慢病毒载体的稳定生产的制作方法

xiaoxiao2020-6-24  5

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专利名称:慢病毒载体的稳定生产的制作方法
技术领域
本发明涉及用于基因治疗的慢病毒载体(LV)的生产。更具体地讲,本发明涉及稳定慢病毒包装细胞系以及使用杂合杆状-腺伴随病毒(baculo-Adeno associated virus(AAV))载体而制备包装细胞系的方法,用于慢病毒结构蛋白和调控蛋白的稳定整合。直量
自从2001年针对AIDS的首次LV I期临床试验之后,研究基于HIV的LV作为基因递送载体的38个1-1I期和2个I1-1II期试验已经经过当局的审查;它们中的3个仍然处于审查中。最大数量的试验包括单基因病,其中的一些具有高发病率,例如库利氏贫血(Cooley’ s anemia) β -重型地中海贫血(4个试验)。其次是癌症和感染性疾病,主要是HIV-1感染。通常,Ι/II期试验中招募的患者数量是有限的,但在III期中则不是。因此迫切需要第2代(基于LTR)和第3代(基于SIN) LV的稳定包装细胞系,以应付LV大规模生产的需要,大量用于未来有希望的III期试验。基于瞬时方案的LV生产在全局应用的安全性、成本和再现性的观点来看确实是不现实的。越来越多的证据显示,新近开发的用于基因治疗的病毒整合载体LV具有广泛应用性,可转导终末分化的或处于周期中的细胞,对维持长期转基因表达是理想的并且比先前畏惧的更安全。在过去20年里对莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV) Y-逆转录病毒载体(YRV)积累的经验指导了 LV递送系统的快速发展,其开发起源于克服逆转录病毒不能转导非分裂细胞(non divi ng cell)的需要。具体地讲,自失活(SIN)转移载体的产生使得在人类临床试验中大量使用LV的前景更可行[I],只要发展和优化同样有效的制备方法。然而,与通过若干人和鼠的市售包装细胞系就可制备的Y RV相反,不仅用于研究级、而且用于GMP级的目前的LV生产几乎都通过瞬时转染。该技术昂贵,难以标准化和规模化并且需要大量下游验证试验。此外,与稳定生产相比,在瞬时生产期间可能通过包装和转移载体构建体中的病毒序列间的重组而产生的复制型慢病毒(RCL)的风险,虽是少见的,但是可能性较高的事件。用于LV的与逆转录病毒等效的稳定包装细胞系的开发变得更缓慢和更困难,因为,与Y逆转录病毒相反,慢病毒蛋白例如env、蛋白酶和某些辅助蛋白的表达对于人细胞而言是有毒的。为了克服该问题,在包装细胞的很早期形式中存在的辅助基因,之后在最新一代中被去掉。第一代基于SIV和HIV的LV包装细胞系得自猴VeiO,或人COS、HeLa和HEK293的贴壁细胞[2-5],其经工程化具有携带极少关键性修饰的慢病毒基因组,例如除去了包装信号。事实上gpl20 env和大部分辅助基因都保留下来。所得LV滴度非常低[2-5],而且更重要的是这些载体的可能应用必定限制在⑶4+ T细胞,对于抗AIDS基因治疗方法而言。随后,gpl20 env被来源于疱疹性口炎病毒的糖蛋白(VSV-G)取代并且去掉了所有辅助基因,因为已经证明对于有效LV制备而言是可有可无的。为了避免对VSV-G也描述过的毒性,通过各种不同系统,例如Tet、脱皮素、Rev以及Tet和cumate的组合,有条件地诱导其表达[20]。同样,已经描述了经Tet以及强力霉素和cumate药物组合诱导的gag-pol基因的有条件的表达以降低克隆选择期间病毒蛋白酶的毒性效应[7]。在所有这些系统中,通过质粒DNA瞬时转染而整合gag-pol基因、rev基因和env基因,然后药物选择和细胞克隆。为了实现真实的稳定包装细胞系的一个关键性问题就是选择最好的病毒基因递送载体。大部分研究人员通过质粒DNA瞬时转染而整合gag-pol基因、rev基因和env基因,然后药物选择和细胞克隆[7-10]。已知该技术随时间推移而遭受基因沉默和基因损失[11],这二者均可危害包装克隆的长期稳定性。已经公开了替代的基因递送载体,尤其是在STAR [12]和在新近开发的GPRG-TL-20 [6]包装细胞系中,其中通过MLV-穿梭载体将gag基因、pol基因和rev基因整合到HEK293T细胞中。2拷贝重新编码的gag-pol基因稳定地整合在STAR中,而对于GPRG-TL-20则没有这类信息[6]。与转染env基因的STAR相反,在GPRG-TL-20中所有残留病毒基因都通过SIN-MLV而引入。存在若干系统,允许外源基因组稳定整合到宿主细胞中。Palombo等,1998 [13]公开了杂合杆状病毒-AAV载体,用于专门整合到宿主细胞中。这样的载体看来非常有效,如果它在同一杂合杆状病毒-AVV载体中包含r印基因的话。该文献中未提到本发明的构建体,更不必说提出使用这类系统用于LV生产了。在过去的大约20年里,进行了若干尝试以产生稳定的LV包装细胞系。尽管公开了不同技术,但目前在临床试验中都未使用这些包装细胞系,也没有上市。因此需要用于大规模生产LV的新系统,其是·产能有效并且是安全、成本效果划算和可重复的。发明概沭· 本发明涉及LV生产领域。若干基因治疗临床试验正在进行中,使用LV作为基因递送载体。在所有这些试验中,LV的生产仍然基于瞬时方案。本发明提供了产生基于Hiv-1的包装细胞系的新策略。这样的策略是基于使用:杂合载体,其包含含有侧翼为AAV ITR的整合盒的杆状病毒骨架,即所谓baculo-AAV杂合系统;以及编码rep蛋白的质粒。该系统允许获得HIV-1结构蛋白gag/pol和rev的稳定整合。本发明的系统包括a) baculo-AAV杂合载体,其特征在于它含有2个表达盒,一个编码慢病毒gag基因和pol基因,另一个编码慢病毒rev基因和选择标记,和b)编码rep蛋白的质粒。所提出的系统代表递送HIV-1的结构蛋白和调控蛋白的一种新的有利方式,以便用这样的慢病毒蛋白稳定而有效地改造宿主细胞。使用该系统,获得仅包含HIV-1的结构蛋白和调控蛋白gag/pol和rev的第一中间体,用于作为起点,以得到各自包含调控蛋白(tat)和目标包膜蛋白或者仅包含包膜蛋白的第2代和第3代包装细胞系,以及也包含转移载体的生产用细胞系。第一中间体携带以三-顺反子构型表达Hiv-1 gag-pol基因和rev基因的2拷贝重组baculo-AAV包装构建体。这样的中间体被称为PK-7并在实施例中称为PK-7。已知是ITR-介导的AAV载体整合所必需的AAV rep78蛋白的瞬时表达促进了 baculo-AAV包装载体的基因组整合[14]。这样的第一中间体对于I年培养物而言显示出具有令人吃惊的遗传稳定性,证明在残留遗传元件的瞬时转染之后的功能性LV的连续生产。另外,在这类细胞中未观察到沉默现象。此外,通过非编码的基因间转录活性区中的2个串联整合的包装AAV载体的整合位点的精确作图,我们提供了针对可能的危险基因激活的安全性理由,所述危险基因的mRNA可结合到LV中并最终结合到宿主靶细胞中。
从第一中间体,可获得第2和第3代稳定包装细胞系。具体地讲,依照本发明,可通过将目标包膜蛋白例如MLV 4070 env、RD114 env或GALV env逆转录病毒或其衍生物稳定整合到第一中间体PK-7中而得到第3代包装细胞系。用SIN-LV递送可得到稳定整合,但也可用其它基因递送载体。我们得到相关的包装细胞系,在实施例中称为PK-7-RD,即通过整合嵌合包膜蛋白RD114-TR,其含有来源于猫科内源逆转录病毒包膜的胞外和跨膜结构域以及MLV 4070 env的胞质尾[15]。通过SIN-LV递送而得到RDl 14-TR嵌合包膜蛋白整

口 ο为了得到第2代和第3代生产用细胞系,通过序贯递送,分别整合SIN-Tat、SIN-Env和转移载体或仅SIN-Env和转移载体。在概念上,一次整合一个载体,尽管耗费时间,但降低了同源重组的风险并因此减少了 RCL形成。已开发的基于使用杂合baculo-AAV载体而用于慢病毒gag-pol和rev稳定表达的包装系统被称为“MolPack”,因此,第2代生产用细胞系是用该系统开发的,并含有RD114-TI^P tat分别作为包膜蛋白和调控蛋白,以及编码Chim3作为治疗基因的转移载体,所述细胞系在实施例中称为RD2-MolPack-Chim3。引人注意的是,来源于RD2-MolPack-Chim3克隆的LV滴度比产自HEK293T对照细胞的LV的滴度高出2-log,表明RD2-MolPack-Chim3产生的LV与经瞬时方案产生的等量LV相比更具功能性,通过稳定的生产用细胞系生产的更多优势是成本效果划算和更安全。发明叙述
依照本发明的第一方面,提供用于慢病毒结构蛋白和调控蛋白的稳定表达的系统,其由以下组成:
1.杂合载体,其包含含有侧翼为AAV ITR并包含2个表达盒的整合盒的杆状病毒骨架,其中第一表达盒编码慢病毒gag基因和pol基因,第二个编码慢病毒rev和选择标记,和
.含有处于启动子控制之下的AAV Rep可读框(ORF)的表达质粒。优选杂合载体的2个表达盒是尾-尾的方向并且每个由组成型启动子和多聚A驱动,优选所述启动子选自CMV、CMV IE、PGK、SV40、eFl α、SFFV和RSV,更优选所述启动子是CMV IE启动子。依照本发明的优选方面,所述选择标记选自潮霉素、卡那霉素、新霉素或zeomycin的抗性基因,更优选所述选择标记是潮霉素抗性基因。优选所述选择标记是克隆在内部核糖体进入位点(IRES)下游。优选所述AAV rep蛋白选自rep78或rep68。更优选rep蛋白是rep78。依照本发明另一方面,提供由稳定表达慢病毒gag、pol和rev的细胞组成的半稳定慢病毒包装细胞系,其特征在于这类细胞含有稳定整合到其基因组中的侧翼为AAV ITR并包含2个表达盒的至少一个拷贝的整合盒,其中第一表达盒编码慢病毒gag基因和pol基因,第二个编码慢病毒rev和选择标记。优选所述细胞是优选选自HEK293、HEK293-T、HEK293-SF、TE671、HT1080 或 HeLa的人细胞系,更优选所述细胞系是HEK293-T。优选所述2个表达盒是尾-尾的方向并且每个由组成型启动子和多聚A驱动;优选所述启动子选自CMV、CMV IE、PGK、SV40、eFl α、SFFV和RSV,更优选所述组成型启动子是CMV IE启动子。依照本发明的优选方面,所述选择标记选自潮霉素、卡那霉素、新霉素、zeomycin的抗性基因;优选所述选择标记是潮霉素抗性基因。更优选所述选择标记是克隆在IRES下游。优选所述AAV rep蛋白选自rep78或rep68。更优选rep蛋白是rep78。依照本发明的另一方面,提供得到稳定慢病毒包装细胞系的方法,其包括:
1.制备杂合载体(A),其包含含有侧翼为AAV ITR并包含2个表达盒的整合盒的杆状病毒骨架,其中第一表达盒编码慢病毒gag基因和pol基因,第二个编码慢病毒rev和选择标记,和
.制备表达质粒(B),其含有处于启动子控制之下的AAV rep 0RF,
ii1.用表达质粒B转染细胞并随后用杂合载体A感染该细胞,
iv.在抗生素存在下培养所述细胞,用于选择,
V.得到稳定表达gag蛋白、pol蛋白和rev蛋白的细胞,
v1.将env基因整合到这样的细胞中, vi1.培养所述细胞,以得到稳定表达gag蛋白、pol蛋白、rev蛋白和env蛋白的细胞
系O依照本发明的另一方面,提供得到稳定慢病毒包装细胞系的方法,其包括:
1.制备杂合载体(A),其包含含有侧翼为AAV ITR并包含2个表达盒的整合盒的杆状病毒骨架,其中第一表达盒编码慢病毒gag基因和pol基因,第二个编码慢病毒rev和选择标记,和
.制备表达质粒(B),其含有处于启动子控制之下的AAV rep 0RF,
ii1.用表达质粒B转染细胞并随后用杂合载体A感染该细胞,
iv.在抗生素存在下培养所述细胞,用于选择,
V.得到稳定表达gag蛋白、pol蛋白和rev蛋白的细胞,
v1.将慢病毒tat基因整合到这样的细胞中,
vi1.培养所述细胞,以得到稳定表达gag蛋白、pol蛋白、rev蛋白和tat蛋白的细胞,
vii1.将env基因整合到这样的细胞中,
ix.培养所述细胞,以得到稳定表达gag蛋白、pol蛋白、rev蛋白、tat蛋白和env蛋白的细胞系。优选所述杂合载体的2个表达盒是尾-尾的方向并且每个由组成型启动子和多聚A驱动,优选所述启动子选自CMV、CMV IE、PGK、SV40、eFl α、SFFV和RSV,更优选所述组成型启动子是CMV IE启动子。优选所述tat基因是HIV-1 tat。依照本发明的优选方面,所述选择标记选自潮霉素、卡那霉素、新霉素、zeomycin的抗性基因;优选所述选择标记是潮霉素抗性基因,更优选所述选择标记是克隆在IRES下游。优选使用AAV载体、逆转录病毒载体、稳定质粒整合或同源重组,将所述env基因整合到宿主细胞中。依照更优选的方面,使用SIN慢病毒载体,整合所述env基因。优选所述env基因选自MLV 4070 env、RDl 14 env、嵌合包膜蛋白RD114-TR、嵌合包膜蛋白RDl 14-pro、杆状病毒GP64 env或GALV env或其衍生物;更优选所述env基因是编码嵌合包膜蛋白RD114-TR的基因。在一个优选的实施方案中,提供包含表达盒的SIN慢病毒载体,所述表达盒含有从5’到3’端排列的CMV启动子、在其序列中含有RRE元件的β -球蛋白内含子和RD114-TR0RF,用于嵌合包膜蛋白RD114-TR的稳定整合。优选所述AAV rep蛋白选自rep78或rep68。更优选所述rep蛋白是rep78。依照本发明的另一方面,提供包含稳定整合到其基因组中的以下部分的稳定慢病毒包装细胞系:
1.侧翼为AAVITR并包含2个表达盒的至少一个拷贝的整合盒,其中第一表达盒编码慢病毒gag基因和pol基因,第二个编码慢病毒rev和选择标记,
i1.至少一个拷贝的env。

依照本发明的同一方面,上述稳定慢病毒包装细胞系还包含稳定整合到其基因组中的至少一个拷贝的HIV-1-tat基因。优选所述细胞是人细胞系,优选所述细胞系选自HEK293、HEK293-SF、HEK29 3-T、TE671、HT1080或HeLa,更优选所述细胞系是HEK293-T。优选整合盒的2个表达盒是尾-尾的方向并且每个由组成型启动子和多聚A驱动,优选所述启动子选自CMV、CMV IE、PGK、SV40、eFl α、SFFV和RSV,更优选所述组成型启动子是CMV IE启动子。依照本发明的优选方面,所述选择标记选自潮霉素、卡那霉素、新霉素、zeomycin的抗性基因;优选所述选择标记是潮霉素,更优选所述选择标记是克隆在IRES下游。优选使用AAV载体、逆转录病毒载体、稳定质粒整合或同源重组,将所述env基因整合到宿主细胞中。依照更优选的方面,使用SIN慢病毒载体来整合所述env基因。优选所述env基因选自MLV 4070 env、RDl 14 env、嵌合包膜蛋白RD114-TR、嵌合包膜蛋白RDl 14-pro、杆状病毒GP64 env或GALV env或其衍生物。更优选所述env基因是编码嵌合包膜蛋白RD114-TR的基因。依照另一方面,提供产生慢病毒载体的方法,其包括:
1.培养稳定慢病毒包装细胞系,其含有稳定整合到其基因组中的侧翼为AAV ITR并包含2个表达盒的至少一个拷贝的整合盒,其中第一表达盒编码慢病毒gag基因和pol基因,第二个编码慢病毒rev和选择标记;和至少一个拷贝的env, .在所述稳定包装细胞系中插入转移载体。优选所述2个表达盒是尾-尾的方向并且每个由组成型启动子和多聚A驱动;优选所述启动子选自CMV、CMV IE、PGK、SV40、eFl α、SFFV和RSV,更优选所述组成型启动子是CMV IE启动子。优选所述选择标记选自潮霉素、卡那霉素、新霉素、zeomycin的抗性基因;更优选所述选择标记是潮霉素抗性基因。更优选所述选择标记是克隆在IRES下游。优选所述env基因选自VSV-G env、MLV 4070 env、RDl 14 env、嵌合包膜蛋白RD114-TR、嵌合包膜蛋白RD114pro、杆状病毒GP64 env或GALV env或其衍生物,更优选所述env基因是编码RD114-TR的基因。依照本发明的另一方面,提供包含稳定整合到其基因组中的以下部分的生产用细胞系:
1.侧翼为AAVITR并包含2个表达盒的至少一个拷贝的整合盒,其中第一表达盒编码慢病毒gag基因和pol基因,第二个编码慢病毒rev和选择标记,
i1.至少一个拷贝的env基因,
ii1.转移载体。依照本发明的同一方面,上述生产用细胞系还含有稳定整合到其基因组中的慢病毒tat基因。优选所述细胞是优选选自HEK293、HEK293-T、HEK293-SF、TE671、HT1080 或 HeLa的人细胞系,更优选所述细胞系是HEK293-T。优选所述整合盒的2个表达盒是尾-尾的方向并且每个由组成型启动子和多聚A驱动,优选所述启动子选自CMV、CMV IE、PGK、SV40、eFl α、SFFV和RSV,优选所述组成型启动子是CMV IE启动子。依照本发明的优选方面,所述选择标记选自潮霉素、卡那霉素、新霉素、zeomycin的抗性基因;更优选所述选择标记是潮霉素,更优选所述选择标记是克隆在IRES下游。优选使用AAV载体、逆转录病毒载体、稳定质粒整合或同源重组,将所述env基因整合到宿主细胞中。依照更优选的方面,使用SIN慢病毒载体来整合所述env基因。优选所述env基因选自MLV 4070 env、RDl 14 env、嵌合包膜蛋白RD114-TR、嵌合包膜蛋白RDl 14-pro、杆状病毒GP64 env或GALV env或其衍生物,更优选所述env基因是编码嵌合包膜蛋白RD114-TR的基因。依照另一方面,提供生产慢病毒载体的方法,其包括培养含有稳定整合到其基因组中的以下部分的生产用细胞系:
1.侧翼为AAVITR并包含2个表达盒的至少一个拷贝的整合盒,其中第一表达盒编码慢病毒gag基因和pol基因,第二个编码慢病毒rev和选择标记;
i1.至少一个拷贝的env;
ii1.至少一个拷贝的编码目标基因的转移载体。优选所述2个表达盒是尾-尾的方向并且每个由组成型启动子和多聚A驱动;优选所述启动子选自CMV、CMV IE、PGK、SV40、eFl α、SFFV和RSV,更优选所述组成型启动子是CMV IE启动子。优选所述选择标记选自潮霉素、卡那霉素、新霉素、zeomycin的抗性基因;更优选所述选择标记是潮霉素抗性基因。更优选所述选择标记是克隆在IRES下游。优选所述env基因选自VSV-G env、MLV 4070 env、RDl 14 env、嵌合包膜蛋白RD114-TR、嵌合包膜蛋白RD114pro、杆状病毒GP64 env或GALV env或其衍生物,更优选所述env基因是编码RD114-TR的基因。发明详沭
将以非限制性实施例的方式描述本发明优选特征和实施方案的详细描述。除非另有说明,否则本领域普通技术人员可使用化学、分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术将本发明付诸实施。所有这些技术都是已发表的文献中公开的和解释过的。参见例如 J.Sambrook, E.F.Fritsct^PT.Maniatis, 1989, MolecularCloning: A Laboratory Manual,第二版,第 1-3 部,Cold Spring Harbor LaboratoryPress ;Ausubel, F.M.等(1995 和定期增刊;Current Protocols in Molecular Biology,第 9、13 和 16 章,John Wiley & Sons, New York, N.Y.) ;Current Protocols inImmunology,第 12章,John Wiley & Sons, New York, N.Y.) ;B.Roe, J.Crabtree和A.Kahn, 1996, DNA Isolation 和 Sequencing: Essential Techniques, John Wiley &Sons ;J.M.Polak 和 James 0’D.McGee, 1990, In Situ Hybridization: Principlesand Practice ;0xford University Press ;M.J.Gait (编著),1984, OligonucleotideSynthesis: A Practical Approach, IrI Press ;and, D.M.J.Lilley 和 J.E.Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis andPhysical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press。所有这些出版物都通过引用而结合。baculo-AAV 杂合系统.本发明提供用于产生基于HIV-1的包装细胞系的新策略。LV生产系统的优化是基于LV技术的基因治疗药物开发中需要解决的一个关键性问题。尽管越来越多的临床试验使用该技术,但是在这些试验中LV仍然是使用瞬时转染方案而产生的。按此方式,LV的生产仍然非常昂贵,不能令更多患者满意。为此,进行了大量努力以开发稳定包装细胞系,用于LV。在稳定慢病毒包装细胞系开发中的一个关键性问题就是选择正确的载体,用于改造宿主细胞。在很多情况下,用质粒来改造宿主细胞,但在这种情况下,还观察到基因组不稳定和基因沉默现象。在另外两种情况下,逆转录病毒载体用于稳定整合gag/pol基因和rev基因。迄今为止所开发的稳定包装细胞系都未用于临床试验。本发明的策略是基于使用稳定表达慢病毒的结构蛋白和调控蛋白的系统,所述系统由以下组成:杂合载体,其包含含有侧翼为AAV ITR并包含2个表达盒的整合盒的杆状病毒骨架,其中第一表达盒编码慢病毒gag基因和pol基因,第二个编码慢病毒rev和选择标记;以及含有处于启动子控制之下的AAV rep ORF的表达质粒。杆状病毒骨架的存在允许携带大而复杂的整合盒,所述整合盒包含编码若干不同蛋白的2个表达盒。所得baculo-AAV包装载体允许仅通过一次感染事件就用稳定而有效产生LV所需的gag蛋白、pol蛋白和rev蛋白来改造宿主细胞。

通过AAV rep蛋白的瞬时表达而获得baculo-AAV包装载体的基因组整合。该系统允许获得在非编码的基因间转录活性区中的AAV载体的整合,因此排除了危险基因的激活,所述危险基因的mRNA可结合到LV中并最终结合到宿主靶细胞中。所提出的系统代表用慢病毒结构蛋白和调控蛋白稳定而有效地改造宿主细胞的一种新的有利的递送HIV-1结构蛋白的方式。在一个优选的实施方案中,baculo-AAV包装构建体中包含的2个表达盒是尾-尾的方向并且每个由组成型启动子和多聚A驱动,优选所述启动子选自CMV、CMV IE、PGK、SV40、eFl α、SFFV和RSV,更优选所述启动子是CMV IE启动子。依照本发明的优选方面,AAV包装载体中包含的选择标记选自潮霉素、卡那霉素、新霉素、zeomycin的抗性基因;优选所述标记是潮霉素抗性基因,更优选所述选择标记是克隆在IRES下游。通过AAV Rep蛋白的瞬时表达而获得baculo-AAV包装载体的基因组整合,用于ITR-介导的AAV载体整合。在一个优选的实施方案中,r印蛋白选自r印78和r印68,更优选所述蛋白是rep78。
使用该系统,可获得经改造而稳定表达HIV-1蛋白gag/pol和rev的细胞,我们将这类细胞称为半稳定包装细胞系。具体地讲,本发明公开并要求保护这样的经改造的细胞,和它们在得到包含结构蛋白和调控蛋白以及目标包膜蛋白的第2代和第3代包装细胞系中的用途,以及还包含转移载体的生产用细胞系,以及产生稳定包装细胞系的方法。半稳定包装细胞系
本发明的半稳定包装细胞系由携带表达HIV-1 gag-pol基因和rev基因的至少一个拷贝的重组baculo-AAV包装构建体的宿主细胞组成。通过AAV rep蛋白的瞬时表达而得到baculo-AAV包装载体的基因组整合,以获得ITR-介导的AAV载体整合。优选所述2个表达盒是尾-尾的方向并且每个由组成型启动子和多聚A驱动,优选所述启动子选自CMV、CMVIE、PGK、SV40、eFl α、SFFV和RSV。更优选所述组成型启动子是CMV IE启动子。依照本发明的优选方面,所述选择标记选自潮霉素、卡那霉素、新霉素、zeomycin的抗性基因;优选所述选择标记是潮霉素抗性基因,更优选所述选择标记是克隆在IRES下游。优选所述AAV rep蛋白选自rep78和rep68。更优选rep蛋白是rep78。可经改造而得到半稳定包装细胞系的宿主细胞系是选自HEK293、HEK293-T、HEK293-SF、TE671、HT1080或HeLa的人细胞系,更优选所述细胞系是HEK293-T。这样的半稳定包装细胞系适合于利用半稳定生产系统中的不同env和不同转移载体来输出可能的多种LV。因此,它代表了更有效的慢病毒载体生产的极大优势,因为它允许降低成本,它无需使用编码gag-pol和rev的GMP级的质粒DNA,并且降低了瞬时转染期间质粒间重组事件所致的RCL形成的风险。本发明的半稳定包装细胞系对于I年培养物而言显示出具有令人吃惊的遗传稳定性,证明在残留遗传元件的瞬时转染之后的功能性LV的连续生产。另外,事实上未观察到沉默现象,用该中间体得到的慢病毒颗粒的滴度和感染性在I年之后仍然未受影响。在选择压力存在或不存在的情况下都证实了这样的数据。值得注意的是,对于AAV-1TR介导的盒的整合稳定性而言,文献中没有可用的类似数据。唯一相关的信息是感染了野生型AAV血清型2 (AVV-2)的人骨髓衍生的成纤维细胞样细胞系(Ruddle’s Detroit 6细胞)以潜伏状态保持病毒序列长达至少47和118代[16,17]。正如实施例中所示,本发明的半稳定包装细胞系存活至少102代。稳定包装细胞系
本发明提供得到稳定慢病毒包装细胞系的方法。这样的方法是基于使用baculo-AAV包装构建体,其用于含有2个表达盒的至少一个拷贝的整合盒的稳定整合,所述表达盒中的一个编码慢病毒gag基因和pol基因,第二个编码慢病毒rev和选择标记。通过rep蛋白的共表达而得到该盒的稳定整合,其允许在宿主细胞中的ITR介导的稳定整合。然后在抗生素存在下,培养经过如此改造的宿主细胞并克隆。所得的半稳定包装细胞系是产生第2代或第3代慢病毒包装细胞系的起点。具体地讲,通过进一步整合所需的env蛋白而得到第3代稳定包装细胞系。通过先整合HIV-1 Tat蛋白,再整合所需的包膜而得到第2代稳定包装细胞系。 可使用AAV载体、逆转录病毒载体、稳定质粒整合或同源重组,将包膜蛋白和HIV-1 tat稳定整合到宿主细胞中。优选使用HIV-SIN载体将包膜蛋白和HIV-1 tat整合到宿主细胞中。可使用若干种类的包膜蛋白,例如MLV 4070 env, RDl 14 env、嵌合包膜蛋白RD114-TR、嵌合包膜蛋白RD114-pro、杆状病毒GP64 env或GALV env或其衍生物。更优选所述env基因是编码嵌合包膜蛋白RD114-TR的基因。为了得到RD114-TR包膜蛋白的稳定整合,最先开发SIN构建体,其含有来源于PCMV-RD114-TR质粒的片段并携带处于CMV启动子控制之下的RD114-TR 0RF。该构建体不产生RD114-TR蛋白。在SIN-RDl 14-TR LV构建期间的一个意外发现是认识到β -球蛋白内含子必须必要地包含在CMV启动子和RDl 14-TR ORF之间。一般而言,在SIN-LV中包含的大部分细胞和病毒的基因表达盒都不含内含子元件,因为在载体SD和内含子SA间剪接并随之切除表达盒中含有的启动子的风险。为了避免这种隐患,产生了新的携带2个RRE元件的SIN-LV,一个在SD序列和SA序列间呈典型SIN-LV构型,一个在β -球蛋白内含子内。根据这些发现,表明为获得RD114-TR生产而出乎意料地需要β -球蛋白内含子,可能反映了在SIN-RD114-TR构建体中存在的RD114-TR ORF中或在包含来自RD114-TR终止密码子和3’SaMlI限制酶位点的区的328-bp片段中存在不稳定性或负序列(negativesequence)。通过GENEART AG (Regensburg, Germany)而进行的GeneOptimizer Assisted序列分析表明,具有差的密码子选择的密码子遍及整个RD114-TR基因和328-bp片段,为我们的设想给出了理由。此外,密码子优化分析表明,密码子适应指数(CAI)从0.65提高到0.98 (其中CAI为I是最佳)。因此,原则上说,使用基于MLV或基于HIV的SIN载体将RD114-TR整合到RD-MolPack中的一个替代的和更简单的方法可以是使用重新编码的RDlH-TR0因此制备并测试了含有密码子优化序列的构建体。相比之下,已经发现密码子优化允许甚至在缺乏球蛋白内含子的情况下RD114-TR前体蛋白(PR)的翻译,但是,出乎意料的是,高水平PR并未被弗林蛋白酶(furin)处理成预期的SU亚基和TM亚基。因此,已使用在构建体中在介于CMV启动子和RD114-TR ORF之间包含β-球蛋白内含子的基于HIV的SIN载体,将RDl 14-TR成功整合到包装细胞系中。在一个优选的实施方案中,提供包含表达盒的SIN-LV,所述表达盒含有从5’到3’端排列的CMV启动子、在其序列中含有RRE元件的β-球蛋白内含子和 RD114-TR 0RF。本发明提供生产LV的方法,其包括:
1.如上所述地培养稳定包装细胞系,
i1.在所述半稳定包装细胞系中插入转移载体。目前用于临床试验的LV生产仍然是基于所有所需蛋白的瞬时转染。相比之下,本发明的方法和包装细胞系允许稳定生产。具体地讲,本发明方法中所用的baculo-AAV杂合表达系统,有利地允许仅在一轮转染/感染和克隆中稳定和安全地引入HIV-1的结构蛋白(gag/pol)和调控蛋白(rev)。用这样的表达系统得到的中间体是稳定的,不显现出沉默现象并允许开发第2代和第3代包装细胞系,这些是开发用于LV生产的快速有效方案的非常重要的工具。本发明的稳定包装细胞系可用于成果效果划算和更安全的生产。事实上,完全不存在转染,允许降低成本并降低可能导致形成RCL的重组事件的可能性。此外,已经发现用本发明方法得到的稳定包装细胞系能够产生的LV的滴度至少与用瞬时方案所产生的LV的滴度类似或甚至更高。牛产用细胞系可通过如上所述地将编码目标基因(GOI)的转移载体稳定整合到稳定包装细胞系中,得到生产用细胞系。本发明还提供用于产生LV的方法,其包括培养这样的生产用细胞系。引人注意的是,产自第2代稳定包装细胞系(在实施例中称为RD2-MolPack_Chim3克隆)的LV的平均滴度和感染性比产自HEK293T对照细胞的LV的高出2_log,表明RD2-MolPack-Chim3产生的LV与经瞬时方案产生的等量LV相比更具功能性。令人感兴趣的是克隆RD2-MolPack-Chim3.14,其在悬液中自发生长并产生LV,该LV对SupTl细胞的滴度为 1.0 X 106TU/mlJ^CD34+HSCS0.5 X IO6 TU/mL.
附图描沭


图1.RD-MolPack的开发流程。(a)用于该研究的DNA质粒示意图。pPolh,多角体蛋白启动子;attBl,连接B1;ITR,反向末端重复序列;CMV,巨细胞病毒启动子;In,内含子;RRE,rev效应元件;A,多聚A序列;IRES,内部核糖体进入位点;SD,剪接供体;SA,剪接受体;Ψ,包装信号;WPRE,土拨鼠肝炎转录后调节元件;cPPT,中央聚嘌呤序列(central polypurine tract) ;hPGK,人磷酸甘油激酶启动子。(b) AAV-GPR载体的R印78-介导的基因组整合的图。AAV Rep78促进了侧翼为ITR的AAV-GPR盒的切除并有利于其整合到人染色体中。(c)第2代或第3代RD-MolPack稳定包装细胞系的开发策略流程图。图2.PK克隆的表征。(a) AAV-GPR载体整合的DNA印迹分析。为了确定盒的拷贝数和完整性,将来源于PK克隆的基因组DNA (10 yg)分别用2种不同限制酶和
消化。(b)从GPR盒产生的病毒蛋白的蛋白印迹分析。左图,将得自PK克隆的细胞提取物(50 μ g/道)与识别HIV-1蛋白的抗HIV-1人血清杂交。然后将膜与抗rev特异性Ab杂交。右图,与细胞提取物相同地对产自PK克隆的病毒样颗粒(VLP)的30 ng p24gag-等同物(equivalent)进行处理。(C)通过LM-PCR技术对GPR-盒整合进行示意性作图,该技术鉴定2号染色 体长臂2q32.1位置上的DNA断裂点。(d) AAV-GPR盒和人Hox4基因共定位到2号染色体中。进行PK-7中期染色体原位杂交,分别使用gag-特异性(红色)探针和Hox4-特异性(绿色)探针。(e)在PK-7克隆中的2个GPR整合盒的重排和它们的尾-头方向的示意图。图3.在PK-7-Tat克隆中Tat的表达。(a)对得自PK-7-Tat主体细胞(bulkcell)和5个衍生克隆的核提取物进行蛋白印迹分析(50 yg/道)。将膜与抗tat特异性Ab杂交,剥离(stripping)之后,再与抗YYl Ab杂交,其检测组成型核转录因子,YYl作为内部对照。(b)通过ELISA测量从所选克隆中生产的在每个细胞基础上表达的p24gag ο (c)对 RD2-MolPack-Chim3.14 基因组 DNA 进行针对 SIN-LV-Tat、SIN-LV-RDl 14-TR和LTR-LV-Chim3载体的完整性的DNA印迹分析。经TaqMan PCR计算的这3个载体的载体拷贝数在括号中标出。(d)在图例中所示的不同%的FCS中培养大约2个月的RD2-MolPack-Chim3.14细胞的细胞存活率图。图4.RD114-TR包膜表达的分析。(a)检测来自不同构建体的RD114-TR表达的蛋白印迹测定。用CMV-RDl 14-TR质粒瞬时转染(TF) PK-7细胞(道I),相应的全细胞提取物用作阳性对照。将 SIN-RDl 14-TR (道 2 和道 3)、pIRES-RD114-TR-WT 和 pIRES-RDl 14-TR-密码子优化(CO)(道4 和 5)、SIN-RD114-TR-1N (道 6 和道 7) SIN-RDl 14-TR-1N-RRE (道8和道 9)、SIN-RDl 14-WT-TR-1N-RRE 和 SIN-RDl 14-TR-C0-1N-RRE (道 12 和道 13)转染(TF)到PK-7细胞中或者作为转移载体包装到VSV-G假型LV中,后者是经HEK293T的标准三重转染而产生的。然后含有SIN-RD114-TR的LV用于离心接种PK-7细胞(TD)。道1-9、道12和道13对应于细胞提取物(50 μ g/道);道10和道11对应于LV (30 ng p24gag-等同物/道)。滤膜用抗RD114-TR Ab探测,所述Ab识别嵌合包膜的前体(PR)亚基和跨膜(TM)亚基,但不识别表面(SU)亚基。TM*条带对应于经病毒蛋白酶依赖性切割之后得到的较短的跨膜亚基。(b)在3个PK-7-Tat7-RD克隆中的RD114-TR包膜的蛋白印迹分析。左图,细胞提取物(40 Ug/道)用抗RD114-TR Ab来探测。剥离之后,将膜与抗p24gagAb杂交,以评价每p24gag水平的RD114-TR的相对比例。右图,与细胞提取物相同地对产自PK-7-Tat-RD克隆的LV的30 ng p24gag-等同物进行处理。括号中的数字表示整合的SIN-RDl 14-TR-1N-RRE载体的拷贝。(c)在3个PK-7-RD克隆中的RD114-TR包膜的蛋白印迹分析。左图,细胞提取物(40 yg/道)用抗RD114-TR Ab来探测。剥离之后,将膜与抗p24gag Ab杂交。右图,与细胞提取物相同地对产自PK-7-RD克隆的LV的30 ng p24gag-等同物进行处理。括号中的数字表示整合的SIN-RDl 14-TR-1N-RRE载体的拷贝。⑷在3个PK-7-RD26亚克隆中的RD114-TR包膜的蛋白印迹分析。左图,细胞提取物(40 μ g/道)用抗RD114-TR Ab来探测。剥离之后,将膜与抗p24gag Ab杂交。右图,与细胞提取物相同地对产自PK-7-RD26亚克隆的LV的30 ng p24gag-等同物进行处理。在左图中,括号中的数字表示整合的SIN-RDl 14-TR-1N-RRE载体的拷贝,在右图中,在SIN-GFP转移载体转染之后产自亚克隆的LV的滴度。图5.对bacu1-AAV-GPR基因组DNA和R印78推定的残余DNA整合的分析。(a)重组杆状病毒-AAV DNA的DNA印迹分析。从杆状病毒颗粒中提取DNA,用#7 Ι限制酶消化过夜,印迹之后,将11-kb GPR盒特异性探针探测。将Entry-GPR质粒(I pg)和杆状病毒空DNA (100 ng)上样,分别作为阳性和阴性对照。(b)检测整合到PK-7细胞中的推定的残余rep78质粒DNA。进行R印78特异性PCR,使用PK-7基因组DNA作为样品模板和CMV-R印78(I pg)质粒作为阳性对照。图6.SIN-RDl 14-TR 和 SIN-RDl 14-TR-1N 载体的转录。在额外的 Rev 质粒(2.5μ g)存在(道2和道4)或不存在(道I和道3)时将SIN-RD114-TR载体瞬时转染到HEK293T细胞中之后,RD114-TR RNA表达的RNA印迹分析。共转染后48小时,从HEK293T细胞中提取总RNA (5 yg)并与特异性RD114-TR探针杂交。FL,全长;Exp.FL,预期全长SIN-RDl 14-TR-1N载体,在β -球蛋白内含子存在下预期其比SIN-RDl 14-TR长800_bp。将550-bp RDl 14-TR片段用作特异性探针。
实施例实施例1:通用方法 质粒
通达Mlul/Narl和Mlu/Not\消化,分别从pCG719_pKLgagpol质粒(以下简称CMV-GPR)(图1a,图例 13)和 pCG720_pKrev 质粒(CMV-Rev)(图1a,图例 9)切下野生型HIV-1 gag基因、pol基因和rev基因[27]。在尾-尾的方向的2个不同的表达盒中将病毒基因插入到 Gateway pENTR 4 穿梭载体(Invitrogen, C0., Carlsbad, CA),每个盒由CMV IE启动子驱动并携带多聚A序列。第一盒表达gag基因和pol基因,而第二盒表达rev基因和选择标记潮霉素抗性(hygro)基因;hygro是克隆在IRES下游以允许双-顺反子翻译。将2个表达单元引入携带感染性AAV基因组的重组pSUB201质粒的ZhI位点中[18]。再切下所得 5’ ITR-CMV-GagPol-polyA-polyA-hygro-1RES-Rev-CMV-1TR3’ 盒并插入到Gateway pENTRTM4穿梭载体中。通过含有2个盒的pENTR 4穿梭进入载体和BaculoDirect Linear DNA (BaculoDirect 杆状病毒表达系统,Invitrogen, C0.)之间的噬菌体λ位点-特异性重组系统,获得重组杂合baculo-AAV包装载体(bacu1-AAV-GPR)(图la,图例I)。在同源重组期间,杆状病毒DNA的多角体蛋白基因因此被GPR双盒替代。如Recchia等,2004 [19]所述,通过克隆处于表达载体pABS.43的CMV IE启动子之下的AAV-rep78 0RF,得到 pABCMV-r印78 表达质粒(CMV-AAV-r印78)(图1a,图例 8)。pMD.G质粒(CMV-VSV-G) [20]编码疱疹性口炎包膜糖蛋白(VSV-G)(图la,图例10)。第3代转移载体 pCCLsin.PPT.hPGK.eGFP.WPRE.Amp (SIN-eGFP) [21]表达处在组成型启动子 hPGK之下的eGFP基因(图1a,图例6)。表达抗HIV-1 Chim3转基因的第2代P Λ N-Chim3转移载体描述于Porcellini等,2009 &2010 [23,24](图1a,图例7)。按照不同策略,构建 SIN-RDl 14-TR 载体(图1a,图例 3-5),通过使用从 pCMV_RD114_TR (CMV-RD114-TR)(图la,图例11)质粒中切下的RD114-TR 0RF,其编码由猫科内源逆转录病毒RDl 14包膜的胞外和跨膜结构域以及A-MLVenv 4070A的胞质尾(TR)组成的嵌合RD114-TR包膜[22]。简而言之,将 CMV-RDl 14-TR、CMV-RD114-TR-1N 和 CMV-RDl 14-TR-1N-RRE 盒各自克隆到SIN-poly#7yI载体的#7^/1位点中,所述载体是SIN-eGFP载体的修饰形式,其中hPGK_eGFP盒被除去并用 EcoR^-Mlul-Smal-Mlul-Notl-Sacl-Bglll-BamHl-Sall 多接头取代。SIN-RDl 14-TR-1N构建体和RDl 14-TR-1N-RRE构建体(图1a,图例4和图例5)含有存在于CMV-RDl 14-TR载体中的兔β -球蛋白内含子(图1a,图例11)。在SIN-RDl 14-TR-1N-RRE中,将按照“PCR分析”部分所述进行PCR扩增的230-bp RRE元件整合到β -球蛋白内含子元件的5bal位点中。第2代包装pCMV- Δ R8.74 (CMV-GPRT)构建体(图1a,图例12)编码HIV-1 gag基因、pol基因、rev基因和tat基因[25]。构建SIN-Tat载体(图1a,图例2),即通过将来源于CMV-GPRT质粒(图1a,图例12)的tat基因插入到pIRESpuro3(Clontech Laboratories Inc., a TakaraBio Company, Mountain View, CA) ^EcoRl点中,然后通过将双-顺反子CMV-Tat-1RES`-puro盒克隆到SIN_poly#7i/I载体的#7^/1中。
细胞
在27°C,在不存在CO2的条件下,将草地贪夜蛾{Spodoptera frugiperda, Sf9)昆虫细胞(Invitrogen, C0.)悬浮培养在补充有10% FCS (EuroClone Ltd, UK)和青霉素-链霉素和谷氨酰胺组合(PSG)的TC-100培养基(Invitrogen,C0.)中。将人胚肾293T(HEK293T)细胞及其衍生克隆(PK-7和PK-7衍生物)在补充有10% FCS和PSG的Dulbecco氏改良Eagle培养基(DMEM)中繁殖。将CEM A3.01和SupTl T细胞在补充有10% FCS和PSG 的 RPMI 1640 中培养。从在 Ficoll-Hypaque 梯度(Lymphoprep, Nycomed Pharma AS,Oslo, Norway)上离心的脐带血(UCB)中纯化⑶34+造血干细胞(HSC)和新生儿白细胞。经梯度分离之后,从收集的UCB单核细胞环中通过阳性选择,使用⑶34 MicroBeads试剂盒和MiniMACS Separator 柱(Miltenyi Biotec, Sunnyvale, CA),分离 CD34+ HSC。通过 FACS分析(FACSCalibur BD Bioscience, San Jose, CA)和 FlowJo 软件(Tree Star, Inc.,Ashland, OR),使用抗CD34-PE Ab (BD Pharmingen , San Diego, CA),确定 CD34+细胞纯度(>92%)。在含有人干细胞因子(h-SCF) 100 ng/ml (R&D Systems, Minneapolis, MN)、h_Flt3L 100 ng/ml (Peprotech, Rocky Hill, NJ)、h_IL_6 20ng/ml (R&D Systems)和人血小板生成素(h_Tpo) 20 ng/ml (Peprotech)的20%血清Iscove氏改良Dulbecco氏培养基(IMDM)中,对CD34+细胞预刺激24小时,并在转导期间维持在同一培养基中。用可溶性抗人 CD3 (30 ng/ml) (Orthoclone OKT3, Janssen-Cilag, UK)和重组人 IL-2 (rhIL-2)50 U/ml (Chiron, Emeryville, CA)的RPMI对新生儿白细胞刺激48小时,然后将其保持在补充有10% FCS、PSG和rhIL-2的RPMI中。如下使RD2-MolPack-Chim3.14 克隆适应在含 2.5% FCS 的 Dulbecco 氏培养基(DMEM)中生长:将细胞在120 rpm的旋转摇床上在37°C在5% C02加湿空气气氛中在125-ml摇瓶中培养至密度为1.5 X IO6细胞/ml。生存力保持在彡70%,将细胞分为0.5X IO6细胞/ml,每天更换培养基。在多次传代期间,将FCS从10%降至5%降至2.5% ;至少培养2代之后进行一次血清更换。HEK293T细胞的杆状病毒生产和baculo_GPR感染
按照BaculoDirect方法,使用Gateway 适应性杆状病毒DNA系统(Invitrogen,C0.),产生携带重组杂合baculo-AAV-GPR DNA基因组的杆状病毒。通过噬斑测定评价重组杆状病毒滴度,病毒在Sf9细胞中扩增3代之后相当于I X IO11 pfu/ml。通过用4 μ gAAV-r印78表达质粒转染1.5 X IO6 HEK293T细胞并在24小时之后用重组baculo-AAV-GPR以1,000的MOI感染而得到PK-7克隆。在没有潮霉素时将细胞维持4天,然后在潮霉素(100 μ g/ml)存在下,以系列稀释浓度,将5 X IO5细胞接种在22个10_cm皿中。通过ELISA对22个皿筛选p24gag的产生。仅有以3.7 X IO4细胞/皿接种细胞的一个皿在上清液中释放出足够的p24gag。该皿含有40个集落,将其全部挑取出来并筛选。它们中的3个记为p24gag产生阳性,对其进行进一步表征。LV生产和滴定
通过以下质粒的瞬时共转染,获得从HEK293T细胞产生的假型LV:包装构建体CMV-GPR(第3代)[或CMV-GPRT (第2代)]、VSV-G或RDl 14-TR包膜构建体和第3代SIN-eGFP或第2代PAN-Chim3 [23]或P Λ N_eGFP转移载体。包装:包膜:转移载体的比例为6.5:3.5:10 yg DNA,除非另有说明。通过表达env的质粒和转移载体的共转染,从PK-7克隆产生LV,同时通过仅用合适转移载体转染,获得从PK-7-RD克隆和PK-7-Tat7-RD克隆产生的LV。用标准Ca++磷酸盐方法或Fugene 6系统,按照制造商的说明(Roche DiagnosticsCorporation, Indianapolis, IN)进行瞬时转染,得到类似结果。转染后48小时收获上清液并通过0.45-μ m滤器过滤。根据实验类型,对SupTl、CEM A3.01、原代活化外周血单核细胞(PBMC)和脐带血衍生的⑶34+ HSC计算滴度。简而言之,通过由过夜静止阶段分开的
2次循环的离心接种(I, 240 X g, I 小时),在 polybrene (8 μ g/ml) (Sigma-Aldrich,St Louis, MO)存在下,转导SupTl和活化的原代单核细胞;将CD34+ HSC在不含polybrene的包被 retronectin 的板(Takara Bio, Otsu, Japan)上转导 24 小时。如 Porcellini等,2009 & 2010 [23, 24]所述,使用 FlowJo 软件(Tree Star, Inc., Ashland, OR),通过 eGFP 表达(SIN-eGFP)或 Λ LNFGR 表达(PAN_Chim3)的流式细胞术分析(FACS CaliburBD Bioscience, San Jose, CA)监测转导效率。仅范围5_20%阳性细胞的转导值用于计算每种LV制备物的滴度, 按照以下公式:TU =[细胞数X (% GFP/100)]/上清液体积(以ml 计)。基于滴度的克隆筛选方案
为了加快选择,我们通过计算它们的上清液的LV滴度,筛选了所有PK-7衍生亚克隆。我们建立了小规模的基于Ca++磷酸盐的单个或两个质粒的共转染,产生LV,随后通过小规模转导方案计算其对SupTl细胞的效力。简而言之,将6 X IO4/孔PK-7衍生细胞接种在48孔板中并在24小时之后用获得功能性LV所需的残余质粒进行共转染。转染后48小时,将200 μ I培养上清液用于转导3 X IO4/孔的以7.5 X 104/ml浓度接种的SupTl细胞。所用滴度阈值评分为彡I X IO2 TU/mL.
RNA印迹测定和DNA印迹测定
RNA 印迹测定。用 Trizol 试剂(Life TechnologiesTM Inc., Gaithersburg, MD),按照制造商的说明,提取总RNA。将5 y g/样品在0.8%琼脂糖-甲醛凝胶上运行,通过毛细管转移,转移到Hybond-N膜上,最后用PerfectHyb PLUS杂交缓冲液(Sigma ChemicalCorp., St.Louis, MO)中的 I X IO6 dpm/ml 32P-标记的 550-bp RDl 14-TR探针来探测。充分洗涤之后,在一 70°C将膜曝光至X光胶片。DNA印迹测定。通过QIAamp Mini试剂盒(QIAGEN GmbH, Germany),按照制造商的说明,分离基因组DNA (gDNA)。通过QIAamp DNA micro试剂盒(QIAGEN)从病毒颗粒中提取杆状病毒DNA。用所示限制酶消化过夜之后,将10 μ g的gDNA在0.8%琼脂糖凝胶上运行,通过DNA印迹毛细管转移到尼龙膜(Duralon, Stratagene, TX, USA),然后在PerfectHybPLUS杂交缓冲液中杂交到I X IO6 dpm/ml 32P-随机引物标记的600_bp CMV或ll_kb GPR盒,250-bp tat, 600-bp Chim3 和 500_bp RD114-TR特异性探针。充分洗涤之后,在一 70°C将膜曝光至 X 光胶片或曝光至 PhosphorImager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA)。分析性PCR分析
使用I ng SIN-eGFP载体作为DNA模板和以下的一组引物,得到230-bp RRE扩增子:RRE-正向:5’-AGT ACT GGA GCT TTG TTC CTT GGG-3’;RRE_ 反向:5’-AGT ACT AAA TCCCCA GGA GCT G-3’,在以下PCR条件:98°C 7分钟,30个循环的94°C 30秒、50°C 30秒和72 0C 30 秒。对300 ng基因组gDNA进行PCR分析,用于筛选残余整合到PK-7细胞中的AAV-R印78 质粒,使用下组引物:AAV-R印78 正向:5,-CGG GCT GCT GGC CCA CCA GG-3’ ;AAV-R印78 反向:5’-ATG CCG GGG TTT TAC GAG ATT GTG-3’和以下 PCR 条件:98°C 7 分钟,30个循环的94°C 30秒、66°C 30秒和72°C 1.5分钟。为了确定2个GPR盒的方向,对300 ng gDNA进行PCR扩增,使用下组引物:rev正向:5’- CTT GAG GAG GTC TTC GTC GC-3’; β -球蛋白反向:5’- CCC TGT TAC TTC TCCCCT TCC -3’ ;rev 正向巢式:5’ - TGT CTC CGC TTC TTC CTG CC-3’ ;β-球蛋白巢式反向:5’ - TTA ACC ATA GAA AAG AAG GGG-3’ 和以下条件:94°C 2 分钟,35 个循环的 94°C30 秒、52。。30 秒和 72°C 1.5 分钟。p24gag ELISA
使用 Alliance HIV-1 p24 抗原 ELISA 试剂盒(Perkin Elmer Life and AnalyticalSciences, Inc.Waltham, MA),按照制造商的说明,在培养上清液中测量实际的LV生产,假定I Pg p24gag相当于I X IO4实际颗粒。
蛋白印迹分析
如前所述[23,24],制备来源于PK-7细胞的全细胞和核提取物以及来源于分离的无细胞VLP或LV的病毒蛋白。通过SDS-PAGE将蛋白按大小分级,并且电印迹到Hybond ECL硝基纤维素膜(GE Healthcare, Life Sciences, UK Ltd, UK)。将膜在5%低脂奶粉中封闭,然后与合适的第一 Ab—起温育。使用得自AIDS患者的1: 2,000稀释度的抗HIV血清;1: 500稀释度的识别蛋白外功能区的2个15聚体肽(aa 95-109,QNRRGLDLLTAEQGG和 aa 65-79,SGIVRNKIRTLQEEL)的抗 RD114-TR 兔血清[22];分别为 1:200,1:1,000 和1:500稀释度的HIV-1 rev MoAb (Rev-6, sc-69730)和经亲和纯化的兔多克隆抗YYl Ab(C-20, sc-281) (S.Cruz Biotechnology, Inc., S.Cruz, CA)和小鼠抗p24gag (AcrisAntibodies, Germany)。通过增强化学发光系统ECL (ECL, Amersham),按照制造商的说明,显示Ab结合。通过实时TaqMan PCR对载体拷贝数(VCN)进行定量测定
通过定量 TaqMan PCR,使用 ABI Prism 7, 900 FAST 仪器(Applied Biosystems,Foster City, CA)确定整合载体的载体拷贝数(VCN),并通过SDS 2.3软件(AppliedBiosystems)进行分析。PCR条件如下:50°C 2分钟,95°C 5分钟,接着是40个循环的95°C15秒和60 V 15秒,增量为0.1°C /循环,对于GAG靶序列。用以下引物和探针扩增gDNA:
权利要求
1.一种得到稳定慢病毒包装细胞系的方法,包括: 1.制备杂合载体(A),其包含含有侧翼为AAVITR并包含2个表达盒的整合盒的杆状病毒骨架,其中第一表达盒编码慢病毒gag基因和pol基因,第二个编码慢病毒rev和选择标记,和 .制备表达质粒(B),其含有处于启动子控制之下的AAV rep可读框, ii1.用表达质粒B转染细胞并随后用杂合载体A感染该细胞, iv.在抗生素存在下培养所述细胞,用于选择, V.得到稳定表达gag蛋白、pol蛋白和rev蛋白的细胞, v1.将env基因整合到所述细胞中, vi1.培养所述细胞,以得到稳定表达gag蛋白、pol蛋白、rev蛋白和env蛋白的细胞系。
2.—种得到稳定慢病毒 包装细胞系的方法,包括: 1.制备杂合载体(A),其包含含有侧翼为腺伴随病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)并包含2个表达盒的整合盒的杆状病毒骨架,其中第一表达盒编码慢病毒gag基因和pol基因,第二个编码慢病毒rev和选择标记,和 .制备表达质粒(B),其含有处于启动子控制之下的AAV rep ORF, ii1.用表达质粒B转染细胞并随后用杂合载体A感染该细胞, iv.在抗生素存在下培养所述细胞,用于选择, V.得到稳定表达gag蛋白、pol蛋白和rev蛋白的细胞, v1.将慢病毒tat基因整合到这样的细胞中, vi1.培养所述细胞,以得到稳定表达gag蛋白、pol蛋白、rev蛋白和tat蛋白的细胞系, vii1.将env基因整合到这样的细胞中, ix.培养所述细胞,以得到稳定表达gag蛋白、pol蛋白、rev蛋白、tat蛋白和env蛋白的细胞系。
3.权利要求1或2的方法,其中所述杂合载体的2个表达盒是尾-尾的方向并且每个由组成型启动子和多聚A驱动。
4.权利要求3的方法,其中所述启动子选自CMV、CMVIE、PGK、SV40、eFl a、SFFV和RSV。
5.权利要求4的方法,其中所述启动子是CMVIE。
6.权利要求1-5中任一项的方法,其中所述选择标记选自潮霉素、卡那霉素、新霉素或zeomycin的抗性基因。
7.权利要求6的方法,其中所述选择标记是潮霉素抗性基因。
8.权利要求1或7的方法,其中所述选择标记是克隆在IRES下游。
9.权利要求1-8中任一项的方法,其中AAVRep蛋白是R印78。
10.权利要求1-9中任一项的方法,其中env基因选自MLV4070 env、RDl 14 env、嵌合包膜蛋白RD114-TR、嵌合包膜蛋白RD114-pro、杆状病毒GP64 env或GALV env或其衍生物。
11.权利要求10的方法,其中env基因是编码嵌合包膜蛋白RD114-TR的基因。
12.权利要求11的方法,其中使用包含表达盒的SIN慢病毒载体,整合RD114-TR,所述表达盒含有从5’到3’端排列的CMV启动子、在其序列中含有RRE元件的β -球蛋白内含子和 RD114-TR ORF。
13.一种包含稳定整合到其基因组中的以下部分的稳定慢病毒包装细胞系: 1.侧翼为AAVITR并包含2个表达盒的至少一个拷贝的整合盒,其中第一表达盒编码慢病毒gag基因和pol基因,第二个编码慢病毒rev和选择标记, i1.至少一个拷贝的env基因。
14.权利要求13的稳定慢病毒包装细胞系,其中所述细胞还含有稳定整合到其基因组中的HIV-1 iai基因。
15.权利要求13或14的稳定慢病毒包装细胞系,其中所述细胞是选自HEK293、HEK293-T、HEK293-SF、TE671、HT1080 或 HeLa 的人细胞系。
16.权利要求13-15中任一项的稳定慢病毒包装细胞系,其中所述整合盒的2个表达盒是尾-尾的方向并且每个由组成型启动子和多聚A驱动。
17.权利要求13-16中任一项的稳定慢病毒包装细胞系,其中所述启动子选自CMV、CMV IE、PGK、SV40、eFl a、SFFV 和 RSV。
18.权利要求13-17中任一项的稳定慢病毒包装细胞系,其中所述选择标记选自潮霉素、卡那霉素、新霉素或zeomycin的抗性基因。
19.权利要求13-18中任一项的稳定慢病毒包装细胞系,其中env基因选自MLV4070env, RDl 14 env、嵌合包膜蛋白RD114-TR、嵌合包膜蛋白RD114_pro、杆状病毒GP64 env或GALV env或其衍生物。
20.权利要求13-19中任一项的稳定慢病毒包装细胞系,其中env基因是编码嵌合包膜蛋白RD114-TR的基因。
21.一种生产慢病毒载体的方法,包括: 1.培养权利要求13-20中任一项的稳定慢病毒包装细胞系, .在所述稳定包装细胞系中插入转移载体。
22.一种包含稳定整合到其基因组中的以下部分的生产用细胞系: 1.侧翼为AAVITR并包含2个表达盒的至少一个拷贝的整合盒,其中第一表达盒编码慢病毒gag基因和pol基因,第二个编码慢病毒rev和选择标记, i1.至少一个拷贝的env, ii1.转移载体。
23.权利要求22的生产用细胞系,其中所述细胞还含有稳定整合到其基因组中的至少一个拷贝的慢病毒tat基因。
24.权利要求22或23的生产用细胞系,其中所述细胞是选自HEK293、HEK293-T、HEK293-SF、TE671、HT1080 或 HeLa 的人细胞系。
25.权利要求22-24中任一项的生产用细胞系,其中所述杂合载体的2个表达盒是尾-尾的方向并且每个由组成型启动子和多聚A驱动。
26.权利要求22-25中任一项的生产用细胞系,其中所述启动子选自CMV、CMVIE、PGK、SV40、eFl α , SFFV 和 RSV。
27.权利要求22-26中任一项的生产用细胞系,其中所述选择标记选自潮霉素、卡那霉素、新霉素或zeomycin的抗性基因。
28.权利要求22-27中任一项的生产用细胞系,其中env基因选自MLV4070 env、RDl 14 env、嵌合包膜蛋白RD114-TR、嵌合包膜蛋白RD114-pro、杆状病毒GP64 env或GALVenv或其衍生物。
29.权利要求22-28中任一项的生产用细胞系,其中env基因是编码嵌合包膜蛋白RD114-TR的基因。
30.一种生产慢病毒载体的方法, 包括:.1.培养权利要求22-30中任一项的生产用细胞系。
全文摘要
本发明提供新的稳定包装细胞系和生产用细胞系以及得到它们的方法,以及用这样的细胞系生产慢病毒载体的新方法。用用于慢病毒结构蛋白和调控蛋白的稳定表达的baculo-AAV杂合系统产生本发明的新方法和包装细胞系,所述系统包含含有侧翼为AAVITR的整合盒的杆状病毒骨架,以及编码rep蛋白的质粒。该系统允许得到HIV-1的结构蛋白和调控蛋白gag/pol和rev的稳定整合。所述系统允许得到仅包含HIV的结构蛋白和调控蛋白gag/pol和rev的第一中间体,用作得到稳定包装细胞系以及生产用细胞系的起点。
文档编号C12N15/867GK103228790SQ201180042473
公开日2013年7月31日 申请日期2011年9月1日 优先权日2010年9月2日
发明者C.博沃伦塔, A.斯托尔纳约洛, P.里扎尔迪, F.马维利奥 申请人:莫尔梅德股份有限公司

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