含有其pKa值有利于RNA递送的脂质的脂质体的制作方法
专利名称：含有其pKa值有利于RNA递送的脂质的脂质体的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于免疫的RNA非病毒递送领域。
背景技术：
用于免疫动物的核酸递送已成为数年来的目标。人们已经测试了许多方法，包括使用DNA或RNA，使用病毒或非病毒递送载剂(或者甚至无递送载剂，以“裸”疫苗形式)，使用复制型或非复制型载体，或者使用病毒或非病毒载体。核酸疫苗仍需改进和改良。
发明内容
如本发明所述，以脂质体递送编码免疫原的RNA用来免疫。所述脂质体包含pKa在5.0 7.6范围内的脂质。pKa在该范围内的脂质理想上具有叔胺；此类脂质和具有季胺基团的脂质(如DOTAP或DC-Chol)性质不同。在生理pH下，pKa在5.0 7.6范围内的胺具有中性或减少的表面电荷，而脂质如DOTAP则是强阳离子脂质。本发明人发现，由季胺脂质(如D0TAP)形成的脂质体不如由叔胺脂质(如DLinDMA)形成的脂质体适合递送编码免疫原的RNA。因此，本发明提供具有包封水性核心的脂质双分子层的脂质体，其中:(i)所述脂质双分子层包含PKa在5.0 7.6范围内的脂质，优选所述脂质具有叔胺；以及(ii)所述水性核心包括编码免疫原的RNA。这些脂质体适用于体内递送RNA至脊椎动物细胞，从而它们可用作药物组合物中的成分用来免疫对象抵抗各种疾病。本发明也提供了一种制备包含RNA的脂质体的方法，所述方法包括以下步骤:(a)在低于脂质的PKa但高于4.5的pH下，混合RNA和所述脂质以形成包封所述RNA的脂质体；以及(b)提高所得包含脂质体的混合物的pH，使其高于所述脂质的pKa。脂质体本发明应用其中包封有编码免疫原的RNA的脂质体。因而，使RNA (如天然病毒内一样)由脂质体的脂质双分子层与任何外部介质分隔，而且发现以该途径进行包封可保护RNA不被RNA酶消化。所述脂质体可包括一些处在外部RNA(如在脂质体的表面上)，但是至少一半的RNA(理想上为全部)被包封在所述脂质体的核心中。脂质体内的包封不同于例如参考文献I中公开的脂质/RNA复合物。在水性环境中，各种两亲性脂质能形成双分子层以包封含RNA的水性核心，形成脂质体。这些脂质可具有阴离子、阳离子或两性离子亲水性头部基团。本发明的脂质体包含pKa在5.0 7.6范围内的脂质，并优选pKa在该范围内的脂质具有叔胺。例如，其可包含1，2~ 二亚油基氧基_N, N- 二甲基_3-氣基丙烧(DLinDMA ；pKa5.8)和/或1，2- 二亚麻基氧基_N, N-二甲基-3-氨基丙烧(DLenDMA)。另一种合适的具有叔胺的脂质是1，2-二油烯基氧基-N，N 二甲基-3-氨基丙烷(DODMA)。参见图3和参考文献2。也可使用参考文献3中的某些氨基酸脂质，也可使用参考文献4的某些氨基脂质。参考文献5公开了在其头部基团内具有叔胺的其它可用脂质，其完整内容通过引用纳入本文中。本发明的脂质体可由单一脂质或脂质混合物形成，条件是所述脂质中的至少一种的pKa在5.0 7.6范围内(并且优选具有叔胺)。在该pKa范围内，优选脂质的pKa是5.5 6.7，例如在5.6和6.8之间，在5.6和6.3之间，在5.6和6.0之间，在5.5和6.2之间，或在5.7和5.9之间。所述pKa是50%的脂质带电时的pH，位于脂质完全带电的点和脂质完全不带电的点的中间。可以用各种方法测量所述pKa，但优选使用下述在标题为“pKa测量”部分中公开的方法测量。通常应测量单一脂质的pKa，而不是测量还包括其它脂质的混合物中的脂质的PKa (例如，不像参考文献6中实施的那样，该方法评判SNALP的pKa而不是单一脂质的pKa)。当本发明的脂质体由脂质混合物形成时，优选pKa在所需范围内的那些脂质的比例是脂质总量的20 80%,例如，在30 70%之间，或在40 60%之间。举例来说，在如下所示的可用脂质体中，总 脂质的40%或60%是pKa在所需范围内的脂质。剩余部分可由例如胆固醇(例如35 50%胆固醇)和/或DMG (可选PEG化修饰的DMG)和/或DSPC构成。此类混合物用于下文。这些％值是摩尔百分比。脂质体可包含两亲性脂质，其亲水部分是被PEG化修饰的(即，通过与聚乙二醇共价连接来修饰的)。该修饰可增加所述脂质体的稳定性并防止所述脂质体的非特异性吸附。举例来说，使用诸如参考文献6和7公开的那些技术来使脂质结合PEG。PEG为脂质体提供外层，所述外层可赋予有利的药物代谢动力学特性。RNA (特别是自复制RNA)的有效包封、pKa在5.0 7.6范围内的阳离子脂质、以及PEG化修饰的表面，这三者的结合可实现对于多种细胞类型的有效递送(包括免疫细胞和非免疫细胞)，从而与使用未PEG化修饰的季胺相比，引起更强且更好的免疫应答。可使用不同长度的PEG，例如，在0.5 SkDa之间。用于本发明的脂质可以是饱和的或不饱和的脂质。优选使用至少一种不饱和脂质来制备脂质体。图3显不二种可用的不饱和脂质。若不饱和脂质有两条尾，则两条尾都可以是不饱和尾，或者可以有一条饱和尾和一条不饱和尾。实例中使用DSPC、DLinDMA, PEG-DMG和胆固醇的混合物。本发明的一个独立方面是含DSPC、DLinDMA、PEG-DMG和胆固醇的脂质体。该脂质体优选包封RNA，如自复制RNA，例如编码免疫原的自复制RNA。脂质体颗粒通常分为3组:多层囊泡(MLV);小单层囊泡(SUV);和大单层囊泡(LUV)。MLV的各囊泡中具有多个双分子层，形成若干分离的水性隔室。SUV和LUV具有包封水性核心的单一双分子层；通常SUV的直径彡50nm，LUV的直径>50nm。本发明的脂质体颗粒理想上是直径在50 220nm范围内的LUV。对于包含不同直径LUV的群体的组合物:(i)在数量上至少80%应具有20 220nm范围内的直径，(ii)所述群体的平均直径(Zav，由强度表示)理想上在40 200nm范围内，和/或(iii)所述直径的多分散性指数应〈0.2。希望参考文献I的脂质体/RNA复合物的直径在600 800nm范围内，且具有高多分散性。所述脂质体大体上可以是球形的。用于制备合适的脂质体的技术是本领域所熟知的，例如参见参考文献8 10。参考文献11描述了一种可用的方法，该方法涉及混合α)脂质的乙醇溶液(ii)核酸的水性溶液和(iii)缓冲液，然后进行混合、平衡、稀释和纯化。优选本发明的脂质体可通过该混合工艺获得。混合工艺如上所述，本发明提供用于制备包含RNA的脂质体的工艺，所述工艺包括以下步骤:(a)在低于脂质的pKa但高于4.5的pH下混合RNA和所述脂质；然后(b)提高pH，使其闻于所述脂质的pKa。因此，阳离子脂质在步骤(a)的脂质体形成过程中带正电，但之后的pH变化意味着所述正电基团的大多数(或全部)变为中性。该工艺有利于制备本发明的脂质体，并且通过在步骤(a)过程中避免pH低于4.5，提高了被包封RNA的稳定性。步骤(a)中的pH高于4.5，理想上高于4.8。采用在5.0 6.0范围内，或在5.0 5.5范围内的pH，能够提供合适的脂质体。在步骤(b)中提高pH，使其高于所述脂质的pKa。理想上提高所述pH至低于9，优选低于8。取决于所述脂质的pKa，步骤(b)中的所述pH由此可提高到6 8的范围内，例如提高至pH6.5±0.3。可通过将脂质体转移到合适的缓冲液来实现步骤(b)的pH提高，例如，转移到磷酸盐缓冲盐水中。理想上在脂质体形成发生后实行步骤(b)的pH提高。步骤(a)中所用的RNA可在水性溶液中，用于与脂质的有机溶液混合(例如，乙醇溶液，如参考文献11所述)。然后可稀释所述混合物来形成脂质体，这之后可在步骤(b)中提闻pH。RNA本发明可用 于体内递送编码免疫原的RNA。所述RNA由位于递送部位的非免疫细胞翻译，引起所述免疫原的表达，并且还会引起免疫细胞分泌产生局部佐剂效应的促炎细胞因子和/或I型干扰素。非免疫细胞响应所述RNA时也能分泌I型干扰素和/或促炎细胞因子。所述RNA是正链RNA，因此可被非免疫细胞翻译，而不需要介入任何复制步骤(例如反转录)。所述RNA还能结合由免疫细胞表达的TLR7受体，从而引发佐剂效应。优选正链RNA是自复制RNA。自复制RNA分子(复制子)在被递送到脊椎动物细胞(甚至无任何蛋白质)时，能通过从其自身转录(通过从其自身产生自身的反义拷贝)引起多条子代RNA的产生。因此，自复制RNA分子通常是正链分子，其可在递送到细胞后被直接翻译，而该翻译提供RNA依赖性RNA聚合酶，之后，该RNA聚合酶从所述递送的RNA生成反义和正义转录产物。因此，递送的RNA引起多条子代RNA的产生。这些子代RNA和亚基因组共线性转录产物都能翻译其自身来提供所编码免疫原的原位表达，或者可经转录来提供与递送的RNA同义的其它转录产物，该同义转录产物经过翻译来提供所述免疫原的原位表达。该顺序转录的总体结果是所引入的复制子RNA在数量上的巨大扩增，并且其编码的免疫原成为所述细胞的主要多肽产物。如下所示，RNA不需具有自复制活性来提供佐剂效应，即便这样可以增强转染后的细胞因子分泌。所述自复制活性特别有利于非免疫细胞实现所述免疫原的高水平表达。而它也会促进所述非免疫细胞的凋亡。实现自复制的一种合适的系统是使用基于α病毒的RNA复制子。这些正链复制子在递送到细胞后经翻译以产生复制酶(或复制酶-转录酶)。所述复制酶作为多蛋白被翻译，其自切割以提供复制复合物，所述复制复合物产生所述递送的正链RNA的基因组负链拷贝。这些负链转录产物可以转录其自身来进一步产生所述正链亲本RNA的拷贝，而且还产生编码所述免疫原的亚基因组转录产物。因此，所述亚基因组转录产物的翻译使得所述受感染细胞原位表达所述免疫原。合适的α病毒复制子可以使用来自以下病毒的复制酶:辛德毕斯病毒(sindbis virus)、塞姆利基森林病毒(semliki forest virus)、东部马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒等。可使用突变或野生型病毒序列，例如，在复制子中已使用VEEV的减毒TC83突变体[12]。因此，优选的自复制RNA分子编码⑴可从所述自复制RNA分子转录RNA的RNA依赖性RNA聚合酶和(ii)免疫原。所述聚合酶可以是α病毒复制酶，例如包含一种或多种α病毒蛋白nsPl、nsP2、nsP3和nsP4的α病毒复制酶。尽管除了所述非结构复制酶多蛋白，天然α病毒基因组还编码结构病毒体蛋白，但优选本发明的自复制RNA分子不编码α病毒结构蛋白。因此，优选自复制RNA可在细胞中导致产生其本身的基因组RNA拷贝，但不会导致产生含有RNA的病毒体。无法产生这些病毒体是指不像野生型α病毒，所述自复制RNA分子自身不能以感染形式永存。本发明的自复制RNA缺失野生型病毒永存所必需的α病毒结构蛋白，并且由编码所需免疫原的基因代替了它们的位置，因此，所述亚基因组转录产物编码所述免疫原，而不是编码所述α病毒病毒体结构蛋白。因此，本发明所用的自复制RNA分子可具有两个开放阅读框。第一个(5’)开放阅读框编码复制酶；第二个(3’)开放阅读框编码免疫原。在一些实施方式中，所述RNA可具有额外的(例如下游)开放阅读框，比如用来编码其它免疫原(参见下文)或者编码辅助多肽。
自复制RNA分子可具有与所述编码的复制酶相容的5’序列。自复制RNA分子可具有不同长度，但其长度通常是5000 25000个核苷酸，例如8000 15000个核苷酸，或者9000 12000个核苷酸。因此，所述RNA比siRNA递送中所见的长。本发明所用的RNA可具有5’帽子(例如，7-甲基鸟苷)。该帽子结构能增强RNA的体内翻译。本发明所用的RNA分子的5’核苷酸可具有5’三磷酸基团。在有帽RNA中，其可通过5’-5’桥与7-甲基鸟苷连接。5’三磷酸能增强RIG-1的结合，从而增强佐剂效应。RNA分子可具有3’多聚腺苷尾。该RNA分子还可在靠近其3’端处包含多腺苷聚合酶识别序列(例如AAUAAA)。本发明所用的RNA分子通常是单链的。单链RNA通常能通过与TLR7、TLR8、RNA解旋酶和/或PKR结合而引发佐剂效应。以双链形式递送的RNA(dsRNA)能结合TLR3，而且该受体还能被dsRNA触发，该dsRNA在单链RNA复制过程中或在单链RNA的二级结构中形成。本发明所用的RNA分子能通过体外转录(IVT)方便地制备。IVT可使用(cDNA)模板生成，并在细菌内以质粒形式增殖，或通过合成生成(例如通过基因合成和/或聚合酶链式反应(PCR)工程化方法)。例如，DNA依赖性RNA聚合酶(例如噬菌体T7、T3或SP6RNA聚合酶)可用于从DNA模板转录RNA。可按需求使用合适的加帽和加多聚腺苷反应(尽管复制子的多聚腺苷通常在DNA模板内编码)。这些RNA聚合酶对转录的5’核苷酸有着严格的要求，在某些实施方式中，这些要求须与所编码复制子的要求相符，以确保IVT转录的RNA作为其自编码复制酶的底物能有效地发挥功能。 如参考文献13中讨论的，自复制RNA可包括(除任何5’帽子结构之外)一个或多个具有修饰核碱基的核苷酸。因此，所述RNA可包括m5C(5-甲基胞苷)、m5U(5_甲基尿苷)、m6A(N6-甲基腺苷)、s2U(2-硫代尿苷)、Um(2’-0-甲基尿苷)、mlA(l_甲基腺苷)、m2A(2-甲基腺苷)、Am(2’-O-甲基腺苷)、ms2m6A(2-甲硫基-N6-甲基腺苷)、i6A(N6-异戊烯基腺苷)、ms2i6A(2-甲硫基-N6异戊烯基腺苷)、io6A (N6-(顺羟异戊烯基)腺苷)、ms2io6A(2-甲硫基_N6_(顺羟异戊烯基)腺苷)、g6A(N6-甘氨酰基氨甲酰基腺苷)、t6A (N6-苏氨酰基氨甲酰基腺苷)、ms2t6A (2-甲硫基-N6-苏氨酰基氨甲酰基腺苷)、m6t6A (N6-甲基-N6-苏氨酰基氨甲酰基腺苷)、hn6A (N6-羟基正缬氨酰基氨甲酰基腺苷)、ms2hn6A(2-甲硫基-N6-羟基正缬氨酰基氨甲酰基腺苷、Ar (p) (2’ -O-核糖基腺苷(磷酸))、I (次黄嘌呤核苷)、mil (1-甲基次黄嘌呤核苷)、m’ Im(l, 2’ _0_ 二甲基次黄嘌呤核苷)、m3C(3-甲基胞苷)、Cm(2T-0-甲基胞苷)、s2C(2_硫代胞苷)、ac4C(N4_乙酰基胞苷)、f5C(5_ 甲酸基胞苷，5-fonnylcytidine)、m5Cm(5, 2-0- 二甲基胞苷)、ac4Cm(N4 乙酰基2T0甲基胞苷)、k2C(赖胞苷)、mlGd-甲基鸟苷)、m2G(N2-甲基鸟苷)、m7G(7-甲基鸟苷)、Gm(2’-0-甲基鸟苷)、m22G(N2，N2-二甲基鸟苷)、m2Gm(N2, 2’-O-二甲基鸟苷)、m22Gm(N2, N2, 2’ -O-三甲基鸟苷)、Gr (p) (2’ -O-核糖基鸟苷(磷酸))、yW(怀丁苷)、o2yff(过氧化怀丁苷)、OHyW(羟基怀丁苷)、OHyW*(欠修饰的羟基怀丁苷)、imG(丫苷)、mimG(甲基鸟苷)、Q (queuosine,辫苷)、oQ (环氧辫苷)、galQ(半乳糖-辫苷)、manQ (甘露糖-辫苷)>preQo (7-氰基-7-去氮鸟苷)、preQi (7-氨甲基-7-去氮鸟苷)、G (古嘌苷)、D (二氢尿苷)、m5Um(5，2’ _0_ 二甲基尿苷)、s4U(4_硫代尿苷)、m5s2U(5-甲基_2_硫代尿苷)、s2Um (2-硫代-2 ’ -O-甲基尿苷)、acp3U (3- (3-氨基_3_羧丙基)尿苷)、ho5U (5-羟基尿苷)、mo5U (5-甲氧基尿苷)、cmo5U (尿苷5-轻乙酸)、mcmo5U (尿苷5-轻乙酸甲基酯)、chm5U (5-(羧轻甲基)尿苷))、mchm5U (5-(羧轻甲基)尿苷甲基酯)、mcm5U (5-甲氧羰基甲基尿苷)、mcm5Um (S-甲氧基羰甲基-2-0-甲基尿苷)、mcm5s2U (5-甲氧基羰甲基_2_硫代尿苷)、nm5s2U (5-氨甲基-2-硫代尿苷)、mnm5U (5-甲基氨甲基尿苷)、mnm5s2U (5-甲基氨甲基-2-硫代尿苷)、mnm5se2U (5-甲基氨甲基_2_硒尿苷)、ncm5U (5-氨基甲酰甲基尿苷)、ncm5Um(5-氨基甲酰甲基_2’ -O-甲基尿苷)、cmnm5U(5-羧甲基氨甲基尿苷)、cnmm5Um(5-羧甲基氨甲基-2-L-0甲基尿苷)、cmnm5s2U(5-羧甲基氨甲基_2_硫代尿苷)、m62A(N6，N6-二甲基腺苷)、Tm(2’-0-甲基次黄嘌呤核苷)、m4C(N4-甲基胞苷)、m4Cm (N4, 2-0- 二甲基胞苷)、hm5C (5-羟甲基胞苷)、m3U (3-甲基尿苷)、cm5U (5-羧甲基尿苷)、m6Am(N6, T-O- 二甲基腺苷)、rn62Am(N6, N6, 0_2_ 三甲基腺苷)、m2，7G (N2, 7- 二甲基鸟苷)、m2’ 2’ 7G(N2, N2, 7-三甲基鸟苷)、m3Um(3，2T-0- 二甲基尿苷),m5D(5-甲基二氢尿苷)、f5Cm(5-甲酰基-2’ -O-甲基胞苷)、mlGm(l, 2’ -O-二甲基鸟苷)、m’Am(l, 2_0_ 二甲基腺苷)益立诺甲基尿苷(irinomethyluridine))、tm5s2U(S-氨基乙磺酰基甲基-2-硫代尿苷))、imG-14(4-去甲基鸟苷)、imG2(异鸟苷)、或ac6A(N6-乙酰基腺苷)、次黄嘌呤、次黄嘌呤核苷、8-氧代-腺嘌呤，及其7-取代衍生物、二氢尿嘧啶、假尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-氨基尿嘧啶、5- (C1-C6)-烷基尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5- (C2-C6)-烯基尿嘧啶、5- (C2-C6)-炔基尿嘧啶、5-(羟甲基)尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羟基胞嘧啶、5- (C1-C6)-烷基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5- (C2-C6)-烯基胞嘧啶、5- (C2-C6)-炔基胞嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-溴胞嘧啶、N2- 二甲基鸟嘌呤、7-去氮鸟嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤、7-去氮-7-取代鸟嘌呤、7-去氮-7-(C2-C6)炔基鸟嘌呤、7-去氮-8-取代鸟嘌呤、8-羟基鸟嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、8-氧代鸟嘌呤、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、2，4-二氨基嘌呤、2，6- 二氨基嘌呤、8-氮杂嘌呤、取代的7-去氮嘌呤、7-去氮-7-取代嘌呤、7-去氮-8-取代嘌呤、或者脱碱基核苷酸。例如，自复制RNA可包含一个或多个修饰的嘧啶核碱基，比如假尿苷和/或5-甲基胞嘧啶残基。然而，在一些实施方式中，RNA不包含修饰的核碱基，并且可以不包含修饰的核苷酸，即，RNA中的所有核苷酸都是标准的A、C、G和U核糖核苷酸(除可含有7'甲基鸟苷的任何5’帽子结构外)。在其它实施方式中，RNA可包含含有7’ -甲基鸟苷的5’帽子，且最前的1、2或3个5’端核糖核苷酸可在核糖的2’位点被甲基化。本发明所用的RNA理想上在核苷之间仅包含磷酸二酯键，但在某些实施方式中，其可包含氨基磷酸酯键、硫代磷酸酯键和/或甲基磷酸酯键。理想上，脂质体包含少于10个不同的RNA种类，例如5、4、3或2个不同种类；最优选脂质体包含单个RNA·种类，即，脂质体中的所有RNA分子具有相同的序列和相同的长度。每个脂质体的RNA含量可以不同。每个脂质体的自复制RNA分子个体的数量通常(50个，例如每个脂质体〈20个、〈10个、〈5个或者I 4个。免疫原本发明所用的RNA分子编码多肽免疫原。在脂质体给药后，所述RNA在体内翻译，所述免疫原可在受者内引起免疫应答。所述免疫原可引起免疫应答来对抗细菌、病毒、真菌或寄生虫(或者，在一些实施方式中，对抗过敏原；在其它实施方式中，对抗肿瘤抗原)。所述免疫应答可包括抗体应答(通常包含IgG)和/或细胞介导的免疫应答。所述多肽免疫原通常会引起识别对应细菌、病毒、真菌或寄生虫(或过敏原或肿瘤)多肽的免疫应答，但在一些实施方式中，所述多肽可作为模拟表位(mimotope)来引起识别细菌、病毒、真菌或寄生虫糖类的免疫应答。所述免疫原通常会是表面多肽，例如:粘附素、血细胞凝集素、包膜糖蛋白、刺突糖蛋白等。自复制RNA分子能编码单一多肽免疫原或多种多肽。多种免疫原可以单一的多肽免疫原(融合多肽)或以分开的多种多肽形式存在。若表达的免疫原是分开的多种多肽，则这些多肽中的一个或多个可与上游IRES或其它病毒启动子元件一起提供。或者，多种免疫原可由多蛋白表达，所述多蛋白编码融合于短自催化蛋白酶(例如足口病病毒2A蛋白)的单一免疫原或作为内含肽。与参考文献I和14不同,所述RNA编码免疫原。为避免疑虑,本发明不包含编码萤火虫荧光素酶的RNA或编码大肠杆菌(E.coli) β-半乳糖苷酶融合蛋白的RNA或者编码绿色荧光蛋白(GFP)的RNA。并且，所述RNA不是小鼠胸腺总RNA。在一些实施方式中，所述免疫原引起的免疫应答对抗以下这些细菌中的一种:脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis):可用免疫原包括但不限于,膜蛋白如粘附素、自身转运蛋白、毒素、获铁蛋白和因子H结合蛋白。参考文献15中公开了三种可用多肽的组合。
肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae):参考文献16中公开了可用的多肽免疫原。这些多肽免疫原包括但不限于RrgB菌毛亚基、β-N-乙酰基-己糖胺酶前体(spr0057)、spr0096、全身应激蛋白GSP-781 (spr2021，SP2216)、丝氨酸/苏氨酸激酶StkP(SP1732)和肺炎球菌表面粘附素PsaA。产脓链球菌(Streptococcus pyogenes):可用免疫原包括但不限于参考文献17和18中公开的多肽。粘膜炎莫拉菌(Moraxellacatarrhal is) 百日咳博德特菌(Bordetella pertussis):可用的百日咳免疫原包括但不限于百日咳毒素或类毒素(PT)、丝状血细胞凝集素(FHA)、百日咳杆菌粘附素、凝集原2和3。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus):可用的免疫原包括但不限于参考文献19中公开的多肽，例如溶血素、esxA、esxB、铁色素结合蛋白(sta006)和/或staOll脂蛋白。破伤风梭菌(Clostridium tetani):典型的免疫原是破伤风类毒素。白喉杆菌(Cornynebacterium diphtheriae):典型的免疫原是白喉类毒素。流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae):可用免疫原包括但不限于参考文献20和21中公开的多肽。铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)无乳链球 菌(Streptococcus agalactiae):可用免疫原包括但不限于参考文献17中公开的多肽。沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis):可用免疫原包括但不限于PepA、LcrE、ArtJ、DnaK, CT398、OmpH 样蛋白(OmpH-1ike)、L7/L12、OmcA, AtoS、CT547、Eno, HtrA 和MurG(例如，如参考文献22中公开的多肽)。LcrE[23]和HtrA[24]是两种优选的免疫原。肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae):可用的免疫原包括但不限于参考文献25中公开的多肽。幽门螺杆菌(Helicobacter pylori):可用的免疫原包括但不限于CagA、VacA、NAP、和/或尿素酶[26]。大肠杆菌(Escherichia coli):可用的免疫原包括但不限于源自以下大肠杆菌的免疫原:肠产毒性大肠杆菌(ETEC)、肠聚集性大肠杆菌(EAggEC)、弥散粘附性大肠杆菌(DAEC)、肠致病性大肠杆菌(EPEC)、肠外致病性大肠杆菌(ExPEC)和/或肠出血性大肠杆菌(EHEC)。ExPEC菌株包括尿致病性大肠杆菌(UPEC)和脑膜炎/脓毒症相关的大肠杆菌(MNEC)。参考文献27和28公开了可用的UPEC多肽免疫原。参考文献29中公开了所用的MNEC免疫原。一种可用于若干大肠杆菌类型的免疫原是AcfD [30].
炭疽杆菌(Bacillusanthracis)鼠疫杆菌(Yersinia pestis):可用的免疫原包括但不限于参考文献31和32中公开的那些免疫原。表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermis):产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)或肉毒杆菌(Clostridiumbotulinums)嗜肺军团菌(Legionellapneumophila)
贝氏柯克斯体(Coxiellaburnetti)布鲁氏菌(Brucella)，例如，牛型布鲁氏菌(B.abortus)、犬型布鲁氏菌(B.canis)、羊型布鲁氏菌(B.melitensis)、沙林鼠型布鲁氏菌(B.neotomae)、绵羊型布鲁氏菌(B.0vis)、猪型布鲁氏菌(B.suis)、鳍脚类布鲁氏菌(B.pinnipediae).
弗朗西斯氏菌(Francisella)，例如新杀手弗朗西斯氏菌(F.novicida)、蜃楼弗朗西斯氏菌(F.philomiragia)、土拉热弗朗西斯氏菌(F.tularensis)。淋病奈瑟球菌(Neisseriagonorrhoeae)梅毒螺旋菌(Treponemapallidum)杜克氏嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)类肠球菌(Enterococcusfaecalis)或屎肠球菌(Enterococcus faecium)腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)
小肠结肠炎耶尔森菌(Yersiniaenterocolitica)结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)立克次体(Rickettsia)单核细胞增生利斯特菌(Listeria monocytogenes)霍乱弧菌(Vibriocholerae)伤寒沙门菌(Salmonellatyphi)包柔氏螺旋体菌(Borreliaburgdorferi)牙銀P卜啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis)克雷伯氏菌(Klebsiella)在一些实施方式中，所述免疫原引起的免疫应答对抗以下这些病毒中的一种:正粘病毒(Orthomyxovirus):可用免疫原可来自甲型、乙型或丙型流感病毒，例如血细胞凝集素、神经氨酸苷酶或基质M2蛋白。当所述免疫原是甲型流感病毒血细胞凝集素时，其可来自任何亚型，例如111、!12、!13、!14、!15、!16、!17、!18、!19、!110、!111、!112、!113、!114、H15 或 H16。副粘病毒科(Paramyxoviridae)病毒:病毒免疫原包括但不限于衍生自以下病毒的那些免疫原:肺炎病毒(例如，呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus, RSV)、腮腺炎病毒属(例如，腮腺炎病毒)、副粘病毒(例如，副流感病毒)、肺炎后病毒和麻疹病毒(例如，麻疹)。痘病毒(Poxviridae):病毒免疫原包括但不限于衍生自正痘病毒(Orthopoxvirus)如天花(Variola vera)的免疫原，包括但不限于重型天花(Variolamajor)和轻型天花(Variola minor)。小核糖核酸病毒(Picornavirus):病毒免疫原包括但不限于衍生自以下病毒的那些免疫原:小核糖核酸病毒，如肠道病毒、鼻病毒、嗜肝RNA病毒、心脏病毒和口蹄疫病毒的那些免疫原。在一个实施方式中，所述肠道病毒是脊髓灰质炎病毒，例如I型、2型和/或3型脊髓灰质炎病毒。在另一个实施方式中，所述肠道病毒是EV71肠道病毒。在另一个实施方式中，所述肠道病毒是A型或B型柯萨奇(coxsackie)病毒。布尼亚病毒(Bunyavirus):病毒免疫原包括但不限于衍生自以下病毒的那些免疫原:正布尼亚病毒(Orthobunyavirus)如加利福尼亚脑炎病毒、白蛉病毒(Phlebovirus)如裂谷热病毒或内罗病毒(Nairovirus)如克里米亚-刚果出血热病毒。嗜肝RNA病毒(Heparnavirus):病毒免疫原包括但不限于衍生自嗜肝RNA病毒如甲型肝炎病毒(HAV)的免疫原。线状病毒(Filovirus):病毒免疫原包括但不限于衍生自以下病毒的那些免疫原:线状病毒，例如埃博拉病毒属(Ebola virus)(包括扎伊尔(Zaire)埃博拉病毒、象牙海岸(Ivory Coast)埃博拉病毒、雷斯顿(Reston)或苏丹(Sudan)埃博拉病毒)或者马尔堡病毒(Marburg virus)。披膜病毒(Togavirus):病毒免疫原包括但不限于衍生自以下病毒的那些免疫原:披膜病毒(Togavirus),如风疫病毒(Rubivirus)、α病毒(Alphavirus)或动脉炎病毒属(Arterivirus)。该病毒包括风疫病毒(rubella virus)。黄病毒(Flavivirus):病毒免疫原包括但不限于衍生自以下病毒的那些免疫原:黄病毒，如蜱传脑炎(TBE)病毒、登革热(1、2、3或4型)病毒、黄热病毒、日本脑炎病毒、开萨诺森林病毒、西尼罗河脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、俄国春夏脑炎病毒、波瓦生脑炎病毒。瘟病毒(Pestivirus):病毒免疫原包括但不限于衍生自瘟病毒，如牛病毒性腹泻(BVDV)、经典猪瘟(CSFV)或边界病(BDV)的那些免疫原。嗜肝DNA病毒(Hepadnavirus):病毒免疫原包括但不限于衍生自嗜肝DNA病毒如乙型肝炎病毒的那些免疫原。组合物可包括乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)。其它肝炎病毒:组合物可包括衍生自丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒或庚型肝炎病毒的免疫原。杆状病毒(R habdovirus):病毒免疫原包括但不限于衍生自杆状病毒如狂犬病病毒属(例如狂犬病毒)和水泡病毒(VSV)的那些免疫原。杯状病毒(Caliciviridae):病毒免疫原包括但不限于衍生自杯状病毒,如诺沃克病毒(Norwalk virus)(诺如病毒(Norovirus))和诺沃克样病毒，如夏威夷病毒(HawaiiVirus)和雪山病毒(Snow Mountain Virus)的那些免疫原。冠状病毒(Coronavirus):病毒免疫原包括但不限于衍生自SARS冠状病毒、禽传染性支气管炎(IBV)、小鼠肝炎病毒(MHV)和猪传染性肠胃炎病毒(TGEV)的那些免疫原。所述冠状病毒免疫原可以是刺突多肽。逆转录病毒(Retrovirus):病毒免疫原包括但不限于衍生自肿瘤病毒(Oncovirus)、慢病毒(Lentivirus)(例如 HIV-1 或 HIV-2)或者泡沫病毒(Spumavirus)的那些免疫原。呼肠病毒(Reovirus):病毒免疫原包括但不限于衍生自正呼肠孤病毒属(Orthoreovirus)、轮状病毒(rotavirus)、环状病毒(Orbivirus)、或科罗拉多壁風热病毒(Coltivirus)的那些免疫原。细小病毒(Parvovirus):病毒免疫原包括但不限于衍生自细小病毒B19的那些免疫原。疱疫病毒(Herpesvirus):病毒免疫原包括但不限于衍生自以下病毒的那些免疫原:人疱疹病毒，如(仅为示例)单纯疱疹病毒(HSV)(例如HSVl型和2型)、水痘-带状疱疹病毒(VZV)、艾伯斯坦-巴尔病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)、人疱疹病毒6 (HHV6)、人疱疹病毒7 (HHV7)和人疱疹病毒8 (HHV8)。乳头状多瘤空泡病毒(Papovaviruses):病毒免疫原包括但不限于衍生自乳头状瘤病毒(Papillomaviruses)和多瘤病毒(Polyomaviruses)的那些免疫原。人乳头状瘤病毒可以是血清型 1、2、4、5、6、8、11、13、16、18、31、33、35、39、41、42、47、51、57、58、63 或 65，例如来自血清型6、11、16和/或18中的一种或多种。腺病毒(Adenovirus):病毒免疫原包括衍生自腺病毒血清型36 (Ad_36)的那些免疫原。在一些实施方式中，所述免疫原引起的免疫应答对抗感染鱼的病毒，例如:传染性鲑鱼贫血病毒(ISAV)、鲑鱼胰腺病病毒(SPDV)、传染性胰脏坏死病毒(IPNV)、水道猫鱼病毒(CCV)、鱼类淋巴囊肿病病毒(FLDV)、传染性造血组织坏死病毒(IHNV)、锦鲤疱疹病毒、鲑鱼小核糖核酸样病毒(也称作大西洋鲑鱼的小核糖核酸样病毒)、陆封鲑病毒(landlocked salmon virus，LSV)、大西洋娃鱼轮状病毒(ASR)、蹲鱼草毒病病毒(TSD)、银鲑鱼肿瘤病毒(CSTV)或病毒性出血性败血症病毒(VHSV)。真菌免疫原可衍生自皮肤真菌(Dermatophytres)，包括:絮状表皮癣菌(Epidermophyton f 1ccusum)、奥杜安氏小抱子菌(Microsporum audouini)、犬小抱子菌(Microsporum canis)、扭曲小抱子菌(Microsporum distortum)、马类小抱子菌(Microsporum equinum)、石膏样小抱子菌(Microsporum gypsum)、矮小小抱子菌(Microsporum nan um)、同心性毛癣菌(Trichophyton concentricum)、马发癣菌(Trichophyton equinum)、鸡毛癣菌(Trichophyton gallinae)、石膏状毛癣菌(Trichophyton gypseum)、麦格氏毛癣菌(Trichophyton megnini)、须癣毛癣菌(Trichophyton mentagrophytes)、昆克努发癣菌(Trichophyton quinckeanum)、红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)、许兰毛癣菌(Trichophyton schoenleini)、断发毛癣菌(Trichophyton tonsurans)、抚状毛癣菌(Trichophyton verrucosum)、抚状毛癣菌的白变种(var.album)、盘状变种(var.discoides)、赫色变种(var.0chraceum)、紫色毛癣菌(Trichophyton violaceum)和 / 或蜜块状发癣菌(Trichophyton faviforme);或者衍生自烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、黄曲霉(Aspergillus flavus)、黑曲霉(Aspergillusniger)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、土曲霉(Aspergillus terreus)、聚多曲霉(Aspergillus sydowi)、黄曲霉(Aspergillus flavatus)、灰绿曲霉(Aspergillusglaucus)、头状芽裂殖菌(Blastoschizomyces capitatus)、白假丝酵母(Candidaalbicans)、烯醇酶假丝酵母(Candida enolase)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、光滑假丝酵母(Candida glabrata)、克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)、类星形假丝酵母(Candida stellatoidea)、克鲁斯假丝酵母(Candida kusei)、帕拉克斯假丝酵母(Candida parakwsei)、葡萄牙假丝酵母(Candidalusitaniae)、伪热带假丝酵母(Candida pseudotropicalis)、季也蒙假丝酵母(Candidaguilliermondi)、卡氏枝抱霉(Cladosporium carrionii)、粗球抱子菌(Coccidioidesimmitis)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatidis)、新型隐球菌(Cryptococcusneoformans)、棒地霉(Geotrichum cIavatum)Λ 荚膜组织胞衆菌(Histoplasmacapsulatum)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、微抱子虫(Microsporidia)、脑炎微孢子虫属(Encephalitozoon spp)、表层角结膜炎微孢子虫(Septata intestinalis)和肠微孢子虫(Enterocytozoon bieneusi);较不常见的是:短粒虫属(Brachiola spp.)、微抱子虫属(Microsporidium spp.)、抱子虫属(Nosema spp.)、皮里虫属(Pleistophoraspp)、气管普抱虫属(Trachipleistophora spp.)、条抱虫属(Vittaforma spp.)、巴西芽生菌(Paracoccidioides brasiliensis)、卡氏月市抱子虫(Pneumocystis carinii)、苜猜腐酶(Pythiumn insidiosum)、卵状糖疫癣菌(Pityrosporum ovale)、酿酒酵母(Sacharomycescerevisae)、布拉酵母(Saccharomyces boulardii)、粟酒酵母(Saccharomyces pombe)、尖端赛多抱子菌(Scedosporium apiosperum)、申克抱子丝菌(Sporothrix schenckii)、白吉利丝孢酵母(Trichosporon beigelii)、弓形虫(Toxoplasma gondii)、马尔尼菲青霉菌(Penicillium marneffei)、马拉色菌(Malassezia spp.)、着色真菌属(Fonsecaea spp.)、王氏霉菌属(Wangiella spp.)、孢子丝菌属(Sporothrix spp.)、娃粪霉属(Basidiobolusspp.)、耳霉属(Conidiobolus spp.)、根霉属(Rhizopus spp.)、毛霉属(Mucor spp.)、犁头霉属(Absidia spp.)、被抱霉属(Mortierella spp.)、小克银汉霉属(Cunninghamellaspp.)、瓶霉属(Saksenaea spp.)、链格抱菌属(Alternaria spp.)、弯抱菌属(Curvulariaspp.)、长螺孢菌属(Helminthosporium spp.)、镰胞菌属(Fusarium spp.)、曲霉属(Aspergillus spp.)、青霉属(Penicillium spp.)、链核霉菌属(Monolinia spp.)、丝核菌属(Rhizoctonia spp.)、拟青霉属(Paecilomyces spp.)、皮司霉属(Pithomyces spp.)和枝抱霉属(Cladosporium spp.)。在一些实施方式中，所述免疫原引起的免疫应答对抗来自疟原虫(Plasmodium)属的寄生虫，例如恶性症原虫(P.falciparum)、间日症原虫(P.vivax)、三日症原虫(P.malariae)或卵形疟原虫(P.0vale)。因此，本发明可用于免疫对抗疟疾。在一些实施方式中，所述免疫原引起的免疫应答对抗源自鱼虱科(Caligidae)家族的寄生虫，尤其是那些源自疮痂鱼虱属(Lepeophtheiiois)和鱼虱属(Caligus)例如海虱如鲑疮痂鱼虱(Lepeophtheirus salmonis)或智利鱼風(Caligus rogercresseyi)的寄生虫。在一些实施方式中，所述免疫原引起的免疫应答对抗以下过敏原:花粉过敏原(树、草本和青草花粉过敏原)、昆虫或蜘蛛类动物过敏原(吸入式、唾液和毒液过敏原，例如螨虫过敏原、蟑螂和蠓过敏原、膜翅类毒液过敏原)、动物毛发和皮屑过敏原(来自例如狗、猫、马、大鼠、小鼠等)；以及食物过敏原(例如麦醇溶蛋白)。来自树、青草和草本植物的重要花粉过敏原，例如源于分类学的以下目:壳斗目(Fagales)、木樨目(Oleales)Iiv桕目(Pinales)以及悬铃木科(platanaceae)，包括但不限于桦木(桦属(Betula))、赤杨(棺木属(Alnus))、榛木(榛属(Corylus))、鹅耳枥木(鹅耳枥属(Carpinus))和橄榄(齐墩果属(Olea))、雪松(柳杉属(Cryptomeria)和桧属(Juniperus))、悬铃木(悬铃木属(Platanus))，禾本目包括以下属的青草:黑麦草属(Lolium)、猫尾草属(Phleum)、早熟禾(Poa)、狗牙根属(Cynodon)、鸭茅属(Dactylis)、域毛草属(Holcus)、藹草属(Phalaris)、黑麦属(Secale)和蜀黍属(Sorghum)，菊目(Asterales)和荨麻目(Urticales)包括以下属的非禾本草本植物:豚草属(Ambrosia)、艾属(Artemisia)和墙草属(Parietaria)。其它重要的吸入式过敏原是来自以下这些过敏原:表皮螨属(Dermatophagoides)和嗜霉螨属(Euroglyphus)的屋尘螨、储粮尘螨例如害嗜鳞螨(Lepidoglyphus)、食甜螨属(Glycyphagus)和食酪螨属(Tyrophagus)，来自蟑螂、蠓和跳蚤例如小蠊属(Blatella)、大爐属(Periplaneta)、摇蚊属(Chironomus)和柿头圣属(Ctenocephalides)，来自哺乳动物比如猫、狗和马，毒液过敏原包括例如源自螫或咬型的昆虫，比如来自分类学的膜翅目的那些昆虫，包括蜜蜂(蜜蜂科，Apidae)、黄蜂(胡蜂科，Vespidea)和蚂蚁(蚁科，Formicidae)。在一些实施方式中，所述免疫原是肿瘤抗原，选自:(a)癌症-睾丸抗原，如NY-ESO-1、SSX2、SCPl 以及 RAGE、BAGE、GAGE 和 MAGE 家族多肽，如 GAGE-1、GAGE_2、MAGE_1、MAGE-2, MAGE-3, MAGE-4, MAGE-5、MAGE-6和MAGE-12 (例如，可用于针对黑色素瘤、肺肿瘤、头颈部肿瘤、NSCLC瘤、乳腺肿瘤、胃肠道肿瘤和膀胱肿瘤)；(b)突变的抗原，例如p53(与各种实体瘤如结直肠癌、肺癌、头颈部癌有关)、p21/Ras (与例如黑色素瘤、胰腺癌和结直肠癌有关)、CDK4 (与例如黑色素瘤有关)、MUM1 (与例如黑色素瘤有关)、半胱天冬酶-8 (与例如头颈部癌有关)、CIA0205(与例如膀胱癌有关)、HLA-A2-R1701、β联蛋白(与例如黑色素瘤有关)、TCR(与例如T-细胞非霍奇金淋巴瘤有关)、BCR-abl (与例如慢性髓细胞性白血病有关)、磷酸丙糖异构酶、KIA0205、⑶C-27和LDLR-FUT ； (c)过表达的抗原，例如半乳糖凝集素4 (与例如结直肠癌有关)、半乳糖凝集素9 (与例如霍奇金病有关)、蛋白酶3 (与例如慢性髓细胞性白血病有关)、WT1 (与例如各种白血病有关)、碳酸酐酶(与例如肾癌有关)、醛缩酶A (与例如肺癌有关)、PRAME (与例如黑色素瘤有关)、HER-2/neu (与例如乳腺癌、结肠癌、肺癌和卵巢癌有关)、乳腺球蛋白、甲胎蛋白(与例如肝细胞癌有关)、KSA(与例如结直肠癌有关)、胃泌素(与例如胰腺癌和胃癌有关)、端粒酶催化蛋白、MUC-1 (与例如乳腺癌和卵巢癌有关)、G-250 (与例如肾细胞癌有关)、p53 (与例如乳腺癌和结肠癌有关)和癌胚抗原(与例如乳腺癌、肺癌和胃肠道癌如结直肠癌有关)；(d)共有的抗原，例如黑色素瘤-黑素细胞分化抗原如MART-l/Melan A、gplOO、MClR、黑素细胞-刺激激素受体、酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白-1/TRP1和酪氨酸酶相关蛋白_2/TRP2(与例如黑色素瘤有关)；(e)前列腺相关抗原，如PAP、PSA、PSMA, PSH-PU PSM-PU PSM-P2,与例如前列腺癌有关；(f)免疫球蛋白独特型(与例如骨髓瘤和B细胞淋巴瘤有关)。在某些实施方式中，肿瘤抗原包括但不限于巾15、!10111/]1-40、!1-1^8 424- 虬、!14-1 1\16!1-161(、]^1^-狀1 、艾伯斯坦-巴尔病毒抗原、EBNA、人乳头瘤病毒(HPV)抗原，包括E6和E7、乙肝和丙肝病毒抗原、人T细胞嗜淋巴病毒抗原、15-1801856218(-3、。1^111111-23!11、1六6-72-4、0六19-9、0六72-4、CAMl7.UNuMa, K_ras、pl6、TAGE, PSCA, CT7、43_9F、5T4、791Tgp72、β -HCG, BCA225、BTAA,CA125、CA 15-3 (CA27.29\BCAA)、CA195、CA242、CA-50、CAM43、CD68\KP1、C0-029、FGF-5、Ga733 (EpCAM)、HTgp-175、M344、MA-50、MG7_Ag、M0V18、NB/70K、NY-CO-1、RCASl、SDCCAG16、TA-90 (Mac-2结合蛋白\亲环蛋白C相关蛋白)、TAAL6、TAG72、TLP、TPS及类似物。药物组合物本发明的脂质体可用作药物组合物中的组分来免疫对象对抗各种疾病。除脂质体之外，这些组合物通常还包括药学上可接受的载体。药学上可接受的载体的全面讨论参见参考文献33。本发明的药物组合物可包括一种或多种小分子免疫增强剂。例如，所述组合物可包括TLR2激动剂(例如Pam3CSK4)、TLR4激动剂(例如氨烷基氨基葡糖苷磷酸，如E6020)、TLR7激动剂(例如咪喹莫特(imiquimod))、TLR8激动剂(例如瑞喹莫德(resiquimod))和/或TLR9激动剂(例如IC31)。任何所述的激动剂理想上具有<2000Da的分子量。包封RNA时,在一些实施方式中，所述激动剂也与RNA —同包封,但在其它实施方式中，不包封所述激动剂。RNA被颗粒吸附时，在一些实施方式中，所述激动剂也与RNA —同被吸附，但在其它实施方式中，不吸附所述激动剂。本发明的药物组合物可包括处于普通水(例如w.f.1)或缓冲液中的脂质体，所述缓冲液为例如:磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、硼酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液或柠檬酸盐缓冲液。缓冲盐浓度一般在5 20mM范围内。本发明的药物组合物的pH可在5.0和9.5之间，如在6.0和8.0之间。本发明的组合物可含有钠盐(如氯化钠)以产生张力。NaCl的浓度通常是IO 土 2mg/mL,例如约 9mg/mL。本发明的组合物可包含金属离子螯合剂。这些金属离子螯合剂可通过清除能加速磷酸二酯水解的离子来延长RNA的稳定性。因此，组合物可包含EDTA、EGTA、BAPTA、喷替酸等中的一种或多种。所述螯合剂的浓度通常在10 500 μ M之间，例如0.1mM。柠檬酸盐，例如柠檬酸钠，既可作为螯合剂，又提供有利的缓冲活性。本发明的药物组合物的重量摩尔渗透压浓度可在200m0sm/kg和400m0sm/kg之间，如在240 360m0sm/kg之间或在290 310m0sm/kg之间。本发明的药物组合物可包含一种或多种防腐剂，例如硫柳汞或2-苯氧乙醇。优选不含汞的组合物，且可制备不含防腐剂的疫苗。本发明的药物组合物优选是无菌的组合物。本发明的药物组合物优选无热源，如含有〈1EU (内毒素单位，标准量度)/剂量，并优选〈0.1EU/剂量。`本发明的药物组合物优选不含谷蛋白。本发明的药物组合物可以以单位剂量形式制备。在一些实施方式中，单位剂量的体积可在0.1 1.0mL之间，例如约0.5mL。可将所述组合物制备为溶液或悬浮液形式的注射剂。所述组合物可制备来用于肺部给药，例如用细喷雾形式通过吸入器给药。所述组合物可以制备用于鼻部、耳部或眼部给药，例如以喷雾或滴剂形式给药。一般将可注射形式用于肌肉内给药。组合物包含免疫有效量的脂质体，以及任何其它所需的组分。本文中的术语“免疫有效量”是指在一次剂量或一系列剂量的一部分中给予个体的量对治疗或预防有效。该量的变化取决于如下因素:待治疗个体的健康和身体状况、年龄、待治疗个体的分类群(例如，非人的灵长动物、灵长动物等)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗配方、治疗医生对医学情况的评估和其它相关因素。预计所述量将落入可通过常规试验测定的相对较宽范围内。本发明的组合物的脂质体和RNA含量一般按每剂量RNA的量来表示。优选剂量具有彡100 μ g的RNA(例如10 100 μ g，如约10 μ g、25 μ g、50 μ g、75 μ g或100 μ g)，但可见表达的水平低很多，例如< ^/剂量、< IOOng/剂量、< IOng/剂量、(Ing/剂量等。本发明还提供一种递送装置(例如注射器、喷雾器、喷洒器、吸入器、透皮贴片等)，所述递送装置包含本发明的药物组合物。该装置可用于对脊椎动物对象给予所述的组合物。本发明的脂质体不包括核糖体。治疗及医学应用方法
对比参考文献14中公开的粒子，本发明的脂质体和药物组合物用于体内使用来引起对抗感兴趣的免疫原的免疫应答。
本发明提供了用于在脊椎动物内产生免疫应答的方法，所述方法包括给予有效量的本发明的脂质体或药物组合物的步骤。所述免疫应答优选为保护性的免疫应答，并优选涉及抗体和/或细胞介导的免疫。所述方法可产生加强应答。本发明还提供了本发明所述的脂质体或药物组合物，所述脂质体或药物组合物用于在脊椎动物体内产生免疫应答的方法中。本发明还提供了本发明的脂质体在制造用于在脊椎动物体内产生免疫应答的药物中的应用。通过利用这些应用和方法在脊椎动物体内产生免疫应答，可保护所述脊椎动物对抗各种疾病和/或感染，例如，对抗如上讨论的细菌和/或病毒性疾病。所述脂质体和组合物是免疫原性的，更优选为疫苗组合物。如本发明所述的疫苗可以是预防性(即，用来预防感染)或治疗性(即，用来治疗感染)疫苗，但一般是预防性疫苗。所述脊椎动物优选哺乳动物，如人或大型兽类哺乳动物(例如，马、牛、鹿、山羊、猪)。当预防性使用所述疫苗时，人优选是儿童(如幼童或婴儿)或青少年；当所述疫苗用于治疗用途时，人优选是青少年或成人。计划给予儿童的疫苗也可给予成年人，例如，用以评估其安全性、剂量、免疫原性等。按本发明所述制备的疫苗可用于治疗儿童和成年人。因此，人患者可小于I岁、小于5岁、I 5岁、5 15岁、15 55岁或至少55岁。接受疫苗的患者优选老年人(如≥50岁，≥60岁并优选≥65岁)、幼儿(如≤5岁)、住院病人、保健护理人员、武装人员和军人、孕妇、慢性病人或免疫缺陷病人。不过，所述疫苗不仅适用于这些人群，还可用于更广泛的群体。通常将本发明的组合物直接给予患者。可通过肠胃外注射实现直接递送(例如皮下注射、腹腔注射、静脉注射、肌内注射、皮内注射或注射入组织间隙；不同于参考文献1，本发明一般不使用舌内注射)。可选择的递送途径包括直肠、口服(例如片剂、喷雾)、口腔、舌下、阴道、局部、透皮或经皮、鼻内、眼部、耳部、肺部或其它黏膜给药方式。皮内和肌内给药是两种优选的途径。注射可以通过针头(例如皮下针头)进行，但也可以选择使用无针注射。肌内剂量一般为0.5mL。本发明可用于引起全身和/或黏膜免疫，优选引起增强的全身和/或黏膜免疫。可以通过单剂量方案或多剂量方案给药。多剂量可以用于初次免疫方案和/或加强免疫方案。在多剂量方案中，可通过相同或不同的途径如胃肠道外初始和黏膜加强，黏膜初始和胃肠道外加强等给予多剂量。一般间隔至少I周(例如约2周、约3周、约4周、约6周、约8周、约10周、约12周、约16周等)给予多剂量。在一个实施方式中，可在出生后约6周、10周和14周给予多剂量,例如按世界卫生组织的扩大免疫规划(Expanded Programon Immunisation, “EPI”)中常用的在6周龄、10周龄和14周龄时给药。在一个可选实施方式中，间隔约两个月(例如间隔约7、8或9周)给予两个主要剂量，然后在第二次主要剂量后约6个月 I年(例如在第二次主要剂量后约6、8、10或12个月)给予一个或多个加强剂量。在另一个实施方式中，间隔约两个月(例如间隔约7、8或9周)给予三个主要剂量，然后在第三次主要剂量后约6个月 I年(例如，在第三次主要剂量后约6、8、10或12个月)给予一个或多个加强剂量。概述除非另有说明，本发明的实施将采用化学、生物化学、分子生物学、免疫学和药理学的常规方法，这些常规方法在本领域技术范围内。这些技术在文献中已有充分描述。参见例如，参考文献34 40等。本文中所用的术语“包含”涵盖“包括”以及“由…组成”，例如，“包含”X的组合物可以仅由X组成或可包括其它物质，例如X+Y。与数值X相关的 术语“约”是可选的并表示，例如，x±10%。本文所用术语“基本上”不排除“完全”，如“基本上不含” Y的组合物可完全不含Y。如有需要，“基本上”一词可以从本发明的定义中省略。提及电荷、阳离子、阴离子、两性离子等时都是指pH7情况下。TLR3是Toll样受体3。它是一种单次跨膜受体，其在先天免疫系统中起重要作用。已知的TLR3激动剂包括聚(1:C)。“TLR3”是编码该受体的基因的受认可HGNC名称，并且其专有 HGNC ID 是 HGNC:11849。人 TLR3 基因的 RefSeq 序列是 G1:2459625。TLR7是Toll样受体7。它是一种单次跨膜受体，其在先天免疫系统中起重要作用。已知的TLR7激动剂包括例如咪喹莫特。“TLR7”是编码该受体的基因的受认可HGNC名称，并且其专有HGNC ID是HGNC:15631。人TLR7基因的RefSeq序列是G1:67944638。TLR8是Toll样受体8。它是一种单次跨膜受体，其在先天免疫系统中起重要作用。已知的TLR8的激动剂包括例如瑞喹莫德(resiquimod)。“TLR8”是编码该受体的基因的受认可HGNC名称，并且其专有HGNC ID是HGNC: 15632。人TLR8基因的RefSeq序列是GI:20302165oRIG-1样受体(“RLR”)家族包括多种RNA解旋酶，其在先天免疫系统中起重要作用[41]。RLR-1 (也被称作RIG-1或维甲酸诱导基因I)在靠近其N-末端有两个半胱天冬酶(caspase)募集结构域。经认可的编码该RLR-1解旋酶的基因的HGNC名称是“DDX58”(针对DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp)盒多妝 58 (DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box polypeptide58)),并且其专有 HGNC ID 是 HGNC:19102。人 RLR-1 基因的 RefSeq 序列是 G1:77732514。RLR2 (也被称作MDA5或黑色素瘤分化相关基因5)在靠近其N-末端也具有两个半胱天冬酶(caspase)募集结构域。编码该RLR-2解旋酶的基因的受认可HGNC名称是“IFIHl” (针对由解旋酶C域 I 诱导的干扰素(interferon induced with helicase C domainl)),并且其专有 HGNCID 是 HGNC:18873。人 RLR-2 基因的 RefSeq 序列是 G1:27886567。RLR-3 (也被称作 LGP2或遗传学和生理学实验室蛋白2 (laboratory of genetics and physiology2))没有半胱天冬酶募集结构域。编码该RLR-3解旋酶的基因的受认可HGNC名称是“DHX58” (针对DEXH(Asp-Glu-X-His)盒多肽 58 (DEXH(Asp-Glu-X-His) box polyp印tide58))，并且其专有HGNC ID 是 HGNC:29517。人 RLR-3 基因的 RefSeq 序列是 G1: 149408121。PKR是双链RNA依赖性蛋白激酶。其在先天免疫系统中起重要作用。“EIF2AK2”(针对真核生物翻译起始因子 2-α 激酶2 (eukaryotic translation initiationfactor2-alpha kinase2))是编码该酶的基因的受认可HGNC名称，并且其专有HGNCID是HGNC:9437o 人 PKR 基因的 RefSeq 序列是 G1:208431825。
图1显示RNA染色凝胶。泳道表示如下:(I)标记物(markers)⑵裸复制子(3)RNA酶处理后的复制子(4)包封在脂质体内的复制子(5) RNA酶处理后的脂质体(6)经RNA酶处理后又经苯酚/氯仿提取的脂质体。图2是脂质体的电子显微照片。图 3 显示 DLinDMA、DLenDMA 和 DODMA 的结构。图4显示RNA染色凝胶。泳道表示如下:(I)标记物(markers)⑵裸复制子(3)包封在脂质体内的复制子(4)经RNA酶处理后又经苯酚/氯仿提取的脂质体。图5显示RNA递送后第1、3和6天的蛋白质表达，其中，RNA以病毒体包装的复制子形式递送(方形)、以裸露RNA形式递送(菱形)或在脂质体内递送(+=0.1 μ g，X=I μ g)。图6显示四种不同剂量的脂质体包封RNA递送后第1、3和6天的蛋白质表达。图7显示接受病毒体包装的复制子(VRP或VSRP)、I μ g裸露RNA和I μ g脂质体包封的RNA的动物体内抗F IgG滴度。图8显示接受VRP、I μ g裸露RNA和0.1g或I μ g脂质体包封的RNA的动物体内抗F IgG滴度。图9显示接受VRP、0.1g或I μ g脂质体包封的RNA的动物体内中和抗体滴度。图10显示复制子以裸露RNA (圆形)、脂质体包封的RNA (三角形和方形)或脂复合体(lipoplex)(倒三 角形)形式递送后的表达水平。图11显示复制子以裸露RNA (0.01 lyg)、脂质体包封的RNA (0.01 IOyg)或包装成病毒体(VRP，IO6感染单位或IU)形式递送后的F-特异性IgG滴度(第二剂量后2周)。图12显示复制子以裸露RNA(1 μ g)、脂质体包封的RNA (0.1或I μ g)或包装成病毒体(VRP，IO6IU)的形式递送后的F-特异性IgG滴度(圆形)和PRNT滴度(方形)。也显示了未处理(na'i ve)小鼠的滴度。实线表示几何平均数。图13显示在第二剂量后4周，用代表F蛋白内主要抗原表位的合成肽再刺激后的细胞内细胞因子的产量。I轴表示⑶8+⑶4-的细胞因子+百分比。图14显示小牛免疫后超过63天(图14A)和210天(图14B)的F-特异性IgG滴度(平均1gltl滴度土标准偏差)。在第63天时，三条线可由底至顶地被轻易区分:PBS阴性对照、脂质体递送的RNA以及所述“三角4”产物。图15显示相对于脂质体中所用脂质的pKa的第六天的SEAP表达(相对密度)图像。圆形表示含DSPC的脂质体的水平，方形表示不含DSPC的脂质体的水平，有时方形和圆形会重合，只剩下可见的方形用于表示给定的PKa。图16显不在编码F蛋白的复制子的第一剂量后两周的抗F滴度表达(相对于RVO1,100%)。以与图15中同样的方式绘制对应于pKa的滴度图像。星形表示RV02，其使用了 pKa高于其它脂质的阳离子脂质。三角形表示缺乏DSPC的脂质体的数据；圆形表示包含DSPC的脂质体的数据。图17显示复制子以脂质体递送后的总IgG滴度，其中从左向右所用脂质体为RV01、RV16、RV17、RV18或RV19。横线表示均值。每例中，较高的横线是2wp2 (即第二剂量后2周)，而较低的横线是2wpl。
图18显示13组小鼠体内的IgG滴度。每个圆形是一只小鼠个体，实线表示几何平均值。其中，点状水平线是本测试的检测限。所述13组从左至右为如下文所述的A M。图19显示pDC释放的(A) IL-6和(B) IFN a (pg/mL)。从左至右的4对条形是:对照；用RNA+D0TAP免疫；用RNA+脂质转染试剂(Lipofectamine)脂质体免疫；以及用脂质体内的RNA免疫。在每一对中，黑色条形是野生型小鼠，灰色条形是rsql突变体。
具体实施例方式RNA复制子下文使用了多种复制子。一般而言，这些复制子基于杂交α病毒基因组，其具有来自委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)的非结构蛋白，来自辛德毕斯病毒的包装信号以及来自辛德毕斯病毒或VEEV突变种的3’端UTR。该复制子长约IOkb，且具有聚腺苷酸尾。将编码α病毒复制子的质粒DNA (名为:pT7-mVEEV_FL.RSVF或A317、pT7-mVEEV-SEAP或A306、pSP6_VCR-GFP或A50)作为用于体外合成RNA的模板。所述复制子含有RNA复制所需的α病毒遗传元件，但缺失了编码颗粒组装所必需的基因产物的那些遗传元件；所述结构蛋白由所需的蛋白质(报告子(如SEAP或GFP)或者免疫原(如全长RSV F蛋白))所替换，这样所述复制子便无法诱导产生传染颗粒。所述α病毒cDNA上游的噬菌体(T7或SP6)启动子促进所述复制子RNA的体外合成，并且紧邻聚(A)尾下游的丁型肝炎病毒(HDV)核酶通过其自切割活性产生正确的3’末端。用合适的限制性内切核酸酶线性化所述HDV核酶下游的质粒DNA后，用T7或SP6曬菌体衍生的DNA依赖性RNA聚 合酶体外合成失控转录物(run-off transcript)。按照生产商(安碧公司(Ambion))提供的说明，在7.5mM(T7RNA聚合酶)或5mM(SP6RNA聚合酶)存在下，让各三磷酸核苷(ATP、CTP、GTP和UTP)在37° C转录2小时。转录后，用TURBO DNA酶(安碧公司(Ambion))消化模板DNA。用LiCl沉淀复制子RNA，并将其复溶于无核酸酶的水中。通过ScriptCap m7G加帽系统(埃皮森特生物技术公司(EpicentreBiotechnologies)),按照使用手册的描述,用牛痘加帽酶(VCE)对未加帽的RNA进行转录后加帽；以该方式加帽的复制子标有前缀“V”，例如，vA317是通过VCE加帽的A317复制子。用LiCl沉淀转录后加帽的RNA，并将其复溶于无核酸酶的水中。RNA样品的浓度通过检测OD260nm测定。体外转录物的完整性通过变性琼脂糖凝胶电泳证实。脂质体包封将RNA包封在按参考文献11和42制备的脂质体内。所述脂质体由10%DSPC (两性离子型)、40%DLinDMA(阳离子型)、48%胆固醇和2%连接PEG的DMG(2kDa PEG)组成。这些比例指的是占整个脂质体中的摩尔％。按参考文献6的方法合成DLinDMA(l，2_ 二亚油基氧基-N，N- 二甲基_3_氨基丙烷)。DSPC (1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱)购自基酶公司(Genzyme)。胆固醇获自西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)。连接PEG的DMG (1，2- 二肉豆蘧酰基_sn_丙三基-3-磷酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)，铵盐)、D0TAP(1，2-二油酰基-3-三甲基铵基丙烧，氯盐)和DC-chol (盐酸3 β - [N- (N’, N’ - 二甲氨基乙烧)-氨基甲酸基]胆固醇)，来自阿凡提极性脂公司(Avanti Polar Lipids)。简要来说，将脂质溶解于乙醇(2mL)中，将RNA复制子溶解于缓冲液(2mL，IOOmM柠檬酸钠，pH6)中，用2mL缓冲液混合这些物质，然后平衡I小时。用6mL缓冲液稀释所述混合物，然后过滤。所得产物包含脂质体，具有约95%的包封率。例如，在一个具体的方法中，在乙醇中配制新鲜的脂质储液。称量37mg DLinDMA、
11.8mg DSPC、27.8mg 胆固醇和 8.07mg PEG-DMG，并在 7.55mL 乙醇中溶解。在 37。C 温和摇动新鲜配制的脂质储液约15分钟以形成均质混合物。然后，将755μ L所述储液加入
1.245mL乙醇中形成2mL工作脂质储液。将这个量的脂质用于形成含有250 μ g RNA的脂质体。还以在IOOmM柠檬酸盐缓冲液(pH6)中约I μ g/ μ L的浓度由储液制备2mL RNA工作溶液。在使用三个20mL的玻璃瓶(有搅拌棒)前，用RNA酶去除液(分子生物产品公司(Molecular BioProducts))冲洗所述玻璃瓶，并用足量MilliQ水清洗，以去除瓶子的RNA酶污染。将所述玻璃瓶中的一个用于所述RNA工作溶液，其它的瓶用于收集所述脂质和RNA混合物(如后文所述)。在37° C加热所述工作脂质和RNA溶液lOmin，然后将其装入3cc鲁尔锁(Iuer-1ok)注射器。将2mL朽1檬酸盐缓冲液(pH6)装入另一个3cc注射器中。使用FEP管(氟化乙烯-丙烯；所有使用的FEP管都具有2mm的内直径和3mm的外直径)将装有RNA和所述脂质的注射器连接至T型混流器(ΡΕΕΚ 500 μ m ID连接，艺达思集团健康与科技事业部(Idex Health Science)) 0所述T型混流器的出口也装有FEP管。将装有柠檬酸盐缓冲液的第三个注射器连接至一段单独的FEP管。然后，用注射泵以7mL/min的流速驱动所有注射器。放置所述管的出口以使所述混合物收集到20mL玻璃瓶中(同时搅拌)。取出所述搅拌棒，使所述乙醇/水性溶液平衡至室温lh。将4mL所述混合物装入连有一段FEP管的5cc注射器，将等量的IOOmM柠檬酸盐缓冲液(pH6)装入另一个连有一段等长FEP管的5cc注射器。用注射泵以7m L/分钟的流速驱动所述两个注射器，并将最终的混合物收集到20mL玻璃瓶中(同时搅拌)。之后，使收集自第二混合步骤的混合物(脂质体)通过Mustang Q膜(结合并移除阴离子分子的阴离子交换支持物，获自波尔公司(PaliCorporation))。在该膜用于脂质体之前，先让4mLlM NaOH、4mLlM NaCl和IOmLlOOmM朽1樣酸盐缓冲液(PH6)依次通过该膜。将脂质体在37° C温育IOmin后通过所述膜。接着，将脂质体浓缩到2mL，使用切向流过滤(TFF)对10 15体积I XPBS透析，然后回收终产物。所述TFF系统和中空纤维过滤膜购自斯派实验室(Spectrum Labs)(多明格斯牧场(RanchoDominguez)),并按照生产商指南使用。使用具有IOOkD孔径截止值、8cm2表面积的聚砜中空纤维过滤膜。体外和体内实验所用的制剂用I XPBS稀释到所需的RNA浓度。图2显示通过这些方法制备的脂质体的示例性的电子显微照片。这些脂质体包含包封的编码全长RSV F抗原的RNA。一批脂质体的动态光散射显示其平均直径是141nm(根据密度)或78nm (根据数量)。RNA的包封百分比和RNA的浓度利用Quant-1T RiboGreen RNA试剂盒(英杰生命科技有限公司(InvitiOgen))按照生产商的说明来测定。利用所述试剂盒提供的核糖体RNA标准品生成标准曲线。在添加染料前，在I XTE缓冲液(来自试剂盒)中将所述脂质体稀释到IOX或IOOX。另外，在添加染料(来破坏脂质体并由此检测总RNA)前，在含有0.5%曲通X (Triton X)的I X TE缓冲液中将脂质体稀释到10X或100X。然后，添加等量的染料至各溶液，然后，将约180 μ L添加染料后的各溶液加入(设双重复)96孔组织培养板。在酶标仪上读取荧光(激发波长485nm，发射波长528nm)。所有脂质体制剂的体内给药剂量都基于RNA的包封量。
据显示包封于脂质体内保护了 RNA不被RNA酶消化。实验使用3.8mAU RNA酶A/微克RNA，在室温孵育30分钟。RNA酶用蛋白酶K在55° C灭活10分钟。然后添加1:1v/V的样品混合物比25:24:lv/v/v的苯酚:氯仿:异戊醇以从所述脂质提取所述RNA进入水相。涡旋震荡数秒钟混匀样品，然后将样品置于离心机上以12，000RPM离心15min。移出并使用所述水相(含有所述RNA)来分析所述RNA。在上样之前(每孔400ng RNA)，将所有样品和甲醛上样染料一起孵育，在65° C变性10分钟，并冷却至室温。使用安碧公司(Ambion)的Millennium标记物来估计RNA构建物的分子量。在90V跑胶。按照生产商指南，在水中使用0.1%SYBR金，通过在室温摇晃I小时对所述凝胶染色。图1显示在无包封情况下，RNA被RNA酶完全消化(第3泳道)。包封后无法检测到RNA (第4泳道)，即便这些脂质体经RNA酶处理也未见变化(第4泳道)。脂质体经RNA酶处理后又经苯酚提取，可见未被消化的RNA(第6泳道)。甚至在4° C经过I周后，仍然可见没有任何断裂的RNA(图4，箭头)。在4° C经过6周和一个冻融循环后，体内蛋白表达不变。因此，脂质体包封的RNA是稳定的。为评估所述RNA的体内表达，在所述复制子内编码了报告酶(分泌型碱性磷酸酶，SEAP)而不是免疫原。以1:4在IX磷杂-光(Phospha-Light)稀释缓冲液中稀释血清，在该稀释液中使用化学发光碱性磷酸盐底物来检测表达水平。在第O天，以0.1 μ g或I μ gRNA剂量对8 10周大的BALB/c小鼠(5只/组)进行肌内注射(50 μ L/腿)。不含所述脂质体的相同载体(溶于无RNA酶的1XPBS)也以Iyg给药。还测试了病毒体包装的复制子。本文所用的病毒体包装的复制子(称为“VRPs”)按参考文献43的方法获得，其中，所述α病毒复制子衍生自突变VEEV或者嵌合体，所述嵌合体衍生自VEEV基因组且经基因工程操作而含有辛德毕斯病毒3’端UTR和辛德毕斯病毒包装信号(PS)，通过共电穿孔使其与编码辛德毕斯病毒衣壳和糖蛋白基因的缺损型辅助RNA包装入BHK细胞。如图5所示，就I μ g剂量而言，包封使SEAP水平增加约l/21og，在第6天，0.1yg包封剂量的表达达到了 Iyg未包封剂量所见的水平。到第3天时，表达水平超过了那些使用VRP(SB)所达到的水平。因此，相比裸露RNA对照，配制在脂质体中的RNA的表达增力口，甚至在较低的剂量(IOX)也是如此。表达与VRP对照相比也更高，但表达动力学非常不同(参见图5)。相对于裸露RNA，由电穿孔递送所述RNA使得表达增加，但这些水平都低于由脂质体递送的RNA。为评估所述脂质体组显示的效果是仅仅归因于脂质体组分，还是与包封有联系，所述复制子以包封形式(用两种不同的纯化方法，0.1yg RNA)给药，或在脂质体形成后与其混合(非包封的“脂复合体”，0.1 μ g RNA)给药，或者以裸露RNA(1 μ g)给药。图10显示所述脂复合体显示了最低表达水平，显示包封对蛋白表达是必要的。使用脂质体递送的体内研究证实了这些发现。小鼠接受不同的组合:(i)编码全长RSV F蛋白的自复制RNA复制子(ii)编码GFP的自复制RNA复制子(iii)编码GFP的RNA复制子，其敲除nsP4以排除自复制(iv)全长RSV F蛋白。共有13组接受以下组合物:
权利要求
1.一种具有包封水性核心的脂质双分子层的脂质体，其特征在于:(i)所述脂质双分子层包含PKa在5.0 7.6范围内的脂质；以及(ii)所述水性核心包括编码免疫原的RNA。
2.如权利要求1所述的脂质体，其特征在于，所述pKa在5.0 7.6范围内的脂质具有叔胺。
3.如前述权利要求中任一项所述的脂质体，其特征在于，所述在5.0 7.6范围内的pKa在5.7 5.9之间。
4.如权利要求1所述的脂质体，其特征在于，所述pKa在5.0 7.6范围内的脂质具有如本文中的式 RVOl、RV02、RV03、RV04、RV05、RV06、RV07、RV08、RV09、RVl1、RV12、RV16 或RV17所示。
5.如前述权利要求中任一项所述的脂质体，其直径在20 220nm范围内。
6.如前述权利要求中任一项所述的脂质体，其特征在于，所述RNA分子编码(i)能从所述RNA分子转录RNA的RNA依赖性RNA聚合酶，以及(ii)免疫原。
7.如权利要求5所述的脂质体，其特征在于，所述RNA分子有两个开放阅读框，所述开放阅读框中的第一个开放阅读框编码α病毒复制酶，而第二个开放阅读框编码所述免疫原。
8.如前述权利要求中任一项所述的脂质体，其特征在于，所述RNA分子的长度是9000 12000个核苷酸。
9.如前述权利要求中任一项所述的脂质体，其特征在于，所述免疫原能引起体内免疫应答以对抗细菌、病毒、真菌或寄生虫。
10.如前述权利要求中任一项所述的脂质体，其特征在于，所述免疫原能引起体内免疫应答以对抗呼吸道合胞病毒糖蛋白F。
11.一种药物组合物，所述药物组合物包含如前述权利要求中任一项所述的脂质体。
12.一种用于在脊椎动物体内引起保护性免疫应答的方法，所述方法包括给予所述脊椎动物有效量的如权利要求1 10所述的脂质体或者如权利要求11所述的药物组合物的步骤。
13.一种用于制备包含RNA的脂质体的方法，所述方法包括脂质体形成过程中的如下步骤:(a)在低于脂质的pKa但闻于4.5的pH下混合RNA和所述脂质；然后(b)提闻pH,使其闻于所述脂质的pKa。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于:步骤(a)中所用的RNA在水性溶液中，以与所述脂质的有机溶液混合来获得混合物，然后稀释所述混合物以形成脂质体；以及在步骤(b)中，在脂质体形成后提高所述pH。
全文摘要
在脂质体内递送编码免疫原的RNA以用于免疫目的。所述脂质体包含pKa在5.0～7.6范围内的脂质，优选所述脂质具有叔胺。在生理pH下，这些脂质体的表面电荷基本呈中性，并且所述脂质体对免疫有效。
文档编号C12N15/86GK103153284SQ201180042459
公开日2013年6月12日 申请日期2011年7月6日 优先权日2010年7月6日
发明者A·吉尔 申请人:诺华有限公司
技术领域：
本发明涉及用于免疫的RNA非病毒递送领域。
背景技术：
用于免疫动物的核酸递送已成为数年来的目标。人们已经测试了许多方法，包括使用DNA或RNA，使用病毒或非病毒递送载剂(或者甚至无递送载剂，以“裸”疫苗形式)，使用复制型或非复制型载体，或者使用病毒或非病毒载体。核酸疫苗仍需改进和改良。
发明内容
如本发明所述，以脂质体递送编码免疫原的RNA用来免疫。所述脂质体包含pKa在5.0 7.6范围内的脂质。pKa在该范围内的脂质理想上具有叔胺；此类脂质和具有季胺基团的脂质(如DOTAP或DC-Chol)性质不同。在生理pH下，pKa在5.0 7.6范围内的胺具有中性或减少的表面电荷，而脂质如DOTAP则是强阳离子脂质。本发明人发现，由季胺脂质(如D0TAP)形成的脂质体不如由叔胺脂质(如DLinDMA)形成的脂质体适合递送编码免疫原的RNA。因此，本发明提供具有包封水性核心的脂质双分子层的脂质体，其中:(i)所述脂质双分子层包含PKa在5.0 7.6范围内的脂质，优选所述脂质具有叔胺；以及(ii)所述水性核心包括编码免疫原的RNA。这些脂质体适用于体内递送RNA至脊椎动物细胞，从而它们可用作药物组合物中的成分用来免疫对象抵抗各种疾病。本发明也提供了一种制备包含RNA的脂质体的方法，所述方法包括以下步骤:(a)在低于脂质的PKa但高于4.5的pH下，混合RNA和所述脂质以形成包封所述RNA的脂质体；以及(b)提高所得包含脂质体的混合物的pH，使其高于所述脂质的pKa。脂质体本发明应用其中包封有编码免疫原的RNA的脂质体。因而，使RNA (如天然病毒内一样)由脂质体的脂质双分子层与任何外部介质分隔，而且发现以该途径进行包封可保护RNA不被RNA酶消化。所述脂质体可包括一些处在外部RNA(如在脂质体的表面上)，但是至少一半的RNA(理想上为全部)被包封在所述脂质体的核心中。脂质体内的包封不同于例如参考文献I中公开的脂质/RNA复合物。在水性环境中，各种两亲性脂质能形成双分子层以包封含RNA的水性核心，形成脂质体。这些脂质可具有阴离子、阳离子或两性离子亲水性头部基团。本发明的脂质体包含pKa在5.0 7.6范围内的脂质，并优选pKa在该范围内的脂质具有叔胺。例如，其可包含1，2~ 二亚油基氧基_N, N- 二甲基_3-氣基丙烧(DLinDMA ；pKa5.8)和/或1，2- 二亚麻基氧基_N, N-二甲基-3-氨基丙烧(DLenDMA)。另一种合适的具有叔胺的脂质是1，2-二油烯基氧基-N，N 二甲基-3-氨基丙烷(DODMA)。参见图3和参考文献2。也可使用参考文献3中的某些氨基酸脂质，也可使用参考文献4的某些氨基脂质。参考文献5公开了在其头部基团内具有叔胺的其它可用脂质，其完整内容通过引用纳入本文中。本发明的脂质体可由单一脂质或脂质混合物形成，条件是所述脂质中的至少一种的pKa在5.0 7.6范围内(并且优选具有叔胺)。在该pKa范围内，优选脂质的pKa是5.5 6.7，例如在5.6和6.8之间，在5.6和6.3之间，在5.6和6.0之间，在5.5和6.2之间，或在5.7和5.9之间。所述pKa是50%的脂质带电时的pH，位于脂质完全带电的点和脂质完全不带电的点的中间。可以用各种方法测量所述pKa，但优选使用下述在标题为“pKa测量”部分中公开的方法测量。通常应测量单一脂质的pKa，而不是测量还包括其它脂质的混合物中的脂质的PKa (例如，不像参考文献6中实施的那样，该方法评判SNALP的pKa而不是单一脂质的pKa)。当本发明的脂质体由脂质混合物形成时，优选pKa在所需范围内的那些脂质的比例是脂质总量的20 80%,例如，在30 70%之间，或在40 60%之间。举例来说，在如下所示的可用脂质体中，总 脂质的40%或60%是pKa在所需范围内的脂质。剩余部分可由例如胆固醇(例如35 50%胆固醇)和/或DMG (可选PEG化修饰的DMG)和/或DSPC构成。此类混合物用于下文。这些％值是摩尔百分比。脂质体可包含两亲性脂质，其亲水部分是被PEG化修饰的(即，通过与聚乙二醇共价连接来修饰的)。该修饰可增加所述脂质体的稳定性并防止所述脂质体的非特异性吸附。举例来说，使用诸如参考文献6和7公开的那些技术来使脂质结合PEG。PEG为脂质体提供外层，所述外层可赋予有利的药物代谢动力学特性。RNA (特别是自复制RNA)的有效包封、pKa在5.0 7.6范围内的阳离子脂质、以及PEG化修饰的表面，这三者的结合可实现对于多种细胞类型的有效递送(包括免疫细胞和非免疫细胞)，从而与使用未PEG化修饰的季胺相比，引起更强且更好的免疫应答。可使用不同长度的PEG，例如，在0.5 SkDa之间。用于本发明的脂质可以是饱和的或不饱和的脂质。优选使用至少一种不饱和脂质来制备脂质体。图3显不二种可用的不饱和脂质。若不饱和脂质有两条尾，则两条尾都可以是不饱和尾，或者可以有一条饱和尾和一条不饱和尾。实例中使用DSPC、DLinDMA, PEG-DMG和胆固醇的混合物。本发明的一个独立方面是含DSPC、DLinDMA、PEG-DMG和胆固醇的脂质体。该脂质体优选包封RNA，如自复制RNA，例如编码免疫原的自复制RNA。脂质体颗粒通常分为3组:多层囊泡(MLV);小单层囊泡(SUV);和大单层囊泡(LUV)。MLV的各囊泡中具有多个双分子层，形成若干分离的水性隔室。SUV和LUV具有包封水性核心的单一双分子层；通常SUV的直径彡50nm，LUV的直径>50nm。本发明的脂质体颗粒理想上是直径在50 220nm范围内的LUV。对于包含不同直径LUV的群体的组合物:(i)在数量上至少80%应具有20 220nm范围内的直径，(ii)所述群体的平均直径(Zav，由强度表示)理想上在40 200nm范围内，和/或(iii)所述直径的多分散性指数应〈0.2。希望参考文献I的脂质体/RNA复合物的直径在600 800nm范围内，且具有高多分散性。所述脂质体大体上可以是球形的。用于制备合适的脂质体的技术是本领域所熟知的，例如参见参考文献8 10。参考文献11描述了一种可用的方法，该方法涉及混合α)脂质的乙醇溶液(ii)核酸的水性溶液和(iii)缓冲液，然后进行混合、平衡、稀释和纯化。优选本发明的脂质体可通过该混合工艺获得。混合工艺如上所述，本发明提供用于制备包含RNA的脂质体的工艺，所述工艺包括以下步骤:(a)在低于脂质的pKa但高于4.5的pH下混合RNA和所述脂质；然后(b)提高pH，使其闻于所述脂质的pKa。因此，阳离子脂质在步骤(a)的脂质体形成过程中带正电，但之后的pH变化意味着所述正电基团的大多数(或全部)变为中性。该工艺有利于制备本发明的脂质体，并且通过在步骤(a)过程中避免pH低于4.5，提高了被包封RNA的稳定性。步骤(a)中的pH高于4.5，理想上高于4.8。采用在5.0 6.0范围内，或在5.0 5.5范围内的pH，能够提供合适的脂质体。在步骤(b)中提高pH，使其高于所述脂质的pKa。理想上提高所述pH至低于9，优选低于8。取决于所述脂质的pKa，步骤(b)中的所述pH由此可提高到6 8的范围内，例如提高至pH6.5±0.3。可通过将脂质体转移到合适的缓冲液来实现步骤(b)的pH提高，例如，转移到磷酸盐缓冲盐水中。理想上在脂质体形成发生后实行步骤(b)的pH提高。步骤(a)中所用的RNA可在水性溶液中，用于与脂质的有机溶液混合(例如，乙醇溶液，如参考文献11所述)。然后可稀释所述混合物来形成脂质体，这之后可在步骤(b)中提闻pH。RNA本发明可用 于体内递送编码免疫原的RNA。所述RNA由位于递送部位的非免疫细胞翻译，引起所述免疫原的表达，并且还会引起免疫细胞分泌产生局部佐剂效应的促炎细胞因子和/或I型干扰素。非免疫细胞响应所述RNA时也能分泌I型干扰素和/或促炎细胞因子。所述RNA是正链RNA，因此可被非免疫细胞翻译，而不需要介入任何复制步骤(例如反转录)。所述RNA还能结合由免疫细胞表达的TLR7受体，从而引发佐剂效应。优选正链RNA是自复制RNA。自复制RNA分子(复制子)在被递送到脊椎动物细胞(甚至无任何蛋白质)时，能通过从其自身转录(通过从其自身产生自身的反义拷贝)引起多条子代RNA的产生。因此，自复制RNA分子通常是正链分子，其可在递送到细胞后被直接翻译，而该翻译提供RNA依赖性RNA聚合酶，之后，该RNA聚合酶从所述递送的RNA生成反义和正义转录产物。因此，递送的RNA引起多条子代RNA的产生。这些子代RNA和亚基因组共线性转录产物都能翻译其自身来提供所编码免疫原的原位表达，或者可经转录来提供与递送的RNA同义的其它转录产物，该同义转录产物经过翻译来提供所述免疫原的原位表达。该顺序转录的总体结果是所引入的复制子RNA在数量上的巨大扩增，并且其编码的免疫原成为所述细胞的主要多肽产物。如下所示，RNA不需具有自复制活性来提供佐剂效应，即便这样可以增强转染后的细胞因子分泌。所述自复制活性特别有利于非免疫细胞实现所述免疫原的高水平表达。而它也会促进所述非免疫细胞的凋亡。实现自复制的一种合适的系统是使用基于α病毒的RNA复制子。这些正链复制子在递送到细胞后经翻译以产生复制酶(或复制酶-转录酶)。所述复制酶作为多蛋白被翻译，其自切割以提供复制复合物，所述复制复合物产生所述递送的正链RNA的基因组负链拷贝。这些负链转录产物可以转录其自身来进一步产生所述正链亲本RNA的拷贝，而且还产生编码所述免疫原的亚基因组转录产物。因此，所述亚基因组转录产物的翻译使得所述受感染细胞原位表达所述免疫原。合适的α病毒复制子可以使用来自以下病毒的复制酶:辛德毕斯病毒(sindbis virus)、塞姆利基森林病毒(semliki forest virus)、东部马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒等。可使用突变或野生型病毒序列，例如，在复制子中已使用VEEV的减毒TC83突变体[12]。因此，优选的自复制RNA分子编码⑴可从所述自复制RNA分子转录RNA的RNA依赖性RNA聚合酶和(ii)免疫原。所述聚合酶可以是α病毒复制酶，例如包含一种或多种α病毒蛋白nsPl、nsP2、nsP3和nsP4的α病毒复制酶。尽管除了所述非结构复制酶多蛋白，天然α病毒基因组还编码结构病毒体蛋白，但优选本发明的自复制RNA分子不编码α病毒结构蛋白。因此，优选自复制RNA可在细胞中导致产生其本身的基因组RNA拷贝，但不会导致产生含有RNA的病毒体。无法产生这些病毒体是指不像野生型α病毒，所述自复制RNA分子自身不能以感染形式永存。本发明的自复制RNA缺失野生型病毒永存所必需的α病毒结构蛋白，并且由编码所需免疫原的基因代替了它们的位置，因此，所述亚基因组转录产物编码所述免疫原，而不是编码所述α病毒病毒体结构蛋白。因此，本发明所用的自复制RNA分子可具有两个开放阅读框。第一个(5’)开放阅读框编码复制酶；第二个(3’)开放阅读框编码免疫原。在一些实施方式中，所述RNA可具有额外的(例如下游)开放阅读框，比如用来编码其它免疫原(参见下文)或者编码辅助多肽。
自复制RNA分子可具有与所述编码的复制酶相容的5’序列。自复制RNA分子可具有不同长度，但其长度通常是5000 25000个核苷酸，例如8000 15000个核苷酸，或者9000 12000个核苷酸。因此，所述RNA比siRNA递送中所见的长。本发明所用的RNA可具有5’帽子(例如，7-甲基鸟苷)。该帽子结构能增强RNA的体内翻译。本发明所用的RNA分子的5’核苷酸可具有5’三磷酸基团。在有帽RNA中，其可通过5’-5’桥与7-甲基鸟苷连接。5’三磷酸能增强RIG-1的结合，从而增强佐剂效应。RNA分子可具有3’多聚腺苷尾。该RNA分子还可在靠近其3’端处包含多腺苷聚合酶识别序列(例如AAUAAA)。本发明所用的RNA分子通常是单链的。单链RNA通常能通过与TLR7、TLR8、RNA解旋酶和/或PKR结合而引发佐剂效应。以双链形式递送的RNA(dsRNA)能结合TLR3，而且该受体还能被dsRNA触发，该dsRNA在单链RNA复制过程中或在单链RNA的二级结构中形成。本发明所用的RNA分子能通过体外转录(IVT)方便地制备。IVT可使用(cDNA)模板生成，并在细菌内以质粒形式增殖，或通过合成生成(例如通过基因合成和/或聚合酶链式反应(PCR)工程化方法)。例如，DNA依赖性RNA聚合酶(例如噬菌体T7、T3或SP6RNA聚合酶)可用于从DNA模板转录RNA。可按需求使用合适的加帽和加多聚腺苷反应(尽管复制子的多聚腺苷通常在DNA模板内编码)。这些RNA聚合酶对转录的5’核苷酸有着严格的要求，在某些实施方式中，这些要求须与所编码复制子的要求相符，以确保IVT转录的RNA作为其自编码复制酶的底物能有效地发挥功能。 如参考文献13中讨论的，自复制RNA可包括(除任何5’帽子结构之外)一个或多个具有修饰核碱基的核苷酸。因此，所述RNA可包括m5C(5-甲基胞苷)、m5U(5_甲基尿苷)、m6A(N6-甲基腺苷)、s2U(2-硫代尿苷)、Um(2’-0-甲基尿苷)、mlA(l_甲基腺苷)、m2A(2-甲基腺苷)、Am(2’-O-甲基腺苷)、ms2m6A(2-甲硫基-N6-甲基腺苷)、i6A(N6-异戊烯基腺苷)、ms2i6A(2-甲硫基-N6异戊烯基腺苷)、io6A (N6-(顺羟异戊烯基)腺苷)、ms2io6A(2-甲硫基_N6_(顺羟异戊烯基)腺苷)、g6A(N6-甘氨酰基氨甲酰基腺苷)、t6A (N6-苏氨酰基氨甲酰基腺苷)、ms2t6A (2-甲硫基-N6-苏氨酰基氨甲酰基腺苷)、m6t6A (N6-甲基-N6-苏氨酰基氨甲酰基腺苷)、hn6A (N6-羟基正缬氨酰基氨甲酰基腺苷)、ms2hn6A(2-甲硫基-N6-羟基正缬氨酰基氨甲酰基腺苷、Ar (p) (2’ -O-核糖基腺苷(磷酸))、I (次黄嘌呤核苷)、mil (1-甲基次黄嘌呤核苷)、m’ Im(l, 2’ _0_ 二甲基次黄嘌呤核苷)、m3C(3-甲基胞苷)、Cm(2T-0-甲基胞苷)、s2C(2_硫代胞苷)、ac4C(N4_乙酰基胞苷)、f5C(5_ 甲酸基胞苷，5-fonnylcytidine)、m5Cm(5, 2-0- 二甲基胞苷)、ac4Cm(N4 乙酰基2T0甲基胞苷)、k2C(赖胞苷)、mlGd-甲基鸟苷)、m2G(N2-甲基鸟苷)、m7G(7-甲基鸟苷)、Gm(2’-0-甲基鸟苷)、m22G(N2，N2-二甲基鸟苷)、m2Gm(N2, 2’-O-二甲基鸟苷)、m22Gm(N2, N2, 2’ -O-三甲基鸟苷)、Gr (p) (2’ -O-核糖基鸟苷(磷酸))、yW(怀丁苷)、o2yff(过氧化怀丁苷)、OHyW(羟基怀丁苷)、OHyW*(欠修饰的羟基怀丁苷)、imG(丫苷)、mimG(甲基鸟苷)、Q (queuosine,辫苷)、oQ (环氧辫苷)、galQ(半乳糖-辫苷)、manQ (甘露糖-辫苷)>preQo (7-氰基-7-去氮鸟苷)、preQi (7-氨甲基-7-去氮鸟苷)、G (古嘌苷)、D (二氢尿苷)、m5Um(5，2’ _0_ 二甲基尿苷)、s4U(4_硫代尿苷)、m5s2U(5-甲基_2_硫代尿苷)、s2Um (2-硫代-2 ’ -O-甲基尿苷)、acp3U (3- (3-氨基_3_羧丙基)尿苷)、ho5U (5-羟基尿苷)、mo5U (5-甲氧基尿苷)、cmo5U (尿苷5-轻乙酸)、mcmo5U (尿苷5-轻乙酸甲基酯)、chm5U (5-(羧轻甲基)尿苷))、mchm5U (5-(羧轻甲基)尿苷甲基酯)、mcm5U (5-甲氧羰基甲基尿苷)、mcm5Um (S-甲氧基羰甲基-2-0-甲基尿苷)、mcm5s2U (5-甲氧基羰甲基_2_硫代尿苷)、nm5s2U (5-氨甲基-2-硫代尿苷)、mnm5U (5-甲基氨甲基尿苷)、mnm5s2U (5-甲基氨甲基-2-硫代尿苷)、mnm5se2U (5-甲基氨甲基_2_硒尿苷)、ncm5U (5-氨基甲酰甲基尿苷)、ncm5Um(5-氨基甲酰甲基_2’ -O-甲基尿苷)、cmnm5U(5-羧甲基氨甲基尿苷)、cnmm5Um(5-羧甲基氨甲基-2-L-0甲基尿苷)、cmnm5s2U(5-羧甲基氨甲基_2_硫代尿苷)、m62A(N6，N6-二甲基腺苷)、Tm(2’-0-甲基次黄嘌呤核苷)、m4C(N4-甲基胞苷)、m4Cm (N4, 2-0- 二甲基胞苷)、hm5C (5-羟甲基胞苷)、m3U (3-甲基尿苷)、cm5U (5-羧甲基尿苷)、m6Am(N6, T-O- 二甲基腺苷)、rn62Am(N6, N6, 0_2_ 三甲基腺苷)、m2，7G (N2, 7- 二甲基鸟苷)、m2’ 2’ 7G(N2, N2, 7-三甲基鸟苷)、m3Um(3，2T-0- 二甲基尿苷),m5D(5-甲基二氢尿苷)、f5Cm(5-甲酰基-2’ -O-甲基胞苷)、mlGm(l, 2’ -O-二甲基鸟苷)、m’Am(l, 2_0_ 二甲基腺苷)益立诺甲基尿苷(irinomethyluridine))、tm5s2U(S-氨基乙磺酰基甲基-2-硫代尿苷))、imG-14(4-去甲基鸟苷)、imG2(异鸟苷)、或ac6A(N6-乙酰基腺苷)、次黄嘌呤、次黄嘌呤核苷、8-氧代-腺嘌呤，及其7-取代衍生物、二氢尿嘧啶、假尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-氨基尿嘧啶、5- (C1-C6)-烷基尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5- (C2-C6)-烯基尿嘧啶、5- (C2-C6)-炔基尿嘧啶、5-(羟甲基)尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羟基胞嘧啶、5- (C1-C6)-烷基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5- (C2-C6)-烯基胞嘧啶、5- (C2-C6)-炔基胞嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-溴胞嘧啶、N2- 二甲基鸟嘌呤、7-去氮鸟嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤、7-去氮-7-取代鸟嘌呤、7-去氮-7-(C2-C6)炔基鸟嘌呤、7-去氮-8-取代鸟嘌呤、8-羟基鸟嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、8-氧代鸟嘌呤、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、2，4-二氨基嘌呤、2，6- 二氨基嘌呤、8-氮杂嘌呤、取代的7-去氮嘌呤、7-去氮-7-取代嘌呤、7-去氮-8-取代嘌呤、或者脱碱基核苷酸。例如，自复制RNA可包含一个或多个修饰的嘧啶核碱基，比如假尿苷和/或5-甲基胞嘧啶残基。然而，在一些实施方式中，RNA不包含修饰的核碱基，并且可以不包含修饰的核苷酸，即，RNA中的所有核苷酸都是标准的A、C、G和U核糖核苷酸(除可含有7'甲基鸟苷的任何5’帽子结构外)。在其它实施方式中，RNA可包含含有7’ -甲基鸟苷的5’帽子，且最前的1、2或3个5’端核糖核苷酸可在核糖的2’位点被甲基化。本发明所用的RNA理想上在核苷之间仅包含磷酸二酯键，但在某些实施方式中，其可包含氨基磷酸酯键、硫代磷酸酯键和/或甲基磷酸酯键。理想上，脂质体包含少于10个不同的RNA种类，例如5、4、3或2个不同种类；最优选脂质体包含单个RNA·种类，即，脂质体中的所有RNA分子具有相同的序列和相同的长度。每个脂质体的RNA含量可以不同。每个脂质体的自复制RNA分子个体的数量通常(50个，例如每个脂质体〈20个、〈10个、〈5个或者I 4个。免疫原本发明所用的RNA分子编码多肽免疫原。在脂质体给药后，所述RNA在体内翻译，所述免疫原可在受者内引起免疫应答。所述免疫原可引起免疫应答来对抗细菌、病毒、真菌或寄生虫(或者，在一些实施方式中，对抗过敏原；在其它实施方式中，对抗肿瘤抗原)。所述免疫应答可包括抗体应答(通常包含IgG)和/或细胞介导的免疫应答。所述多肽免疫原通常会引起识别对应细菌、病毒、真菌或寄生虫(或过敏原或肿瘤)多肽的免疫应答，但在一些实施方式中，所述多肽可作为模拟表位(mimotope)来引起识别细菌、病毒、真菌或寄生虫糖类的免疫应答。所述免疫原通常会是表面多肽，例如:粘附素、血细胞凝集素、包膜糖蛋白、刺突糖蛋白等。自复制RNA分子能编码单一多肽免疫原或多种多肽。多种免疫原可以单一的多肽免疫原(融合多肽)或以分开的多种多肽形式存在。若表达的免疫原是分开的多种多肽，则这些多肽中的一个或多个可与上游IRES或其它病毒启动子元件一起提供。或者，多种免疫原可由多蛋白表达，所述多蛋白编码融合于短自催化蛋白酶(例如足口病病毒2A蛋白)的单一免疫原或作为内含肽。与参考文献I和14不同,所述RNA编码免疫原。为避免疑虑,本发明不包含编码萤火虫荧光素酶的RNA或编码大肠杆菌(E.coli) β-半乳糖苷酶融合蛋白的RNA或者编码绿色荧光蛋白(GFP)的RNA。并且，所述RNA不是小鼠胸腺总RNA。在一些实施方式中，所述免疫原引起的免疫应答对抗以下这些细菌中的一种:脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis):可用免疫原包括但不限于,膜蛋白如粘附素、自身转运蛋白、毒素、获铁蛋白和因子H结合蛋白。参考文献15中公开了三种可用多肽的组合。
肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae):参考文献16中公开了可用的多肽免疫原。这些多肽免疫原包括但不限于RrgB菌毛亚基、β-N-乙酰基-己糖胺酶前体(spr0057)、spr0096、全身应激蛋白GSP-781 (spr2021，SP2216)、丝氨酸/苏氨酸激酶StkP(SP1732)和肺炎球菌表面粘附素PsaA。产脓链球菌(Streptococcus pyogenes):可用免疫原包括但不限于参考文献17和18中公开的多肽。粘膜炎莫拉菌(Moraxellacatarrhal is) 百日咳博德特菌(Bordetella pertussis):可用的百日咳免疫原包括但不限于百日咳毒素或类毒素(PT)、丝状血细胞凝集素(FHA)、百日咳杆菌粘附素、凝集原2和3。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus):可用的免疫原包括但不限于参考文献19中公开的多肽，例如溶血素、esxA、esxB、铁色素结合蛋白(sta006)和/或staOll脂蛋白。破伤风梭菌(Clostridium tetani):典型的免疫原是破伤风类毒素。白喉杆菌(Cornynebacterium diphtheriae):典型的免疫原是白喉类毒素。流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae):可用免疫原包括但不限于参考文献20和21中公开的多肽。铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)无乳链球 菌(Streptococcus agalactiae):可用免疫原包括但不限于参考文献17中公开的多肽。沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis):可用免疫原包括但不限于PepA、LcrE、ArtJ、DnaK, CT398、OmpH 样蛋白(OmpH-1ike)、L7/L12、OmcA, AtoS、CT547、Eno, HtrA 和MurG(例如，如参考文献22中公开的多肽)。LcrE[23]和HtrA[24]是两种优选的免疫原。肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae):可用的免疫原包括但不限于参考文献25中公开的多肽。幽门螺杆菌(Helicobacter pylori):可用的免疫原包括但不限于CagA、VacA、NAP、和/或尿素酶[26]。大肠杆菌(Escherichia coli):可用的免疫原包括但不限于源自以下大肠杆菌的免疫原:肠产毒性大肠杆菌(ETEC)、肠聚集性大肠杆菌(EAggEC)、弥散粘附性大肠杆菌(DAEC)、肠致病性大肠杆菌(EPEC)、肠外致病性大肠杆菌(ExPEC)和/或肠出血性大肠杆菌(EHEC)。ExPEC菌株包括尿致病性大肠杆菌(UPEC)和脑膜炎/脓毒症相关的大肠杆菌(MNEC)。参考文献27和28公开了可用的UPEC多肽免疫原。参考文献29中公开了所用的MNEC免疫原。一种可用于若干大肠杆菌类型的免疫原是AcfD [30].
炭疽杆菌(Bacillusanthracis)鼠疫杆菌(Yersinia pestis):可用的免疫原包括但不限于参考文献31和32中公开的那些免疫原。表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermis):产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)或肉毒杆菌(Clostridiumbotulinums)嗜肺军团菌(Legionellapneumophila)
贝氏柯克斯体(Coxiellaburnetti)布鲁氏菌(Brucella)，例如，牛型布鲁氏菌(B.abortus)、犬型布鲁氏菌(B.canis)、羊型布鲁氏菌(B.melitensis)、沙林鼠型布鲁氏菌(B.neotomae)、绵羊型布鲁氏菌(B.0vis)、猪型布鲁氏菌(B.suis)、鳍脚类布鲁氏菌(B.pinnipediae).
弗朗西斯氏菌(Francisella)，例如新杀手弗朗西斯氏菌(F.novicida)、蜃楼弗朗西斯氏菌(F.philomiragia)、土拉热弗朗西斯氏菌(F.tularensis)。淋病奈瑟球菌(Neisseriagonorrhoeae)梅毒螺旋菌(Treponemapallidum)杜克氏嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)类肠球菌(Enterococcusfaecalis)或屎肠球菌(Enterococcus faecium)腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)
小肠结肠炎耶尔森菌(Yersiniaenterocolitica)结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)立克次体(Rickettsia)单核细胞增生利斯特菌(Listeria monocytogenes)霍乱弧菌(Vibriocholerae)伤寒沙门菌(Salmonellatyphi)包柔氏螺旋体菌(Borreliaburgdorferi)牙銀P卜啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis)克雷伯氏菌(Klebsiella)在一些实施方式中，所述免疫原引起的免疫应答对抗以下这些病毒中的一种:正粘病毒(Orthomyxovirus):可用免疫原可来自甲型、乙型或丙型流感病毒，例如血细胞凝集素、神经氨酸苷酶或基质M2蛋白。当所述免疫原是甲型流感病毒血细胞凝集素时，其可来自任何亚型，例如111、!12、!13、!14、!15、!16、!17、!18、!19、!110、!111、!112、!113、!114、H15 或 H16。副粘病毒科(Paramyxoviridae)病毒:病毒免疫原包括但不限于衍生自以下病毒的那些免疫原:肺炎病毒(例如，呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus, RSV)、腮腺炎病毒属(例如，腮腺炎病毒)、副粘病毒(例如，副流感病毒)、肺炎后病毒和麻疹病毒(例如，麻疹)。痘病毒(Poxviridae):病毒免疫原包括但不限于衍生自正痘病毒(Orthopoxvirus)如天花(Variola vera)的免疫原，包括但不限于重型天花(Variolamajor)和轻型天花(Variola minor)。小核糖核酸病毒(Picornavirus):病毒免疫原包括但不限于衍生自以下病毒的那些免疫原:小核糖核酸病毒，如肠道病毒、鼻病毒、嗜肝RNA病毒、心脏病毒和口蹄疫病毒的那些免疫原。在一个实施方式中，所述肠道病毒是脊髓灰质炎病毒，例如I型、2型和/或3型脊髓灰质炎病毒。在另一个实施方式中，所述肠道病毒是EV71肠道病毒。在另一个实施方式中，所述肠道病毒是A型或B型柯萨奇(coxsackie)病毒。布尼亚病毒(Bunyavirus):病毒免疫原包括但不限于衍生自以下病毒的那些免疫原:正布尼亚病毒(Orthobunyavirus)如加利福尼亚脑炎病毒、白蛉病毒(Phlebovirus)如裂谷热病毒或内罗病毒(Nairovirus)如克里米亚-刚果出血热病毒。嗜肝RNA病毒(Heparnavirus):病毒免疫原包括但不限于衍生自嗜肝RNA病毒如甲型肝炎病毒(HAV)的免疫原。线状病毒(Filovirus):病毒免疫原包括但不限于衍生自以下病毒的那些免疫原:线状病毒，例如埃博拉病毒属(Ebola virus)(包括扎伊尔(Zaire)埃博拉病毒、象牙海岸(Ivory Coast)埃博拉病毒、雷斯顿(Reston)或苏丹(Sudan)埃博拉病毒)或者马尔堡病毒(Marburg virus)。披膜病毒(Togavirus):病毒免疫原包括但不限于衍生自以下病毒的那些免疫原:披膜病毒(Togavirus),如风疫病毒(Rubivirus)、α病毒(Alphavirus)或动脉炎病毒属(Arterivirus)。该病毒包括风疫病毒(rubella virus)。黄病毒(Flavivirus):病毒免疫原包括但不限于衍生自以下病毒的那些免疫原:黄病毒，如蜱传脑炎(TBE)病毒、登革热(1、2、3或4型)病毒、黄热病毒、日本脑炎病毒、开萨诺森林病毒、西尼罗河脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、俄国春夏脑炎病毒、波瓦生脑炎病毒。瘟病毒(Pestivirus):病毒免疫原包括但不限于衍生自瘟病毒，如牛病毒性腹泻(BVDV)、经典猪瘟(CSFV)或边界病(BDV)的那些免疫原。嗜肝DNA病毒(Hepadnavirus):病毒免疫原包括但不限于衍生自嗜肝DNA病毒如乙型肝炎病毒的那些免疫原。组合物可包括乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)。其它肝炎病毒:组合物可包括衍生自丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒或庚型肝炎病毒的免疫原。杆状病毒(R habdovirus):病毒免疫原包括但不限于衍生自杆状病毒如狂犬病病毒属(例如狂犬病毒)和水泡病毒(VSV)的那些免疫原。杯状病毒(Caliciviridae):病毒免疫原包括但不限于衍生自杯状病毒,如诺沃克病毒(Norwalk virus)(诺如病毒(Norovirus))和诺沃克样病毒，如夏威夷病毒(HawaiiVirus)和雪山病毒(Snow Mountain Virus)的那些免疫原。冠状病毒(Coronavirus):病毒免疫原包括但不限于衍生自SARS冠状病毒、禽传染性支气管炎(IBV)、小鼠肝炎病毒(MHV)和猪传染性肠胃炎病毒(TGEV)的那些免疫原。所述冠状病毒免疫原可以是刺突多肽。逆转录病毒(Retrovirus):病毒免疫原包括但不限于衍生自肿瘤病毒(Oncovirus)、慢病毒(Lentivirus)(例如 HIV-1 或 HIV-2)或者泡沫病毒(Spumavirus)的那些免疫原。呼肠病毒(Reovirus):病毒免疫原包括但不限于衍生自正呼肠孤病毒属(Orthoreovirus)、轮状病毒(rotavirus)、环状病毒(Orbivirus)、或科罗拉多壁風热病毒(Coltivirus)的那些免疫原。细小病毒(Parvovirus):病毒免疫原包括但不限于衍生自细小病毒B19的那些免疫原。疱疫病毒(Herpesvirus):病毒免疫原包括但不限于衍生自以下病毒的那些免疫原:人疱疹病毒，如(仅为示例)单纯疱疹病毒(HSV)(例如HSVl型和2型)、水痘-带状疱疹病毒(VZV)、艾伯斯坦-巴尔病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)、人疱疹病毒6 (HHV6)、人疱疹病毒7 (HHV7)和人疱疹病毒8 (HHV8)。乳头状多瘤空泡病毒(Papovaviruses):病毒免疫原包括但不限于衍生自乳头状瘤病毒(Papillomaviruses)和多瘤病毒(Polyomaviruses)的那些免疫原。人乳头状瘤病毒可以是血清型 1、2、4、5、6、8、11、13、16、18、31、33、35、39、41、42、47、51、57、58、63 或 65，例如来自血清型6、11、16和/或18中的一种或多种。腺病毒(Adenovirus):病毒免疫原包括衍生自腺病毒血清型36 (Ad_36)的那些免疫原。在一些实施方式中，所述免疫原引起的免疫应答对抗感染鱼的病毒，例如:传染性鲑鱼贫血病毒(ISAV)、鲑鱼胰腺病病毒(SPDV)、传染性胰脏坏死病毒(IPNV)、水道猫鱼病毒(CCV)、鱼类淋巴囊肿病病毒(FLDV)、传染性造血组织坏死病毒(IHNV)、锦鲤疱疹病毒、鲑鱼小核糖核酸样病毒(也称作大西洋鲑鱼的小核糖核酸样病毒)、陆封鲑病毒(landlocked salmon virus，LSV)、大西洋娃鱼轮状病毒(ASR)、蹲鱼草毒病病毒(TSD)、银鲑鱼肿瘤病毒(CSTV)或病毒性出血性败血症病毒(VHSV)。真菌免疫原可衍生自皮肤真菌(Dermatophytres)，包括:絮状表皮癣菌(Epidermophyton f 1ccusum)、奥杜安氏小抱子菌(Microsporum audouini)、犬小抱子菌(Microsporum canis)、扭曲小抱子菌(Microsporum distortum)、马类小抱子菌(Microsporum equinum)、石膏样小抱子菌(Microsporum gypsum)、矮小小抱子菌(Microsporum nan um)、同心性毛癣菌(Trichophyton concentricum)、马发癣菌(Trichophyton equinum)、鸡毛癣菌(Trichophyton gallinae)、石膏状毛癣菌(Trichophyton gypseum)、麦格氏毛癣菌(Trichophyton megnini)、须癣毛癣菌(Trichophyton mentagrophytes)、昆克努发癣菌(Trichophyton quinckeanum)、红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)、许兰毛癣菌(Trichophyton schoenleini)、断发毛癣菌(Trichophyton tonsurans)、抚状毛癣菌(Trichophyton verrucosum)、抚状毛癣菌的白变种(var.album)、盘状变种(var.discoides)、赫色变种(var.0chraceum)、紫色毛癣菌(Trichophyton violaceum)和 / 或蜜块状发癣菌(Trichophyton faviforme);或者衍生自烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、黄曲霉(Aspergillus flavus)、黑曲霉(Aspergillusniger)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、土曲霉(Aspergillus terreus)、聚多曲霉(Aspergillus sydowi)、黄曲霉(Aspergillus flavatus)、灰绿曲霉(Aspergillusglaucus)、头状芽裂殖菌(Blastoschizomyces capitatus)、白假丝酵母(Candidaalbicans)、烯醇酶假丝酵母(Candida enolase)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、光滑假丝酵母(Candida glabrata)、克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)、类星形假丝酵母(Candida stellatoidea)、克鲁斯假丝酵母(Candida kusei)、帕拉克斯假丝酵母(Candida parakwsei)、葡萄牙假丝酵母(Candidalusitaniae)、伪热带假丝酵母(Candida pseudotropicalis)、季也蒙假丝酵母(Candidaguilliermondi)、卡氏枝抱霉(Cladosporium carrionii)、粗球抱子菌(Coccidioidesimmitis)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatidis)、新型隐球菌(Cryptococcusneoformans)、棒地霉(Geotrichum cIavatum)Λ 荚膜组织胞衆菌(Histoplasmacapsulatum)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、微抱子虫(Microsporidia)、脑炎微孢子虫属(Encephalitozoon spp)、表层角结膜炎微孢子虫(Septata intestinalis)和肠微孢子虫(Enterocytozoon bieneusi);较不常见的是:短粒虫属(Brachiola spp.)、微抱子虫属(Microsporidium spp.)、抱子虫属(Nosema spp.)、皮里虫属(Pleistophoraspp)、气管普抱虫属(Trachipleistophora spp.)、条抱虫属(Vittaforma spp.)、巴西芽生菌(Paracoccidioides brasiliensis)、卡氏月市抱子虫(Pneumocystis carinii)、苜猜腐酶(Pythiumn insidiosum)、卵状糖疫癣菌(Pityrosporum ovale)、酿酒酵母(Sacharomycescerevisae)、布拉酵母(Saccharomyces boulardii)、粟酒酵母(Saccharomyces pombe)、尖端赛多抱子菌(Scedosporium apiosperum)、申克抱子丝菌(Sporothrix schenckii)、白吉利丝孢酵母(Trichosporon beigelii)、弓形虫(Toxoplasma gondii)、马尔尼菲青霉菌(Penicillium marneffei)、马拉色菌(Malassezia spp.)、着色真菌属(Fonsecaea spp.)、王氏霉菌属(Wangiella spp.)、孢子丝菌属(Sporothrix spp.)、娃粪霉属(Basidiobolusspp.)、耳霉属(Conidiobolus spp.)、根霉属(Rhizopus spp.)、毛霉属(Mucor spp.)、犁头霉属(Absidia spp.)、被抱霉属(Mortierella spp.)、小克银汉霉属(Cunninghamellaspp.)、瓶霉属(Saksenaea spp.)、链格抱菌属(Alternaria spp.)、弯抱菌属(Curvulariaspp.)、长螺孢菌属(Helminthosporium spp.)、镰胞菌属(Fusarium spp.)、曲霉属(Aspergillus spp.)、青霉属(Penicillium spp.)、链核霉菌属(Monolinia spp.)、丝核菌属(Rhizoctonia spp.)、拟青霉属(Paecilomyces spp.)、皮司霉属(Pithomyces spp.)和枝抱霉属(Cladosporium spp.)。在一些实施方式中，所述免疫原引起的免疫应答对抗来自疟原虫(Plasmodium)属的寄生虫，例如恶性症原虫(P.falciparum)、间日症原虫(P.vivax)、三日症原虫(P.malariae)或卵形疟原虫(P.0vale)。因此，本发明可用于免疫对抗疟疾。在一些实施方式中，所述免疫原引起的免疫应答对抗源自鱼虱科(Caligidae)家族的寄生虫，尤其是那些源自疮痂鱼虱属(Lepeophtheiiois)和鱼虱属(Caligus)例如海虱如鲑疮痂鱼虱(Lepeophtheirus salmonis)或智利鱼風(Caligus rogercresseyi)的寄生虫。在一些实施方式中，所述免疫原引起的免疫应答对抗以下过敏原:花粉过敏原(树、草本和青草花粉过敏原)、昆虫或蜘蛛类动物过敏原(吸入式、唾液和毒液过敏原，例如螨虫过敏原、蟑螂和蠓过敏原、膜翅类毒液过敏原)、动物毛发和皮屑过敏原(来自例如狗、猫、马、大鼠、小鼠等)；以及食物过敏原(例如麦醇溶蛋白)。来自树、青草和草本植物的重要花粉过敏原，例如源于分类学的以下目:壳斗目(Fagales)、木樨目(Oleales)Iiv桕目(Pinales)以及悬铃木科(platanaceae)，包括但不限于桦木(桦属(Betula))、赤杨(棺木属(Alnus))、榛木(榛属(Corylus))、鹅耳枥木(鹅耳枥属(Carpinus))和橄榄(齐墩果属(Olea))、雪松(柳杉属(Cryptomeria)和桧属(Juniperus))、悬铃木(悬铃木属(Platanus))，禾本目包括以下属的青草:黑麦草属(Lolium)、猫尾草属(Phleum)、早熟禾(Poa)、狗牙根属(Cynodon)、鸭茅属(Dactylis)、域毛草属(Holcus)、藹草属(Phalaris)、黑麦属(Secale)和蜀黍属(Sorghum)，菊目(Asterales)和荨麻目(Urticales)包括以下属的非禾本草本植物:豚草属(Ambrosia)、艾属(Artemisia)和墙草属(Parietaria)。其它重要的吸入式过敏原是来自以下这些过敏原:表皮螨属(Dermatophagoides)和嗜霉螨属(Euroglyphus)的屋尘螨、储粮尘螨例如害嗜鳞螨(Lepidoglyphus)、食甜螨属(Glycyphagus)和食酪螨属(Tyrophagus)，来自蟑螂、蠓和跳蚤例如小蠊属(Blatella)、大爐属(Periplaneta)、摇蚊属(Chironomus)和柿头圣属(Ctenocephalides)，来自哺乳动物比如猫、狗和马，毒液过敏原包括例如源自螫或咬型的昆虫，比如来自分类学的膜翅目的那些昆虫，包括蜜蜂(蜜蜂科，Apidae)、黄蜂(胡蜂科，Vespidea)和蚂蚁(蚁科，Formicidae)。在一些实施方式中，所述免疫原是肿瘤抗原，选自:(a)癌症-睾丸抗原，如NY-ESO-1、SSX2、SCPl 以及 RAGE、BAGE、GAGE 和 MAGE 家族多肽，如 GAGE-1、GAGE_2、MAGE_1、MAGE-2, MAGE-3, MAGE-4, MAGE-5、MAGE-6和MAGE-12 (例如，可用于针对黑色素瘤、肺肿瘤、头颈部肿瘤、NSCLC瘤、乳腺肿瘤、胃肠道肿瘤和膀胱肿瘤)；(b)突变的抗原，例如p53(与各种实体瘤如结直肠癌、肺癌、头颈部癌有关)、p21/Ras (与例如黑色素瘤、胰腺癌和结直肠癌有关)、CDK4 (与例如黑色素瘤有关)、MUM1 (与例如黑色素瘤有关)、半胱天冬酶-8 (与例如头颈部癌有关)、CIA0205(与例如膀胱癌有关)、HLA-A2-R1701、β联蛋白(与例如黑色素瘤有关)、TCR(与例如T-细胞非霍奇金淋巴瘤有关)、BCR-abl (与例如慢性髓细胞性白血病有关)、磷酸丙糖异构酶、KIA0205、⑶C-27和LDLR-FUT ； (c)过表达的抗原，例如半乳糖凝集素4 (与例如结直肠癌有关)、半乳糖凝集素9 (与例如霍奇金病有关)、蛋白酶3 (与例如慢性髓细胞性白血病有关)、WT1 (与例如各种白血病有关)、碳酸酐酶(与例如肾癌有关)、醛缩酶A (与例如肺癌有关)、PRAME (与例如黑色素瘤有关)、HER-2/neu (与例如乳腺癌、结肠癌、肺癌和卵巢癌有关)、乳腺球蛋白、甲胎蛋白(与例如肝细胞癌有关)、KSA(与例如结直肠癌有关)、胃泌素(与例如胰腺癌和胃癌有关)、端粒酶催化蛋白、MUC-1 (与例如乳腺癌和卵巢癌有关)、G-250 (与例如肾细胞癌有关)、p53 (与例如乳腺癌和结肠癌有关)和癌胚抗原(与例如乳腺癌、肺癌和胃肠道癌如结直肠癌有关)；(d)共有的抗原，例如黑色素瘤-黑素细胞分化抗原如MART-l/Melan A、gplOO、MClR、黑素细胞-刺激激素受体、酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白-1/TRP1和酪氨酸酶相关蛋白_2/TRP2(与例如黑色素瘤有关)；(e)前列腺相关抗原，如PAP、PSA、PSMA, PSH-PU PSM-PU PSM-P2,与例如前列腺癌有关；(f)免疫球蛋白独特型(与例如骨髓瘤和B细胞淋巴瘤有关)。在某些实施方式中，肿瘤抗原包括但不限于巾15、!10111/]1-40、!1-1^8 424- 虬、!14-1 1\16!1-161(、]^1^-狀1 、艾伯斯坦-巴尔病毒抗原、EBNA、人乳头瘤病毒(HPV)抗原，包括E6和E7、乙肝和丙肝病毒抗原、人T细胞嗜淋巴病毒抗原、15-1801856218(-3、。1^111111-23!11、1六6-72-4、0六19-9、0六72-4、CAMl7.UNuMa, K_ras、pl6、TAGE, PSCA, CT7、43_9F、5T4、791Tgp72、β -HCG, BCA225、BTAA,CA125、CA 15-3 (CA27.29\BCAA)、CA195、CA242、CA-50、CAM43、CD68\KP1、C0-029、FGF-5、Ga733 (EpCAM)、HTgp-175、M344、MA-50、MG7_Ag、M0V18、NB/70K、NY-CO-1、RCASl、SDCCAG16、TA-90 (Mac-2结合蛋白\亲环蛋白C相关蛋白)、TAAL6、TAG72、TLP、TPS及类似物。药物组合物本发明的脂质体可用作药物组合物中的组分来免疫对象对抗各种疾病。除脂质体之外，这些组合物通常还包括药学上可接受的载体。药学上可接受的载体的全面讨论参见参考文献33。本发明的药物组合物可包括一种或多种小分子免疫增强剂。例如，所述组合物可包括TLR2激动剂(例如Pam3CSK4)、TLR4激动剂(例如氨烷基氨基葡糖苷磷酸，如E6020)、TLR7激动剂(例如咪喹莫特(imiquimod))、TLR8激动剂(例如瑞喹莫德(resiquimod))和/或TLR9激动剂(例如IC31)。任何所述的激动剂理想上具有<2000Da的分子量。包封RNA时,在一些实施方式中，所述激动剂也与RNA —同包封,但在其它实施方式中，不包封所述激动剂。RNA被颗粒吸附时，在一些实施方式中，所述激动剂也与RNA —同被吸附，但在其它实施方式中，不吸附所述激动剂。本发明的药物组合物可包括处于普通水(例如w.f.1)或缓冲液中的脂质体，所述缓冲液为例如:磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、硼酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液或柠檬酸盐缓冲液。缓冲盐浓度一般在5 20mM范围内。本发明的药物组合物的pH可在5.0和9.5之间，如在6.0和8.0之间。本发明的组合物可含有钠盐(如氯化钠)以产生张力。NaCl的浓度通常是IO 土 2mg/mL,例如约 9mg/mL。本发明的组合物可包含金属离子螯合剂。这些金属离子螯合剂可通过清除能加速磷酸二酯水解的离子来延长RNA的稳定性。因此，组合物可包含EDTA、EGTA、BAPTA、喷替酸等中的一种或多种。所述螯合剂的浓度通常在10 500 μ M之间，例如0.1mM。柠檬酸盐，例如柠檬酸钠，既可作为螯合剂，又提供有利的缓冲活性。本发明的药物组合物的重量摩尔渗透压浓度可在200m0sm/kg和400m0sm/kg之间，如在240 360m0sm/kg之间或在290 310m0sm/kg之间。本发明的药物组合物可包含一种或多种防腐剂，例如硫柳汞或2-苯氧乙醇。优选不含汞的组合物，且可制备不含防腐剂的疫苗。本发明的药物组合物优选是无菌的组合物。本发明的药物组合物优选无热源，如含有〈1EU (内毒素单位，标准量度)/剂量，并优选〈0.1EU/剂量。`本发明的药物组合物优选不含谷蛋白。本发明的药物组合物可以以单位剂量形式制备。在一些实施方式中，单位剂量的体积可在0.1 1.0mL之间，例如约0.5mL。可将所述组合物制备为溶液或悬浮液形式的注射剂。所述组合物可制备来用于肺部给药，例如用细喷雾形式通过吸入器给药。所述组合物可以制备用于鼻部、耳部或眼部给药，例如以喷雾或滴剂形式给药。一般将可注射形式用于肌肉内给药。组合物包含免疫有效量的脂质体，以及任何其它所需的组分。本文中的术语“免疫有效量”是指在一次剂量或一系列剂量的一部分中给予个体的量对治疗或预防有效。该量的变化取决于如下因素:待治疗个体的健康和身体状况、年龄、待治疗个体的分类群(例如，非人的灵长动物、灵长动物等)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗配方、治疗医生对医学情况的评估和其它相关因素。预计所述量将落入可通过常规试验测定的相对较宽范围内。本发明的组合物的脂质体和RNA含量一般按每剂量RNA的量来表示。优选剂量具有彡100 μ g的RNA(例如10 100 μ g，如约10 μ g、25 μ g、50 μ g、75 μ g或100 μ g)，但可见表达的水平低很多，例如< ^/剂量、< IOOng/剂量、< IOng/剂量、(Ing/剂量等。本发明还提供一种递送装置(例如注射器、喷雾器、喷洒器、吸入器、透皮贴片等)，所述递送装置包含本发明的药物组合物。该装置可用于对脊椎动物对象给予所述的组合物。本发明的脂质体不包括核糖体。治疗及医学应用方法
对比参考文献14中公开的粒子，本发明的脂质体和药物组合物用于体内使用来引起对抗感兴趣的免疫原的免疫应答。
本发明提供了用于在脊椎动物内产生免疫应答的方法，所述方法包括给予有效量的本发明的脂质体或药物组合物的步骤。所述免疫应答优选为保护性的免疫应答，并优选涉及抗体和/或细胞介导的免疫。所述方法可产生加强应答。本发明还提供了本发明所述的脂质体或药物组合物，所述脂质体或药物组合物用于在脊椎动物体内产生免疫应答的方法中。本发明还提供了本发明的脂质体在制造用于在脊椎动物体内产生免疫应答的药物中的应用。通过利用这些应用和方法在脊椎动物体内产生免疫应答，可保护所述脊椎动物对抗各种疾病和/或感染，例如，对抗如上讨论的细菌和/或病毒性疾病。所述脂质体和组合物是免疫原性的，更优选为疫苗组合物。如本发明所述的疫苗可以是预防性(即，用来预防感染)或治疗性(即，用来治疗感染)疫苗，但一般是预防性疫苗。所述脊椎动物优选哺乳动物，如人或大型兽类哺乳动物(例如，马、牛、鹿、山羊、猪)。当预防性使用所述疫苗时，人优选是儿童(如幼童或婴儿)或青少年；当所述疫苗用于治疗用途时，人优选是青少年或成人。计划给予儿童的疫苗也可给予成年人，例如，用以评估其安全性、剂量、免疫原性等。按本发明所述制备的疫苗可用于治疗儿童和成年人。因此，人患者可小于I岁、小于5岁、I 5岁、5 15岁、15 55岁或至少55岁。接受疫苗的患者优选老年人(如≥50岁，≥60岁并优选≥65岁)、幼儿(如≤5岁)、住院病人、保健护理人员、武装人员和军人、孕妇、慢性病人或免疫缺陷病人。不过，所述疫苗不仅适用于这些人群，还可用于更广泛的群体。通常将本发明的组合物直接给予患者。可通过肠胃外注射实现直接递送(例如皮下注射、腹腔注射、静脉注射、肌内注射、皮内注射或注射入组织间隙；不同于参考文献1，本发明一般不使用舌内注射)。可选择的递送途径包括直肠、口服(例如片剂、喷雾)、口腔、舌下、阴道、局部、透皮或经皮、鼻内、眼部、耳部、肺部或其它黏膜给药方式。皮内和肌内给药是两种优选的途径。注射可以通过针头(例如皮下针头)进行，但也可以选择使用无针注射。肌内剂量一般为0.5mL。本发明可用于引起全身和/或黏膜免疫，优选引起增强的全身和/或黏膜免疫。可以通过单剂量方案或多剂量方案给药。多剂量可以用于初次免疫方案和/或加强免疫方案。在多剂量方案中，可通过相同或不同的途径如胃肠道外初始和黏膜加强，黏膜初始和胃肠道外加强等给予多剂量。一般间隔至少I周(例如约2周、约3周、约4周、约6周、约8周、约10周、约12周、约16周等)给予多剂量。在一个实施方式中，可在出生后约6周、10周和14周给予多剂量,例如按世界卫生组织的扩大免疫规划(Expanded Programon Immunisation, “EPI”)中常用的在6周龄、10周龄和14周龄时给药。在一个可选实施方式中，间隔约两个月(例如间隔约7、8或9周)给予两个主要剂量，然后在第二次主要剂量后约6个月 I年(例如在第二次主要剂量后约6、8、10或12个月)给予一个或多个加强剂量。在另一个实施方式中，间隔约两个月(例如间隔约7、8或9周)给予三个主要剂量，然后在第三次主要剂量后约6个月 I年(例如，在第三次主要剂量后约6、8、10或12个月)给予一个或多个加强剂量。概述除非另有说明，本发明的实施将采用化学、生物化学、分子生物学、免疫学和药理学的常规方法，这些常规方法在本领域技术范围内。这些技术在文献中已有充分描述。参见例如，参考文献34 40等。本文中所用的术语“包含”涵盖“包括”以及“由…组成”，例如，“包含”X的组合物可以仅由X组成或可包括其它物质，例如X+Y。与数值X相关的 术语“约”是可选的并表示，例如，x±10%。本文所用术语“基本上”不排除“完全”，如“基本上不含” Y的组合物可完全不含Y。如有需要，“基本上”一词可以从本发明的定义中省略。提及电荷、阳离子、阴离子、两性离子等时都是指pH7情况下。TLR3是Toll样受体3。它是一种单次跨膜受体，其在先天免疫系统中起重要作用。已知的TLR3激动剂包括聚(1:C)。“TLR3”是编码该受体的基因的受认可HGNC名称，并且其专有 HGNC ID 是 HGNC:11849。人 TLR3 基因的 RefSeq 序列是 G1:2459625。TLR7是Toll样受体7。它是一种单次跨膜受体，其在先天免疫系统中起重要作用。已知的TLR7激动剂包括例如咪喹莫特。“TLR7”是编码该受体的基因的受认可HGNC名称，并且其专有HGNC ID是HGNC:15631。人TLR7基因的RefSeq序列是G1:67944638。TLR8是Toll样受体8。它是一种单次跨膜受体，其在先天免疫系统中起重要作用。已知的TLR8的激动剂包括例如瑞喹莫德(resiquimod)。“TLR8”是编码该受体的基因的受认可HGNC名称，并且其专有HGNC ID是HGNC: 15632。人TLR8基因的RefSeq序列是GI:20302165oRIG-1样受体(“RLR”)家族包括多种RNA解旋酶，其在先天免疫系统中起重要作用[41]。RLR-1 (也被称作RIG-1或维甲酸诱导基因I)在靠近其N-末端有两个半胱天冬酶(caspase)募集结构域。经认可的编码该RLR-1解旋酶的基因的HGNC名称是“DDX58”(针对DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp)盒多妝 58 (DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box polypeptide58)),并且其专有 HGNC ID 是 HGNC:19102。人 RLR-1 基因的 RefSeq 序列是 G1:77732514。RLR2 (也被称作MDA5或黑色素瘤分化相关基因5)在靠近其N-末端也具有两个半胱天冬酶(caspase)募集结构域。编码该RLR-2解旋酶的基因的受认可HGNC名称是“IFIHl” (针对由解旋酶C域 I 诱导的干扰素(interferon induced with helicase C domainl)),并且其专有 HGNCID 是 HGNC:18873。人 RLR-2 基因的 RefSeq 序列是 G1:27886567。RLR-3 (也被称作 LGP2或遗传学和生理学实验室蛋白2 (laboratory of genetics and physiology2))没有半胱天冬酶募集结构域。编码该RLR-3解旋酶的基因的受认可HGNC名称是“DHX58” (针对DEXH(Asp-Glu-X-His)盒多肽 58 (DEXH(Asp-Glu-X-His) box polyp印tide58))，并且其专有HGNC ID 是 HGNC:29517。人 RLR-3 基因的 RefSeq 序列是 G1: 149408121。PKR是双链RNA依赖性蛋白激酶。其在先天免疫系统中起重要作用。“EIF2AK2”(针对真核生物翻译起始因子 2-α 激酶2 (eukaryotic translation initiationfactor2-alpha kinase2))是编码该酶的基因的受认可HGNC名称，并且其专有HGNCID是HGNC:9437o 人 PKR 基因的 RefSeq 序列是 G1:208431825。
图1显示RNA染色凝胶。泳道表示如下:(I)标记物(markers)⑵裸复制子(3)RNA酶处理后的复制子(4)包封在脂质体内的复制子(5) RNA酶处理后的脂质体(6)经RNA酶处理后又经苯酚/氯仿提取的脂质体。图2是脂质体的电子显微照片。图 3 显示 DLinDMA、DLenDMA 和 DODMA 的结构。图4显示RNA染色凝胶。泳道表示如下:(I)标记物(markers)⑵裸复制子(3)包封在脂质体内的复制子(4)经RNA酶处理后又经苯酚/氯仿提取的脂质体。图5显示RNA递送后第1、3和6天的蛋白质表达，其中，RNA以病毒体包装的复制子形式递送(方形)、以裸露RNA形式递送(菱形)或在脂质体内递送(+=0.1 μ g，X=I μ g)。图6显示四种不同剂量的脂质体包封RNA递送后第1、3和6天的蛋白质表达。图7显示接受病毒体包装的复制子(VRP或VSRP)、I μ g裸露RNA和I μ g脂质体包封的RNA的动物体内抗F IgG滴度。图8显示接受VRP、I μ g裸露RNA和0.1g或I μ g脂质体包封的RNA的动物体内抗F IgG滴度。图9显示接受VRP、0.1g或I μ g脂质体包封的RNA的动物体内中和抗体滴度。图10显示复制子以裸露RNA (圆形)、脂质体包封的RNA (三角形和方形)或脂复合体(lipoplex)(倒三 角形)形式递送后的表达水平。图11显示复制子以裸露RNA (0.01 lyg)、脂质体包封的RNA (0.01 IOyg)或包装成病毒体(VRP，IO6感染单位或IU)形式递送后的F-特异性IgG滴度(第二剂量后2周)。图12显示复制子以裸露RNA(1 μ g)、脂质体包封的RNA (0.1或I μ g)或包装成病毒体(VRP，IO6IU)的形式递送后的F-特异性IgG滴度(圆形)和PRNT滴度(方形)。也显示了未处理(na'i ve)小鼠的滴度。实线表示几何平均数。图13显示在第二剂量后4周，用代表F蛋白内主要抗原表位的合成肽再刺激后的细胞内细胞因子的产量。I轴表示⑶8+⑶4-的细胞因子+百分比。图14显示小牛免疫后超过63天(图14A)和210天(图14B)的F-特异性IgG滴度(平均1gltl滴度土标准偏差)。在第63天时，三条线可由底至顶地被轻易区分:PBS阴性对照、脂质体递送的RNA以及所述“三角4”产物。图15显示相对于脂质体中所用脂质的pKa的第六天的SEAP表达(相对密度)图像。圆形表示含DSPC的脂质体的水平，方形表示不含DSPC的脂质体的水平，有时方形和圆形会重合，只剩下可见的方形用于表示给定的PKa。图16显不在编码F蛋白的复制子的第一剂量后两周的抗F滴度表达(相对于RVO1,100%)。以与图15中同样的方式绘制对应于pKa的滴度图像。星形表示RV02，其使用了 pKa高于其它脂质的阳离子脂质。三角形表示缺乏DSPC的脂质体的数据；圆形表示包含DSPC的脂质体的数据。图17显示复制子以脂质体递送后的总IgG滴度，其中从左向右所用脂质体为RV01、RV16、RV17、RV18或RV19。横线表示均值。每例中，较高的横线是2wp2 (即第二剂量后2周)，而较低的横线是2wpl。
图18显示13组小鼠体内的IgG滴度。每个圆形是一只小鼠个体，实线表示几何平均值。其中，点状水平线是本测试的检测限。所述13组从左至右为如下文所述的A M。图19显示pDC释放的(A) IL-6和(B) IFN a (pg/mL)。从左至右的4对条形是:对照；用RNA+D0TAP免疫；用RNA+脂质转染试剂(Lipofectamine)脂质体免疫；以及用脂质体内的RNA免疫。在每一对中，黑色条形是野生型小鼠，灰色条形是rsql突变体。
具体实施例方式RNA复制子下文使用了多种复制子。一般而言，这些复制子基于杂交α病毒基因组，其具有来自委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)的非结构蛋白，来自辛德毕斯病毒的包装信号以及来自辛德毕斯病毒或VEEV突变种的3’端UTR。该复制子长约IOkb，且具有聚腺苷酸尾。将编码α病毒复制子的质粒DNA (名为:pT7-mVEEV_FL.RSVF或A317、pT7-mVEEV-SEAP或A306、pSP6_VCR-GFP或A50)作为用于体外合成RNA的模板。所述复制子含有RNA复制所需的α病毒遗传元件，但缺失了编码颗粒组装所必需的基因产物的那些遗传元件；所述结构蛋白由所需的蛋白质(报告子(如SEAP或GFP)或者免疫原(如全长RSV F蛋白))所替换，这样所述复制子便无法诱导产生传染颗粒。所述α病毒cDNA上游的噬菌体(T7或SP6)启动子促进所述复制子RNA的体外合成，并且紧邻聚(A)尾下游的丁型肝炎病毒(HDV)核酶通过其自切割活性产生正确的3’末端。用合适的限制性内切核酸酶线性化所述HDV核酶下游的质粒DNA后，用T7或SP6曬菌体衍生的DNA依赖性RNA聚 合酶体外合成失控转录物(run-off transcript)。按照生产商(安碧公司(Ambion))提供的说明，在7.5mM(T7RNA聚合酶)或5mM(SP6RNA聚合酶)存在下，让各三磷酸核苷(ATP、CTP、GTP和UTP)在37° C转录2小时。转录后，用TURBO DNA酶(安碧公司(Ambion))消化模板DNA。用LiCl沉淀复制子RNA，并将其复溶于无核酸酶的水中。通过ScriptCap m7G加帽系统(埃皮森特生物技术公司(EpicentreBiotechnologies)),按照使用手册的描述,用牛痘加帽酶(VCE)对未加帽的RNA进行转录后加帽；以该方式加帽的复制子标有前缀“V”，例如，vA317是通过VCE加帽的A317复制子。用LiCl沉淀转录后加帽的RNA，并将其复溶于无核酸酶的水中。RNA样品的浓度通过检测OD260nm测定。体外转录物的完整性通过变性琼脂糖凝胶电泳证实。脂质体包封将RNA包封在按参考文献11和42制备的脂质体内。所述脂质体由10%DSPC (两性离子型)、40%DLinDMA(阳离子型)、48%胆固醇和2%连接PEG的DMG(2kDa PEG)组成。这些比例指的是占整个脂质体中的摩尔％。按参考文献6的方法合成DLinDMA(l，2_ 二亚油基氧基-N，N- 二甲基_3_氨基丙烷)。DSPC (1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱)购自基酶公司(Genzyme)。胆固醇获自西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)。连接PEG的DMG (1，2- 二肉豆蘧酰基_sn_丙三基-3-磷酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)，铵盐)、D0TAP(1，2-二油酰基-3-三甲基铵基丙烧，氯盐)和DC-chol (盐酸3 β - [N- (N’, N’ - 二甲氨基乙烧)-氨基甲酸基]胆固醇)，来自阿凡提极性脂公司(Avanti Polar Lipids)。简要来说，将脂质溶解于乙醇(2mL)中，将RNA复制子溶解于缓冲液(2mL，IOOmM柠檬酸钠，pH6)中，用2mL缓冲液混合这些物质，然后平衡I小时。用6mL缓冲液稀释所述混合物，然后过滤。所得产物包含脂质体，具有约95%的包封率。例如，在一个具体的方法中，在乙醇中配制新鲜的脂质储液。称量37mg DLinDMA、
11.8mg DSPC、27.8mg 胆固醇和 8.07mg PEG-DMG，并在 7.55mL 乙醇中溶解。在 37。C 温和摇动新鲜配制的脂质储液约15分钟以形成均质混合物。然后，将755μ L所述储液加入
1.245mL乙醇中形成2mL工作脂质储液。将这个量的脂质用于形成含有250 μ g RNA的脂质体。还以在IOOmM柠檬酸盐缓冲液(pH6)中约I μ g/ μ L的浓度由储液制备2mL RNA工作溶液。在使用三个20mL的玻璃瓶(有搅拌棒)前，用RNA酶去除液(分子生物产品公司(Molecular BioProducts))冲洗所述玻璃瓶，并用足量MilliQ水清洗，以去除瓶子的RNA酶污染。将所述玻璃瓶中的一个用于所述RNA工作溶液，其它的瓶用于收集所述脂质和RNA混合物(如后文所述)。在37° C加热所述工作脂质和RNA溶液lOmin，然后将其装入3cc鲁尔锁(Iuer-1ok)注射器。将2mL朽1檬酸盐缓冲液(pH6)装入另一个3cc注射器中。使用FEP管(氟化乙烯-丙烯；所有使用的FEP管都具有2mm的内直径和3mm的外直径)将装有RNA和所述脂质的注射器连接至T型混流器(ΡΕΕΚ 500 μ m ID连接，艺达思集团健康与科技事业部(Idex Health Science)) 0所述T型混流器的出口也装有FEP管。将装有柠檬酸盐缓冲液的第三个注射器连接至一段单独的FEP管。然后，用注射泵以7mL/min的流速驱动所有注射器。放置所述管的出口以使所述混合物收集到20mL玻璃瓶中(同时搅拌)。取出所述搅拌棒，使所述乙醇/水性溶液平衡至室温lh。将4mL所述混合物装入连有一段FEP管的5cc注射器，将等量的IOOmM柠檬酸盐缓冲液(pH6)装入另一个连有一段等长FEP管的5cc注射器。用注射泵以7m L/分钟的流速驱动所述两个注射器，并将最终的混合物收集到20mL玻璃瓶中(同时搅拌)。之后，使收集自第二混合步骤的混合物(脂质体)通过Mustang Q膜(结合并移除阴离子分子的阴离子交换支持物，获自波尔公司(PaliCorporation))。在该膜用于脂质体之前，先让4mLlM NaOH、4mLlM NaCl和IOmLlOOmM朽1樣酸盐缓冲液(PH6)依次通过该膜。将脂质体在37° C温育IOmin后通过所述膜。接着，将脂质体浓缩到2mL，使用切向流过滤(TFF)对10 15体积I XPBS透析，然后回收终产物。所述TFF系统和中空纤维过滤膜购自斯派实验室(Spectrum Labs)(多明格斯牧场(RanchoDominguez)),并按照生产商指南使用。使用具有IOOkD孔径截止值、8cm2表面积的聚砜中空纤维过滤膜。体外和体内实验所用的制剂用I XPBS稀释到所需的RNA浓度。图2显示通过这些方法制备的脂质体的示例性的电子显微照片。这些脂质体包含包封的编码全长RSV F抗原的RNA。一批脂质体的动态光散射显示其平均直径是141nm(根据密度)或78nm (根据数量)。RNA的包封百分比和RNA的浓度利用Quant-1T RiboGreen RNA试剂盒(英杰生命科技有限公司(InvitiOgen))按照生产商的说明来测定。利用所述试剂盒提供的核糖体RNA标准品生成标准曲线。在添加染料前，在I XTE缓冲液(来自试剂盒)中将所述脂质体稀释到IOX或IOOX。另外，在添加染料(来破坏脂质体并由此检测总RNA)前，在含有0.5%曲通X (Triton X)的I X TE缓冲液中将脂质体稀释到10X或100X。然后，添加等量的染料至各溶液，然后，将约180 μ L添加染料后的各溶液加入(设双重复)96孔组织培养板。在酶标仪上读取荧光(激发波长485nm，发射波长528nm)。所有脂质体制剂的体内给药剂量都基于RNA的包封量。
据显示包封于脂质体内保护了 RNA不被RNA酶消化。实验使用3.8mAU RNA酶A/微克RNA，在室温孵育30分钟。RNA酶用蛋白酶K在55° C灭活10分钟。然后添加1:1v/V的样品混合物比25:24:lv/v/v的苯酚:氯仿:异戊醇以从所述脂质提取所述RNA进入水相。涡旋震荡数秒钟混匀样品，然后将样品置于离心机上以12，000RPM离心15min。移出并使用所述水相(含有所述RNA)来分析所述RNA。在上样之前(每孔400ng RNA)，将所有样品和甲醛上样染料一起孵育，在65° C变性10分钟，并冷却至室温。使用安碧公司(Ambion)的Millennium标记物来估计RNA构建物的分子量。在90V跑胶。按照生产商指南，在水中使用0.1%SYBR金，通过在室温摇晃I小时对所述凝胶染色。图1显示在无包封情况下，RNA被RNA酶完全消化(第3泳道)。包封后无法检测到RNA (第4泳道)，即便这些脂质体经RNA酶处理也未见变化(第4泳道)。脂质体经RNA酶处理后又经苯酚提取，可见未被消化的RNA(第6泳道)。甚至在4° C经过I周后，仍然可见没有任何断裂的RNA(图4，箭头)。在4° C经过6周和一个冻融循环后，体内蛋白表达不变。因此，脂质体包封的RNA是稳定的。为评估所述RNA的体内表达，在所述复制子内编码了报告酶(分泌型碱性磷酸酶，SEAP)而不是免疫原。以1:4在IX磷杂-光(Phospha-Light)稀释缓冲液中稀释血清，在该稀释液中使用化学发光碱性磷酸盐底物来检测表达水平。在第O天，以0.1 μ g或I μ gRNA剂量对8 10周大的BALB/c小鼠(5只/组)进行肌内注射(50 μ L/腿)。不含所述脂质体的相同载体(溶于无RNA酶的1XPBS)也以Iyg给药。还测试了病毒体包装的复制子。本文所用的病毒体包装的复制子(称为“VRPs”)按参考文献43的方法获得，其中，所述α病毒复制子衍生自突变VEEV或者嵌合体，所述嵌合体衍生自VEEV基因组且经基因工程操作而含有辛德毕斯病毒3’端UTR和辛德毕斯病毒包装信号(PS)，通过共电穿孔使其与编码辛德毕斯病毒衣壳和糖蛋白基因的缺损型辅助RNA包装入BHK细胞。如图5所示，就I μ g剂量而言，包封使SEAP水平增加约l/21og，在第6天，0.1yg包封剂量的表达达到了 Iyg未包封剂量所见的水平。到第3天时，表达水平超过了那些使用VRP(SB)所达到的水平。因此，相比裸露RNA对照，配制在脂质体中的RNA的表达增力口，甚至在较低的剂量(IOX)也是如此。表达与VRP对照相比也更高，但表达动力学非常不同(参见图5)。相对于裸露RNA，由电穿孔递送所述RNA使得表达增加，但这些水平都低于由脂质体递送的RNA。为评估所述脂质体组显示的效果是仅仅归因于脂质体组分，还是与包封有联系，所述复制子以包封形式(用两种不同的纯化方法，0.1yg RNA)给药，或在脂质体形成后与其混合(非包封的“脂复合体”，0.1 μ g RNA)给药，或者以裸露RNA(1 μ g)给药。图10显示所述脂复合体显示了最低表达水平，显示包封对蛋白表达是必要的。使用脂质体递送的体内研究证实了这些发现。小鼠接受不同的组合:(i)编码全长RSV F蛋白的自复制RNA复制子(ii)编码GFP的自复制RNA复制子(iii)编码GFP的RNA复制子，其敲除nsP4以排除自复制(iv)全长RSV F蛋白。共有13组接受以下组合物:
权利要求
1.一种具有包封水性核心的脂质双分子层的脂质体，其特征在于:(i)所述脂质双分子层包含PKa在5.0 7.6范围内的脂质；以及(ii)所述水性核心包括编码免疫原的RNA。
2.如权利要求1所述的脂质体，其特征在于，所述pKa在5.0 7.6范围内的脂质具有叔胺。
3.如前述权利要求中任一项所述的脂质体，其特征在于，所述在5.0 7.6范围内的pKa在5.7 5.9之间。
4.如权利要求1所述的脂质体，其特征在于，所述pKa在5.0 7.6范围内的脂质具有如本文中的式 RVOl、RV02、RV03、RV04、RV05、RV06、RV07、RV08、RV09、RVl1、RV12、RV16 或RV17所示。
5.如前述权利要求中任一项所述的脂质体，其直径在20 220nm范围内。
6.如前述权利要求中任一项所述的脂质体，其特征在于，所述RNA分子编码(i)能从所述RNA分子转录RNA的RNA依赖性RNA聚合酶，以及(ii)免疫原。
7.如权利要求5所述的脂质体，其特征在于，所述RNA分子有两个开放阅读框，所述开放阅读框中的第一个开放阅读框编码α病毒复制酶，而第二个开放阅读框编码所述免疫原。
8.如前述权利要求中任一项所述的脂质体，其特征在于，所述RNA分子的长度是9000 12000个核苷酸。
9.如前述权利要求中任一项所述的脂质体，其特征在于，所述免疫原能引起体内免疫应答以对抗细菌、病毒、真菌或寄生虫。
10.如前述权利要求中任一项所述的脂质体，其特征在于，所述免疫原能引起体内免疫应答以对抗呼吸道合胞病毒糖蛋白F。
11.一种药物组合物，所述药物组合物包含如前述权利要求中任一项所述的脂质体。
12.一种用于在脊椎动物体内引起保护性免疫应答的方法，所述方法包括给予所述脊椎动物有效量的如权利要求1 10所述的脂质体或者如权利要求11所述的药物组合物的步骤。
13.一种用于制备包含RNA的脂质体的方法，所述方法包括脂质体形成过程中的如下步骤:(a)在低于脂质的pKa但闻于4.5的pH下混合RNA和所述脂质；然后(b)提闻pH,使其闻于所述脂质的pKa。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于:步骤(a)中所用的RNA在水性溶液中，以与所述脂质的有机溶液混合来获得混合物，然后稀释所述混合物以形成脂质体；以及在步骤(b)中，在脂质体形成后提高所述pH。
全文摘要
在脂质体内递送编码免疫原的RNA以用于免疫目的。所述脂质体包含pKa在5.0～7.6范围内的脂质，优选所述脂质具有叔胺。在生理pH下，这些脂质体的表面电荷基本呈中性，并且所述脂质体对免疫有效。
文档编号C12N15/86GK103153284SQ201180042459
公开日2013年6月12日 申请日期2011年7月6日 优先权日2010年7月6日
发明者A·吉尔 申请人:诺华有限公司
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