苷酸是宿主细胞异源性的。本发明的一个方面涉及重组宿主细胞，其包含异丁醇生物合成途径，其中所述途径包括由多肽催化的丙酮酸至乙酰乳酸的底物至产物的转化，所述多肽由整合到染色体中的异源性多核苷酸编码，并且其中所述途径包括由多肽催化的乙酰乳酸至2，3- 二羟基异戊酸的底物至产物的转化，所述多肽由质粒上的多核苷酸编码。在多个实施例中，与编码催化丙酮酸至乙酰乳酸的转化的多肽的多核苷酸没有被整合到染色体中的重组宿主细胞相t匕，所述异丁醇生产的滴度是提高的。本发明的一个方面涉及重组宿主细胞，其包含2，3- 丁二醇、2- 丁醇或2- 丁酮生物合成途径，其中所述途径包括由多肽催化的丙酮酸至乙酰乳酸的底物至产物的转化，所述多肽由整合到染色体中的异源性多核苷酸编码，并且其中所述途径包括至少一种由多肽催化的底物至产物的转化，所述多肽由质粒上的多核苷酸编码。在多个实施例中，与编码催化丙酮酸至乙酰乳酸的转化的多肽的多核苷酸没有被整合到染色体中的重组宿主细胞相比，所述2，3- 丁二醇、2- 丁醇或2- 丁酮生产的滴度是提高的。在另一方面，本发明涉及重组宿主细胞，其包含编码第一多肽的第一异源性多核苷酸，所述第一多肽催化利用丙酮酸的生物合成途径的转化步骤；编码第二多肽的第二异源性多核苷酸，所述第二多肽催化利用丙酮酸的生物合成途径的转化步骤；和编码第三多肽的第三异源性多核苷酸，所述第三多肽催化利用丙酮酸的生物合成途径的转化步骤；其中所述第一和第二异源性多核苷酸被整合到宿主细胞的染色体中；其中所述第三异源性多核苷酸没有被整合到宿主细胞的染色体中；并且其中所述第一、第二、和第三多肽催化利用丙酮酸的生物合成途径的不同步骤。
在另一方面，本发明涉及重组宿主细胞，其包含(a)编码第一多肽的第一异源性多核苷酸，所述第一多肽催化丙酮酸至乙酰乳酸的底物至产物的转化；(b)编码第二多肽的第二异源性多核苷酸，所述第二多肽催化α-酮异戊酸至异丁醛的底物至产物的转化；和(c)编码第三多肽的第三异源性多核苷酸，所述第三多肽催化不是(a)或(b)的转化步骤的异丁醇生物合成途径转化步骤；其中所述第一和第二异源性多核苷酸被整合到染色体中；其中所述第三异源性多核苷酸没有被整合到染色体中；并且其中所述宿主细胞产生异丁醇。在另一方面，本发明涉及重组宿主细胞，其包含(a)编码第一多肽的第一异源性多核苷酸，所述第一多肽催化α -酮异戊酸至异丁醛的底物至产物的转化；和6)编码第二多肽的第二异源性多核苷酸，所述第二多肽催化不是(a)的转化步骤的异丁醇生物合成途径转化步骤；其中所述第一异源性多核苷酸被整合到染色体中；其中所述第二异源性多核苷酸没有被整合到染色体中；并且其中所述宿主细胞产生异丁醇。在本发明的多个方面，所述宿主细胞是细菌、蓝细菌、丝状真菌或酵母。在另一方面，宿主细胞是下列属的成员:梭菌属(Clostridium)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、红球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽抱杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、肠球菌属(Enterococcus)、产喊杆菌属(Alcaligenes)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、伊萨酵母属(Issatchenkia)、类芽抱杆菌属(Paenibacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、毕赤酵母属(Pichia)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)或糖酵母属(Saccharomyces)。在另一方面，宿主细胞是大肠杆菌(Escherichia coli)、真养产碱杆菌(Alcaligenes eutrophus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、浸麻类芽抱杆菌(Paenibacillus macerans)、红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、享乌鸡肠球菌(Enterococcus gallinarium)、屎肠球菌(Enterococcus faecalis)或啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)。在另一方面,所述宿主细胞是兼性厌氧菌。在本发明的另一方面，利用丙酮酸的生物合成途径包含一种或多种编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化途径的底物至产物的转化。在另一方面，一种或多种多核苷酸被整合到染色体中。在另一方面，利用丙酮酸的生物合成途径形成产物2，3-丁二醇、异丁醇、2-丁醇或2-丁酮。在本发明的一个方面， 利用丙酮酸的生物合成途径是丁醇生物合成途径。在另一方面，丁醇生物合成途径是2- 丁醇生物合成途径或异丁醇生物合成途径。在另一方面，宿主细胞包含一种或多种编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列底物至产物的转化:(i)丙酮酸至乙酰乳酸；(ii)乙酰乳酸至2，3- 二羟基异戊酸；(iii) 2，3- 二羟基异戊酸至α-酮异戊酸；(iv) α-酮异戊酸至异丁醛；或(V)异丁醛至异丁醇。在另一方面，(ii)、(iii )、( iv)或(V)的一种或多种多核苷酸在质粒上。在另一方面，宿主细胞包含一种或多种编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列底物至产物的转化:(i)丙酮酸至乙酰乳酸；(ii)乙酰乳酸至2，3- 二羟基异戊酸；(iii) 2，3- 二羟基异戊酸至α -酮异戊酸；(iv) α -酮异戍酸至异丁酰-CoA ； (V)异丁酰-CoA至异丁醒；或(>；0异丁醒至异丁醇。在另一方面，
(ii)、(iii)、(iv)、(v)或(vi)的一种或多种多核苷酸在质粒上。在另一方面，宿主细胞包含一种或多种编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列底物至产物的转化:(i)丙酮酸至乙酰乳酸；(ii)乙酰乳酸至2，3- 二羟基异戊酸；(iii) 2，3- 二羟基异戊酸至α -酮异戊酸；(iv) α -酮异戊酸至缬氨酸；(V)缬氨酸至异丁胺；(vi)异丁胺至异丁醛；或(vii)异丁醒至异丁醇。在另一方面，(ii)、(iii)、(iv)、(V)、(vi)或(vii)的一种或多种多核苷酸在质粒上。在本发明的另一方面，宿主细胞包含一种或多种编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列底物至产物的转化:(i)丙酮酸至乙酰乳酸；(ii)乙酰乳酸至乙偶姻；(iii)乙偶姻至2，3-丁二醇；或(^)2，3-丁二醇至2-丁酮。在另一方面，(ii)、(iii)或(iv)的一种或多种多核苷酸在质粒上。在另一方面，宿主细胞包含一种或多种编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列底物至产物的转化:(i)丙酮酸至乙酰乳酸；(ii)乙酰乳酸至乙偶姻；(iii)乙偶姻至2，3- 丁二醇；(iv)2, 3- 丁二醇至2- 丁酮；或(v)2- 丁酮至2- 丁醇。在另一方面，(ii)、(iii)、(iv)或(V)的一种或多种多核苷酸在质粒上。在本发明的另一方面，宿主细胞包含一种或多种编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列底物至产物的转化:(i)丙酮酸至乙酰乳酸；(ii) α-乙酰乳酸至乙偶姻；(iii)乙偶姻至3-氨基-2- 丁醇；(iv) 3-氨基-2- 丁醇至3-氨基-2- 丁醇磷酸；(V)或3-氨基-2-丁醇磷酸至2-丁酮。在另一方面，(ii)、(iii)、(iv)或(V)的一种或多种多核苷酸在质粒上。在另一方面，宿主细胞包含一种或多种编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列底物至产物的转化:(i)丙酮酸至乙酰乳酸；(ii) α -乙酰乳酸至乙偶姻；(iii)乙偶姻至3-氨基-2- 丁醇；(iv) 3-氨基-2- 丁醇至3-氨基-2- 丁醇磷酸；(V) 3-氨基-2- 丁醇磷酸至 2- 丁酮；或(>；0 2- 丁酮至 2- 丁醇。在另一方面，(ii)、(iii)、(iv)、(v)或(vi)的一种或多种多核苷酸在质粒上。在另一方面，至少其中一种编 码催化底物至产物转化的多肽的多核苷酸是异源性的。在另一个实施例中，多于一种编码催化底物至产物转化的多肽的多核苷酸是异源性的。在另一个实施例中，所有编码催化利用丙酮酸的生物合成途径中每个底物至产物转化的多肽的多核苷酸是异源性的。在本发明的一个方面，催化丙酮酸至乙酰乳酸的底物至产物转化的多肽是乙酰乳酸合酶。在另一方面，乙酰乳酸合酶与表I所述的乙酰乳酸合酶具有至少约80%的氨基酸序列同一性。在另一方面，乙酰乳酸合酶与具有SEQ ID N0:2、4、6、8、10、12、14、16或18的氨基酸序列具有至少约80%的同一性。在另一方面，催化丙酮酸至乙酰乳酸的转化的多肽对应于酶委员会编号(Enzyme Commission Number) EC2.2.1.6。在本发明的另一方面，催化乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸的转化的多肽对应于酶委员会编号ECl.1.1.86。在另一方面，催化2，3-二羟基异戊酸至α-酮异戊酸的转化的多肽对应于酶委员会编号EC4.2.1.9。在另一方面，催化α -酮异戊酸至异丁醛的转化的多肽对应于酶委员会编号EC4.1.1.72或4.1.1.1。在另一方面，催化异丁醛至异丁醇的转化的多肽对应于酶委员会编号ECl.1.1.265、1.1.1.1或1.1.1.2。在一个方面，本发明的宿主细胞中丙酮酸脱羧酶的表达是降低的或基本上消除的。在另一方面，宿主细胞包含内源性多核苷酸中的缺失、突变、和/或替换，所述内源性多核苷酸编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽。在本发明的另一方面，一种或多种编码催化本文所述的生物合成途径步骤的多肽的多核苷酸在质粒中。在另一方面，所述质粒包含与SEQ ID NO:1至89中的一种或多种至少约 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99% 相同的序列，或者与 SEQ ID NO: 129-133或它们的编码区中的任何一个至少约75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的序列。在一个方面，本发明的宿主细胞中甘油-3-磷酸脱氢酶的表达是降低的或基本上消除的。在另一方面，本发明的宿主细胞中FRA2的表达是降低的或基本上消除的。在另一方面，本文所述的一种或多种多核苷酸被整合到宿主细胞的染色体中I3DCl-TRXl基因间区域处。在一个方面，本发明涉及生产来自本发明宿主细胞的生物合成途径产物的方法。在另一方面，本发明涉及生产丁醇的方法，所述方法包括(a)提供本发明的重组宿主细胞；以及(b)在产生丁醇的条件下，使所述重组宿主细胞与可发酵碳底物接触以形成发酵液体培养基。在另一方面，所述方法还包括使所述发酵液体培养基与提取剂接触以产生两相发酵混合物。在另一方面，所述提取剂包括脂肪酸。在另一方面，所述脂肪酸来源于玉米油或大豆油。在另一方面，所述提取剂包括与水不混溶的有机提取剂如C12-C22脂肪醇、C12-C22脂肪酸、C12-C22脂肪酸的酯、C12-C22脂肪酰胺或C12-C22脂肪醛。在另一方面，所述方法还包括使所述发酵液体培养基与有机酸和酶接触，所述酶能够用所述有机酸酯化丁醇。在另一方面，所述方法还包括蒸发所述发酵液体培养基的至少一部分以形成包含水和丁醇的蒸气流。在一个方面，与编码催化丙酮酸至乙酰乳酸的转化的多肽的多核苷酸没有被整合到染色体中的宿主细胞相比，本发明的宿主细胞的丁醇生产速率提高至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约95%、至少约2倍、至少约3倍或至少约4倍。在另一方面，与编码催化丙酮酸至乙酰乳酸的转化的多肽的多核苷酸没有被整合到染色体中的宿主细胞相比，本发明的宿主细胞的丁醇生产滴度提高至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约95%、至少约2倍、至少约3倍或至少约4倍。 在另一方面，本发明涉及提高非整合重组多核苷酸的拷贝数或表达的方法，所述重组多核苷酸编码催化本文所述的生物合成途径步骤的多肽，所述方法包括在产生生物合成途径产物的条件下，使本发明的宿主细胞与可发酵碳底物接触以形成发酵液体培养基。在另一方面，本发明涉及提高利用丙酮酸的生物合成途径的流量的方法，所述方法包括:(a)提供本发明的重组宿主细胞；以及(b)在提高所述宿主细胞中利用丙酮酸的生物合成途径的流量的条件下，使所述宿主细胞与可发酵碳底物接触以形成发酵液体培养基。在另一方面，本发明涉及制备重组宿主细胞的方法，所述方法包括用下列多核苷酸转化宿主细胞:(i) 一种或多种编码催化利用丙酮酸的生物合成途径的底物至产物转化的多肽的多核苷酸jP(ii)编码催化丙酮酸至乙酰乳酸的转化的多肽的多核苷酸；其中
(ii)的多核苷酸被整合到染色体中。在另一方面，本发明涉及提高利用丙酮酸的生物合成途径产物的形成的方法，所述方法包括:(i)提供本发明的重组宿主细胞；以及(ii)使所述宿主细胞在形成利用丙酮酸的途径产物的条件下生长，其产物量大于由不包含整合到染色体中的编码催化丙酮酸至乙酰乳酸的转化的多肽的多核苷酸的宿主细胞形成的产物量。
在另一方面，本发明涉及组合物，其包含(i)本发明的宿主细胞；(ii) 丁醇；和
(iii)提取剂。在另一方面，本发明涉及组合物，其包含(i)本发明的宿主细胞；(ii)丁醇；
(iii)提取剂；和(iv)酯化酶。在另一方面，此类组合物的丁醇是异丁醇。在另一方面，本发明涉及将乙酰乳酸合酶(als)染色体整合到酵母宿主细胞的方法，所述方法包括用包含SEQ ID NO: 131的整合载体转化所述宿主细胞。在另一方面，宿主细胞还包含异丁醇生物合成途径。在另一方面，所述宿主包含至少两个染色体整合的多核苷酸。
并入本文并成为说明书的一部分的附图示出了本发明，并且与说明书一起进一步用来解释本发明的原理并使得本领域的技术人员能够利用本发明。图1示出利用丙酮酸的途径和酶。图2示出三种不同的异丁醇生物合成途径图3示出四种不同的2- 丁醇生物合成途径。图4A-4D示出乙酰乳酸合酶(als)编码区的序列关系，所述编码区用枯草芽孢杆菌(B.subtilis) AlsS序列的BLAST分析进行检索，限制为该序列的100个最近邻居。als编码序列通过它的来源生物进行鉴定。图 5 示出 PNY2204 基因座(pdcl Δ::ilvD::pUC19_kan::FBA_alsS::TRX1)0图 6 示出 PNY2211 基因座(pdcl Δ::ilvD::FBA_alsS:: TRX1)0 认为 pdcl-trxl 基因间区域中的alsS基因整合是“无痕”插入，因为载体、标记基因和1xP序列丢失。根据下面的详细描述和附带的序列描述可以更充分地理解本发明，下面的详细描述和所附的序列描述形成了本申请的一部分。下列序列符合37C.F.R.§ §1.821-1.825(“对含有核酸序列和/或氨基酸序列公开的专利申请的要求一序列规则”)并且符合世界知识产权组织(WIPO)标准ST.25 (2009)和EPO和PCT的序列表要求[规则5.2和49.5 (a-bis),以及行政性指示的208节和附录C]。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循如37C.F.R.§ 1.822所示的规定。表1:本f渉及的编码区和蛋白质的序列号(SEQ ID NO)
权利要求
1.重组宿主细胞，包含异丁醇生物合成途径，其中所述途径包括由整合到染色体中的异源性多核苷酸编码的多肽催化的丙酮酸至乙酰乳酸的底物至产物的转化，并且其中所述途径包括由质粒上的多核苷酸编码的多肽催化的乙酰乳酸至2，3- 二羟基异戊酸的底物至产物的转化，并且其中与编码催化丙酮酸至乙酰乳酸的转化的多肽的多核苷酸没有被整合到染色体中的重组宿主细胞相比，所述异丁醇生产的滴度是提高的。
2.重组宿主细胞，包含2，3-丁二醇、2- 丁醇或2- 丁酮生物合成途径，其中所述途径包括由整合到染色体中的异源性多核苷酸编码的多肽催化的丙酮酸至乙酰乳酸的底物至产物的转化，并且其中所述途径包括至少一种由质粒上的多核苷酸编码的多肽催化的底物至产物的转化。
3.根据权利要求1或2所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞选自:细菌、蓝细菌、丝状真菌和酵母。
4.根据权利要求1至2中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是选自下列属的成员:梭菌属(Clostridium)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、红球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽抱杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、肠球菌属(Enterococcus )、产喊杆菌属(Alcali genes)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、类芽抱杆菌属(Paenibacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、毕赤酵母属(Pichia)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、伊萨酵母属(Issatchenkia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)和糖酵母属(Saccharomyces)。
5.根据权利要求1至2中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是大肠杆菌(Escherichia coli)。
6.根据权利要求1至2中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述多肽是在所述宿主细胞胞质溶胶中表达的。
7.根据权利要求1至2中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。
8.根据权利要求1至2中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
9.根据权利要求1或3至8中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞还包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列底物至产物的转化:2，3- 二羟基异戊酸至α -酮异戊酸；α -酮异戊酸至异丁醛；以及异丁醛至异丁醇。
10.根据权利要求1或2至8中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞还包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列底物至产物的转化:2，3- 二羟基异戊酸至α -酮异戊酸；α -酮异戊酸至异丁酰-CoA ;异丁酰-CoA至异丁醛；以及异丁醛至异丁醇。
11.根据权利要求1或2至8中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞还包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列底物至产物的转化:2，3- 二羟基异戊酸至α -酮异戊酸；α-酮异戊酸至缬氨酸；缬氨酸至异丁胺；异丁胺至异丁醛；以及异丁醛至异丁醇。
12.根据权利要求2至8中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞还包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列底物至产物的转化:乙酰乳酸至乙偶姻；乙偶姻至·2，3- 丁二醇；以及2，3- 丁二醇至2- 丁酮。
13.根据权利要求2至8中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞还包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列底物至产物的转化:乙酰乳酸至乙偶姻；乙偶姻至·2，3- 丁二醇；2，3- 丁二醇至2- 丁酮；以及2- 丁酮至2- 丁醇。
14.根据权利要求1至8中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述催化丙酮酸至乙酰乳酸的底物至产物的转化的多肽是乙酰乳酸合酶。
15.根据权利要求14所述的重组宿主，其中所述乙酰乳酸合酶与选自SEQID N0:2、4、6、8、10、12、14、16或18的氨基酸序列具有至少约80%的同一性。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞中丙酮酸脱羧酶的表达是降低的或基本上消除的。
17.根据权利要求1至15中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞包含内源性多核苷酸中的缺失、突变、和/或替换，所述内源性多核苷酸编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽。
18.根据权利要求1至15中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸被整合到内源性多核苷酸中，所述多核苷酸编码催化丙酮酸至乙酰乳酸的转化的多肽，所述内源性多核苷酸编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞中甘油-3-磷酸脱氢酶的表达是降低的或基本上消除的。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞中Fra2的表达是降低的或基本上消除的。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸被整合到染色体中roc1-TRXI基因间区域处。
22.重组宿主细胞，包含:(a)编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化丙酮酸至乙酰乳酸的底物至产物的转化，其中所述多核苷酸被整合到染色体中；(b)编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸的底物至产物的转化，其中所述多核苷酸在质粒上；(c)编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化2，3-二羟基异戊酸至α-酮异戊酸的底物至产物的转化；和(d)编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化α-酮异戊酸至异丁醛的底物至产物的转化；其中所述宿主细胞基本上不具有丙酮酸脱羧酶活性；并且其中所述宿主细胞产生异丁醇。
23.方法，包括:(a)提供权利要求1至22中任一项或它们的任何组合 的重组宿主细胞；以及(b)在产生生物合成途径产物的条件下，使所述宿主细胞与可发酵碳底物接触以形成发酵液体培养基。
24.根据权利要求23所述的方法，还包括使所述发酵液体培养基与提取剂接触以产生两相发酵混合物。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述提取剂包括脂肪酸。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述脂肪酸来源于玉米油或大豆油。
27.根据权利要求24所述的方法，其中所述提取剂包括与水不混溶的有机提取剂，所述有机提取剂选自=C12-C22脂肪醇、C12-C22脂肪酸、C12-C22脂肪酸的酯、C12-C22脂肪醛和C12-C22脂肪酰胺。
28.根据权利要求23至27中任一项所述的方法，其中所述生物合成途径产物是醇，并且其中所述方法还包括使所述发酵液体培养基与有机酸和酶接触，所述酶能够用所述有机酸酯化所述醇。
29.根据权利要求23至28中任一项所述的方法，其中所述生物合成途径产物是醇，并且其中所述方法还包括蒸发所述发酵液体培养基的至少一部分以形成包含水和醇的蒸气流。
30.根据权利要求23至29中任一项所述的方法，其中所述生物合成途径产物是丁醇。
31.根据权利要求23至30中任一项所述的方法，其中所述生物合成途径产物是异丁醇。
32.根据权利要求30至31中任一项所述的方法，其中与编码催化丙酮酸至乙酰乳酸的转化的多肽的多核苷酸没有被整合到染色体中的重组宿主细胞相比，所述丁醇生产的速率提高至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约95%、至少约2倍、至少约3倍或至少约4倍。
33.根据权利要求30至31中任一项所述的方法，其中与编码催化丙酮酸至乙酰乳酸的转化的多肽的多核苷酸没有被整合到染色体中的重组宿主细胞相比，所述丁醇生产的滴度提高至少约10%、至少 约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约95%、至少约2倍、至少约3倍或至少约4倍。
34.根据权利要求32至33中任一项所述的方法，其中所述丁醇是异丁醇。
35.提高催化生物合成途径步骤的非整合重组多核苷酸的拷贝数或表达的方法，包括: 在产生生物合成途径产物的条件下，使权利要求1至22中任一项的重组宿主细胞与可发酵碳底物接触以形成发酵液体培养基。
36.提高利用丙酮酸的生物合成途径的流量的方法，包括: (a)提供权利要求1至22中任一项或它们的任何组合的重组宿主细胞；以及 (b)在提高所述宿主细胞中利用丙酮酸的生物合成途径的流量的条件下，使所述宿主细胞与可发酵碳底物接触以形成发酵液体培养基。
37.提高2，3-丁二醇、异丁醇、2- 丁醇或2- 丁酮生物合成途径产物的形成的方法，包括: (i)提供权利要求1至22中任一项或它们的任何组合的重组宿主细胞；以及 ( )使所述宿主细胞在形成利用丙酮酸的途径产物的条件下生长； 其中由所述重组宿主细胞形成的产物量大于由编码催化丙酮酸至乙酰乳酸的转化的多肽的多核苷酸没有被整合到染色体中的宿主细胞形成的产物量。
38.组合物，包含: (i)权利要求1至23中任一项或它们的任何组合的宿主细胞； ( ) 丁醇；和(iii)提取剂。
39.组合物，包含: (i)权利要求1至23中任一项或它们的任何组合的宿主细胞； ( ) 丁醇； (iii)提取剂；和 (iv)酯化酶。
40.根据权利要求38或39所述的组合物，其中所述提取剂包括脂肪酸。
41.根据权利要求41所述的组合物，其中所述脂肪酸来源于玉米油或大豆油。
42.根据权利要求38或39所述的组合物，其中所述提取剂是与水不混溶的有机提取齐U，所述有机提取剂选自=C 12-C22脂肪醇、C12-C22脂肪酸、C12-C22脂肪酸的酯、C12-C22脂肪醛和C12-C22脂肪醒。
43.根据权利要求38或39所述的组合物，其中所述提取剂包括油醇。
44.权利要求1或3至23中任一项的宿主细胞或权利要求38至43中任一项的组合物在生产异丁醇的方法中的用途。
45.权利要求1或3至23中任一项的宿主细胞或权利要求38至43中任一项的组合物在生产包含异丁醇的燃料组合物的方法中的用途。
46.根据权利要求2至8中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞还包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列底物至产物的转化:乙酰乳酸至乙偶姻；乙偶姻至3-氨基-2- 丁醇；3_氨基-2- 丁醇至3-氨基-2- 丁醇磷酸；以及3-氨基-2- 丁醇磷酸至2_ 丁酮。
47.根据权利要求2至8中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞还包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列底物至产物的转化:乙酰乳酸至乙偶姻；乙偶姻至3-氨基-2- 丁醇；3_氨基-2- 丁醇至3-氨基-2- 丁醇磷酸；3_氨基-2- 丁醇磷酸至2- 丁酮。
全文摘要
本发明涉及具有至少一种整合多核苷酸的重组宿主细胞，所述多核苷酸编码催化利用丙酮酸的生物合成途径中的步骤(例如丙酮酸至乙酰乳酸的转化)的多肽。本发明也涉及使用此类宿主细胞提高异丁醇、2，3-丁二醇、2-丁醇或2-丁酮的生物合成产量的方法。
文档编号C12N15/63GK103080298SQ201180042345
公开日2013年5月1日 申请日期2011年9月7日 优先权日2010年9月7日
发明者L.C.安东尼, L.A.马吉奥-霍尔, B.J.保罗 申请人:布特马斯先进生物燃料有限责任公司
技术领域：
本发明涉及工业微生物和丁醇及其异构体的发酵生产领域。更具体地讲，本发明涉及具有一种或多种整合多核苷酸的重组宿主细胞，所述多核苷酸编码催化利用丙酮酸的生物合成途径中的步骤(例如丙酮酸至乙酰乳酸的转化)的多肽。
背景技术：
丁醇是重要的工业化学品，其用作燃料添加剂、塑料工业中的化学原料以及食品和香料工业中的食品级提取剂。每年由石油化学方法生产了 100至120亿磅的丁醇，并且对这种通用化学品的需求还很可能会增加。2-丁酮，也被称为甲基乙基酮(MEK)，是被广泛使用的溶剂，并且是继丙酮之后最重要的商品化生产的酮。它被用作用于漆料、树脂和粘合剂的溶剂，以及选择性提取剂、氧化反应的活化剂，并且它能够通过在催化剂的存在下与氢反应而以化学方法被转化为2- 丁醇(Nystrom等人，J.Am.Chem.Soc.,69:1198,1947)。2，3-丁二醇可被 用于丁烯和丁二烯(二者是重要的化工原料，目前由裂化石油获得)的化学合成中，并且2，3- 丁二醇的酯可被用作增塑剂(Voloch等人,“FermentationDerived2, 3-Butanediol,，，！Comprehensive Biotechnology, Pergamon Press Ltd.,England，第 2 卷，第 3 节，第 933-947 页，1986)。可工程化微生物以表达用于生产例如2，3-丁二醇、2-丁酮、2-丁醇和异丁醇的产物的生物合成途径。美国专利7，851，188公开了用于生产异丁醇的工程化重组微生物。美国专利申请公布20070259410和20070292927公开了用于生产2- 丁酮或2- 丁醇的工程化重组微生物。已知多个用于异丁醇和2-丁醇的生物合成的途径，它们全部从细胞的丙酮酸开始。丁二醇是2-丁醇途径中的中间体，所述途径在美国专利申请公布20070292927中公开。已经改变了酵母中的丙酮酸代谢以生产乳酸和甘油。美国专利申请公布20070031950公开了带有一种或多种丙酮酸脱羧酶或丙酮酸脱氢酶基因的破坏并且表达D-乳酸脱氢酶基因的酵母菌株，其被用于生产D-乳酸。Ishida等人(Biosc1.Biotech,and Biochem.，70:1148-1153，2006)描述了具有破坏的丙酮酸脱羧酶基因并表达乳酸脱氧酶的啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)。美国专利申请公布2005/0059136公开了没有丙酮酸脱水酶活性的葡萄糖耐受的不依赖C2碳源(GCSI)的酵母菌株，其可以具有外源乳酸脱氢酶基因。Nevoigt等人(Yeast，12:1331-1337，1996)描述了在啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)中降低的丙酮酸脱羧酶和提高的NAD-依赖的甘油_3_磷酸脱氢酶对甘油产量的影响。工业发酵生产醇或其它化合物需要酵母细胞稳定生产丙酮酸生物合成途径的多核苷酸。此外还需要在重组宿主细胞如酵母中生产异丁醇、2，3- 丁二醇、2- 丁醇或2- 丁酮的改善方法。
发明内容
本文提供了具有一种或多种整合多核苷酸的重组宿主细胞，所述多核苷酸编码催化利用丙酮酸的生物合成途径中的步骤(例如丙酮酸至乙酰乳酸的转化)的多肽。与不具有编码催化生物合成途径步骤(例如丙酮酸至乙酰乳酸的转化)的多肽的整合多核苷酸的宿主细胞相比，此类宿主细胞提供稳定和/或增加生物合成途径产物形成的方法，所述产物例如异丁醇、2，3- 丁二醇、2- 丁醇或2- 丁酮。本发明的一个方面涉及包含编码多肽的多核苷酸的重组宿主细胞，所述多肽催化丙酮酸至乙酰乳酸的转化，所述多核苷酸被整合到宿主细胞的染色体中。在另一方面，所述宿主细胞包含利用丙酮酸的生物合成途径和编码催化丙酮酸至乙酰乳酸的转化的多肽的多核苷酸，所述多核苷酸被整合到宿主细胞的染色体中。在另一方面，所述多核苷酸是宿主细胞异源性的。本发明的一个方面涉及重组宿主细胞，其包含异丁醇生物合成途径，其中所述途径包括由多肽催化的丙酮酸至乙酰乳酸的底物至产物的转化，所述多肽由整合到染色体中的异源性多核苷酸编码，并且其中所述途径包括由多肽催化的乙酰乳酸至2，3- 二羟基异戊酸的底物至产物的转化，所述多肽由质粒上的多核苷酸编码。在多个实施例中，与编码催化丙酮酸至乙酰乳酸的转化的多肽的多核苷酸没有被整合到染色体中的重组宿主细胞相t匕，所述异丁醇生产的滴度是提高的。本发明的一个方面涉及重组宿主细胞，其包含2，3- 丁二醇、2- 丁醇或2- 丁酮生物合成途径，其中所述途径包括由多肽催化的丙酮酸至乙酰乳酸的底物至产物的转化，所述多肽由整合到染色体中的异源性多核苷酸编码，并且其中所述途径包括至少一种由多肽催化的底物至产物的转化，所述多肽由质粒上的多核苷酸编码。在多个实施例中，与编码催化丙酮酸至乙酰乳酸的转化的多肽的多核苷酸没有被整合到染色体中的重组宿主细胞相比，所述2，3- 丁二醇、2- 丁醇或2- 丁酮生产的滴度是提高的。在另一方面，本发明涉及重组宿主细胞，其包含编码第一多肽的第一异源性多核苷酸，所述第一多肽催化利用丙酮酸的生物合成途径的转化步骤；编码第二多肽的第二异源性多核苷酸，所述第二多肽催化利用丙酮酸的生物合成途径的转化步骤；和编码第三多肽的第三异源性多核苷酸，所述第三多肽催化利用丙酮酸的生物合成途径的转化步骤；其中所述第一和第二异源性多核苷酸被整合到宿主细胞的染色体中；其中所述第三异源性多核苷酸没有被整合到宿主细胞的染色体中；并且其中所述第一、第二、和第三多肽催化利用丙酮酸的生物合成途径的不同步骤。
在另一方面，本发明涉及重组宿主细胞，其包含(a)编码第一多肽的第一异源性多核苷酸，所述第一多肽催化丙酮酸至乙酰乳酸的底物至产物的转化；(b)编码第二多肽的第二异源性多核苷酸，所述第二多肽催化α-酮异戊酸至异丁醛的底物至产物的转化；和(c)编码第三多肽的第三异源性多核苷酸，所述第三多肽催化不是(a)或(b)的转化步骤的异丁醇生物合成途径转化步骤；其中所述第一和第二异源性多核苷酸被整合到染色体中；其中所述第三异源性多核苷酸没有被整合到染色体中；并且其中所述宿主细胞产生异丁醇。在另一方面，本发明涉及重组宿主细胞，其包含(a)编码第一多肽的第一异源性多核苷酸，所述第一多肽催化α -酮异戊酸至异丁醛的底物至产物的转化；和6)编码第二多肽的第二异源性多核苷酸，所述第二多肽催化不是(a)的转化步骤的异丁醇生物合成途径转化步骤；其中所述第一异源性多核苷酸被整合到染色体中；其中所述第二异源性多核苷酸没有被整合到染色体中；并且其中所述宿主细胞产生异丁醇。在本发明的多个方面，所述宿主细胞是细菌、蓝细菌、丝状真菌或酵母。在另一方面，宿主细胞是下列属的成员:梭菌属(Clostridium)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、红球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽抱杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、肠球菌属(Enterococcus)、产喊杆菌属(Alcaligenes)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、伊萨酵母属(Issatchenkia)、类芽抱杆菌属(Paenibacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、毕赤酵母属(Pichia)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)或糖酵母属(Saccharomyces)。在另一方面，宿主细胞是大肠杆菌(Escherichia coli)、真养产碱杆菌(Alcaligenes eutrophus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、浸麻类芽抱杆菌(Paenibacillus macerans)、红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、享乌鸡肠球菌(Enterococcus gallinarium)、屎肠球菌(Enterococcus faecalis)或啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)。在另一方面,所述宿主细胞是兼性厌氧菌。在本发明的另一方面，利用丙酮酸的生物合成途径包含一种或多种编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化途径的底物至产物的转化。在另一方面，一种或多种多核苷酸被整合到染色体中。在另一方面，利用丙酮酸的生物合成途径形成产物2，3-丁二醇、异丁醇、2-丁醇或2-丁酮。在本发明的一个方面， 利用丙酮酸的生物合成途径是丁醇生物合成途径。在另一方面，丁醇生物合成途径是2- 丁醇生物合成途径或异丁醇生物合成途径。在另一方面，宿主细胞包含一种或多种编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列底物至产物的转化:(i)丙酮酸至乙酰乳酸；(ii)乙酰乳酸至2，3- 二羟基异戊酸；(iii) 2，3- 二羟基异戊酸至α-酮异戊酸；(iv) α-酮异戊酸至异丁醛；或(V)异丁醛至异丁醇。在另一方面，(ii)、(iii )、( iv)或(V)的一种或多种多核苷酸在质粒上。在另一方面，宿主细胞包含一种或多种编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列底物至产物的转化:(i)丙酮酸至乙酰乳酸；(ii)乙酰乳酸至2，3- 二羟基异戊酸；(iii) 2，3- 二羟基异戊酸至α -酮异戊酸；(iv) α -酮异戍酸至异丁酰-CoA ； (V)异丁酰-CoA至异丁醒；或(>；0异丁醒至异丁醇。在另一方面，
(ii)、(iii)、(iv)、(v)或(vi)的一种或多种多核苷酸在质粒上。在另一方面，宿主细胞包含一种或多种编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列底物至产物的转化:(i)丙酮酸至乙酰乳酸；(ii)乙酰乳酸至2，3- 二羟基异戊酸；(iii) 2，3- 二羟基异戊酸至α -酮异戊酸；(iv) α -酮异戊酸至缬氨酸；(V)缬氨酸至异丁胺；(vi)异丁胺至异丁醛；或(vii)异丁醒至异丁醇。在另一方面，(ii)、(iii)、(iv)、(V)、(vi)或(vii)的一种或多种多核苷酸在质粒上。在本发明的另一方面，宿主细胞包含一种或多种编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列底物至产物的转化:(i)丙酮酸至乙酰乳酸；(ii)乙酰乳酸至乙偶姻；(iii)乙偶姻至2，3-丁二醇；或(^)2，3-丁二醇至2-丁酮。在另一方面，(ii)、(iii)或(iv)的一种或多种多核苷酸在质粒上。在另一方面，宿主细胞包含一种或多种编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列底物至产物的转化:(i)丙酮酸至乙酰乳酸；(ii)乙酰乳酸至乙偶姻；(iii)乙偶姻至2，3- 丁二醇；(iv)2, 3- 丁二醇至2- 丁酮；或(v)2- 丁酮至2- 丁醇。在另一方面，(ii)、(iii)、(iv)或(V)的一种或多种多核苷酸在质粒上。在本发明的另一方面，宿主细胞包含一种或多种编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列底物至产物的转化:(i)丙酮酸至乙酰乳酸；(ii) α-乙酰乳酸至乙偶姻；(iii)乙偶姻至3-氨基-2- 丁醇；(iv) 3-氨基-2- 丁醇至3-氨基-2- 丁醇磷酸；(V)或3-氨基-2-丁醇磷酸至2-丁酮。在另一方面，(ii)、(iii)、(iv)或(V)的一种或多种多核苷酸在质粒上。在另一方面，宿主细胞包含一种或多种编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列底物至产物的转化:(i)丙酮酸至乙酰乳酸；(ii) α -乙酰乳酸至乙偶姻；(iii)乙偶姻至3-氨基-2- 丁醇；(iv) 3-氨基-2- 丁醇至3-氨基-2- 丁醇磷酸；(V) 3-氨基-2- 丁醇磷酸至 2- 丁酮；或(>；0 2- 丁酮至 2- 丁醇。在另一方面，(ii)、(iii)、(iv)、(v)或(vi)的一种或多种多核苷酸在质粒上。在另一方面，至少其中一种编 码催化底物至产物转化的多肽的多核苷酸是异源性的。在另一个实施例中，多于一种编码催化底物至产物转化的多肽的多核苷酸是异源性的。在另一个实施例中，所有编码催化利用丙酮酸的生物合成途径中每个底物至产物转化的多肽的多核苷酸是异源性的。在本发明的一个方面，催化丙酮酸至乙酰乳酸的底物至产物转化的多肽是乙酰乳酸合酶。在另一方面，乙酰乳酸合酶与表I所述的乙酰乳酸合酶具有至少约80%的氨基酸序列同一性。在另一方面，乙酰乳酸合酶与具有SEQ ID N0:2、4、6、8、10、12、14、16或18的氨基酸序列具有至少约80%的同一性。在另一方面，催化丙酮酸至乙酰乳酸的转化的多肽对应于酶委员会编号(Enzyme Commission Number) EC2.2.1.6。在本发明的另一方面，催化乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸的转化的多肽对应于酶委员会编号ECl.1.1.86。在另一方面，催化2，3-二羟基异戊酸至α-酮异戊酸的转化的多肽对应于酶委员会编号EC4.2.1.9。在另一方面，催化α -酮异戊酸至异丁醛的转化的多肽对应于酶委员会编号EC4.1.1.72或4.1.1.1。在另一方面，催化异丁醛至异丁醇的转化的多肽对应于酶委员会编号ECl.1.1.265、1.1.1.1或1.1.1.2。在一个方面，本发明的宿主细胞中丙酮酸脱羧酶的表达是降低的或基本上消除的。在另一方面，宿主细胞包含内源性多核苷酸中的缺失、突变、和/或替换，所述内源性多核苷酸编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽。在本发明的另一方面，一种或多种编码催化本文所述的生物合成途径步骤的多肽的多核苷酸在质粒中。在另一方面，所述质粒包含与SEQ ID NO:1至89中的一种或多种至少约 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99% 相同的序列，或者与 SEQ ID NO: 129-133或它们的编码区中的任何一个至少约75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的序列。在一个方面，本发明的宿主细胞中甘油-3-磷酸脱氢酶的表达是降低的或基本上消除的。在另一方面，本发明的宿主细胞中FRA2的表达是降低的或基本上消除的。在另一方面，本文所述的一种或多种多核苷酸被整合到宿主细胞的染色体中I3DCl-TRXl基因间区域处。在一个方面，本发明涉及生产来自本发明宿主细胞的生物合成途径产物的方法。在另一方面，本发明涉及生产丁醇的方法，所述方法包括(a)提供本发明的重组宿主细胞；以及(b)在产生丁醇的条件下，使所述重组宿主细胞与可发酵碳底物接触以形成发酵液体培养基。在另一方面，所述方法还包括使所述发酵液体培养基与提取剂接触以产生两相发酵混合物。在另一方面，所述提取剂包括脂肪酸。在另一方面，所述脂肪酸来源于玉米油或大豆油。在另一方面，所述提取剂包括与水不混溶的有机提取剂如C12-C22脂肪醇、C12-C22脂肪酸、C12-C22脂肪酸的酯、C12-C22脂肪酰胺或C12-C22脂肪醛。在另一方面，所述方法还包括使所述发酵液体培养基与有机酸和酶接触，所述酶能够用所述有机酸酯化丁醇。在另一方面，所述方法还包括蒸发所述发酵液体培养基的至少一部分以形成包含水和丁醇的蒸气流。在一个方面，与编码催化丙酮酸至乙酰乳酸的转化的多肽的多核苷酸没有被整合到染色体中的宿主细胞相比，本发明的宿主细胞的丁醇生产速率提高至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约95%、至少约2倍、至少约3倍或至少约4倍。在另一方面，与编码催化丙酮酸至乙酰乳酸的转化的多肽的多核苷酸没有被整合到染色体中的宿主细胞相比，本发明的宿主细胞的丁醇生产滴度提高至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约95%、至少约2倍、至少约3倍或至少约4倍。 在另一方面，本发明涉及提高非整合重组多核苷酸的拷贝数或表达的方法，所述重组多核苷酸编码催化本文所述的生物合成途径步骤的多肽，所述方法包括在产生生物合成途径产物的条件下，使本发明的宿主细胞与可发酵碳底物接触以形成发酵液体培养基。在另一方面，本发明涉及提高利用丙酮酸的生物合成途径的流量的方法，所述方法包括:(a)提供本发明的重组宿主细胞；以及(b)在提高所述宿主细胞中利用丙酮酸的生物合成途径的流量的条件下，使所述宿主细胞与可发酵碳底物接触以形成发酵液体培养基。在另一方面，本发明涉及制备重组宿主细胞的方法，所述方法包括用下列多核苷酸转化宿主细胞:(i) 一种或多种编码催化利用丙酮酸的生物合成途径的底物至产物转化的多肽的多核苷酸jP(ii)编码催化丙酮酸至乙酰乳酸的转化的多肽的多核苷酸；其中
(ii)的多核苷酸被整合到染色体中。在另一方面，本发明涉及提高利用丙酮酸的生物合成途径产物的形成的方法，所述方法包括:(i)提供本发明的重组宿主细胞；以及(ii)使所述宿主细胞在形成利用丙酮酸的途径产物的条件下生长，其产物量大于由不包含整合到染色体中的编码催化丙酮酸至乙酰乳酸的转化的多肽的多核苷酸的宿主细胞形成的产物量。
在另一方面，本发明涉及组合物，其包含(i)本发明的宿主细胞；(ii) 丁醇；和
(iii)提取剂。在另一方面，本发明涉及组合物，其包含(i)本发明的宿主细胞；(ii)丁醇；
(iii)提取剂；和(iv)酯化酶。在另一方面，此类组合物的丁醇是异丁醇。在另一方面，本发明涉及将乙酰乳酸合酶(als)染色体整合到酵母宿主细胞的方法，所述方法包括用包含SEQ ID NO: 131的整合载体转化所述宿主细胞。在另一方面，宿主细胞还包含异丁醇生物合成途径。在另一方面，所述宿主包含至少两个染色体整合的多核苷酸。
并入本文并成为说明书的一部分的附图示出了本发明，并且与说明书一起进一步用来解释本发明的原理并使得本领域的技术人员能够利用本发明。图1示出利用丙酮酸的途径和酶。图2示出三种不同的异丁醇生物合成途径图3示出四种不同的2- 丁醇生物合成途径。图4A-4D示出乙酰乳酸合酶(als)编码区的序列关系，所述编码区用枯草芽孢杆菌(B.subtilis) AlsS序列的BLAST分析进行检索，限制为该序列的100个最近邻居。als编码序列通过它的来源生物进行鉴定。图 5 示出 PNY2204 基因座(pdcl Δ::ilvD::pUC19_kan::FBA_alsS::TRX1)0图 6 示出 PNY2211 基因座(pdcl Δ::ilvD::FBA_alsS:: TRX1)0 认为 pdcl-trxl 基因间区域中的alsS基因整合是“无痕”插入，因为载体、标记基因和1xP序列丢失。根据下面的详细描述和附带的序列描述可以更充分地理解本发明，下面的详细描述和所附的序列描述形成了本申请的一部分。下列序列符合37C.F.R.§ §1.821-1.825(“对含有核酸序列和/或氨基酸序列公开的专利申请的要求一序列规则”)并且符合世界知识产权组织(WIPO)标准ST.25 (2009)和EPO和PCT的序列表要求[规则5.2和49.5 (a-bis),以及行政性指示的208节和附录C]。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循如37C.F.R.§ 1.822所示的规定。表1:本f渉及的编码区和蛋白质的序列号(SEQ ID NO)
权利要求
1.重组宿主细胞，包含异丁醇生物合成途径，其中所述途径包括由整合到染色体中的异源性多核苷酸编码的多肽催化的丙酮酸至乙酰乳酸的底物至产物的转化，并且其中所述途径包括由质粒上的多核苷酸编码的多肽催化的乙酰乳酸至2，3- 二羟基异戊酸的底物至产物的转化，并且其中与编码催化丙酮酸至乙酰乳酸的转化的多肽的多核苷酸没有被整合到染色体中的重组宿主细胞相比，所述异丁醇生产的滴度是提高的。
2.重组宿主细胞，包含2，3-丁二醇、2- 丁醇或2- 丁酮生物合成途径，其中所述途径包括由整合到染色体中的异源性多核苷酸编码的多肽催化的丙酮酸至乙酰乳酸的底物至产物的转化，并且其中所述途径包括至少一种由质粒上的多核苷酸编码的多肽催化的底物至产物的转化。
3.根据权利要求1或2所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞选自:细菌、蓝细菌、丝状真菌和酵母。
4.根据权利要求1至2中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是选自下列属的成员:梭菌属(Clostridium)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、红球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽抱杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、肠球菌属(Enterococcus )、产喊杆菌属(Alcali genes)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、类芽抱杆菌属(Paenibacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、毕赤酵母属(Pichia)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、伊萨酵母属(Issatchenkia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)和糖酵母属(Saccharomyces)。
5.根据权利要求1至2中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是大肠杆菌(Escherichia coli)。
6.根据权利要求1至2中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述多肽是在所述宿主细胞胞质溶胶中表达的。
7.根据权利要求1至2中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。
8.根据权利要求1至2中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
9.根据权利要求1或3至8中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞还包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列底物至产物的转化:2，3- 二羟基异戊酸至α -酮异戊酸；α -酮异戊酸至异丁醛；以及异丁醛至异丁醇。
10.根据权利要求1或2至8中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞还包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列底物至产物的转化:2，3- 二羟基异戊酸至α -酮异戊酸；α -酮异戊酸至异丁酰-CoA ;异丁酰-CoA至异丁醛；以及异丁醛至异丁醇。
11.根据权利要求1或2至8中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞还包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列底物至产物的转化:2，3- 二羟基异戊酸至α -酮异戊酸；α-酮异戊酸至缬氨酸；缬氨酸至异丁胺；异丁胺至异丁醛；以及异丁醛至异丁醇。
12.根据权利要求2至8中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞还包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列底物至产物的转化:乙酰乳酸至乙偶姻；乙偶姻至·2，3- 丁二醇；以及2，3- 丁二醇至2- 丁酮。
13.根据权利要求2至8中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞还包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列底物至产物的转化:乙酰乳酸至乙偶姻；乙偶姻至·2，3- 丁二醇；2，3- 丁二醇至2- 丁酮；以及2- 丁酮至2- 丁醇。
14.根据权利要求1至8中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述催化丙酮酸至乙酰乳酸的底物至产物的转化的多肽是乙酰乳酸合酶。
15.根据权利要求14所述的重组宿主，其中所述乙酰乳酸合酶与选自SEQID N0:2、4、6、8、10、12、14、16或18的氨基酸序列具有至少约80%的同一性。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞中丙酮酸脱羧酶的表达是降低的或基本上消除的。
17.根据权利要求1至15中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞包含内源性多核苷酸中的缺失、突变、和/或替换，所述内源性多核苷酸编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽。
18.根据权利要求1至15中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸被整合到内源性多核苷酸中，所述多核苷酸编码催化丙酮酸至乙酰乳酸的转化的多肽，所述内源性多核苷酸编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞中甘油-3-磷酸脱氢酶的表达是降低的或基本上消除的。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞中Fra2的表达是降低的或基本上消除的。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸被整合到染色体中roc1-TRXI基因间区域处。
22.重组宿主细胞，包含:(a)编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化丙酮酸至乙酰乳酸的底物至产物的转化，其中所述多核苷酸被整合到染色体中；(b)编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸的底物至产物的转化，其中所述多核苷酸在质粒上；(c)编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化2，3-二羟基异戊酸至α-酮异戊酸的底物至产物的转化；和(d)编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化α-酮异戊酸至异丁醛的底物至产物的转化；其中所述宿主细胞基本上不具有丙酮酸脱羧酶活性；并且其中所述宿主细胞产生异丁醇。
23.方法，包括:(a)提供权利要求1至22中任一项或它们的任何组合 的重组宿主细胞；以及(b)在产生生物合成途径产物的条件下，使所述宿主细胞与可发酵碳底物接触以形成发酵液体培养基。
24.根据权利要求23所述的方法，还包括使所述发酵液体培养基与提取剂接触以产生两相发酵混合物。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述提取剂包括脂肪酸。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述脂肪酸来源于玉米油或大豆油。
27.根据权利要求24所述的方法，其中所述提取剂包括与水不混溶的有机提取剂，所述有机提取剂选自=C12-C22脂肪醇、C12-C22脂肪酸、C12-C22脂肪酸的酯、C12-C22脂肪醛和C12-C22脂肪酰胺。
28.根据权利要求23至27中任一项所述的方法，其中所述生物合成途径产物是醇，并且其中所述方法还包括使所述发酵液体培养基与有机酸和酶接触，所述酶能够用所述有机酸酯化所述醇。
29.根据权利要求23至28中任一项所述的方法，其中所述生物合成途径产物是醇，并且其中所述方法还包括蒸发所述发酵液体培养基的至少一部分以形成包含水和醇的蒸气流。
30.根据权利要求23至29中任一项所述的方法，其中所述生物合成途径产物是丁醇。
31.根据权利要求23至30中任一项所述的方法，其中所述生物合成途径产物是异丁醇。
32.根据权利要求30至31中任一项所述的方法，其中与编码催化丙酮酸至乙酰乳酸的转化的多肽的多核苷酸没有被整合到染色体中的重组宿主细胞相比，所述丁醇生产的速率提高至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约95%、至少约2倍、至少约3倍或至少约4倍。
33.根据权利要求30至31中任一项所述的方法，其中与编码催化丙酮酸至乙酰乳酸的转化的多肽的多核苷酸没有被整合到染色体中的重组宿主细胞相比，所述丁醇生产的滴度提高至少约10%、至少 约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约95%、至少约2倍、至少约3倍或至少约4倍。
34.根据权利要求32至33中任一项所述的方法，其中所述丁醇是异丁醇。
35.提高催化生物合成途径步骤的非整合重组多核苷酸的拷贝数或表达的方法，包括: 在产生生物合成途径产物的条件下，使权利要求1至22中任一项的重组宿主细胞与可发酵碳底物接触以形成发酵液体培养基。
36.提高利用丙酮酸的生物合成途径的流量的方法，包括: (a)提供权利要求1至22中任一项或它们的任何组合的重组宿主细胞；以及 (b)在提高所述宿主细胞中利用丙酮酸的生物合成途径的流量的条件下，使所述宿主细胞与可发酵碳底物接触以形成发酵液体培养基。
37.提高2，3-丁二醇、异丁醇、2- 丁醇或2- 丁酮生物合成途径产物的形成的方法，包括: (i)提供权利要求1至22中任一项或它们的任何组合的重组宿主细胞；以及 ( )使所述宿主细胞在形成利用丙酮酸的途径产物的条件下生长； 其中由所述重组宿主细胞形成的产物量大于由编码催化丙酮酸至乙酰乳酸的转化的多肽的多核苷酸没有被整合到染色体中的宿主细胞形成的产物量。
38.组合物，包含: (i)权利要求1至23中任一项或它们的任何组合的宿主细胞； ( ) 丁醇；和(iii)提取剂。
39.组合物，包含: (i)权利要求1至23中任一项或它们的任何组合的宿主细胞； ( ) 丁醇； (iii)提取剂；和 (iv)酯化酶。
40.根据权利要求38或39所述的组合物，其中所述提取剂包括脂肪酸。
41.根据权利要求41所述的组合物，其中所述脂肪酸来源于玉米油或大豆油。
42.根据权利要求38或39所述的组合物，其中所述提取剂是与水不混溶的有机提取齐U，所述有机提取剂选自=C 12-C22脂肪醇、C12-C22脂肪酸、C12-C22脂肪酸的酯、C12-C22脂肪醛和C12-C22脂肪醒。
43.根据权利要求38或39所述的组合物，其中所述提取剂包括油醇。
44.权利要求1或3至23中任一项的宿主细胞或权利要求38至43中任一项的组合物在生产异丁醇的方法中的用途。
45.权利要求1或3至23中任一项的宿主细胞或权利要求38至43中任一项的组合物在生产包含异丁醇的燃料组合物的方法中的用途。
46.根据权利要求2至8中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞还包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列底物至产物的转化:乙酰乳酸至乙偶姻；乙偶姻至3-氨基-2- 丁醇；3_氨基-2- 丁醇至3-氨基-2- 丁醇磷酸；以及3-氨基-2- 丁醇磷酸至2_ 丁酮。
47.根据权利要求2至8中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞还包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列底物至产物的转化:乙酰乳酸至乙偶姻；乙偶姻至3-氨基-2- 丁醇；3_氨基-2- 丁醇至3-氨基-2- 丁醇磷酸；3_氨基-2- 丁醇磷酸至2- 丁酮。
全文摘要
本发明涉及具有至少一种整合多核苷酸的重组宿主细胞，所述多核苷酸编码催化利用丙酮酸的生物合成途径中的步骤(例如丙酮酸至乙酰乳酸的转化)的多肽。本发明也涉及使用此类宿主细胞提高异丁醇、2，3-丁二醇、2-丁醇或2-丁酮的生物合成产量的方法。
文档编号C12N15/63GK103080298SQ201180042345
公开日2013年5月1日 申请日期2011年9月7日 优先权日2010年9月7日
发明者L.C.安东尼, L.A.马吉奥-霍尔, B.J.保罗 申请人:布特马斯先进生物燃料有限责任公司
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