涉及编码pae以及pae样多肽的基因并具有改变的贮藏化合物水平的植物种子、相关的构...的制作方法
专利名称：涉及编码pae以及pae样多肽的基因并具有改变的贮藏化合物水平的植物种子、相关的构 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物分子生物学领域。更具体地，本发明涉及在植物和种子中编码果胶乙酰酯酶(PAE)和果胶乙酰酯酶样(PAE样)蛋白质的分离的核酸片段以及此类片段用于调节编码PAE或PAE样活性的基因的表达的用途。
背景技术：
在成熟期，大豆种子干重的约40%是蛋白质，并且20%是可提取的油。这些组成了大豆作物的有经济价值的产物。例如，植物油是可得自植物的最富含能量的生物质；它们具有碳水化合物两倍的能含量。另外，只需要很少的能量来提取植物油并将其转化成燃料。在种子重量的剩余40%中，约10%是可溶性碳水化合物。可溶性碳水化合物部分对大豆种子的经济价值没有多少贡献，并且可溶性碳水化合物级分的主要组分棉籽糖对加工过程和对大豆粉在单腹动物中的食物价值都是有害的(Coon等人(1988) Proceedings SoybeanUtilization Alternatives, Univ.0f Minnesota,第 203-211 页X因为更好的理解了种子中贮藏化合物生物合成途径，很显然，有可能通过改变油、淀粉和可溶性碳水化合物生物合成途径中的特定酶的催化活性来调节植物细胞中贮藏化合物库的大小(Taiz L.等人 ，PlantPhysiology ;The Benjamin/Cummings PublishingCompany:New York, 1991)。例如，调查LPAT和DAGAT的过表达的研究显示出，使甘油主链酰化的最终步骤在种子中对于向着脂质的流量发挥了重要的控制作用。通过过表达酵母甘油3-磷酸脱氢酶也可在油籽油菜中提高种子油含量，而在质粒中的脂肪酸从头合成所涉及的各个基因(例如乙酰-CoA羧化酶和脂肪酸合酶)的过表达基本上没有改变所积累的脂质的量(Vigeolas H.等人，Plant BiotechnologyJ.5,431-441 (2007))。在拟南芥中已鉴定了低种子油突变体wrinkledl。该突变明显产生了碳水化合物代谢的种子特异性调控中的缺陷(Focks,Nicole 等人,Plant Physiol.(1998), 118 (I) , 91-101 )。持续关注鉴定编码可在植物中调节贮藏化合物诸如油、蛋白质、淀粉和可溶性碳水化合物的合成的蛋白质的基因。丝氨酸水解酶类是自然界中富含的，并且在例如蛋白酶、脂肪酶、酯酶和转移酶的酶中发挥不同的生物化学作用。全部这些相异的酶类在活性位点均有丝氨酸残基，其在亲核攻击中作为底物从而形成共价中间体。已从植物和微生物中纯化了果胶乙酰酯酶(PAE) (EC3.1.1.6)。PAE特异性地使乙酰化碳水化合物聚合物如木聚糖和果胶去乙酰化。PAE已显示例如在半乳糖醛酸残基的C2和/或C3位置从甜菜果胶除去乙酰酯基团(Nielsen, John E.；Christensen, Tove M.1.E.Distribution of pectin methylesterase and acetylesterase in thegenus Citrus visualized by tissue prints andchromatography.Plant Science (Shannon，Ireland) (2002)，162 (5)，799-807)。编码来自植物的PAE的基因已被克隆和测序(Christensen等人，Protein and cDNA sequences oforange fruit pectin acetylesterase, and uses thereof0 PCT 国际申请(2000)，第 88页C0DEN:PIXXD2W02000017368A120000330)。在接受了深度基因组或EST (表达序列标记)测序的每种植物中，已鉴定了编码与PAE具有相似性的蛋白质的大基因家族。就PAE基因家族而言，不同的序列性质和所观察到的表达模式表明，基因家族成员有多糖的去乙酰化之外的生物化学功能。对于这些与具有PAE相似性的蛋白质的可能的作用，进行的研究很少。根据编码PAE样蛋白质的基因在植物中普遍存在的性质，对它们在植物生长和发育中，特别是在贮藏化合物在种子中含量的调控中的作用的深入研究是极为受关注的。
发明内容
在第一实施例中，本发明涉及包含重组DNA构建体的转基因植物，所述重组DNA构建体包含可操作地连接到至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽基于 Clustal V 比对方法在与 SEQ ID NO:36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68或85进行比较时具有至少70%序列同一性的氨基酸序列，并且其中来自所述转基因植物的种子在与来自不包含所述重组DNA构建体的对照植物的种子进行比较时具有改变的油、蛋白质、淀粉和/或可溶性碳水化合物含量。在第二实施例中，本发明涉及包含重组DNA构建体的转基因种子，所述重组DNA构建体包含可操作地连接到至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽基于 Clustal V 比对方法在与 SEQ ID NO:36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、
58、60、62、64、66、68或85进行比较时具有至少70%序列同一性的氨基酸序列 ，并且其中所述转基因种子在与不包含所述重组DNA构建体的对照种子进行比较时具有改变的油、蛋白质、淀粉和/或可溶性碳水化合物含量。在第三实施例中，本发明涉及转基因种子，所述转基因种子包含:重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含:(a)可操作地连接到至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽基于Clustal V比对方法在与SEQ IDNO:36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68 或 85 进行比较时具有至少70%序列同一性的氨基酸序列，或(b)包含至少一种调控元件的抑制DNA构建体，所述调控元件可操作地连接到:(i)以下序列的全部或部分:(A)编码多肽的核酸序列，所述多肽基于 Clustal V 比对方法在与 SEQ ID NO:36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68或85进行比较时具有至少70%序列同一性的氨基酸序列，或(B) (b) (i) (A)的核酸序列的全长互补序列来源于受关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域，所述区域基于Clustal V比对方法在与所述区域所源自的有义链或反义链的所述全部或部分进行比较时具有至少70%序列同一性的核酸序列，并且其中所述受关注的靶基因编码PAE样蛋白质，并且其中所述植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时具有改变的油、蛋白质、淀粉和/或可溶性碳水化合物含量。在第四实施例中，本发明涉及转基因种子，所述转基因种子在与非转基因的种子的油含量进行比较时，基于干重计具有提高了至少4%的油含量，其中所述转基因种子包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含:(a)如SEQ ID NO: 35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67或84所不的核苷酸序列的全部或部分；或(b) (a)的全长互补序列:其中(a)或(b)具有足以抑制内源性活性在转基因植物中的表达的长度，并且进一步地其中所述种子与从非转基因的植物获得的种子相比，基于干重计具有至少4%的油含量的提闻。
在第五实施例中，本发明涉及转基因种子，所述转基因种子包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含:(a) SEQ ID NO: 35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、
63、65、67或84所示的核苷酸序列的全部或部分；或(b)(a)的全长互补序列:其中(a)或
(b)具有足以抑制内源性PAE或PAE样蛋白质活性在转基因植物中的表达的长度，并且进一步地其中所述种子与从非转基因的植物获得的种子相比，基于干重计具有至少4%的油含量的提闻。在第六实施例中，本发明涉及用于产生转基因种子的方法，所述方法包括:Ca)用重组DNA构建体转化植物细胞，所述重组DNA构建体包含可操作地连接到至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽基于Clustal V比对方法在与SEQ IDNO:35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67 或 84 进行比较时具有至少70%序列同一性的氨基酸序列；和(b)由(a)的转化的植物细胞再生转基因植物；以及(c)选择产生转基因种子的转基因植物，所述转基因种子与从非转基因的植物获得的转基因种子相比具有改变的油、蛋白质、淀粉和/或可溶性碳水化合物含量。在第七实施例中，本发明涉及用于产生转基因种子的方法，所述方法包括:(a)用重组DNA构建体转化植物细胞，所述重组DNA构建体包含:(i)如SEQ ID N0:35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67或84所示的核苷酸序列的全部或部分；或
(ii)⑴的全长互补序列；其中⑴或(ii)具有足以抑制内源性PAE或PAE样蛋白质活性在转基因植物中的表达的长度；(b)由(a)的转化的植物细胞再生转基因植物；以及(c)选择产生转基因种子的转基因植物，所述转基因种子与从非转基因的植物获得的转基因种子相比具有改变的油、蛋白质、淀粉和/或可溶性碳水化合物含量。在第八实施例中，本发明涉及用于产生转基因种子的方法，所述方法包括:(a)用重组DNA构建体转化植物细胞，所述重组DNA构建体包含:(i)如SEQ ID N0:35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67或84所示的核苷酸序列的全部或部分；或
(ii)⑴的全长互补序列；其中⑴或(ii)具有足以抑制内源性PAE或PAE样蛋白质活性在转基因植物中的表达的长度；(b)由(a)的转化的植物细胞再生转基因植物；以及(c)选择产生转基因种子的转基因植物，所述转基因种子与从非转基因的植物获得的转基因种子相比，基于干重计具有至少4%的油含量的提高。在第九实施例中，本发明涉及转基因种子，所述转基因种子包含:重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含:(a)可操作地连接到至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽基于Clustal V比对方法在与SEQ IDN0:36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68 或 85 进行比较时具有至少70%序列同一性的氨基酸序列；或(b)包含至少一种调控元件的抑制DNA构建体，所述调控元件可操作地连接到:(i)以下序列的全部或部分:(A)编码多肽的核酸序列，所述多肽基于 Clustal V 比对方法在与 SEQ ID NO:36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、
64、66、68或85进行比较时具有至少70%序列同一性的氨基酸序列，或(B)(b) (i) (A)的核酸序列的全长互补序列来源于受关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域，所述区域基于Clu stal V比对方法在与所述区域所源自的有义链或反义链的所述全部或部分进行比较时具有至少70%序列同一性的核酸序列，并且其中所述受关注的靶基因编码PAE样蛋白质，并且其中所述植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时具有改变的、提高的或降低的油、蛋白质、淀粉和/或可溶性碳水化合物含量。在第十实施例中，本发明包括分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含:(a)编码改变即提高或降低油、蛋白质、淀粉和/或可溶性碳水化合物含量所需的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽在与SEQ ID N0:36或48进行比较时具有至少95%序列同一性的氨基酸序列，或(b)所述核苷酸序列的全长互补序列，其中所述全长互补序列和所述核苷酸序列由相同数目的核苷酸组成并且 是100%互补的。所述多肽可包含SEQ ID N0:36或48的氨基酸序列。所述核苷酸序列可包含SEQ ID NO:35或47的核苷酸序列。在另一个实施例中，本发明涉及包含本发明任何分离的多核苷酸的重组DNA构建体，所述分离的多核苷酸可操作地连接到至少一种调控序列，并且本发明涉及包含所述重组DNA构建体的细胞、植物和种子。所述细胞可为真核细胞，例如酵母、昆虫或植物细胞，或者为原核细胞，例如细菌细胞。从单子叶植物和双子叶植物(例如，分别如玉米和大豆)获得的包含本发明的重组构建体的种子在本发明的范围之内。驱动表达本发明核酸序列的种子特异性或种子优选的启动子也被包括在内。驱动表达本发明核酸序列的胚或胚乳特异性的启动子也被包括在内。此外，本发明的方法对于从单子叶植物(例如玉米和稻)和双子叶植物(例如大豆和卡诺拉)获得转基因种子是有用的。也在本发明范围之内的是从转基因种子获得的产物和/或副产物，所述转基因种子从单子叶植物或双子叶植物(分别例如玉米和大豆)获得。在另一个实施例中，本发明涉及用于在植物中抑制编码具有PAE样蛋白质活性的多肽的基因的表达水平的方法，其中所述方法包括用本发明的任何核酸片段转化单子叶植物或双子叶植物。
和序列表根据以下的形成本专利申请的一部分的具体实施方式
和附图以及序列表，可更全面地理解本发明。图1A-1D显示了由来源于以下的核苷酸序列编码的PAE和PAE样蛋白质的氨基酸序列的比对:完菁(Brassica rapa) (SEQ ID NO: 36);向日葵(Helianthus annuus)(SEQ ID NO:38);蓖麻(Ricinus communis) (SEQ ID NO:40);大豆(Glycine max) (SEQ IDN0:42、44、46 和 48);玉米(Zea mays) (SEQ ID N0:50、52 和 54);水稻(Oryzasativa) (SEQID N0:56、58 和 60);高粱(Sorghumbicolor) (SEQ ID N0:62、64 和 66);小麦(Triticumaestivum) (SEQ ID NO:68);拟南芥(Arabidopsisthaliana) (SEQ ID N0:85,At2g46930)；SEQ ID勵:86，对应于来自美国专利申请”20100083407的5￡0 ID NO:53381 (大豆)；和SEQ ID N0:87，对应于美国专利申请US20090094717的SEQ ID NO: 13822 (拟南芥)。就比对而言，将在全部序列之间在给定位置处保守的氨基酸划框表示。该程序用短划线来使序列间最大程度的对齐。图2显示了图1A-1D中显示的每对氨基酸序列的百分比序列同一性的图表。序列描述以及所附序列表遵循如37C.F.R.§1.821-1.825所示的关于专利申请中核苷酸和/或氨基酸序列公开的规定。
SEQIDNO:1对应于载体PHSbarENDS2的核苷酸序列。SEQIDN0:2对应于多接头的核苷酸序列。SEQIDN0:3对应于载体pKR85的核苷酸序列。SEQIDN0:4对应于载体pKR278的核苷酸序列。SEQIDN0:5对应于载体pKR407的核苷酸序列。SEQIDN0:6对应于载体pKR1468的核苷酸序列。SEQIDN0:7对应于载体pKR1475的核苷酸序列。SEQIDN0:8对应于载体pKR92的核苷酸序列。SEQIDN0:9对应于载体pKR1478的核苷酸序列。SEQIDNO: 10 对应于 SAIFF 和 lo22730 的基因组 DNA。SEQIDNO: 11 对应于正向引物 PAE ORF FffD0SEQIDNO: 12 对应于反向引物 PAE ORF REV。SEQIDNO: 13对应于包含PAE的载体pENTR的核苷酸序列。SEQID勵:14对应于载体口10 1478^^￡的核苷酸序列。SEQID勵:15对应于？10 1481的核苷酸序列。SEQIDNO: 16 对应于 AthLcc In 正向引物。SEQIDNO: 17 对应于 AthLcc In 反向引物。SEQIDNO: 18对应于含有漆酶内含子的PCR (聚合酶链反应)产物。SEQIDNO: 19对应于PSM1318的核苷酸序列。SEQIDN0:20 对应于 pMBL18AITR12INT 的核苷酸序列。SEQIDNO:21对应于PSM1789的核苷酸序列。SEQIDN0:22 对应于 pMBL18AITR12INT ATTR21 的核苷酸序列。SEQIDNO:23 对应于 SuSy-5’ 引物。SEQIDNO: 24 对应于 SuSy-3’ 引物。SEQIDN0:25对应于pLF122的核苷酸序列。SEQIDN0:26对应于pKR1142的核苷酸序列。SEQIDN0:27对应于pKR1155的核苷酸序列。SEQIDN0:28对应于KS294的核苷酸序列。SEQIDN0:29对应于pKR627的核苷酸序列。SEQIDN0:30对应于pKR132的核苷酸序列。SEQIDNO:31对应于pKR278的核苷酸序列。SEQIDN0:32对应于pKR1157的核苷酸序列。SEQIDN0:33对应于pKR1479的核苷酸序列。SEQIDN0:34 对应于 pKR1481-PAE 的核苷酸序列。 表I列出了本文所述的多肽、包含编码这些多肽全部或其主要部分的核酸片段的克隆的命名、以及在所附序列表中使用的对应标识符(SEQ ID NO:)。表I还标示了作为单独的EST (“EST”)的cDNA克隆、包含标明的cDNA克隆的整个cDNA插入物的序列(“FIS”)、由两个或更多个EST组装而成的重叠群(“Contig”)、由FIS和一个或多个EST组装而成的重叠群(“Contig*”)或编码源自FIS、重叠群、EST和PCR或FIS和PCR的完整或功能性蛋白质的序列(“ CGS ”)。表IPAE样蛋白质
权利要求
1.包含重组DNA构建体的转基因植物，所述重组DNA构建体包含可操作地连接到至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽基于Clustal V比对方法在与 SEQ ID NO:36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68 或 85 进行比较时具有至少70%序列同一性的氨基酸序列，并且其中从所述转基因植物获得的种子在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时具有改变的即提高的或降低的油、蛋白质、淀粉和/或可溶性碳水化合物含量。
2.从权利要求1所述的转基因植物获得的转基因种子，所述转基因种子包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含可操作地连接到至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO:36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68或85进行比较时具有至少70%序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述转基因种子在与来自不包含所述重组DNA构建体的对照植物的种子进行比较时具有改变的油、蛋白质、淀粉和/或可溶性碳水化合物含量。
3.转基因种子，包含: 重组DNA构建体，其包含: (a)可操作地连接到至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽基于 Clustal V 比对方法在与 SEQ ID NO:36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68或85进行比较时具有至少70%序列同一性的氨基酸序列，或 (b)抑制DNA构建体，所述构建体包含至少一种调控元件，所述调控元件可操作地连接到: (i)以下序列的全部或部分:(A)编码多肽的核酸序列，所述多肽基于ClustalV比对方法在与 SEQ ID N0:36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68 或 85 进行比较时具有至少70%序列同一性的氨基酸序列，或(B) (b) (i) (A)的核酸序列的全长互补序列；或 (ii)来源于受关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域，所述区域基于Clustal V比对方法在与所述区域所源自的有义链或反义链的所述全部或部分进行比较时具有至少70%序列同一性的核酸序列，并且其中所述受关注的靶基因编码PAE或PAE样蛋白质， 并且其中所述植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时具有改变的、提高的或降低的油、蛋白质、淀粉和/或可溶性碳水化合物含量。
4.根据权利要求1所述的转基因种子，其中所述油含量在与非转基因的植物的油含量进行比较时提高了至少4%。
5.包含重组DNA构建体的转基因种子，包含:(a)如 SEQ ID NO:35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67 或84 所示的核苷酸序列的全部或部分； 或(b) (a)的全长互补序列: 其中(a)或(b)具有足以抑制内 源性PAE或PAE样蛋白质活性在转基因植物中的表达的长度，并且进一步地其中所述种子与从非转基因的植物获得的种子相比，基于干重计具有至少4%的油含量的提高。
6.产生转基因植物的方法，所述方法包括:(a)用重组DNA构建体转化植物细胞，所述重组DNA构建体包含可操作地连接到至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽基于Clustal V比对方法在与 SEQ ID NO:36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68 或 85 进行比较时具有至少70%序列同一性的氨基酸序列；以及由所述转化的植物细胞再生植物。
7.产生转基因种子的方法，所述方法包括: (a)用重组DNA构建体转化植物细胞，所述 重组DNA构建体包含可操作地连接到至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽基于Clustal V比对方法在与 SEQ ID NO:36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68 或 85 进行比较时具有至少70%序列同一性的氨基酸序列；以及 (b)由(a)的转化的植物细胞再生转基因植物；以及 (c)选择产生转基因种子的转基因植物，所述转基因种子与从非转基因的植物获得的转基因种子相比具有改变的油、蛋白质、淀粉和/或可溶性碳水化合物含量。
8.产生转基因种子的方法，所述方法包括: (a)用重组DNA构建体转化植物细胞，所述重组DNA构建体包含可操作地连接到至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽基于Clustal V比对方法在与 SEQ ID NO:36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68 或 85 进行比较时具有至少70%序列同一性的氨基酸序列；以及 (b)由(a)的转化的植物细胞再生转基因植物；以及 (c)选择产生转基因种子的转基因植物，所述转基因种子与从非转基因的植物获得的转基因种子相比具有至少0.5%的提高的淀粉含量。
9.产生转基因种子的方法，所述方法包括: (a)用重组DNA构建体转化植物细胞，所述重组DNA构建体包含:(i)如SEQ ID NO:35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67 或84 所示的核苷酸序列的全部或部分；或 (ii)(i)的全长互补序列； 其中(i)或(ii)具有足以抑制内源性PAE或PAE样蛋白质活性在转基因植物中的表达的长度； (b)由(a)的转化的植物细胞再生转基因植物；以及 (c)选择产生转基因种子的转基因植物，所述转基因种子与从非转基因的植物获得的转基因种子相比具有改变的油、蛋白质、淀粉和/或可溶性碳水化合物含量。
10.产生转基因种子的方法，所述方法包括: (a)用重组DNA构建体转化植物细胞，所述重组DNA构建体包含:(i)如SEQ ID NO:35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67 或84 所示的核苷酸序列的全部或部分；或 (ii)(i)的全长互补序列； 其中(i)或(ii)具有足以抑制内源性PAE或PAE样蛋白质活性 在转基因植物中的表达的长度； (b)由(a)的转化的植物细胞再生转基因植物；以及 (c)选择产生转基因种子的转基因植物，所述转基因种子与从非转基因的植物获得的转基因种子相比，基于干重计具有至少4%的油含量的提高。
11.根据权利要求1、2、3、4或5中任一项所述的转基因种子，其中所述转基因种子从单子叶植物或双子叶植物获得。
12.根据权利要求1、2、3、4或5中任一项所述的转基因种子，其中所述转基因种子从玉米植物或大豆植物获得。
13.根据权利要求1、2、3、4或5中任一项所述的转基因种子，其中所述至少一种调控元件是种子特异性或种子优选的启动子。
14.根据权利要求1、2、3、4或5中任一项所述的转基因种子，其中所述至少一种调控元件是胚乳或胚特异性启动子。
15.根据权利要求6、7、8、9或10中任一项所述的方法，其中所述转基因种子从转基因双子叶植物获得，所述转基因双子叶植物在其基因组中包含所述重组构建体。
16.根据权利要求6、7、8、9或10中任一项所述的方法，其中所述双子叶植物是大豆。
17.通过权利要求6、7、8、9或10中任一项所述的方法获得的转基因种子。
18.从权利要求6、7、8、9或10中任一项所述的转基因种子获得的产物和/或副产物。
19.通过权利要求6、7、8、9、10或11中任一项所述的方法获得的转基因种子，其中所述转基因种子从单子叶植物或双子叶植物获得。
20.来自权利要求2所 述的转基因种子的产物和/或副产物，其中所述植物是玉米或大豆。
21.来自权利要求3所述的转基因种子的产物和/或副产物，其中所述植物是玉米或大豆。
22.来自权利要求4所述的转基因种子的产物和/或副产物，其中所述植物是玉米或大豆。
23.来自权利要求5所述的转基因种子的产物和/或副产物，其中所述植物是玉米或大豆。
24.分离的多核苷酸，包括: (a)编码在植物中改变，即提高或降低油、蛋白质、淀粉和/或可溶性碳水化合物含量所必需的多肽的核苷酸序列，其中基于Clustal V比对方法，使用逐对比对默认参数KTUPLE=1、GAPPENALTY=3、WINDOW=5 和 DIAGONALS SAVED=5，，在与 SEQ ID NO: 36 或 48 进行比较时，所述多肽具有至少95%序列同一性的氨基酸序列；或 (b)(a)的核苷酸序列的全长互补序列。
25.根据权利要求24所述的多核苷酸，其中所述多肽的氨基酸序列包含SEQID NO: 36或48。
26.根据权利要求24所述的多核苷酸，其中所述核苷酸序列包含SEQID NO: 35或47。
27.包含重组DNA构建体的植物或种子，其中所述重组DNA构建体包含可操作地连接到至少一种调控序列的权利要求24至26中任一项所述的多核苷酸。
全文摘要
本发明涉及植物分子生物学领域。更具体地，本发明涉及在植物和种子中编码PAE或PAE样蛋白质的分离的核酸片段以及此类片段用于调节编码PAE或PAE样蛋白质活性的基因在转化的宿主细胞中的表达的用途。
文档编号C12N15/55GK103080320SQ201180042448
公开日2013年5月1日 申请日期2011年6月29日 优先权日2010年7月1日
发明者K·迈尔, B·麦戈尼格尔, K·L·斯特卡 申请人:纳幕尔杜邦公司
技术领域：
本发明涉及植物分子生物学领域。更具体地，本发明涉及在植物和种子中编码果胶乙酰酯酶(PAE)和果胶乙酰酯酶样(PAE样)蛋白质的分离的核酸片段以及此类片段用于调节编码PAE或PAE样活性的基因的表达的用途。
背景技术：
在成熟期，大豆种子干重的约40%是蛋白质，并且20%是可提取的油。这些组成了大豆作物的有经济价值的产物。例如，植物油是可得自植物的最富含能量的生物质；它们具有碳水化合物两倍的能含量。另外，只需要很少的能量来提取植物油并将其转化成燃料。在种子重量的剩余40%中，约10%是可溶性碳水化合物。可溶性碳水化合物部分对大豆种子的经济价值没有多少贡献，并且可溶性碳水化合物级分的主要组分棉籽糖对加工过程和对大豆粉在单腹动物中的食物价值都是有害的(Coon等人(1988) Proceedings SoybeanUtilization Alternatives, Univ.0f Minnesota,第 203-211 页X因为更好的理解了种子中贮藏化合物生物合成途径，很显然，有可能通过改变油、淀粉和可溶性碳水化合物生物合成途径中的特定酶的催化活性来调节植物细胞中贮藏化合物库的大小(Taiz L.等人 ，PlantPhysiology ;The Benjamin/Cummings PublishingCompany:New York, 1991)。例如，调查LPAT和DAGAT的过表达的研究显示出，使甘油主链酰化的最终步骤在种子中对于向着脂质的流量发挥了重要的控制作用。通过过表达酵母甘油3-磷酸脱氢酶也可在油籽油菜中提高种子油含量，而在质粒中的脂肪酸从头合成所涉及的各个基因(例如乙酰-CoA羧化酶和脂肪酸合酶)的过表达基本上没有改变所积累的脂质的量(Vigeolas H.等人，Plant BiotechnologyJ.5,431-441 (2007))。在拟南芥中已鉴定了低种子油突变体wrinkledl。该突变明显产生了碳水化合物代谢的种子特异性调控中的缺陷(Focks,Nicole 等人,Plant Physiol.(1998), 118 (I) , 91-101 )。持续关注鉴定编码可在植物中调节贮藏化合物诸如油、蛋白质、淀粉和可溶性碳水化合物的合成的蛋白质的基因。丝氨酸水解酶类是自然界中富含的，并且在例如蛋白酶、脂肪酶、酯酶和转移酶的酶中发挥不同的生物化学作用。全部这些相异的酶类在活性位点均有丝氨酸残基，其在亲核攻击中作为底物从而形成共价中间体。已从植物和微生物中纯化了果胶乙酰酯酶(PAE) (EC3.1.1.6)。PAE特异性地使乙酰化碳水化合物聚合物如木聚糖和果胶去乙酰化。PAE已显示例如在半乳糖醛酸残基的C2和/或C3位置从甜菜果胶除去乙酰酯基团(Nielsen, John E.；Christensen, Tove M.1.E.Distribution of pectin methylesterase and acetylesterase in thegenus Citrus visualized by tissue prints andchromatography.Plant Science (Shannon，Ireland) (2002)，162 (5)，799-807)。编码来自植物的PAE的基因已被克隆和测序(Christensen等人，Protein and cDNA sequences oforange fruit pectin acetylesterase, and uses thereof0 PCT 国际申请(2000)，第 88页C0DEN:PIXXD2W02000017368A120000330)。在接受了深度基因组或EST (表达序列标记)测序的每种植物中，已鉴定了编码与PAE具有相似性的蛋白质的大基因家族。就PAE基因家族而言，不同的序列性质和所观察到的表达模式表明，基因家族成员有多糖的去乙酰化之外的生物化学功能。对于这些与具有PAE相似性的蛋白质的可能的作用，进行的研究很少。根据编码PAE样蛋白质的基因在植物中普遍存在的性质，对它们在植物生长和发育中，特别是在贮藏化合物在种子中含量的调控中的作用的深入研究是极为受关注的。
发明内容
在第一实施例中，本发明涉及包含重组DNA构建体的转基因植物，所述重组DNA构建体包含可操作地连接到至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽基于 Clustal V 比对方法在与 SEQ ID NO:36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68或85进行比较时具有至少70%序列同一性的氨基酸序列，并且其中来自所述转基因植物的种子在与来自不包含所述重组DNA构建体的对照植物的种子进行比较时具有改变的油、蛋白质、淀粉和/或可溶性碳水化合物含量。在第二实施例中，本发明涉及包含重组DNA构建体的转基因种子，所述重组DNA构建体包含可操作地连接到至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽基于 Clustal V 比对方法在与 SEQ ID NO:36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、
58、60、62、64、66、68或85进行比较时具有至少70%序列同一性的氨基酸序列 ，并且其中所述转基因种子在与不包含所述重组DNA构建体的对照种子进行比较时具有改变的油、蛋白质、淀粉和/或可溶性碳水化合物含量。在第三实施例中，本发明涉及转基因种子，所述转基因种子包含:重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含:(a)可操作地连接到至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽基于Clustal V比对方法在与SEQ IDNO:36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68 或 85 进行比较时具有至少70%序列同一性的氨基酸序列，或(b)包含至少一种调控元件的抑制DNA构建体，所述调控元件可操作地连接到:(i)以下序列的全部或部分:(A)编码多肽的核酸序列，所述多肽基于 Clustal V 比对方法在与 SEQ ID NO:36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68或85进行比较时具有至少70%序列同一性的氨基酸序列，或(B) (b) (i) (A)的核酸序列的全长互补序列来源于受关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域，所述区域基于Clustal V比对方法在与所述区域所源自的有义链或反义链的所述全部或部分进行比较时具有至少70%序列同一性的核酸序列，并且其中所述受关注的靶基因编码PAE样蛋白质，并且其中所述植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时具有改变的油、蛋白质、淀粉和/或可溶性碳水化合物含量。在第四实施例中，本发明涉及转基因种子，所述转基因种子在与非转基因的种子的油含量进行比较时，基于干重计具有提高了至少4%的油含量，其中所述转基因种子包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含:(a)如SEQ ID NO: 35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67或84所不的核苷酸序列的全部或部分；或(b) (a)的全长互补序列:其中(a)或(b)具有足以抑制内源性活性在转基因植物中的表达的长度，并且进一步地其中所述种子与从非转基因的植物获得的种子相比，基于干重计具有至少4%的油含量的提闻。
在第五实施例中，本发明涉及转基因种子，所述转基因种子包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含:(a) SEQ ID NO: 35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、
63、65、67或84所示的核苷酸序列的全部或部分；或(b)(a)的全长互补序列:其中(a)或
(b)具有足以抑制内源性PAE或PAE样蛋白质活性在转基因植物中的表达的长度，并且进一步地其中所述种子与从非转基因的植物获得的种子相比，基于干重计具有至少4%的油含量的提闻。在第六实施例中，本发明涉及用于产生转基因种子的方法，所述方法包括:Ca)用重组DNA构建体转化植物细胞，所述重组DNA构建体包含可操作地连接到至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽基于Clustal V比对方法在与SEQ IDNO:35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67 或 84 进行比较时具有至少70%序列同一性的氨基酸序列；和(b)由(a)的转化的植物细胞再生转基因植物；以及(c)选择产生转基因种子的转基因植物，所述转基因种子与从非转基因的植物获得的转基因种子相比具有改变的油、蛋白质、淀粉和/或可溶性碳水化合物含量。在第七实施例中，本发明涉及用于产生转基因种子的方法，所述方法包括:(a)用重组DNA构建体转化植物细胞，所述重组DNA构建体包含:(i)如SEQ ID N0:35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67或84所示的核苷酸序列的全部或部分；或
(ii)⑴的全长互补序列；其中⑴或(ii)具有足以抑制内源性PAE或PAE样蛋白质活性在转基因植物中的表达的长度；(b)由(a)的转化的植物细胞再生转基因植物；以及(c)选择产生转基因种子的转基因植物，所述转基因种子与从非转基因的植物获得的转基因种子相比具有改变的油、蛋白质、淀粉和/或可溶性碳水化合物含量。在第八实施例中，本发明涉及用于产生转基因种子的方法，所述方法包括:(a)用重组DNA构建体转化植物细胞，所述重组DNA构建体包含:(i)如SEQ ID N0:35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67或84所示的核苷酸序列的全部或部分；或
(ii)⑴的全长互补序列；其中⑴或(ii)具有足以抑制内源性PAE或PAE样蛋白质活性在转基因植物中的表达的长度；(b)由(a)的转化的植物细胞再生转基因植物；以及(c)选择产生转基因种子的转基因植物，所述转基因种子与从非转基因的植物获得的转基因种子相比，基于干重计具有至少4%的油含量的提高。在第九实施例中，本发明涉及转基因种子，所述转基因种子包含:重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含:(a)可操作地连接到至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽基于Clustal V比对方法在与SEQ IDN0:36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68 或 85 进行比较时具有至少70%序列同一性的氨基酸序列；或(b)包含至少一种调控元件的抑制DNA构建体，所述调控元件可操作地连接到:(i)以下序列的全部或部分:(A)编码多肽的核酸序列，所述多肽基于 Clustal V 比对方法在与 SEQ ID NO:36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、
64、66、68或85进行比较时具有至少70%序列同一性的氨基酸序列，或(B)(b) (i) (A)的核酸序列的全长互补序列来源于受关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域，所述区域基于Clu stal V比对方法在与所述区域所源自的有义链或反义链的所述全部或部分进行比较时具有至少70%序列同一性的核酸序列，并且其中所述受关注的靶基因编码PAE样蛋白质，并且其中所述植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时具有改变的、提高的或降低的油、蛋白质、淀粉和/或可溶性碳水化合物含量。在第十实施例中，本发明包括分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含:(a)编码改变即提高或降低油、蛋白质、淀粉和/或可溶性碳水化合物含量所需的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽在与SEQ ID N0:36或48进行比较时具有至少95%序列同一性的氨基酸序列，或(b)所述核苷酸序列的全长互补序列，其中所述全长互补序列和所述核苷酸序列由相同数目的核苷酸组成并且 是100%互补的。所述多肽可包含SEQ ID N0:36或48的氨基酸序列。所述核苷酸序列可包含SEQ ID NO:35或47的核苷酸序列。在另一个实施例中，本发明涉及包含本发明任何分离的多核苷酸的重组DNA构建体，所述分离的多核苷酸可操作地连接到至少一种调控序列，并且本发明涉及包含所述重组DNA构建体的细胞、植物和种子。所述细胞可为真核细胞，例如酵母、昆虫或植物细胞，或者为原核细胞，例如细菌细胞。从单子叶植物和双子叶植物(例如，分别如玉米和大豆)获得的包含本发明的重组构建体的种子在本发明的范围之内。驱动表达本发明核酸序列的种子特异性或种子优选的启动子也被包括在内。驱动表达本发明核酸序列的胚或胚乳特异性的启动子也被包括在内。此外，本发明的方法对于从单子叶植物(例如玉米和稻)和双子叶植物(例如大豆和卡诺拉)获得转基因种子是有用的。也在本发明范围之内的是从转基因种子获得的产物和/或副产物，所述转基因种子从单子叶植物或双子叶植物(分别例如玉米和大豆)获得。在另一个实施例中，本发明涉及用于在植物中抑制编码具有PAE样蛋白质活性的多肽的基因的表达水平的方法，其中所述方法包括用本发明的任何核酸片段转化单子叶植物或双子叶植物。
和序列表根据以下的形成本专利申请的一部分的具体实施方式
和附图以及序列表，可更全面地理解本发明。图1A-1D显示了由来源于以下的核苷酸序列编码的PAE和PAE样蛋白质的氨基酸序列的比对:完菁(Brassica rapa) (SEQ ID NO: 36);向日葵(Helianthus annuus)(SEQ ID NO:38);蓖麻(Ricinus communis) (SEQ ID NO:40);大豆(Glycine max) (SEQ IDN0:42、44、46 和 48);玉米(Zea mays) (SEQ ID N0:50、52 和 54);水稻(Oryzasativa) (SEQID N0:56、58 和 60);高粱(Sorghumbicolor) (SEQ ID N0:62、64 和 66);小麦(Triticumaestivum) (SEQ ID NO:68);拟南芥(Arabidopsisthaliana) (SEQ ID N0:85,At2g46930)；SEQ ID勵:86，对应于来自美国专利申请”20100083407的5￡0 ID NO:53381 (大豆)；和SEQ ID N0:87，对应于美国专利申请US20090094717的SEQ ID NO: 13822 (拟南芥)。就比对而言，将在全部序列之间在给定位置处保守的氨基酸划框表示。该程序用短划线来使序列间最大程度的对齐。图2显示了图1A-1D中显示的每对氨基酸序列的百分比序列同一性的图表。序列描述以及所附序列表遵循如37C.F.R.§1.821-1.825所示的关于专利申请中核苷酸和/或氨基酸序列公开的规定。
SEQIDNO:1对应于载体PHSbarENDS2的核苷酸序列。SEQIDN0:2对应于多接头的核苷酸序列。SEQIDN0:3对应于载体pKR85的核苷酸序列。SEQIDN0:4对应于载体pKR278的核苷酸序列。SEQIDN0:5对应于载体pKR407的核苷酸序列。SEQIDN0:6对应于载体pKR1468的核苷酸序列。SEQIDN0:7对应于载体pKR1475的核苷酸序列。SEQIDN0:8对应于载体pKR92的核苷酸序列。SEQIDN0:9对应于载体pKR1478的核苷酸序列。SEQIDNO: 10 对应于 SAIFF 和 lo22730 的基因组 DNA。SEQIDNO: 11 对应于正向引物 PAE ORF FffD0SEQIDNO: 12 对应于反向引物 PAE ORF REV。SEQIDNO: 13对应于包含PAE的载体pENTR的核苷酸序列。SEQID勵:14对应于载体口10 1478^^￡的核苷酸序列。SEQID勵:15对应于？10 1481的核苷酸序列。SEQIDNO: 16 对应于 AthLcc In 正向引物。SEQIDNO: 17 对应于 AthLcc In 反向引物。SEQIDNO: 18对应于含有漆酶内含子的PCR (聚合酶链反应)产物。SEQIDNO: 19对应于PSM1318的核苷酸序列。SEQIDN0:20 对应于 pMBL18AITR12INT 的核苷酸序列。SEQIDNO:21对应于PSM1789的核苷酸序列。SEQIDN0:22 对应于 pMBL18AITR12INT ATTR21 的核苷酸序列。SEQIDNO:23 对应于 SuSy-5’ 引物。SEQIDNO: 24 对应于 SuSy-3’ 引物。SEQIDN0:25对应于pLF122的核苷酸序列。SEQIDN0:26对应于pKR1142的核苷酸序列。SEQIDN0:27对应于pKR1155的核苷酸序列。SEQIDN0:28对应于KS294的核苷酸序列。SEQIDN0:29对应于pKR627的核苷酸序列。SEQIDN0:30对应于pKR132的核苷酸序列。SEQIDNO:31对应于pKR278的核苷酸序列。SEQIDN0:32对应于pKR1157的核苷酸序列。SEQIDN0:33对应于pKR1479的核苷酸序列。SEQIDN0:34 对应于 pKR1481-PAE 的核苷酸序列。 表I列出了本文所述的多肽、包含编码这些多肽全部或其主要部分的核酸片段的克隆的命名、以及在所附序列表中使用的对应标识符(SEQ ID NO:)。表I还标示了作为单独的EST (“EST”)的cDNA克隆、包含标明的cDNA克隆的整个cDNA插入物的序列(“FIS”)、由两个或更多个EST组装而成的重叠群(“Contig”)、由FIS和一个或多个EST组装而成的重叠群(“Contig*”)或编码源自FIS、重叠群、EST和PCR或FIS和PCR的完整或功能性蛋白质的序列(“ CGS ”)。表IPAE样蛋白质
权利要求
1.包含重组DNA构建体的转基因植物，所述重组DNA构建体包含可操作地连接到至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽基于Clustal V比对方法在与 SEQ ID NO:36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68 或 85 进行比较时具有至少70%序列同一性的氨基酸序列，并且其中从所述转基因植物获得的种子在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时具有改变的即提高的或降低的油、蛋白质、淀粉和/或可溶性碳水化合物含量。
2.从权利要求1所述的转基因植物获得的转基因种子，所述转基因种子包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含可操作地连接到至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO:36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68或85进行比较时具有至少70%序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述转基因种子在与来自不包含所述重组DNA构建体的对照植物的种子进行比较时具有改变的油、蛋白质、淀粉和/或可溶性碳水化合物含量。
3.转基因种子，包含: 重组DNA构建体，其包含: (a)可操作地连接到至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽基于 Clustal V 比对方法在与 SEQ ID NO:36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68或85进行比较时具有至少70%序列同一性的氨基酸序列，或 (b)抑制DNA构建体，所述构建体包含至少一种调控元件，所述调控元件可操作地连接到: (i)以下序列的全部或部分:(A)编码多肽的核酸序列，所述多肽基于ClustalV比对方法在与 SEQ ID N0:36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68 或 85 进行比较时具有至少70%序列同一性的氨基酸序列，或(B) (b) (i) (A)的核酸序列的全长互补序列；或 (ii)来源于受关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域，所述区域基于Clustal V比对方法在与所述区域所源自的有义链或反义链的所述全部或部分进行比较时具有至少70%序列同一性的核酸序列，并且其中所述受关注的靶基因编码PAE或PAE样蛋白质， 并且其中所述植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时具有改变的、提高的或降低的油、蛋白质、淀粉和/或可溶性碳水化合物含量。
4.根据权利要求1所述的转基因种子，其中所述油含量在与非转基因的植物的油含量进行比较时提高了至少4%。
5.包含重组DNA构建体的转基因种子，包含:(a)如 SEQ ID NO:35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67 或84 所示的核苷酸序列的全部或部分； 或(b) (a)的全长互补序列: 其中(a)或(b)具有足以抑制内 源性PAE或PAE样蛋白质活性在转基因植物中的表达的长度，并且进一步地其中所述种子与从非转基因的植物获得的种子相比，基于干重计具有至少4%的油含量的提高。
6.产生转基因植物的方法，所述方法包括:(a)用重组DNA构建体转化植物细胞，所述重组DNA构建体包含可操作地连接到至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽基于Clustal V比对方法在与 SEQ ID NO:36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68 或 85 进行比较时具有至少70%序列同一性的氨基酸序列；以及由所述转化的植物细胞再生植物。
7.产生转基因种子的方法，所述方法包括: (a)用重组DNA构建体转化植物细胞，所述 重组DNA构建体包含可操作地连接到至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽基于Clustal V比对方法在与 SEQ ID NO:36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68 或 85 进行比较时具有至少70%序列同一性的氨基酸序列；以及 (b)由(a)的转化的植物细胞再生转基因植物；以及 (c)选择产生转基因种子的转基因植物，所述转基因种子与从非转基因的植物获得的转基因种子相比具有改变的油、蛋白质、淀粉和/或可溶性碳水化合物含量。
8.产生转基因种子的方法，所述方法包括: (a)用重组DNA构建体转化植物细胞，所述重组DNA构建体包含可操作地连接到至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽基于Clustal V比对方法在与 SEQ ID NO:36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68 或 85 进行比较时具有至少70%序列同一性的氨基酸序列；以及 (b)由(a)的转化的植物细胞再生转基因植物；以及 (c)选择产生转基因种子的转基因植物，所述转基因种子与从非转基因的植物获得的转基因种子相比具有至少0.5%的提高的淀粉含量。
9.产生转基因种子的方法，所述方法包括: (a)用重组DNA构建体转化植物细胞，所述重组DNA构建体包含:(i)如SEQ ID NO:35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67 或84 所示的核苷酸序列的全部或部分；或 (ii)(i)的全长互补序列； 其中(i)或(ii)具有足以抑制内源性PAE或PAE样蛋白质活性在转基因植物中的表达的长度； (b)由(a)的转化的植物细胞再生转基因植物；以及 (c)选择产生转基因种子的转基因植物，所述转基因种子与从非转基因的植物获得的转基因种子相比具有改变的油、蛋白质、淀粉和/或可溶性碳水化合物含量。
10.产生转基因种子的方法，所述方法包括: (a)用重组DNA构建体转化植物细胞，所述重组DNA构建体包含:(i)如SEQ ID NO:35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67 或84 所示的核苷酸序列的全部或部分；或 (ii)(i)的全长互补序列； 其中(i)或(ii)具有足以抑制内源性PAE或PAE样蛋白质活性 在转基因植物中的表达的长度； (b)由(a)的转化的植物细胞再生转基因植物；以及 (c)选择产生转基因种子的转基因植物，所述转基因种子与从非转基因的植物获得的转基因种子相比，基于干重计具有至少4%的油含量的提高。
11.根据权利要求1、2、3、4或5中任一项所述的转基因种子，其中所述转基因种子从单子叶植物或双子叶植物获得。
12.根据权利要求1、2、3、4或5中任一项所述的转基因种子，其中所述转基因种子从玉米植物或大豆植物获得。
13.根据权利要求1、2、3、4或5中任一项所述的转基因种子，其中所述至少一种调控元件是种子特异性或种子优选的启动子。
14.根据权利要求1、2、3、4或5中任一项所述的转基因种子，其中所述至少一种调控元件是胚乳或胚特异性启动子。
15.根据权利要求6、7、8、9或10中任一项所述的方法，其中所述转基因种子从转基因双子叶植物获得，所述转基因双子叶植物在其基因组中包含所述重组构建体。
16.根据权利要求6、7、8、9或10中任一项所述的方法，其中所述双子叶植物是大豆。
17.通过权利要求6、7、8、9或10中任一项所述的方法获得的转基因种子。
18.从权利要求6、7、8、9或10中任一项所述的转基因种子获得的产物和/或副产物。
19.通过权利要求6、7、8、9、10或11中任一项所述的方法获得的转基因种子，其中所述转基因种子从单子叶植物或双子叶植物获得。
20.来自权利要求2所 述的转基因种子的产物和/或副产物，其中所述植物是玉米或大豆。
21.来自权利要求3所述的转基因种子的产物和/或副产物，其中所述植物是玉米或大豆。
22.来自权利要求4所述的转基因种子的产物和/或副产物，其中所述植物是玉米或大豆。
23.来自权利要求5所述的转基因种子的产物和/或副产物，其中所述植物是玉米或大豆。
24.分离的多核苷酸，包括: (a)编码在植物中改变，即提高或降低油、蛋白质、淀粉和/或可溶性碳水化合物含量所必需的多肽的核苷酸序列，其中基于Clustal V比对方法，使用逐对比对默认参数KTUPLE=1、GAPPENALTY=3、WINDOW=5 和 DIAGONALS SAVED=5，，在与 SEQ ID NO: 36 或 48 进行比较时，所述多肽具有至少95%序列同一性的氨基酸序列；或 (b)(a)的核苷酸序列的全长互补序列。
25.根据权利要求24所述的多核苷酸，其中所述多肽的氨基酸序列包含SEQID NO: 36或48。
26.根据权利要求24所述的多核苷酸，其中所述核苷酸序列包含SEQID NO: 35或47。
27.包含重组DNA构建体的植物或种子，其中所述重组DNA构建体包含可操作地连接到至少一种调控序列的权利要求24至26中任一项所述的多核苷酸。
全文摘要
本发明涉及植物分子生物学领域。更具体地，本发明涉及在植物和种子中编码PAE或PAE样蛋白质的分离的核酸片段以及此类片段用于调节编码PAE或PAE样蛋白质活性的基因在转化的宿主细胞中的表达的用途。
文档编号C12N15/55GK103080320SQ201180042448
公开日2013年5月1日 申请日期2011年6月29日 优先权日2010年7月1日
发明者K·迈尔, B·麦戈尼格尔, K·L·斯特卡 申请人:纳幕尔杜邦公司
最新回复(0)